Contribución del Laboratorio al diagnóstico de la Hemocromatosis Hereditaria

Nazareth del Amo del ArcoQIR 4º año. Bioquímica Clínica

INDICE

INTRODUCCIÓN y ANTECEDENTES

METABOLISMO DEL HIERRO

FISIOPATOLOGÍA HFE

DIAGNÓSTICO

TRATAMIENTO Y PRONÓSTICO

INTRODUCCIÓN

La hemocromatosis hereditaria tipo 1 es un trastorno común del metabolismo del hierro que afecta a 1 de cada 200 a 400 individuos (0.25%-0.50%) de origen nórdico o céltico

Se caracteriza por un incremento en la absorción intestinal de hierro con depósito de éste en órganos (hígado, corazón y páncreas)

INTRODUCCIÓN

El exceso de hierro induce daño tisular con fibrosis e insuficiencia funcional que puede ocasionar cirrosis y hepatocarnicoma, diabetesmellitus, miocardiopatía, artropatía, hipogonadismo e hiperpigmentacióncutánea

1865 1935 1970 1980 1996

Trousseau Sheldon Simon et al Freder et al

Primer caso de HH Herencia AR¿Gen?

Gen HFE

ANTECEDENTES

Importancia y justificación

Las mutaciones del gen HFE son comunes y pueden originar daño irreversible a órganos

Tratamiento temprano previene el daño a los órganos

Importancia de distinguir la sobrecarga de Fe debida a la HH de sobrecargas observadas en otras patologías

Clasificación de las sobrecargas de Fe

SOBRECARGA DE Fe ADQUIRIDAS

• Anemias con sobrecarga de Fe

Talasemia mayor

A. Sideroblástica

A. Hemolítica crónica

•Sobrecarga transfusional

•Sobrecarga dietética

•Hepatopatías crónicas

Hepatitis C

Hepatopatía alcohólica

Esteatohepatitis no alcohólica

Porfiria cutánea tarda

OTROS

•Deficiencia dehemooxigenasa

•Sobrecarga de Fe neonatal

•Aceruloplasminemia

•A- o Hipotransferrinemiacongénita

•Variantes de DMT1

HEMOCROMATOSIS HEREDITARIAS

•Asociada al gen HFE (Tipo 1)

Homocigosis C282Y

Heterocigosis compuesta C282Y/H63D

•No asociada al gen HFE

Tipo 2 A HH Juvenil. Mutación HJV

Tipo 2 B HH Juvenil. Mutación HAMP

Tipo 3 Mutación TfR2

Tipo 4 Mutación Ferroportina

Tipo 5 Mutación Ferritina

Clasificación de las sobrecargas de Fe

CC GG (187)(187) H63D

5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtggatgaccagctgttcgtgttctatgatCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’

GG AA (845)(845) C282Y

5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatatacgtGccaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'

Frecuencia de mutaciones del gen HFE entre 1076 pacientes con HH

6%1%3%3.5%2%84%TOTAL (1076)

21%1%4%7%3%60%CARELLA, ITALIA

9%2%9%4%4%72%BOROT, FRANCIA

01.5%3%5%091%JOUANOLLE, FRANCIA

1%1%1%4%1%93%CARDOSO, SUECIA

4%1%03%1%91%CONSORTIUM, R. UNIDO

00000100%JAZKINSKA, AUSTRALIA

4%0002%95%ADAMS, CANADA

8%4%8%4%15%60%BARTON, EE.UU

7%1.5%3%6%1.5%82%BEUTTLER, EE.UU

7%0.6%4%4%0.6%83%FEDER, EE.UU

-/-H63D/ H63DH63D/-C282Y/H63DC282Y/-C282Y/ C282Y

INDICE

INTRODUCCIÓN y ANTECEDENTESMETABOLISMO DEL FeFISIOPATOLOGÍA HFEDIAGNÓSTICOTRATAMIENTO Y PRONÓSTICO

Fe: elemento esencial vs tóxico

Esencial para transporte electrónico y metabolismo celular

• Fe2+/Fe3+: Capacidad dadora/aceptora de electrones. Crucial para el funcionamiento de hemoglobina y mioglobina, enzimas de citocromo de mitocondria.

• Cluster Fe-S

Formación de radicales libres• Fe2+ + H2O2 Fe3+ + 2OH . (R. De Fenton)• Daña la membrana celular, proteínas y ADN

Distribución

HFE/TFR1TFR2HJV

Metabolismo del Fe: 4 puntos clave

ENTEROCITO PRECURSOR ERITROIDE

HEPATOCITOMACRÓFAGO

DMT1HEMOOXIGENASAFERROPORTINA

TrF1

HEMOOXIGENASA

INDICE

INTRODUCCIÓNANTECEDENTES

FISIOPATOLOGÍA DE LA PROTEÍNA HFEDIAGNÓSTICOTRATAMIENTO Y PRONÓSTICO

FISIOPATOLOGÍA DE LA PROTEÍNA HFE

La proteína HFE estácompuesta por:

• 3 dominios α(extracelulares), uno de los cuales (α3) se acopla a la β2–microglobulina

• Región transmembrana

• Cola citoplasmática

¿Mecanismo?

“MODELO DE LA CRIPTA”

Mutación C282Y:Impide la unión de la beta-2-microglobulina a la proteína HFE por la rotura del enlace disulfuro, esta no puede ser transferida a la membrana plasmática basolateral y queda en el citosol, pudiendo impedir la captación del Fe circulante mediada por los TfR en las células de las criptas y así dar una falsa señal de que los depósitos de Fe están bajos; así aumentaría la producción de DMT1 en los enterocitos de las vellosidades, captándose más Fe

“MODELO DE LA HEPCIDINA”

Péptido secretado por el hígado

Conocimiento limitado de los mecanismos que regulan la producción y secreción de hepcidina en el hepatocito. El gen de la hepcidina (HAMP), localizado en el cromosoma 19q13.1, codifica para una proteína de 64 aminoácidos. La producción y localización de su precursor (pre-prohepcidina )en los hepatocitos se supone intracelular

La hepcidina ejerce su papel regulador inhibiendo la ferroportina (enzima transmembrana que transporta Fe en enterocitos y macrófagos)

Pre- prohepcidina prohepcidina hepcidina

- 24 aa - 33 aa

25 aa

REGULACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE Fe: “MODELO DE LA HEPCIDINA”

Ferroportina

La expresión de la hepcidina está regulada por: la concentración de Fe en los hepatocitos ( ) estímulo de inflamación, demanda de Fe por los eritrocitos e hipoxia Un incremento en la producción de hepcidina conduce a una disminución de la concentración plasmática de Fe (por inhibición de la ferroportina)

ACUMULACIÓN DE Fe

REGULACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE Fe: “MODELO DE LA HEPCIDINA” II

MUTACIÓN HFE

En las HH relacionadas con los genes HFE, TRF2 y HJV, la producción de hepcidina está disminuida, la ferroportina no sufre inhibición, a pesar del hierro hepático elevado, ocasionando una absorción de Fe inapropiada. De esta forma mediante el control de la síntesis de hepcidina, HFE estámuy implicado en la homesostasis de Fe.

INDICE

INTRODUCCIÓNANTECEDENTESFISIOPATOLOGÍA DE HFE

DIAGNÓSTICOTRATAMIENTO Y PRONÓSTICO

DIAGNÓSTICO

Manifestaciones clínicasAnálisis bioquímicoEstudio genéticoBiopsia hepáticaAlgoritmo diagnóstico

Manifestaciones clínicas

Poco específicas y tardías (hacia la 5ª década)

Astenia. Síntoma inicialArtropatía: (25-50)% casos. Depósito de cristales de pirofostato cálcicoDMHiperpigmentación cutánea: 70% casosCirrosis. Primer órgano afectado, aunque mantiene su funcionalidad hasta fases muy avanzadas. Mayor susceptibilidadMiocardiopatía: 30% casos. IC y/o arritmias por depósito de Fe en el miocardioHipogonadismo: Descenso de LH, FSH y testosterona. Impotencia en estado cirrótico (40%)

Análisis bioquímico (I)

Saturación de la transferrina (IST): Manifestación fenotípica más temprana de la HH. Sensible

[ Fe sérico (µmol/L) / CF Trf (µmol Fe/L) ] x 100

CF Trf (µmol Fe/L) = Trf (g/L) x 25.1

• Punto de corte: Controversia

• IST 45% S: 98% en identificación de homocigotos C282Y y 22% para heterocigotos

• IST 60% S: (79-86)%

• IST <45% Mínima mejora de sensibilidad. Descenso de especificidad y VPP

Análisis bioquímico (II)

Análisis bioquímico (II)

Ferritina: Reflejo de los depósitos de Fe del organismo. Poco específico

• Sexo y edad• Consumo de alcohol• Reactante de fase aguda • Punto de corte: 300 ng/ml H y 200 ng/ml M• Valores superiores a 1000 ng/ml necesaria biopsia

hepática para detectar si existe fibrosis

Hierro sérico: Poca sensibilidad y especificidad

Estudio genético

•• Solo los genotipos: C282Y/ C282Y y Solo los genotipos: C282Y/ C282Y y C282Y/H63D deben considerarse indicativos de C282Y/H63D deben considerarse indicativos de

HHHH

6%1%3%3.5%2%84%TOTAL (1076)

21%1%4%7%3%60%CARELLA, ITALIA

9%2%9%4%4%72%BOROT, FRANCIA

01.5%3%5%091%JOUANOLLE, FRANCIA

1%1%1%4%1%93%CARDOSO, SUECIA

4%1%03%1%91%CONSORTIUM, R. UNIDO

00000100%JAZKINSKA, AUSTRALIA

4%0002%95%ADAMS, CANADA

8%4%8%4%15%60%BARTON, EE.UU

7%1.5%3%6%1.5%82%BEUTTLER, EE.UU

7%0.6%4%4%0.6%83%FEDER, EE.UU

-/-H63D/ H63DH63D/-C282Y/H63DC282Y/-C282Y/ C282Y

Estudio genético : PROCEDIMIENTO

RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphims)

1. EXTRACCIÓN ADN

2 Tubos con EDTA-K2

Volumen: 6 mlEspécimen: SangrePruebas asociadas: ESTUDIO DEL GEN HFE

ObtenciObtencióón ADN: KIT FLEXIGENE DNAn ADN: KIT FLEXIGENE DNABuffer de lisis: Rotura de membrana nuclearBuffer de lisis: Rotura de membrana nuclearBuffer desnaturalizaciBuffer desnaturalizacióón: Eliminar proten: Eliminar proteíínasnas

Precipitación de ADN con isopropanol

Cuantificación: Absorción a 260 nm

2. AMPLIFICACIÓN: PCR

DNA Polimerasa

Mg++

dNTP (A, T, C, G)

CebadoresDNA molde

REQUERIMIENTOS DE LA PCR

HFEHFE2,7 2,7 KbKb

CC GG (187)(187) H63D

5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtggatgaccagctgttcgtgttctatgatCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’

GG AA (845)(845) C282Y

5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatatacgtGccaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'

EXON EXON EXON EXON EXON EXON EXON1 2 3 4 5 76

210 pb 390 pb

3. DIGESTION: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Detectan la presencia o ausencia de un cambio de base por reconocimiento de una secuencia

específica

GATCCTAG

H63D

G T A C

C A T G

C282Y

5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtgg

atgaccagctgttcgtgttctatGATCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’

CC GG (187)(187) H63D

5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtgg

atgaccagctgttcgtgttctatGATGatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’

ALELO NORMAL: Enzima reconoce secuencia y corta2 fragmentos

ALELO MUTADO: Enzima NO reconoce secuencia y NO corta.Secuencia intacta

5’....acatggttaaggcctgttgctctgtctccaggttcacactctctgcactacctcttcatgggtgcctcagagcaggaccttggtctttccttgtttgaagctttgggctacgtggatgaccagctgttcgtgttctatG

ATCatgagagtcgccgtgtggagccccgaactccatgggtttccagtagaatttcaagccagatgtggc....3’

308 pb

138 pb

70 pb

5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagtacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctgg

ataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatataCGTGCcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'

ALELO NORMAL: Enzima NO reconoce secuencia y NO corta.

Sin embargo existe otro lugar de restricción...

5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgt

247 pb

acagggtaaacagatccctctcctcatatggatgccaaggagtcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatat

aCGTGCcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'

250 pb

C282Y

RsaI

G T A C

GG AA (845)(845) C282Y

5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgtacttgcccaatggggatgggacctaccagggctgg

ataaccttggctgtaccccctggggaagagcagagatataCGTACcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'

ALELO MUTADO: Enzima reconoce secuencia y corta: 3 fragmentos

acagggtaaacagatccctctcctcatatggatgccaaggagtcgaacctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctgtaccc

cctggggaagagcagagatataCGT

ACcaggtggagcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggggttgagaggagtgcctgag....3'

5'....tggcaagggtaaacagatccctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgcctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttcagtgaccactctacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaacctaaagacgt

247 pb

140 pb 110 pb

4. OBTENCIÓN DE RESULTADOS: ELECTROFORESIS

C282Y H63D

Marcador PM

247-250 pb

140 pb110 pb

138 pb

70 pb

Cribado familiar

• Una vez diagnosticado el individuo, es necesario el cribado familiar y estárecomendado para familiares de primer grado

• Cónyuge: 33% probabilidad de ser portador de mutación

• Si negativo Fin. Hijos sólo serán portadores heterocigotos

• Si positivo-> Estudio genético a hijos

Cribado poblacional

HH cumple varios de los criterios de los que la OMS establece necesarios para realizar cribado poblacional:• Fase latente reconocida• Conocimiento de la historia de

la condición, incluyendo su evolución de enfermedad latente a declarada

• Disponibilidad de test de cribado fiable

• Aceptación del test por parte de la población

• Política de a quién tratar aceptada

• Ser coste/afectivo

• Baja penetrancia y prevalencia de la mutación en ciertas etnias

• ¿Métodos de cribado y protocolos a utilizar?

CONTROVERTIDO

Prevalencia de los genotipos que predisponen a HH tipo 1 es muy alta

1% Presenta genotipo compatible1‰ Homocigotos C282Y

Penetrancia bioquímica alta

>90% Homocigotos C282Y presentan IST y/o Ferritina alterados

Penetrancia clínica baja (valorada como presentación de cirrosis hepática a lo largo de los años)

10% aprox Homocigotos C282Y1% Resto de genotipos

PREVALENCIA Y PENETRANCIA DE HH TIPO 1

Biopsia hepática

Gold standard para el diagnóstico de fibrosis hepática

Debe considerarse en adición al estudio genético positivoen pacientes que cumplen alguno de los criterios:

• Ferritina > 1000 µg/L• Edad > 40 años• Hepatomegalia• Tests de función hepática alterados

Además de la cuantificación de hierro hepático

Cuantificación del Fe hepático

DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA

• Tinción de Perls´: Establecimiento de la distribución celular de Fe con azul de Prusia

• Hasta 1985 método de elección.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA

• EAA

Coloración para hierro -Azul de Prusia (400x). Los gránulos gruesos de hemosiderina se tiñen

de azul oscuro

Aplicación clínica en el diagnóstico de HH limitada por la aparición de nuevas técnicas (RM)

MUESTRA: Cilindro de biopsia hepática obtenido por PAAF. Peso mínimo (tejido seco): 0,0010 g . Conservación: -20 ºC

PROCEDIMIENTO: Secado e hidrólisis del tejido hepático. Determinación por espectrofotometría de absorción atómica de llama.

RESULTADOS: µg Fe/g.t.s.

Cuantificación de Fe: EAA

CONDICIONESλ: 248.3 nmRendija: 0,2Llama: Aire/AcetilenoTª: 2000-3000 K

INDICE DE Fe HEPINDICE DE Fe HEPÁÁTICO (IHH)TICO (IHH)

HOMOCIGOTOS IHH > 1.9

HETEROCIGOTOS y otras sobrecargas secundarias de Fe IHH < 1.5

Fe hepático (µmol/g.t.s.)/ Edad

Algoritmo diagnóstico

INDICE

INTRODUCCIÓNANTECEDENTESFISIOPATOLOGÍA HFEDIAGNÓSTICO

TRATAMIENTO Y PRONÓSTICO

TRATAMIENTO y PRONÓSTICO

FlebotomFlebotomíías as terapeterapeúúticasticassemanales ( 500 ml) hasta que se aprecie fallo de la eritropoyesis, detectado como caída del nivel de hemoglobina y hematocrito antes de siguiente flebotomía

Recomendable monitorizar la saturación de transferrina y la ferritina ( cada 3 meses)

Niveles recomendables: IST <50% y ferritina< 50 ng/ml ( incluso 20 ng/ml)

Importancia de la detección precoz para evitar daño de órganos

Esperanza de vida similar a sanos: Solo reducida en pacientes con cirrosis, diabetes y los que no logran deplecionar el Fe tras 18 meses de flebotomías