contenu de la matière : i structure et organisation du
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Contenu de la matiegravere Indash Structure et organisation du mateacuteriel geacuteneacutetique Chromosome plasmides mateacuteriel geacuteneacutetique viralII ndash mutation et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADNIII- Recombinaison geacuteneacutetique et eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables recombinaison homologue recombinaison site speacutecifique eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables et applicationsIV ndashTransferts geacuteneacutetiques chez les bacteacuteries analyse et construction geacuteneacutetiques conjugaison transformation transduction et phages transducteurs applications cartographie geacuteneacutetiqueV ndash Pheacutenomegravene de restriction modification systegraveme de restriction modification enzymes de restriction cartographie de restriction et applicationsVI ndash Reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes reacutegulation transcriptionnelle (exemples E coli Saccharomyces cerevisiae) reacutegulation traductionnelleVII ndash Geacuteneacutetique des bacteacuteriophages reacuteplication du geacutenome viral recombinaison geacuteneacutetique chez les virus meacutecanismes de lrsquoexpression geacuteneacutetique en cascade chez les virus et maintien agrave lrsquoeacutetat prophage
Travaux Dirigeacutes MutationTransferts geacuteneacutetiques et cartographie geacuteneacutetique Enzymes de restriction cartographie de restriction
Generaliteacutes
Les microorganismes sont diviseacutes en 3 domaines qui sonteubacteries
Archaeaeucaryotes
Lrsquoappareil nucleacuteaire
bull Constitue le support de lrsquoinformation geacuteneacutetique heacutereacuteditaire
bull Transmet linformation geacuteneacutetique aux cellules filles par autoreacuteplication
bull Site drsquoaction de certains antibiotiques
bull La majoriteacute des bacteacuteries possegravede un seul chromosome
bull Certaines peuvent avoir un ou plusieurs plasmides (un plasmide ou
bull Un meacutega plasmide)
ADN constitueacute de purines et de pyrimidines deux chaines antiparalelles
ADN est un acide vu la preacutesence du groupement phosphate (chargeacute negativement) qui lui confegravere une aciditeacute
ADN contient aussi un desoxyribose pour pouvoir former une double helice (OH en position 2rsquo rend lrsquoADN instable)
La structure de lrsquoADN change drsquoun milieu a un autreLrsquohelice contient deux sillonsSillon majeur 22AdegSillon mineur 12Adeg
Pas dlrsquohelice 34Adeg (il contient en moyenne 10 pb car quand il contientplus de triple liaisons + 10pb quand il contient plus de double liaisons -10pb)
Les enzymes srsquoaccrochent au grand sillon (bases plus exposeacutees)
Les topoisomerases surenroulent lrsquoADN neacutegativement
bull Les meacutecanismes des variations geacuteneacutetiques bacteacuteriennes
ndash Mutation au niveau du chromosome de la bacteacuterie
ndash Acquisition drsquoun mateacuteriel geacuteneacutetique exogegravene par diffeacuterents pheacutenomegravenes
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Generaliteacutes
Les microorganismes sont diviseacutes en 3 domaines qui sonteubacteries
Archaeaeucaryotes
Lrsquoappareil nucleacuteaire
bull Constitue le support de lrsquoinformation geacuteneacutetique heacutereacuteditaire
bull Transmet linformation geacuteneacutetique aux cellules filles par autoreacuteplication
bull Site drsquoaction de certains antibiotiques
bull La majoriteacute des bacteacuteries possegravede un seul chromosome
bull Certaines peuvent avoir un ou plusieurs plasmides (un plasmide ou
bull Un meacutega plasmide)
ADN constitueacute de purines et de pyrimidines deux chaines antiparalelles
ADN est un acide vu la preacutesence du groupement phosphate (chargeacute negativement) qui lui confegravere une aciditeacute
ADN contient aussi un desoxyribose pour pouvoir former une double helice (OH en position 2rsquo rend lrsquoADN instable)
La structure de lrsquoADN change drsquoun milieu a un autreLrsquohelice contient deux sillonsSillon majeur 22AdegSillon mineur 12Adeg
Pas dlrsquohelice 34Adeg (il contient en moyenne 10 pb car quand il contientplus de triple liaisons + 10pb quand il contient plus de double liaisons -10pb)
Les enzymes srsquoaccrochent au grand sillon (bases plus exposeacutees)
Les topoisomerases surenroulent lrsquoADN neacutegativement
bull Les meacutecanismes des variations geacuteneacutetiques bacteacuteriennes
ndash Mutation au niveau du chromosome de la bacteacuterie
ndash Acquisition drsquoun mateacuteriel geacuteneacutetique exogegravene par diffeacuterents pheacutenomegravenes
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Lrsquoappareil nucleacuteaire
bull Constitue le support de lrsquoinformation geacuteneacutetique heacutereacuteditaire
bull Transmet linformation geacuteneacutetique aux cellules filles par autoreacuteplication
bull Site drsquoaction de certains antibiotiques
bull La majoriteacute des bacteacuteries possegravede un seul chromosome
bull Certaines peuvent avoir un ou plusieurs plasmides (un plasmide ou
bull Un meacutega plasmide)
ADN constitueacute de purines et de pyrimidines deux chaines antiparalelles
ADN est un acide vu la preacutesence du groupement phosphate (chargeacute negativement) qui lui confegravere une aciditeacute
ADN contient aussi un desoxyribose pour pouvoir former une double helice (OH en position 2rsquo rend lrsquoADN instable)
La structure de lrsquoADN change drsquoun milieu a un autreLrsquohelice contient deux sillonsSillon majeur 22AdegSillon mineur 12Adeg
Pas dlrsquohelice 34Adeg (il contient en moyenne 10 pb car quand il contientplus de triple liaisons + 10pb quand il contient plus de double liaisons -10pb)
Les enzymes srsquoaccrochent au grand sillon (bases plus exposeacutees)
Les topoisomerases surenroulent lrsquoADN neacutegativement
bull Les meacutecanismes des variations geacuteneacutetiques bacteacuteriennes
ndash Mutation au niveau du chromosome de la bacteacuterie
ndash Acquisition drsquoun mateacuteriel geacuteneacutetique exogegravene par diffeacuterents pheacutenomegravenes
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
ADN constitueacute de purines et de pyrimidines deux chaines antiparalelles
ADN est un acide vu la preacutesence du groupement phosphate (chargeacute negativement) qui lui confegravere une aciditeacute
ADN contient aussi un desoxyribose pour pouvoir former une double helice (OH en position 2rsquo rend lrsquoADN instable)
La structure de lrsquoADN change drsquoun milieu a un autreLrsquohelice contient deux sillonsSillon majeur 22AdegSillon mineur 12Adeg
Pas dlrsquohelice 34Adeg (il contient en moyenne 10 pb car quand il contientplus de triple liaisons + 10pb quand il contient plus de double liaisons -10pb)
Les enzymes srsquoaccrochent au grand sillon (bases plus exposeacutees)
Les topoisomerases surenroulent lrsquoADN neacutegativement
bull Les meacutecanismes des variations geacuteneacutetiques bacteacuteriennes
ndash Mutation au niveau du chromosome de la bacteacuterie
ndash Acquisition drsquoun mateacuteriel geacuteneacutetique exogegravene par diffeacuterents pheacutenomegravenes
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
La structure de lrsquoADN change drsquoun milieu a un autreLrsquohelice contient deux sillonsSillon majeur 22AdegSillon mineur 12Adeg
Pas dlrsquohelice 34Adeg (il contient en moyenne 10 pb car quand il contientplus de triple liaisons + 10pb quand il contient plus de double liaisons -10pb)
Les enzymes srsquoaccrochent au grand sillon (bases plus exposeacutees)
Les topoisomerases surenroulent lrsquoADN neacutegativement
bull Les meacutecanismes des variations geacuteneacutetiques bacteacuteriennes
ndash Mutation au niveau du chromosome de la bacteacuterie
ndash Acquisition drsquoun mateacuteriel geacuteneacutetique exogegravene par diffeacuterents pheacutenomegravenes
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
bull Les meacutecanismes des variations geacuteneacutetiques bacteacuteriennes
ndash Mutation au niveau du chromosome de la bacteacuterie
ndash Acquisition drsquoun mateacuteriel geacuteneacutetique exogegravene par diffeacuterents pheacutenomegravenes
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
I- organisation et reacuteplication de lrsquoinformation geacuteneacutetique
1) Le chromosome
ndash ADN double brin circulaire et super enrouleacute
- cible de plusieurs antibiotiques les quinolones inhibent les topo isomeacuterases et les rifamycines inhibent les ARN polymeacuterases
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
11
2) lrsquoADN extrachromosomique
eacuteleacutements geacuteneacutetiques (ADN) de petite taille (05 agrave 5 du chromosome bacteacuterien) bicateacutenaire
extra-chromosomiques = plasmides (eacuteleacutements incsts)bull moleacutecules drsquoADN circulaires superenrouleacutees plus reacutesistant
- Assure leur propre transfert par conjugaison ou transduction
- Confegravere agrave la bacteacuterie une adaptabiliteacute agrave son environnement reacutesistance au antibiotique virulencehellip
Les + connus
le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bacteacuterien par conjugaison
les plasmides de reacutesistance aux ATB (facteurs R)
La R peut concerner plusieurs ATB R par mutation
La R codeacutee par les gegravenes plasmidiques est svt lieacutee agrave la production drsquoenzyme qui inactivent les ATB
les autres plasmides responsables de la virulence (ex production de toxines) R aux ATS deacutegradation de cert substances
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Reacuteplication
bull La reacuteplication deacutebute agrave un site speacutecifique duchromosome origine de reacuteplication
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Reacuteplication
bull La reacuteplication progresse de maniegravere bidirectionnelle agrave
partir de cette origine fourche de reacuteplication
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Reacuteplication
bull chaque brin sert de matrice pour la synthegravese du brin
compleacutementaire
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Reacuteplication
La reacuteplication du chromosome bacteacuterien
bull Permet agrave chaque bacteacuterie fille de recevoir unecopie identique du chromosome
bull est laquosemi conservatrice raquo un brin drsquoADN de labacteacuterie parentale et un brin drsquoADNneacuteosyntheacutetiseacute
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Reacuteplication
La reacuteplication des plasmides
bull Indeacutependante du chromosomebull Peut se transmettre aux cellules filles lors de la division bacteacuteriennebull peut ne pas ecirctre transmis agrave la bacteacuterie fillebull peut se transmettre drsquoune bacteacuterie agrave une autre
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Les virus
bull Unicellulaires
bull ACARYOTES
bull Parasites stricts
bull Un seul acide nucleacuteique ou ADN ou ARN
bull Ultrafiltrables
bull Microscope eacutelectronique
bull proteacutegeacute dans une capside (nature proteique) Structure particulaire speacutecifique qui est support de la classification morphologique cubique heacutelicoidalehellip
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Le mateacuteriel geacuteneacutetique viral
On a commenceacute a eacutetudier Les virus depuis 1950
Les virus sont les plus petits et les plus primitifs des agents infectieux conventionnels
Ils diffegraverent de la plupart des bacteacuteries champignons et protozoaires par le fait quils sont
des parasites intracellulaires obligatoires
Les virus ne disposent pas de leacutequipement enzymatique neacutecessaire pour leur reacuteplication
laquo Un virus est essentiellement un programme geacuteneacutetique qui transmet de cellule en cellule le message Reproduis moi raquo
Pour se reproduire ils doivent donc laquo parasiterraquo les reacuteserves eacutenergeacutetiques de la cellule hocircte ses
nucleacuteotides ses acides amineacutes ses lipides ainsi que ses voies meacutetaboliques de biosynthegravese
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
la plupart des virus possegravedent des facteurs qui deacutetournent les processus meacutetaboliques
des cellules hocirctes au profit de la production de nouvelles particules virales
Ceci est en partie responsable de la mort des cellules infecteacutees et contribue aux manifestations
cliniques infectieuses
Les autres diffeacuterences majeures entre les virus et les micro-organismes plus complexes sont
les suivantes
un geacutenome viral est constitueacute dARN ou dADN jamais des deux simultaneacutement
bull les bacteacuteries champignons et protozoaires se reproduisent par scissipariteacute tandis que
les virus utilisent un mode complexe
bull les virus nont ni paroi ni organisation cellulaire
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Merci de votre attention
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Mutations et meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN Taille de mutation effet mutagegravene agents mutagegravenes meacutecanismes de reacuteparation de lrsquoADN
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Taille de mutation
ADN est lrsquoensemble de nucleacuteotides enchaineacutes avec preacutecision
Des variations de seacutequences ont pourtant lieu entrainant souvent lrsquoapparition de pheacutenotypes
Alteacutereacutes
Ces mutations sont geacuteneacuteralement neacutefastes
Les taux de mutations peuvent ecirctre augmenteacutes artificiellement (au labo)
Les mutations (du latin mutare changer) ont eacuteteacute caracteriseacutees par les phenotypes ou par
Alteration drsquoexpression phenotypiques qursquoelles engendrent
Les geneticiens avaient predit lrsquoexistance de divers types drsquoalteration
Changement drsquoune paire de nucleacuteotides drsquoun gene crsquoest une mutation geacutenotypique qui sera
exprimeacute par une concequence phenotypique
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Mutation et mutagenese
Les mutations peuvent modifier les phenotypes des microorganismes de differentes
Mannieres
Les mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou de la cellule
Les mutations letales ne sont pas concerveacutees sauf si elle recessives
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Les mutations spontaneacutees
Elles apparaissent sans intervention drsquoagents externesCette classe peut reacutesulter drsquoerreurs dans la reacuteplication drsquoADN ou encore de lrsquoaction de transposon
Elles apparaissent aussi suite au deacutecalage du cadre de lecture (frameshift mutation) causeacutee par une deacuteleacutetion ou insertion de base
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Les M spontanneacutees resultent de lesions de lrsquoADN ou drsquoerreur de replication
Exemple
A) deacutepurination
Des nucluotides puriques deacutepurineacutes (perdent leur base) entrainent la formation drsquoun site
Apurinique (site AP)
Lors de la replication lrsquoADN poly comble le vide par nrsquoimporte quelle nucleacuteotide
Donc ce site est mutagenique
B) desamination
la C peut etre desamineacutee en U qui se lie avec le A et qui sera ensuite elimineacute pour former un site
Apyrimidique ( apyrimidinique)
A est deacutesamineacute en hypoxanthine qui se lie avec le C
G est deacutesamineacute en xanthine qui ne se lie pas
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
c) Tautomeacuterisation
Est un isomegravere structurale des bases Il se forme suite a des rearangements dans la distributionDes H de la base Ces rearrangements alterent les proprieteacutes des liaisons H
AC
Amino (-NH2) (-NH) imino
A-NH ====C et C-NH ====A
GT
Ceto (C=O) Enol (OH)
T-OH G (3 liaisons)
G-OH T (2 liasons)
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Les mutation induites
Tt agents qui altere ou modifie la chimie de lrsquoADN ou interfere avec ses mecanismes de
Reparations induira des mutations
Les mutagenes peuvent etre classeacutes selon leurs mecanismes drsquoaction
4 modes sont connus
incorporation drsquoanalogues de bases
Des appariements erroneacutes (modification de bases)
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
incorporation drsquoanalogues de bases
Apres leur incorporation dans la chaine drsquoADN ces composeacutes montrent un appariement different
de celui des bases qursquoelles remplacent et peuvent provoquer des mutations
Parmi ces composeacutes on cite le 5 bromouracile (5-BU) qui est un analogue de T et srsquoapparie avec
le G 5BrU (T)
Et le 2 amino purine (A)
Des appariements erroneacutes (modification de bases) par des agent chimiques tel que
bull lrsquooxyde nitrique qui desamine le CG et A
bull Nitroso guanidine (NTG) il ajoute un grpt alkyl et reagit avec le G et T
G devient O6 methylG = T
T devient O4 methyl T = G
G
C
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Agents chimiques intercalants entre deux bases de lrsquoADN
Deforment lrsquoADN et provoquent lrsquoinsertion ou la deletion drsquo1 seule paire de nucleacuteotides
Ces mutagegravenes srsquoincerent entre deux bases Empileacutees de lrsquohelice Ca provoque probablement
une mutation par formation drsquoune boucle dans lrsquoADN
Exemple drsquoagents la proflavine et lrsquoorangeacute drsquoacridine
Les agents endommageant physiquement lrsquoADN
Bcp de substances mutagenes comme bcp de cancerigenes alterent les bases drsquoune maniegravere si
importante que les liaisons H entre les paires de bases ne peuvent plus srsquoetablir et que lrsquoADN ne
peut plus servir de matrice Par exemple les radiations UV provoque la formation de dimere de
thymine entre deux pyrimidines contigues
Ces mutations devraient etre letales mais elles peuvent declencher des mecanismes de
reparation qui vont corriger le materiel genetique endommageacute en faisant des erreurs
Si un cycle complet de replication de lrsquoADN a lieu avant que la lesion initiale ne soit repareacutee
la mutation devient stable et heriditaire
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Mutation ponctuelle concerne une paire de base Elle peut etre
Silencieuse (degenerescence du code genetique plusieurs codon pour un meme AA)
Faux sens substitution drsquoune seule base codant un AA different de celui du depart
au niveau fonction de la proteine lrsquoeffet peut varier de la perte complete de
lrsquoactiviteacute a pas de changement du tt
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
TD ndeg01 MUTATIONS
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
reacuteparation
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Les meacutecanismes de reacuteparation
Ls tps de reparation varie de qlq secondes a qlq heuresLa reparation se fait grace au fait qursquoil ya 2 exemplaires drsquoADN (deux brins)La reparation se fait souvent par excision du brin portant lrsquoerreur
Les differents meacutecanismes de reacuteparation
1) PhotoreacuteactivationEn 1949 kelner a constateacute que lorsque streptomyces est irradieacute avec les UV seschances de survie etaient plus importantes lorsque ce dernier est exposeacute a la lumiereVisible Cest la photoreacuteactivation qui repare les dimeres de pyrimidineSe fait en 3 etapesa) Photolyase analyse lrsquoADN et se lie a la lesionb) Le complexe photolyase-dimere absorbe une qtiteacute de lumiere de 350-500nmc) Lrsquoenergie absorbeacutee sert pour reparer la lesion puis la photolyase se detache de lrsquoADN
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
2) 6 methyl guanine ou 4 methylthymine transferaseCodeacute par le gene ada Lrsquoenzyme citeacutee va transformer le grpt methyl ou alkyl sur elle-mecircmeUne fois le grpt est enleveacute les bases retrouvent le proprieteacutees initiales et leurs liaisons HUne fois le grpt fixeacute il est degradeacute juste apres
3) Nucleacuteotide excision repair (NER) ou Uvr ABCEst le systegraveme de reparation sans lumiereIl reconnait des distorsions majeurs causeacutees par les UV (ne reconnait pas les mineurs)La reparation des dimeres de T et autres se faits en 3 etapes et selon 2 modeles1er modeleUVrABC reconnait la distorsion et fait une incision du coteacute 5rsquo du dimere et coupe la liaisonphosphodiester
Lrsquoactiviteacute exonucleasique de lrsquoADN poly1 enleve 7 a 20 nucleotides du brin coupeacute (avec le dimere)lrsquoADN poly1 utilise son activiteacute polymerasique 5rsquo-3rsquo pour remplacer les nucleotides enleveacuteLe processus se termine par une lyase2er modeleReconnaissance du dimereLe UVrABC fait 2 coupures ds le mm brinLa polyI remplit le vide Intervention de la ligase
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Mecanisme
2SU de UVrA interagissent avec une SU UVrB Ce complexe palpe lrsquoADN
Une foi le dimere retrouveacute les deux SU UVrA se detachent et UVrC se fixe a la place de uvrA
Uvr B est induite par uvrC pour faire une incision du coteacute 5rsquo ou bien des deux coteacutes selon le
modele
4) Methyl directed mismatch repair system (MMR)
Syst de reparation par methylation
Il differencie entre le brin parental et le nouveau brin
Les sequences GATC du brin parental sont marqeacutees par la desoxyadenosinemethylase
Apres reconnaissance le mesapariemment est lieacute au dimere MutS-MutS avec MutL qui active
lrsquoendonuclease MutH qui clive le brin non methyleacute dans un site adjascent a la sequence GATC
Lrsquohelicase est activeacute par MutS et Mut L entre ds lrsquohelice via le site de clivage et ouvre la double
helice ds lrsquoorientation vers le mesappariement
Ainsi une partie drsquoADN coupeacute puis le vide est remplit par lrsquoADN polyIII (plus performante que la
polyI qui ne peut pas faire un nbr eleveacute de paire de base) et une ligase
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
5) Base excision repair system (BER)Ce systegraveme est lieacute a lrsquoADN glycosylase qui reconnait differents types de bases modifieacutees ou mal IncorporeacuteesLes glycosylases enlevent les bases en hydrolysant les liaisons Nglycosidique entre les bases et le desoxyribose creant ainsi un site AP
Exemples5-1) uracile N glycosylaseLrsquoenlevement de U se fait en 3 etapesUracile N-glycosylase reconnait lrsquoU et clive la liaison N-glycosidique entre le U et le sucre en formant un site APLe site AP est reconnu par une AP endonucleacutease qui catalyse une coupure de la liaison phosphodiester du coteacute 5rsquo du siteLrsquoADN polyI utilise ses activiteacutes exo et polymerasique 5rsquo-3rsquo pour enlever le site AP et remplit levide puis la ligase intervient
5-2) les bases deasmineacutees et alkyleacuteesPour chaqursquoune de ces bases une glycosylase specifique existe pour agir de la meme manniereque le processus precedent
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Le systeme SOS
Crsquoest un syst de reparation mutagene
Chez Ecoli 20 genes ou plus sont inductibles lorsque la replication est bloqueacutee
Il fonctionne pour permettre la survie en reparant ou deviant la lesion
Le produit du gene recA a un role centrale qui fonctionne comme activateur du systegraveme en
cas de dommage
Un signal inducteur est lrsquoaugmentation de lrsquoADN simple brin qui active la syntese de recA
Lrsquoinitiation du syst se fait quant la prot recA se lie a la region simple brin de lrsquoADN
Elle change de conformation pour activer son action proteasique qui clive lexA le represseur
du systegraveme SOS
Le regulant lexA inclut des genes de recombinaison et de reparation recA recN uvrAB les
genes de reparation par excisionUVrD polyIV polyIIhellip
Une fois lex A est inactiveacutee 20 a30 prot sont induites qui sont essentielles pour le SOS
Rec A facilite le clivage de umuD pour donner la forme active qui est umuDrsquo qui possede une activiteacute polymerasique (poly5) qui joue un role critique ds la production de umuE qui est unepolymerase specialiseacutee qui fonctionne ds le ca de traitement de mutagenese
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
TD 2II MUTANTS DEacuteFICIENTS (AUXOTROPHES)Six clones dEcoli numeacuteroteacutes de 1 agrave 6 sont cultiveacutes sur milieu minimum MMadditionneacute de threacuteonine (Thr) leucine (Leu) Pheacutenylalanine (Phe) et cysteacuteine(Cys) puis repiqueacutes sur huit milieux minima MM diversement additionneacutes dun ou de plusieurs de ces quatre acides amineacutes comme indiqueacute sur la figure Les clones qui poussent sur les boicirctes de Peacutetri sont indiqueacutes par leurs numeacuteros
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Indiquer quels sont les pheacutenotypes qui correspondent agrave ces 6 clones
SolutionSur la boite contenant (MM + Thr+Cys+Leu+Phe) les six clones se deacuteveloppentCeci laisse supposer que ces clones ensemble ou chacun drsquoentre eux est peutecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1 acide amineacute deux trois ou tous lesquatre)Nous allons essayer de traiter clone par clone pour deacuteterminer leurs pheacutenotypescorrespondants chaque clone est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe (pour 1acide amineacute deux trois ou tous les quatre)
Clone ndeg1 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de la Cysteacuteine de la Leucine et de la Pheacutenylalanine (Il nrsquoest donc pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Or nous remarquons qursquoil se deacuteveloppe sur les autres milieux (en absence de la Thr)Ce clone est donc prototrophe Thr+ Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Clone ndeg2 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Thr Cela veut dire qursquoil est capable de pousser en absence de Cys Leu et Phe (Il nrsquoest pas donc auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Threacuteonine (Thr) pour sa croissance ou non Nous remarquons qursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les milieux ne contenant pas de ThrCe clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine Thr- Cys+ Leu+ Phe+
Clone ndeg3 Ce clone se deacuteveloppe sur le MM+Cys Cela veut dire qursquoil est capable depousser en absence de Thr Leu et Phe (donc Il nrsquoest pas auxotrophe pour ces trois derniers acides amineacutes)Il faut voir srsquoil exige la Cysteacuteine (Cys) pour sa croissance ou non On noteqursquoil ne se deacuteveloppe pas sur les autres milieux quand la cysteacuteine est absente1048766 Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine Thr+ Cys- Leu+ Phe+
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
Clone ndeg4 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se deacuteveloppe uniquement sur
MM + Thr + Leu et sur MM + Thr + Phe + Leu
Rien qursquoon nous basant sur ce reacutesultat nous pouvons deacuteduire facilement que ce clone nrsquoest
auxotrophe ni pour la Pheacutenylalanine (Phe) ni pour la Cysteacuteine (Cys)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Threacuteonine et la Leucine Thr- Cys+ Leu - Phe+
Clone ndeg5 Il est peut ecirctre prototrophe ou auxotrophe Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM
avec un seul acide amineacute Cela veut dire qursquoil exige au moins deux acides amineacutes diffeacuterents Il se
deacuteveloppe uniquement sur MM + Cys + Phe et sur MM + Cys + Phe + Leu
On nous basant sur le fait que ce clone pousse sur MM + Cys + Phe nous pouvons deacuteduire que
ce clone nrsquoest pas auxotrophe pour la Threacuteonine (Thr) ni pour la Leucine (Leu)
Ce clone est donc auxotrophe pour la Cysteacuteine et la Pheacutenylalanine
Thr + Cys - Leu + Phe -
Clone ndeg6 Ce clone ne se deacuteveloppe pas sur le MM avec un seul acide amineacute Cela
veut dire qursquoil exige deux ou trois acides amineacutes diffeacuterents
Autrement-dit il pourrait ecirctre Cys- Phe- Phe- Leu- Cys- Leu- ou Cys- Phe-Leu-
Veacuterification Sur MM+Cys+Phe il ne se deacuteveloppe pas sur MM+Phe+Leu il ne
se deacuteveloppe pas non plus mais nous nrsquoavons pas testeacute MM+Cys+Leu Il pourrait
donc ecirctre Cys- Leu- ou Cys- Phe- Leu-
1048766 Pour trancher il faut repiquer le clone ndeg6 sur un milieu minimum additionneacute
de Cysteacuteine et de Leucine
Srsquoil se deacuteveloppe crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe+ srsquoil ne se deacuteveloppe pas
crsquoest qursquoil est Thr+ Cys- Leu- Phe-
Les enzymes de restriction
Ce sont des endonucleacuteases capables de couper lrsquoADN double brin agrave des sites speacutecifiques de 4
agrave 6 paires de bases (parfois plus)
Les seacutequences reconnues comportent 4 agrave 10 nucleacuteotides et sont le plus souvent
palindromiques crsquoest-agrave-dire que le site de restriction preacutesente un centre de symeacutetrie ce qui fait
que la succession des nucleacuteotides est identique pour le brin sens et Antisens
Les enzymes de restriction sont isoleacutees le plus souvent de bacteacuteries Les bacteacuteries utilisent ces
enzymes pour se deacutefendre contre une invasion drsquoADN eacutetranger particuliegraverement drsquoorigine
virale
Le meacutecanisme de deacutefense des bacteacuteries vis-agrave-vis des virus est appeleacute systegraveme de
restriction-meacutethylation Pour deacutetruire lADN du parasite la bacteacuterie exprime des gegravenes de
restriction et de meacutethylation Les gegravenes de restriction permettent la synthegravese dendonucleacuteases
coupant lADN en des sites tregraves speacutecifiques Afin de proteacuteger lADN bacteacuterien de lhydrolyse par
lenzyme une meacutethylase codeacutee par le gegravene de meacutethylation va modifier les nucleacuteotides de lADN
bacteacuterien en les meacutethylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction
Exple La meacutethylation de lrsquoadeacutenine (repreacutesenteacutee sur le scheacutema associeacutee avec un cercle) aboutit agrave
une absence de reconnaissance de ce site speacutecifique par lrsquoenzyme Hind III et donc agrave une absence
de coupure enzymatique
5rsquo-Aring-A-G-C-T-T-3rsquo
3rsquo-T-T-C-G-A-Aring-5rsquo
La deacutecouverte des enzymes de restriction signe le deacutebut de lrsquoegravere du geacutenie geacuteneacutetique
En 1972 Lrsquoeacutequipe de Berg utilise lrsquoenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une moleacutecule
drsquoADN hybride qui contient agrave la fois lrsquoADN drsquoun virus et une forme alteacutereacutee drsquoun
bacteacuteriophage Crsquoest la premiegravere recombinaison geacuteneacutetique reacutealiseacutee in vitro
Le nom des enzymes correspond
- agrave lrsquoinitiale du genre auquel appartient la bacteacuterie pour la premiegravere lettre (en majuscule)
- suivie des deux premiegraveres lettres de lrsquoespegravece bacteacuterienne (en minuscule)
- la varieacuteteacute est deacutesigneacutee par une lettre ou un nombre
- le chiffre romain repreacutesente le numeacutero drsquoordre de deacutecouverte de lrsquoenzyme chez lrsquoespegravece
donneacutee
Exple Eco R1
Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes
- la coupure agrave extreacutemiteacutes franches dites aussi bouts francs la coupure a lieu au milieu du
palindrome
- la coupure agrave extreacutemiteacutes sortantes dites aussi coheacutesives on parle aussi de coupures
deacutecaleacutees la coupure a lieu de part et drsquoautre du centre de symeacutetrie
Ecriture du site de restriction il srsquoeacutecrit toujours dans le sens 5rsquo-3rsquo on peut lrsquoeacutecrire sous
forme simplifieacutee en eacutecrivant qursquoun seul brin par exemple GAATTC il faut ensuite reconstituer
lrsquoautre brin par compleacutementariteacute et son niveau de coupure gracircce au centre de symeacutetrie
5rsquoGAATTC3rsquo
3rsquoCTTAAG5rsquo
Les enzymes de restriction qui proviennent de deux souches bacteacuteriennes diffeacuterentes et qui
reconnaissent les mecircmes seacutequences sont appeleacutees isoschizomegraveres (ex Hae III et BsuR I)
iso = eacutegal et skizein = fendre
NB deux isoschizomegraveres ne catalysent pas obligatoirement le mecircme type de coupure
Conditions drsquoactiviteacute des enzymes de restriction
- Une uniteacute drsquoenzyme de restriction est la quantiteacute drsquoenzyme capable drsquohydrolyser
complegravetement 1 mg drsquoADN (ADN subtrats phage l SV40 T7hellip) en 1 heure dans des
conditions optimales de tempeacuterature pH et saliniteacute dans un volume de 50 mL
bull La reacuteaction geacuteneacuterale catalyseacutee par les enzymes de restriction implique la preacutesence
dans le milieu reacuteactionnel des facteurs suivants
mdash Enzyme (3121n)
mdash Substrat ADN double brin non digeacutereacute
mdash Produit ADN double brin digeacutereacute
mdash Cofacteurs
bull En geacuteneacuteral seul le Mg++ est indispensable Quelques endonucleacuteases font appel agrave
drsquoautres cofacteurs
Les enzymes de meacutethylation ont pour coenzyme la S-Adeacutenosyl-Meacutethionine (S-Ado-Met)
- La dureacutee drsquoincubation est fonction de la masse drsquoADN et du nombre drsquouniteacutes drsquoenzyme en
preacutesence Elle est geacuteneacuteralement de 1 agrave 2 heures Actuellement on a des enzymes plus rapides
frac12 heure drsquoaction
- Lrsquoenzyme est accompagneacutee du tampon drsquohydrolyse approprieacute concentreacute 10 fois
(10X)Plusieurs tampons sont fournis avec les enzymes de restriction les diffeacuterences portant
essentiellement sur la saliniteacute et sur le pH
- Tous les tampons contiennent du Mg2+ cofacteur des enzymes de restriction
- Les reacuteactions se font geacuteneacuteralement dans un volume de 10 - 20 mL sur des quantiteacutes drsquoADN
de 100 - 500 ng
- Lrsquoarrecirct de la digestion est reacutealiseacute soit par chauffage (10 minutes agrave 68degC) soit par addition
drsquoune solution de charge contenant du SDS etou de lrsquoEDTA
UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les utilisations des enzymes de restriction sont tregraves nombreuses en biologie moleacuteculaire Par
exemple elles permettent de fractionner lrsquoADN en multiples fragments susceptibles drsquoecirctre
seacutepareacutes par les techniques drsquoeacutelectrophoregravese Les enzymes de restriction peuvent ecirctre utiliseacutees
pour preacuteparer un fragment drsquoADN drsquoun gegravene donneacute (insert) agrave ecirctre inseacutereacute dans un vecteur comme
un plasmide Les enzymes de restriction sont utiliseacutees couramment pour rechercher des
mutations dans le geacutenome
Les enzymes de restriction sont largement utiliseacutees dans le domaine de la biologie
moleacuteculaire
- pour fabriquer des ADN recombineacutes crsquoest-agrave-dire des moleacutecules reacutesultant de la fusion de
diffeacuterents segments drsquoADN inteacutegration drsquoun gegravene drsquointeacuterecirct dans un vecteur geacuteneacutetique
hellip
- utilisation des sites de restriction comme marqueur sur lrsquoADN reacutealisation de
cartographies de restriction analyse de lrsquoADN pour la deacutetection de mutations qui se
traduisent par la disparition ou lrsquoapparition drsquoun site de restriction conduisant agrave une variation
de la longueur des fragments de restriction (polymorphisme de longueur des fragments de
restriction = RFLP = restriction fragments lenght polymorphisme) hellip
bull Lrsquoanalyse de la longueur des fragments de restriction agrave la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des
techniques drsquoanalyse de la seacutequence primaire de lrsquoADN agrave la recherche de substitutions
drsquoinsertions ou de deacuteleacutetions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur
des fragments de restriction
Vecteurs et transformation des cellules
Apregraves insertion drsquoune seacutequence drsquoADN particuliegravere dans un plasmide (qursquoon appelle aussi
vecteur) celui-ci peut ecirctre introduit dans une bacteacuterie (transformation) soit pour obtenir un
grand nombre drsquoexemplaire de cette seacutequence soit pour modifier le patrimoine geacuteneacutetique de la
bacteacuterie
Une des limitations de la transformation est que la bacteacuterie peut toleacuterer ou non la seacutequence
introduite et donc peut eacuteventuellement eacuteliminer le plasmide ou le modifier
Fig Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977) geacuteneacuteralement unplasmide contient une orgine de reacuteplication un ou plusieurs gegravenes de reacutesistance agrave des
antibiotiques (gegravenes de seacutelection ici ampiciline et teacutetracycline) et un grand nombre de site de restriction
Recombinaison geacuteneacutetique
Deacutefinition
bull La recombinaison implique un echange reciproque entre deux ADN
bull La recombinaison implique lrsquoeacutechange physique de reacutegions correspondantes dans des
moleacutecules drsquoADN
bull Crsquoest un processus genetique qui change un gene drsquoun etat a un autre
bull Dans le but drsquoavoir une nouvelle information genetique soit pour reparer un fragment
defectueux ou dans un but Evolutif (acquisition de nouveaux caracteres)
bull La recombinaison chez les bacteries est unidirectionnelle (du donneur au receveur)
bull LrsquoADN exogene est soit incorporeacute Lorsqursquoil a une sequence homologue a celle de la
cellule ce dernier est incorporeacute pour donner un genome recombinant soit degradeacute par
des nucleases dans un processus de restriction
bull Un fragment de materiel genetique est insereacute dans le chromosome par
lrsquoincorporation drsquoun simple brin
Raparation par recombinaison
La recombinaison intervient dans la cassure double brin drsquoADN
Elle se fait comme suit
1) Rec BCD repare lrsquoADN simple brin
2) Rec A se lie a lrsquoextremiteacute de lrsquoADN Sb et initie la recombinaison
3) Recombinaison
Rec BCD est une endonuclease
exonuclease 5rsquo-3rsquo
exonuclease 3rsquo-5rsquo
helicase
ATPase
Controcircle de la recombinaison
Si Rec A a muteacute pas de recombinaison
Si Rec BCD a muteacute peut etre remplaceacute par Rec Q (helicase) Rec J (exo 5rsquo-3rsquo) Rec F qui est un syst
de secours (syst rec FOR ou rec F)
La recombinaison homologue par RecA srsquoeffectue de deux maniegraveres
bull La voie RecBCD deacutependante
reacutepare lrsquoADN double brin par le complexe RecBCD
bull La voie Rec F deacutependante quant agrave elle traite
les bris simple brin par Rec FOR
Cette derniegravere voie nrsquoest en geacuteneacuteral requise que si Rec BCD est
absent lorsqursquoil srsquoagit drsquoeacutevegravenements autres que la reacuteactivation de fourche de reacuteplication
Recombinaison homologue
Cette recombinaison peut survenir entre des seacutequences largement homologues entre elles on
parle alors de recombinaison homologue
Il faut des seacutequences drsquohomologie
Exemple ATTTGGGGCCCC
TAAACACCGGTG
La recombinaison homologue dont les principales voies sont RecBCD et RecF
agit souvent comme meacutecanisme de reacuteparation des bris qui se produisent dans lrsquoADN mais
eacutegalement comme vecteur de la diversiteacute geacuteneacutetique
RecBCD reacutepare une rupture drsquoADN double brin alors que RecF reacutepare une rupture drsquoADN
simple brin
Lorsque ces systegravemes sont muteacutes la viabiliteacute des cellules srsquoen trouve fortement compromise
RECOMBINAISON site speacutecifique
Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits
deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo
se divise en une succession drsquoeacutetapes relativement simples qui impliquent au minimum deux
acteurs une recombinase et une paire des sites de recombinaison
Les paires de sites de recombinaisons sont geacuteneacuteralement identiques
elle peut survenir entre des seacutequences speacutecifiques relativement courtes et ayant une homologie
limiteacutee
Recombinaison illigitime
Se fait sans aucune sequence drsquohomologie
Recombinaison homologue
Pour reparer par recA
La bacterie peut acqueacuterir un ADN exogene par transformation issus de cellules lyseacutees
Pour qursquoune bacterie soit transformable
a) Chez E coliExistence de points chauds qui stimulent la recombinaisonCes sites ont une structure asymeacutetrique de 8pb
5rsquo GCTGGTGG 3rsquo3rsquo CGACCACC 5rsquoSeacutequence chi
seacutequence
Les sites chi sont la cible drsquoune enzyme codeacutee par les gegravenes RecBCDLe complexe RecBCD se fixe sur lrsquoADN du cocircteacute droit de chi se deacuteplace le long de lrsquoADN en le deacuteroulant (activiteacute heacutelicase) deacutegradation du simple brin qui possegravede lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo
Quand atteint la seacutequence Chi marque une pause dissociation ou inactivation de lrsquoactiviteacute nucleacuteasique (RecD)Rec A srsquoempare de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo simple brin libeacutereacutee et empecircche sa reacuteassociation avec le brin compleacutementairePuis Rec A permet la reconnaissance de la seacutequence homologue ainsi que sa deacutestabilisation
formation des heacuteteacuteroduplexes entre deux seacutequences homologuesPuis libeacuteration RecAMeacutecanismes drsquoachegravevement inconnus
EtapesLa recombinaison deacutebute par une coupure double brin par une endonucleacutease dans la moleacutecule drsquoADN dite receveuse
Puis eacutelargissement de la bregraveche par une exonucleacutease extreacutemiteacutes 3rsquoOH simple brin
TD3LE TRANSFERT DE MATERIEL
GENETIQUE
TRANSFERT DE MATERIEL GENETIQUE
bull Le transfert du mateacuteriel geacuteneacutetique se fait par diffeacuterents meacutecanismes
1-La transformation
Crsquoest le transfert drsquoun fragment drsquoADN drsquoune bacteacuterie donatrice libeacutereacute lors drsquoune lyse bacteacuterienne agrave une bacteacuterie reacuteceptrice
Transformation
Pour avoir une transformation il faut que la cellule soit competenteLa competence est un etat physiologique la bacterie de capter un ADN exogene qui se fait a un moment donneacute du cycle cellulaireLa transformation se fait en 2 etapesCompetenceRecombinaison homologue
1-La transformation
bull bacteacuterie reacuteceptrice doit ecirctre dans un eacutetat reacuteceptif ditde compeacutetence (preacutesence de reacutecepteurs speacutecifiquesde lrsquoADN agrave la surface bacteacuterienne)
1-La transformation
bull Inteacutegration de lrsquoADN dans le chromosome de la reacuteceptrice parrecombinaison homologue
bull meacutecanisme drsquoexcision puis inteacutegration par substitution de lazone homologue
1-La transformation
bull Lrsquoeacutechange se fait entre
ndash bacteacuteries de mecircme espegravece
ndash espegraveces apparenteacutees
(homologies de seacutequence neacutecessaires)
1-La transformationExpeacuterience de Griffith
1-La transformation
bull Ex pneumocoque
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages ou phages
Virus speacutecifiques des bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Peuvent se multiplier dans la cellule phage virulent
bull puis sortir en provoquant sa lyse Cycle lytique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Certains srsquointegravegrent dans le geacutenome sousune forme stable prophage
bull Ils se reacutepliquent avec le chromosome Lysogeacutenie
bull Un prophage peut exprimer une partiede ces gegravenes et ainsi modifier lepheacutenotype de la cellule
la reacutecombinaison site-speacutecifique Elle se fait par lrsquoinclusion strictement speacutecifique des petits fragments de lrsquoADN dans les endroits deacutetermineacutes appeacuteleacutes laquo les sites du chromosome-reacutecipient raquo Crsquoest ainsi que par exemple qursquoun phage modeacutereacute entre dans le site speacutecifique du chromosome bacteacuterien et la bacteacuterie devient lysogeacuteniseacutee Cette bacteacuterie portera un phage inactif ou un prophage Crsquoest le pheacutenomegravene de la lysogeacutenie Les bacteacuteries lysogegravenes acqueacuterissent de nouveaux caractegraveres elles sont stables agrave la reacuteinfection par le mecircme phage (crsquoest lrsquoimmuniteacute) les bacteacuteries de la diphteacuterie lysogegravenes forment lrsquoexotoxine qui est codeacutee par un gegravene phagique tox Crsquoest le pheacutenomegravene de la conversion lysogegravene phagique
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
bull Un prophage peut setransformer en un phagevirulent lyse de la cellule
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
Les Bacteacuteriophages
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
La transduction
Le prophage
Stimulus (ex augmentation de la tempeacuterature)
Phage virulent
Reacuteplication
lyse de la bacteacuterie qui lrsquoheacutebergeait+- introduction de fragments drsquoADN
bacteacuteriens dans des particules virales
introduction de ces fragments dans drsquoautres bacteacuteries
2- Transferts utilisant des bacteacuteriophages la transduction
3- La conjugaison
bull Meacutecanisme le plus freacutequent dans la nature
bull Il permet agrave une bacteacuterie de recevoir une moleacuteculedrsquoADN drsquoune autre bacteacuterie suite agrave un contact entredonatrice et reacuteceptrice
3- La conjugaison
bull La conjugaison se fait entre
ndash les bacteacuteries de la mecircme espegravece +++
ndash des espegraveces diffeacuterentes
3- La conjugaison
bull Cet appariement met en jeu
ndash des pili sexuels chez les Gram-
ndash des adheacutesines chez les Gram+
ndash zones de contact agrave la surface des bacteacuteries reacuteceptrices
bull Les pili se contractent pour favoriser le rapprochement
bull Des ponts cytoplasmiques vont permettre le passage de lrsquoADN de la donatrice vers la reacuteceptrice
bull Etats physiologiques du facteur F
bull a Autonome (F+)
Dans cet eacutetat le facteur F porte seulement les gegravenes neacutecessaires pour sa reacuteplication et pour le
transfert drsquoADN
bull Lors de croisements entre les types F+ et F- le F- devient F+ alors que le F+ reste F+
b Inteacutegreacute (Hfr)
Dans cet eacutetat le facteur F est inteacutegreacute dans le chromosome bacteacuterien via un eacutevegravenement de
recombinaison
bull Lors de croissements entre les types Hfr et F- le F- devient rarement Hfr et Hfr reste Hfr
3 Meacutecanisme de conjugaison
Transfert drsquoADN
bull
LrsquoADN plasmidique est entailleacute agrave un site speacutecifique appeleacute origine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de laquo cercle roulant raquo Un ADN simple brin passe dans le pont de conjugaison et entre dans le receveur ougrave le second brin est syntheacutetiseacute
bull Ce processus explique les caracteacuteristiques du croisement F+ x F- Le receveur devient F+ le donneur reste F+
bull Croisement Hfr x F-
bull ii) Transfert drsquoADN
LrsquoADN est entailleacute au niveau de lrsquoorigine de transfert et est reacutepliqueacute par un meacutecanisme de
cercle roulant Mais lrsquoADN qui est transfeacutereacute est le chromosome En fonction drsquoougrave le facteur F
srsquoest inteacutegreacute dans le chromosome et de son orientation diffeacuterents gegravenes chromosomiques
seront transfeacutereacutes agrave diffeacuterents moments Cependant lrsquoordre et les distances relatives des
gegravenes resteront toujours les mecircmes Crsquoest seulement quand lrsquoensemble du chromosome est
transfeacutereacute que le facteur F est transfeacutereacute Puisque des forces de cisaillement seacuteparent les
couples apparieacutes il est rare que lrsquoensemble du chromosome soit transfeacutereacute Ainsi le receveur
ne reccediloit pas le facteur F lors drsquoun croisement Hfr x F-
bull 4 Signification
bull Puisque la cellule receveuse devient un donneur apregraves transfert drsquoun plasmide il est aiseacute de
voir pourquoi un gegravene de reacutesistance aux antibiotiques porteacute sur un plasmide peut
rapidement convertir une population de cellules sensibles en une population reacutesistante
TD 4
III CONJUGAISON INTERROMPUE
On meacutelange une souche dEcoli K12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ) pouvoir
de syntheacutetiser la threacuteonine et la leucine (T1s) sensible au phage T1 (Lac+)
fermentant le lactose (Gal +) fermentant le galactose (Strs) streptomycine
sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-) (T1r) (Lac-) (Gal-) et
(Strr) On interrompt la conjugaison aux temps indiqueacutes ci-contre et on eacutetale pour
chaque temps des eacutechantillons sur des milieux qui permettent de cribler les
recombinants Les reacutesultats sont
10 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r)
15 mn (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s)
20 mn (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s)
28 mn (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s)
Deacuteterminez lordre des gegravenes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s)
Les expeacuteriences de conjugaison interrompue permettent deacutetablir la carte geacuteneacutetiquede la bacteacuterie
Principe On reacutealise un croisement (conjugaison) entre une souche bacteacuterienne Hfr StrS a+ b+ c+ d + et une souche F- Strr a - b - c - d ndash
On preacutelegraveve des eacutechantillons agrave des intervalles de temps deacutetermineacutes
Lagitation violente du milieu permet drsquointerrompre le transfert geacuteneacutetique entre les deux souches(donatrice et reacuteceptrice)
Chaque eacutechantillon est mis en culture dans un milieu speacutecifique appeleacute milieu de criblageUn milieu de criblage est un milieu qui permet la seacutelection des recombinants outrans-conjugants (reacuteceptrice ayant reccedilu du mateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice)
Les eacutechantillons sont placeacutes sur 5 milieux diffeacuterents suppleacutementeacutes chacun avec desmeacutelanges de substances diffeacuterentesun milieu sans A mais avec B C et D permet la croissance des cellules qui aurontinteacutegreacute le gegravene a+ un milieu sans B mais avec A C et D permet la croissance des cellules ayant inteacutegreacutele gegravene b+
Dans notre expeacuterience nous avons travailleacute avec les souches ci-dessous Nous avons deacutefini les recombinants comme eacutetant des reacuteceptrices ayant reccedilu dumateacuteriel geacuteneacutetique de la donatrice Par conseacutequent les geacutenotypes des recombinantsvont correspondre agrave celui de la reacuteceptrice avec lrsquoacquisition drsquoun ou de plusieurscaractegraveres de la donatrice1048766 Apregraves 10 minutes de contact entre la donatrice et la reacuteceptrice la reacuteceptricea reccedilu les gegravenes (T+L+)
1048766 Apregraves 15 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) et le gegravene (T1s)1048766 Apregraves 20 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) et le gegravene (Lac+)1048766 Apregraves 28 min elle a reccedilu les gegravenes (T+L+) le gegravene (T1s) le gegravene (Lac+) etle gegravene (Gal+)Lrsquoordre des gegravenes est le suivant
IV- TRANSPOSONS ET TRANSPOSITION
Historique
Lrsquoexistence drsquoelements genetiques mobiles a ete mise en evidence pour la premiere
fois en 1948 par Barbara Mac Clintock au cours de ses travaux de genetique sur le
mais La mobilite drsquoelements particuliers qursquoelle appela les ≪ controlling elements≫
etait a lrsquoorigine drsquoinstabilites genetiques conduisant a des variations de pigmentation
de grains de mais (McClintock 1948 McClintock 1962) Ces travaux qui ont demontre
la nature dynamique des genomes lui ont valu le prix Nobel en 1983
Eleacutements geacuteneacutetiques transposables
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables sont des segments drsquoADN qui ont la capaciteacute de bouger agrave partir drsquoune position agrave une autre
bull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables peuvent bouger de nrsquoimporte quelle moleacutecule drsquoADN agrave une autre moleacutecule drsquoADN (Intermoleacuteculaire) ou mecircme agrave un autre endroit de la mecircme moleacutecule (intramoleacuteculaire)
Donc Xme vers meme Xme ou bien Xme vers plasmide
bull Le mouvement nrsquoest pas totalement aleacuteatoire il y a des sites de preacutefeacuterence dans la moleacutecule drsquoADN auxquels les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables vont srsquoinseacuterer
Incapable drsquoautoreacuteplicationbull Les eacuteleacutements geacuteneacutetiques transposables nrsquoexistent pas de maniegravere
autonome et ainsi pour ecirctre reacutepliqueacutes ils doivent faire partie drsquoun autre reacuteplicon
Trois familles drsquoeacuteleacutements transposables (capables drsquoecirctre transfeacutereacutes drsquoun site donneur vers un
site cible sous lrsquoeffet drsquoune enzyme de recombinaison speacutecialiseacutee ou recombinase)
Seacutequences drsquoinsertion (IS)
sont les eacuteleacutements transposables les plus simples
Elles ne contiennent que les informations geacuteneacutetiques neacutecessaires agrave leur transposition
De petite taille (geacuteneacuteralement infeacuterieure agrave 2 500 pb)
elles sont le plus souvent bordeacutees par des seacutequences IR (inversement reacutepeacuteteacutees) de 20 agrave 40 pb
qui sont reconnues par la machinerie de transposition
Seul le chromosome seacutequenceacute de Bacillus subtilis nrsquoa reacuteveacuteleacute aucune IS
Les seacutequences drsquoinsertion sont appeleacutees IS suivi drsquoun numeacutero ex IS1
La SI code pour la transposase lrsquoenzyme qui catalyse la transposition et proteacuteine de reacutegulation
Entre les seacutequences reacutepeacuteteacutees terminales se trouvent des gegravenes
impliqueacutes dans la transposition et des seacutequences qui controcirclent
lrsquoexpression de ces gegravenes mais aucun autre gegravene non essentiel nrsquoest
preacutesent
Les SI sont les plus simples composeacutees de
Seacutequences inverseacutees terminales
Ne contiennent que des gegravenes de transposition
Donc IS= SRI et gegravenes de transposition
2) Transposon composite
Composeacute de 2 SI identiques flanquant un ou plusieurs genes accessoirs ( resistance
virulence toxinehellip) avec des genes necessaires pour la transposition
Donc SI+ genes accessoires
Les IS peuvent ecirctre en orientation directe ou inverse
Tregraves souvent seule lrsquoune des deux IS du transposon code pour une transposase
fonctionnelle lrsquoautre codant souvent pour un reacutegulateur de la transposition
Le segment drsquoADN encadreacute par les IS nrsquointervient pas dans la transposition et peut
coder pour nrsquoimporte quelle fonction
ces transposons qui portant des reacutesistances aux antibiotiques sont un facteur majeur du
deacuteveloppement de plasmides qui peuvent confeacuterer une reacutesistance multiple agrave la bacteacuterie
qui porte un tel plasmide
Ces plasmides de reacutesistance multiple sont devenus un problegraveme meacutedical majeur agrave cause
de lrsquoutilisation agrave tort et agrave travers des antibiotiques et ont confeacutereacute un avantage seacutelectif
pour les bacteacuteries portant ces plasmides
3) Transposons non composites
Les transposons non composites se caracteacuterisent par lrsquoabsence drsquoIR agrave leurs extreacutemiteacutes
La plupart drsquoentre eux sont apparenteacutes par leur transposase et par leurs seacutequences
terminales de 35 agrave 48 pb reacutepeacuteteacutees en orientation inverse et reconnues par la
transposase
Ces transposons ont des tailles variables (jusqursquoagrave 70 kb dans le cas de Tn4651)
Ils contiennent des informations geacuteneacutetiques essentielles agrave la transposition et des
informations dites laquo auxiliaires raquo qui peuvent ecirctre des gegravenes cataboliques (Tn4651) ou
des gegravenes de reacutesistance aux antibiotiques
La plupart de ces eacuteleacutements codent pour une transposase (TnpA) et une
reacutesolvaseinvertases (TnpR)
Donc
2 sequences inverseacutees repeteacutees + Genes de transposition + Genes accessoirs
Donc SRI+ genes de transposition+ genes accessoires
Transposon non composite
bull Leur classification est baseacutee sur la reacutesolvase (TnpR) par rapport agrave celui de la transposase
(TnpA) Ils sont soit conseacutecutifs et non interrompu par le site res ougrave agit la reacutesolvase qui
permettra de terminer la reacuteaction en catalysant une eacutetape de recombinaison agrave un site
speacutecifique (res)
4) Transposon complexe
Cas de bacteacuteriophage qui utilise ce pheacutenomegravene dans son cycle
LES SI sont de petits elements de 07 a 25 kb
SRI sont localiseacutees a lrsquoextremiteacute du transposon de 15 a 20 kb
Transposition
Dans de nombreux cas la transposition drsquoun eacuteleacutement geacuteneacutetique transposable reacutesulte en le retrait
de lrsquoeacuteleacutement de son site drsquoorigine et en lrsquoinsertion dans un nouveau site Cependant dans certains
lrsquoeacutevegravenement de transposition est accompagneacute drsquoune duplication de lrsquoeacuteleacutement geacuteneacutetique
transposable Une copie reste au site drsquoorigine et lrsquoautre est transposeacutee au nouveau site
Les meacutecanismes de transposition
Trois types de recombinases ont eacuteteacute deacutefinis en fonction de leur activiteacute enzymatique les
transposases les inteacutegrases et les reacutesolvasesinvertases Ces recombinases deacuteterminent le
meacutecanisme de la transposition qui peut se faire par excisioninteacutegration ecirctre conservative ou
opeacuterer de faccedilon reacuteplicative
bull Lrsquoexcisioninteacutegration
ne fait intervenir aucune synthegravese drsquoADN et est en ce sens un mode de transposition
conservatif Elle opegravere en deux eacutetapes indeacutependantes catalyseacutees par la mecircme recombinase
lrsquointeacutegrase
Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoeacuteleacutement transposable srsquoexcise du reacuteplicon donneur sous la
forme drsquoun intermeacutediaire circulaire reacutesultant de la liaison covalente des deux extreacutemiteacutes
tandis que le reacuteplicon donneur est reacutepareacute par ligature des fragments de jonctions Lrsquointeacutegration
quant agrave elle correspond au processus inverse de lrsquoexcision
Transposition reacuteplicative
La transposase introduit une coupure simple brin au niveau des jonctions transposonreacuteplicon
donneur Comme preacuteceacutedemment les extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de lrsquoeacuteleacutement attaquent et clivent le site
cible en engendrant des extreacutemiteacutes 5rsquo sortantes et se lient agrave ces derniegraveres La structure
qui en reacutesulte est le complexe de transfert de brin ou STC (pour strand transfer complex) Une
reacuteplication semi-conservative initieacutee aux extreacutemiteacutes 3rsquo-OH de la cible se propage agrave travers le
transposon engendrant un co-inteacutegrat qui contient une duplication du site cible La reacutesolution
du co-inteacutegrat laisse une copie du transposon sur le reacuteplicon donneur et lrsquoautre flanqueacutee de la
duplication sur le reacuteplicon cible
Merci de votre attention
Opeacuteron
Pourquoi il y a reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes
Pour reacutepondre aux conditions changeantes immeacutediat de lrsquoenvironnement
La question poseacutee est celle du choix des portions du geacutenome devant ecirctre exprimeacutees agrave un
moment donneacute dans un environnement donneacute
12 Qursquoest-ce-que la REGULATION GENETIQUE
Un moyen pour developper des mecanismes qui lui permettent de reprimer les genes qui
codent pour des proteines inutiles et de les activer au moment ou elles deviennent necessaires
Sites possibles de Reacutegulation des Gegravenes chez les bacteacuteries
Sept meacutecanismes susceptibles de modifier la concentration a lrsquoequilibre drsquoune proteine
1- synthegravese du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de lrsquoARNm
3- deacutegradation de lrsquoARNm
4- synthegravese proteacuteique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des proteines
7- deacutegradation des proteacuteines
Quelques deacutefinitions
Facteur de transcription proteacuteine de reacutegulation transcriptionnelle
Activateur proteacuteine qui stimule lrsquoinitiation de la transcription favorise lrsquoexpression drsquoun gegravene
Reacutepresseur proteacuteine qui inhibe la transcription et empecircche lrsquoexpression drsquoun gegravene
Opeacuterateur site cible de la proteacuteine reacutepresseur (souvent proche du site drsquoinitiation de la
transcription)
Gene de structure code une proteine structurale une enzyme ou une proteine regulatrice
Gene de regulation code une proteine impliquee dans la regulation drsquoexpression drsquoautre gene
Operon
ensemble de genes qui dependent drsquoun meme promoteur (regulateur)
Les genes de lrsquooperon donne naissance a un ARN polycistronique (code pour plusieurs proteines)
La regulation se fait sur lrsquooperateur qui est une sequence interne du promoteur
Lrsquooperateur est le site de liaison de lrsquoinhibiteur
Operon lactose
C un operon inductible (il faut lrsquoinduire pour lrsquoactiver)
Operon lactose est constitueacute drsquoun promoteur un operateur et 3 genes (lac Z lac Y et lac A)
Lac Z code pour la B-galactosidase( catalyse le clivage du lactose en glu et gala)
Lac Y pour permease(responsable du transport du lactose ds la cellule)
Lac A pr transacetylase
En presance du lactose les 3 genes srsquoexpriment Donc c lrsquoinducteur de lrsquooperon
Exple
En presance du glucose et lactose lrsquooperon lactose nrsquoest pas induit
Cet operon code pour
