CONDUCÃTOR ªTIINÞIFIC:

PROF. UNIV. DR. ANA STRATONE

DOCTORAND:

ALEXANDRU DAN CIOCHINÃ

TEZÃ DE DOCTORAT

CONTRIBUÞII PRIVIND APLICAÞIILEMEDICALE ALE PROCEDEELOR

ELECTROMAGNETICE DE SEPARAREªI VECTORIZARE

UNIVERSITATEA DE MEDICINÃ ªI FARMACIE�GR. T. POPA� IAªI

FACULTATEA DE MEDICINÃ

IAªI2011

CUPRINS

PARTEA GENERALÃ

INTRODUCERE..................................................................... 1

Capitolul ISTADIUL ACTUAL AL CUNOªTINÞELORPRIVIND APLICAÞIILE MEDICALE ALEPROCEDEELOR ELECTROMAGNETICEDE SEPARARE ªI VECTORIZARE .................................... 4

1.1. Separarea magneticã ..................................................... 41.1.1. Proprietãþile magnetice ale substanþelor ........... 41.1.2. Clasificarea substanþelor din punct

de vedere magnetic ............................................ 51.1.3. Principiile separãrii magnetice .......................... 71.1.4. Generarea câmpurilor magnetice

în sistemele de separare................................... 10

1.2. Separarea magneticã în gradient înaltde câmp (HGMS) ....................................................... 111.2.1. Consideraþii asupra captãrii

în sistemele HGMS.......................................... 121.2.2. Factorii care influenþeazã separarea

magneticã HGMS ............................................ 141.2.3. Tipuri de separatoare HGMS .......................... 15

1.3. Aplicaþii biomedicale ale separãrii magnetice .......... 181.3.1. Separarea magneticã a eritrocitelor ................ 20

1.3.2. Embolizarea terapeuticã prin metodemagnetice ......................................................... 28

1.3.3. Separarea compuºilor biologici activi,celulelor ºi agenþilor patogeni prinmetode magnetice ............................................ 33

Nanoparticulele magnetice ......................... 34Microsferele magnetice .............................. 35Microsfere polimerice pe bazãde polivinil alcool (PVA) ............................ 36Particule fier-carbon ................................... 36Magnetolipozomii ....................................... 36Bacteriile �magnetice� ................................ 37Fluidele magnetice (ferofluidele) ............... 38

1.3.4. Metode de detecþie cu purtãtori magnetici ..... 411.3.5. Diagnosticul enzimatic al infarctului

miocardic acut (IMA) ...................................... 421.3.6. Eliminarea celulelor leucemice

din mãduva hematogenã .................................. 431.3.7. Radioterapia locoregionalã cu purtãtori

magnetici .......................................................... 441.3.8. Hipertermia intratumoralã terapeuticã

indusã electromagnetic .................................... 451.3.9. Vectorizarea ºi concentrarea locoregionalã

a agenþilor terapeutici prin metodemagnetice ......................................................... 46

1.3.10. Nanoparticule magnetice � agenþide contrast în imagistica prin rezonanþãmagneticã nuclearã (IRM) ............................... 48

PARTEA PERSONALÃ

Capitolul 2MOTIVAREA CERCETÃRII ............................................... 49

Capitolul 3OBIECTIVELE CERCETÃRII ............................................ 50

Capitolul 4MATERIAL ªI METODÃ.................................................... 52

4.1. Separarea eritrocitelor în gradient înaltde câmp magnetic ....................................................... 534.1.1. Prototipul unui separator magnetic

original, cu gradient înalt de câmp,pentru eritrocite ............................................... 53

4.1.2. Determinarea performanþelor circuituluimagnetic ........................................................... 55

4.1.3. Stabilirea ºi verificarea vitezei mediide curgere prin matricea magneticãordonatã ............................................................ 57

4.1.4. Separarea eritrocitelor umaneprin metoda HGMS ......................................... 58

4.2. Vectorizarea ºi concentrarea locoregionalãa unor medicamente magnetice .................................. 604.2.1. Prepararea unui ferofluid original hidrofil,

pe bazã de magnetitã ....................................... 604.2.2. Testarea efectului bacteriostatic ºi/sau

bactericid ale ferofluidelor preparatepe bazã de oleat de amoniu ºi dextrinã .......... 64

4.2.3. Testarea in vitro a unui complexmedicamentos magnetic format dintr-unferofluid original ºi diclofenac sodic .............. 65

4.2.4. Testarea in vitro a unui complexmedicamentos magnetic format dintr-unferofluid original ºi piroxicam ........................ 68

4.2.5. Evaluarea toxicitãþii in vivo a ferofluiduluipreparat pe bazã de oleat de amoniu .............. 68

4.2.6. Evaluarea toxicitãþii in vivo a ferofluiduluipreparat pe bazã de oleat de sodiu .................. 70

4.2.7. Testarea in vivo pe model experimentalde inflamaþie acutã a unui medicamentmagnetic obþinut prin complexareaferofluidului preparat pe bazã de oleatde sodiu cu un antiinflamator ......................... 72

4.2.8. Testarea in vivo pe un model experimentalde inflamaþie acutã a efectului câmpuluimagnetic permanent ......................................... 74

4.3. Detoxifierea sângelui cu ajutorulnanoparticulelor magnetice(hemodializa magneticã) ............................................ 754.3.1. Principiul detoxifierii sângelui prin

metode magnetice ............................................ 754.3.2. Simularea experimentalã a unui sistem

de detoxifiere magneticã a sângelui ............... 76

4.4. Embolizarea terapeuticã prin metode magnetice ...... 794.4.1. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice

intravasculare ................................................... 794.4.2. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice

pe un model de anevrism vascular .................. 82

Capitolul 5REZULTATE ªI INTERPRETAREA ACESTORA............. 83

5.1. Separarea eritrocitelor în gradient înalt de câmpmagnetic ...................................................................... 835.1.1. Determinarea performanþelor circuitului

magnetic ........................................................... 835.1.2. Rezultatele obþinute ......................................... 845.1.3. Discuþii ºi interpretarea rezultatelor

obþinute ............................................................. 86

5.2. Testarea in vitro a celor douã tipuriale unui ferofluid original .......................................... 885.2.1. Testarea efectului bacteriostatic ºi/sau

bactericid ale ferofluidelor preparatepe bazã de oleat de amoniu ºi dextrinã .......... 92

5.2.2. Testarea in vitro a unui complexmedicamentos magnetic format dintr-unferofluid original ºi diclofenacul sodic .......... 93

5.2.3. Testarea in vitro a unui complexmedicamentos magnetic format dintr-unferofluid original ºi piroxicam ........................ 95

5.2.4. Testarea in vivo a toxicitãþii unui ferofluidoriginal apos, pe bazã de magnetitã,având ca surfactant oleatul de amoniu ........... 96

5.2.5. Testarea in vivo a toxicitãþii unui ferofluidoriginal apos, pe bazã de magnetitã,având ca surfactant oleatul de sodiu ............... 99

5.2.6. Testarea in vivo, pe model experimentalde inflamaþie acutã, a unui medicamentmagnetic obþinut prin complexarea unuiferofluid (preparat pe bazã de oleatde sodiu) cu diclofenac sodic........................ 101

5.2.7. Influenþa câmpului magnetic asupraedemului inflamator experimental ................ 106

5.2.8. Influenþa timpului de expunere în câmpmagnetic permanent asupra fenomenuluiinflamator ....................................................... 108

5.2.9. Influenþa intensitãþii câmpului magneticpermanent asupra fenomenuluiinflamator ....................................................... 110

5.3. Detoxifierea sângelui cu ajutorul nanoparticulelormagnetice (hemodializa magneticã) ........................ 1125.3.1. Simularea experimentalã a unui sistem

de detoxifiere magneticã a sângelui ............. 112

5.4. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice ............... 1135.4.1. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice

pe un model de anevrism vascular ................ 117

Capitolul 6CONCLUZII ....................................................................... 119

Capitolul 7PERSPECTIVELE CERCETÃRII ..................................... 128

BIBLIOGRAFIE SELECTIVÃ .......................................... 130

ABREVIERI

ABCM = analizã biochimicã în câmp magneticAPTT = timpul parþial al protrombinei parþial

(ne)activateCL = celulã leucemicãDS = diclofenac sodicEDTA = acid etilendiaminotetraaceticELISA = enzyme-linked immunosorbent assay (mãsurare

imunoenzimaticã utilizând un antigen adsorbit)ELOSA = enzyme-linked oligosorbent assayFABP = fatty acid-binding proteinFF = ferofluidHGMS = separare magneticã în gradient înalt de câmpg.c. = greutate corporalãIMA = infarct miocardic acutIRM = imagisticã prin rezonanþã magneticã nuclearãLyNC = limfocite natural killerM(H) = magnetizaþia funcþie de câmpul magnetic aplicatM(T) = magnetizaþia funcþie de temperaturãMPM = microparticule magneticePEG = polietilenglicolPM = purtãtori magneticiPMA = purtãtori magnetici amorfiPCR = polymerase chain reactionRES = sistem reticuloendotelialPM = purtãtor magneticPX = piroxicamRMN = rezonanþã magneticã nuclearãTT = timpul trombinicPT = timpul de protrombinã

1

PARTEA GENERALÃ

INTRODUCERE

Separarea fizicã a componentelor unui amestec dupã naturalor s-a dovedit a fi, din cele mai vechi timpuri, o necesitatepracticã.

Metodele folosite au evoluat continuu ºi s-au diversificatpermanent, printre acestea dezvoltându-se ºi cele legate defenomenele electromagnetice ºi proprietãþile magnetice alemateriei, procedee al cãror ansamblu s-a constituit într-undomeniu consacrat sub denumirea de separare magneticã (1).

Principial, procesul de separare magneticã constã în acþiu-nea diferenþiatã exercitatã de forþele magnetice, în concurenþãcu forþe de altã naturã, asupra unui amestec (2).

Forþele concurente celor magnetice provin din interacþiunihidrodinamice, atunci când dimensiunile particulelor dintr-unamestec sunt mici, respectiv greutatea, inerþia ºi frecarea, atuncicând dimensiunile particulelor sunt mari (3).

În funcþie de valoarea ºi orientarea acestui grup de forþe,componentele unui amestec sunt colectate sau deviate diferen-þiat, obþinându-se în acest mod fracþionarea acestuia (1, 4).

Independent de acþiunea forþelor concurente enumerate,între componemtele amestecului se exercitã ºi forþe de inter-acþiune, care, de regulã, influenþeazã negativ separarea mag-neticã (2, 5).

Dupã modul în care se manifestã acþiunea magneticã, tehni-cile ºi metodele de separare magneticã pot fi împãrþite în douãcategorii (2, 6):

� tehnici ºi metode de separare în care acþiunea magneticãse exercitã direct asupra componentelor unui amestec;în acest mod sunt separate materialele magnetizabile

2

(dupã susceptibilitãþile lor magnetice) ºi materialele buneconducãtoare electric (dupã conductibilitãþile lor elec-trice, utilizând curenþi induºi);

� tehnici ºi metode de separare în care acþiunea magneticãse exercitã indirect, prin intermediul mediului în care seaflã imersate componentele nemagnetice (cu suscep-tibilitate magneticã neglijabilã) ºi neconducãtoare elec-tric (cu conductibilitate electricã neglijabilã); în acestcaz separarea se face în concordanþã cu densitãþile mate-rialelor (separare magnetodensimetricã), acestea fiindimersate fie în lichide magnetizabile, fie în lichide buneconducãtoare electric.

Metode bazate pe aceste procese se pare cã au fost folositeîncã din antichitate, dar date concrete asupra lor sunt semnalatenumai din secolul al XVIII-lea (2, 6). Ansamblul acestor me-tode este cunoscut sub numele de separare magneticã de or-dinul I sau, de cele mai multe ori, sub denumirea de separaremagneticã, deoarece au avut ºi au cea mai întinsã arie derãspândire în practicã.

Metodele în care acþiunea magneticã se exercitã direct,parametrul de separare fiind însã conductibilitatea electricã,alãturi de metodele în care acþiunea se exercitã indirect suntcunoscute sub numele de separare magneticã de ordinul II.

În prezent, colective de cercetãtori, tot mai numeroase, dinîntreaga lume, îºi concentreazã studiile pe mai multe direcþii,printre care se numãrã:

� Separarea componentelor sângelui uman (62-66);� Embolizarea terapeuticã a vaselor sanguine (67-72);� Hipertermia terapeuticã intratumoralã indusã electro-

magnetic (28, 33, 42, 73-89);� Vectorizarea magneticã ºi concentrarea locoregionalã a

medicamentelor (19-24, 28-32, 40, 69, 90-122);� Radioterapia locoregionalã (89-90, 123-138);� Utilizarea unor agenþi de contrast superparamagnetici

în imagistica de rezonanþã magneticã nuclearã � IRM(87, 89, 132, 136, 139-150);

3

� Dezvoltarea unor metode imunomagnetice cu aplicabi-litate în diagnosticul rapid al infarcutului miocardic acut(151), sau pentru evidenþierea in vivo a unor situsuricelulare specifice (27, 152-153,);

� Studiul dinamicii unor procese celulare (158, 162-183).� Vizualizarea ariilor de rupturã ale barierei hemato-ence-

falice ºi vizualizarea unor leziuni acute ale emisferelorcerebrale de mici dimensiuni (184-187);

� Detoxifierea sângelui prin metode magnetice � hemo-dializa magneticã (177, 180, 188-189).

Cu mai bine de 10 ani în urmã, ne-am propus, în premierã peplan naþional, studierea tehnicilor ºi metodelor de separare mag-neticã din perspectiva unor potenþiale aplicaþii, imediate saude viitor, în domeniul biomedical ºi biotehnologic (190-191).

Am beneficiat de sprijinul constant ºi de o colaborare fruc-tuoasã din partea unui colectiv de cercetãtori de la InstitutulNaþional de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizicã Tehnicã � IFTIaºi, condus de prof. univ. dr. fiz. Gh. Iacob. Cu o bogatã expe-rienþã în domeniul separãrii magnetice, fiind ºi promotorulunor cercetãri originale (2, 14, 39, 70-71, 192), inclusiv a unornoi dispozitive ºi metode în domeniu (193-195), colectivulcondus de prof. univ. dr. fiz. Gh. Iacob s-a arãtat din primulmoment interesat de aplicarea domeniului separãrii magneticeîn biologie ºi medicinã.

În acest sens, pe lângã aprofundarea unor aspecte teoretice,principiale ºi metodologice, am încercat ºi abordarea a douãdirecþii de cercetare: separarea componentelor sângelui umanprin metoda HGMS ºi vectorizarea magneticã a unor substanþebiologic active, prin mai multe granturi, câºtigate în compe-tiþiile lansate de Academia Românã (196), sau CNCSIS prinProgramul ANSTI (197), ºi respectiv INVENT (198-199).

Rezultatele obþinute, atât cele prezentate la conferinþe ºicongrese naþionale (200-219) ºi internaþionale (220-221), câtºi cele publicate în þarã (14, 39, 71, 190-191, 222-227), sau înstrãinãtate (228, 229), ultimul într-o revistã cotatã ISI, ne-aupermis abordarea unui domeniu de cercetare de mare actua-litate, permiþându-ne ºi o serie de contribuþii originale.

4

Capitolul I

STADIUL ACTUAL AL CUNOªTINÞELORPRIVIND APLICAÞIILE MEDICALE

ALE PROCEDEELOR ELECTROMAGNETICEDE SEPARARE ªI VECTORIZARE

1.1. Separarea magneticã

Procesul de separare magneticã constã în acþiunea diferen-þiatã exercitatã de forþele magnetice, în concurenþã cu forþe dealtã naturã, asupra unui amestec (2). Forþele concurente celormagnetice provin din interacþiuni hidrodinamice, atunci cânddimensiunile particulelor dintr-un amestec sunt mici, respectivgreutatea, inerþia ºi frecarea, atunci când dimensiunile particu-lelor sunt mari (3). În funcþie de valoarea ºi orientarea acestuigrup de forþe, componentele unui amestec sunt colectate saudeviate diferenþiat, obþinându-se în acest mod fracþionareaacestuia (1, 4). Dintre procesele de separare magneticã, în careacþiunea se exercitã direct asupra componentelor unui amestec,mult timp au fost cunoscute ºi utilizate doar cele în care sepa-rarea se face dupã susceptibilitatea magneticã (1-2).

1.1.1. Proprietãþile magnetice ale substanþelor

Toate substanþele au în compoziþia lor nuclee ºi electroni, ambelefiind încãrcate cu sarcini electrice, pozitive ºi negative. Oricesarcinã electricã în miºcare genereazã un câmp magnetic (3).

Proprietãþile magnetice ale substanþelor depind de structuralor internã, rolul predominant avându-l momentele magneticeale electronilor. Atunci când o substanþã este introdusã într-uncâmp magnetic, aceasta se magnetizeazã, rezultatul fiind schim-barea valorii iniþiale a câmpului existent în interiorul substan-þei respective, dar ºi modificarea acestuia din urmã în spaþiuldin vecinãtate (5).

5

Proprietãþile magnetice ale atomilor ºi moleculelor suntdependente de temperatura ºi de structura lor electronicã, res-pectiv de modul în care se gãsesc electronii la periferia ato-milor: cuplaþi sau decuplaþi.

1.1.2. Clasificarea substanþelor din punct de vederemagnetic

Dupã sensul ºi intensitatea magnetizãrii, caracterizate prinsemnul ºi valoarea susceptibilitãþii magnetice, substanþele, seîmpart în trei categorii (1,3):

� când c are valoare negativã micã, se numesc diamag-netice;

� când c are valoare pozitivã micã, se numesc paramag-netice;

� când c are valoare pozitivã mare, se numesc ferimag-netice;

� când c are valoare pozitivã foarte mare, se numesc fero-magnetice.

Conform legii de magnetizaþie temporarã � Mt = M

t (H) �

existã douã tipuri de materiale magnetice. Materiale magneticeliniare � pentru care Mt = cm × H, unde cm este o constantã dematerial adimensionalã, numitã susceptibilitate magneticã; dinaceastã categorie fac parte materialele diamagnetice ºi celeantiferomagnetice (un caz particular al feromagneticilor). Ma-teriale magnetice neliniare � pentru care susceptibilitatea mag-neticã depinde de intensitatea câmpului magnetic aplicat. Dinaceastã categorie fac parte materialele feromagnetice, feri-magnetice ºi antiferomagnetice.

1.1.2.1. Substanþe diamagnetice

Diamagnetismul are un caracter universal, fiind datorat induceriide curenþi moleculari în înveliºurile electronice ale atomilor,în prezenþa unui câmp magnetic exterior. În pofida caracteruluisãu universal, diamagnetismul nu poate fi pus în evidenþã la

6

toate substanþele, fiind în multe cazuri ecranat de efectul para-magnetic, care este mult mai intens (2, 5).

Substanþele diamagnetice sunt constituite din atomi fãrãmoment magnetic permanent. Când sunt introduse într-un câmpmagnetic exterior, atomii capãtã un moment magnetic indus,de sens contrar câmpului exterior, magnetizarea acestora fiindliniarã cu câmpul aplicat. În consecinþã, un corp din substanþãdiamagneticã va fi respins spre zonele unde câmpul magneticare intensitate minimã.

1.1.2.2. Substanþe paramagnetice

Substanþele paramagnetice sunt acele substanþe care, la intro-ducerea într-un câmp magnetic omogen, concentreazã liniilemagnetice ale acestuia ºi se orienteazã perpendicular pe liniilede câmp.

În absenþa unui câmp magnetic exterior, atomii substanþelorparamagnetice prezintã un moment propriu, care este în faptrezultanta momentelor magnetice orbitale ºi de spin ale elec-tronilor.

Substanþele feromagnetice constituie un grup aparte întresubstanþele paramagnetice: au un paramagnetism mare, mani-festat chiar ºi în absenþa câmpului magnetic exterior; spiniielectronici necompensaþi sunt orientaþi întâmplãtor în absenþacâmpului, iar în câmp magnetic se orienteazã paralel, pe direc-þia liniilor de forþã, orientare ce se pãstreazã ºi dupã îndepãr-tarea câmpului de forþe (5).

1.1.2.3. Substanþe superparamagnetice

Superparamagnetismul este un fenomen prin care materialelemagnetice pot manifesta un comportament similar paramagne-tismului chiar ºi la temperaturi sub temperatura Curie sauNéel. Este un fenomen relativ rar: în acest caz energia necesarãpentru modificarea direcþiei momentului magnetic al unei par-ticule este comparabilã cu energia termicã ambientalã (1).

7

Substanþele superparamagnetice sunt alcãtuite din particuleferomagnetice foarte mici (1-10 nm). Datoritã dimensiunilorlor reduse acestea îºi pot schimba direcþia în mod aleator subinfluenþa fluctuaþiilor de energie termicã. Sub temperaturaCurie substanþele superparamagnetice prezintã un comporta-ment similar cu cel al substanþelor paramagnetice. În absenþaunui câmp magnetic extern, substanþele superparamagneticeau o distribuþie monodispersã (fig. 1.11). Magnetizaþia se pro-duce doar atunci când asupra acestora acþioneazã influenþaunui câmp magnetic extern (fig.1.12).

Fig. 1.4. Particule fero-magnetice plasate în afaraunui câmp magnetic (230)

Fig. 1.5. Influenþa câmpuluimagnetic asupra particulelor

feromagnetice (230)

1.1.3. Principiile separãrii magnetice

Separarea magneticã este una dintre metodele utilizate pentrusepararea fizicã a elementelor unui amestec dupã natura lor.Aceasta se bazeazã pe comportamentul diferit al substanþeloraflate într-un câmp magnetic, proprietate numitã susceptibi-litate magneticã (1).

Forþa magneticã ce acþioneazã asupra unei substanþe estedatã de formula:

fM

= m0 ×

M × DH

unde H este intensitatea câmpului magnetic, M � magnetizaþiaparticulei, DH � gradientul de câmp magnetic, m0 � permeabi-litatea magneticã a vidului. În cazul unei magnetizaþii liniare,forþa magneticã va avea forma:

fM

= m0 ×

c × H × DH = (m

0/2) × DH2

8

Din aceastã ultimã relaþie se poate observa cã sensul forþeimagnetice coincide cu cel al gradientului de câmp în cazulparticulelor paramagnetice (c>0) ºi este de sens opus acestuiaîn cazul particulelor diamagnetice (c<0). Din aceastã cauzã oparticulã paramagneticã va fi atrasã spre zona cu câmp maxim,iar o particulã diamagneticã va fi respinsã spre zona de inten-sitate mai micã de câmp (fig. 1.13).

Fig. 1.13. O particulã paramagneticã este atrasã spre zona cucâmp maxim; o particulã diamagneticã este respinsã spre

zona cu câmp minim (2)

Separatoarele magnetice extrag particulele feromagneticedin componentele slab paramagnetice sau diamagnetice, deoa-rece diferenþa între susceptibilitãþile componentelor ameste-cului este în acest caz foarte mare (4, 6).

Parametrii fizici ai unui câmp magnetic ce prezintã impor-tanþã în separarea magneticã sunt intensitatea câmpului mag-netic (H) ºi gradientul intensitãþii câmpului magnetic (DH).Considerând cazul ideal, în care câmpul magnetic este uniformîn spaþiu, atunci DH= 0 (fãcându-se abstracþie de deformarealocalã introdusã de prezenþa particulei în câmp), iar forþa ceacþioneazã asupra particulei va fi nulã (2).

La rândul sãu, valoarea forþei magnetice se dovedeºte a fiindependentã de orientarea câmpului magnetic ºi a magne-tizaþiei particulei în raport cu gradientul de câmp, aceasta fiindcu atât mai mare, cu cât este mai mare produsul H × DH (3, 6).

În practicã, se realizeazã o creºtere a intensitãþii forþeimagnetice, fie prin creºterea intensitãþii câmpului magnetic(H), fie prin obþinerea unui gradient DH mai mare. Intensitateacâmpului magnetic se poate mãri printr-un consum sporit deenergie, iar creºterea gradientului se poate realiza printr-o

9

alegere corespunzãtoare a formei circuitului magnetic în spa-þiul de separare (4). Cei doi parametri, consideraþi a fi cei maiimportanþi în procesul separãrii magnetice, sunt dependenþiunul de altul, astfel încât o creºtere a intensitãþii H duce implicitla o creºtere a gradientului DH, în cazul aceleiaºi distribuþiispaþiale a câmpului (2, 220). Esenþa procesului de separaremagneticã constã în acþiunea diferenþiatã asupra componentelorunui amestec a forþelor magnetice, în concurenþã cu forþe dealtã naturã (fig. 1.14). Forþele concurente celor magnetice provindin interacþiuni hidrodinamice pentru corpurile cu dimensiunimici, ºi din inerþie, frecare ºi greutate pentru corpurile cudimensiuni mari. În funcþie de valoarea ºi orientarea acestuigrup de forþe, componentele unui amestec sunt colectate saudeviate diferenþiat, realizându-se fracþionarea acestuia (1-2).

Fig. 1.14. Principiul separãrii magnetice (dupã Gh. Iacob,2005, modificat)

În afara forþelor concurente menþionate anterior, între com-ponentele amestecului se exercitã ºi o serie de forþe de inter-acþiune, care au cel mai adesea un efect negativ în cadrulseparãrii magnetice. În funcþie de orientarea ºi valoarea acestuigrup de forþe, componentele unui amestec sunt colectate saudeviate în mod diferit, realizându-se astfel fracþionarea ames-tecului, în interiorul separatorului magnetic, într-o componentãmagneticã, una nemagneticã ºi una intermediarã (1, 5).

10

Separarea completã reprezintã cazul ideal; în orice separarerealã, în produsele separate se pot gãsi atât particule magne-tice, cât ºi particule nemagnetice.

Condiþia generalã de separabilitate este ca forþa megneticãFM sã întreacã în valoare forþele competitive, ºi anume: forþagravitaþionalã FG, forþa inerþialã FI, forþa de frecare FF ºi forþade antrenare hidrodinamicã F

HD:

FM > FG + FI + FF + FHD

În membrul drept al ecuaþiei de mai sus pot apãrea doi saumai mulþi termeni, în funcþie de caracteristicile constructiveale dispozitivului de separare. În toate situaþiile, forþa compe-titivã preponderentã este cea gravitaþionalã.

1.1.4. Generarea câmpurilor magnetice în sistemelede separare

Una din problemele principale care trebuie rezolvate în pro-cesul separãrii magnetice este obþinerea câmpurilor magneticede intensitãþi ºi configuraþii spaþiale dorite. Sursa efectivã pentrucâmpurile magnetice staþionare poate fi reprezentatã fie dedistribuþia curenþilor liberi, fie de materia magnetizatã.

Câmpurile magnetice intense sunt realizate, de regulã, dedistribuþia curenþilor liberi care circulã prin conductoare, an-samblu cunoscut sub numele de bobine. Acestea au mãrimi ºiconfiguraþii geometrice foarte diferite, în strânsã relaþie cumãrimea ºi structura spaþialã a câmpurilor ce urmeazã a fiobþinute. Câmpurile magnetice relativ scãzute pot fi obþinutecu ajutorul unor combinaþii de magneþi permanenþi, sursa forþeimagnetomotoare fiind materia magnetizatã.

În ambele cazuri, pentru dirijarea fluxurilor magnetice înspaþiul util, sunt necesare circuite magnetice.

Tehnicile de producere a câmpurilor magnetice în bobinese împart în trei grupe:

� tehnici ce utilizeazã conductori normali, obiºnuiþi, dincupru sau aluminiu, lucrând la temperatura camerei;conductorii pot fi rãciþi cu apã sau alte lichide;

11

� tehnici ce utilizeazã conductori normali de înaltã puri-tate, rãciþi însã cu lichide criogenice, cum sunt azotulsau hidrogenul lichid;

� tehnici ce utilizeazã supraconductori, lucrând la tempe-ratura heliului lichid.

Toate cele trei tehnici enumerate pot fi utilizate pentrugenerarea unor câmpuri staþionare, cele din primele douãgrupe putând fi folosite ºi pentru obþinerea unor câmpuripulsatorii.

1.2. Separarea magneticã în gradient înaltde câmp (HGMS)

Separarea magneticã în gradient înalt de câmp (High Gra-dient Magnetic Separation), denumitã ºi separare poligradient,reprezintã o tehnologie de vârf în domeniul atât de dinamic alseparãrii magnetice (1). Aceasta a cunoscut o dezvoltare impe-tuoasã în ultimii zeci de ani, fãcând posibilã separarea unorparticule sau corpusculi cu susceptibilitãþi magnetice foartereduse ºi cu dimensiuni de ordinul micronilor sau chiar maimici (2, 231-232).

Aºa dupã cum rezultã din expresia forþei magnetice, pentrusepararea substanþelor cu susceptibilitate magneticã micã, estenecesarã, pe de o parte obþinerea unui câmp magnetic intens,iar pe de altã parte crearea unor gradienþi de câmp ridicaþi(4, 6). Creºterea intensitãþii câmpului magnetic implicã fiecreºterea curentului de alimentare a bobinelor generatoare, fiemicºorarea întrefierului (2). Prima soluþie necesitã, pe lângã omãrire a puterii instalate a bobinelor, ºi un consum crescut deenergie pentru rãcirea forþatã a acestora (6). A doua soluþieconduce la micºorarea spaþiului util de separare, determinândo capacitate de prelucrare redusã a separatorului (63, 233).Introducerea unor elemente feromagnetice dispersive în întrefierrezolvã inconvenientele legate de intensificarea câmpului, cuscopul de a se obþine o forþã magneticã mai mare.

12

1.2.1. Consideraþii asupra captãrii în sistemele HGMS

Captarea particulelor paramagnetice într-un sistem HGMS afost studiatã pe modele simple, bazate pe analizarea posibilitã-þilor de captare a unor astfel de particule pe un singur fir colector,rezultatele fiind apoi generalizate, în vederea evaluãrii cantita-tive a eficienþei reþinerii particulelor paramagnetice (fig. 1.18).

Fig. 1.18. Configuraþii pentru captarea pe un singur fir(dupã Gh. Iacob, Al. D. Ciochinã, 2002, modificat)

Fig. 1.19. Particulã în apropierea unui fir magnetizat (2)

Factorul fundamental în procesul de captare al particulelorîntr-o matrice este interacþiunea dintre un fir magnetizat (ele-ment al matricei) ºi o particulã de micã dimensiune, într-uncâmp magnetic uniform (fig. 1.19). Firul feromagnetic de razãa ºi permeabilitate µ

c, aºezat perpendicular pe liniile de câmp

magnetic, creeazã o neuniformitate a câmpului de fond H0.

Componenta de bazã a unui sistem HGMS este matriceaferomagneticã, ce trebuie sã fie alcãtuitã din fire magnetizabilecât mai subþiri sau din împletituri de astfel de fire (plase). Înacest mod, matricea magneticã expune fluidului o suprafaþã de

13

captare foarte mare (231-232). În acelaºi timp, matricea ocupãun volum efectiv foarte mic, rezistenþa întâmpinatã de lichidulce o parcurge fiind neglijabilã (1-2, 68). Între douã fire subþiriale matricei magnetizate se genereazã o structurã de captare(un adevãrat �micromagnet�), reprezentatã în fig. 1.21.

Fig. 1.21. Structura unui loc de captare magneticã (190)

În cazul particulelor magnetice, în interiorul acestora esteindus un moment magnetic care depinde de proprietãþile mag-netice ale particulei ºi de intensitatea câmpului aplicat. Astfelde particule vor fi atrase ºi reþinute de firele matricei, în momen-tul în care forþa magneticã depãºeºte ca valoare forþa de dragarehidrodinamicã. Particulele nemagnetice aflate în fluid nu vorfi perturbate de la direcþia lor de cãtre forþa magneticã, ci vorfi antrenate de fluidul în curgere în afara matricei (1-2, 6).

Parametrul fundamental al matricei unui sistem HGMS estefactorul de împachetare F (numit ºi densitate de împachetare).Acesta se defineºte ca fiind raportul dintre volumul efectiv alfirelor ce o compun ºi volumul total în care acestea se aflãdispuse. O valoare redusã a factorului de împachetare F deter-minã o cãdere de presiune de valoare micã (68, 233).

Pentru ca matricea sã devinã magnetizatã este necesarãplasarea acesteia în întrefierul unui circuit magnetic, ce are dreptsursã generatoare electromagneþi sau magneþi permanenþi.

Apariþia unor valori foarte mari (de ordinul 105 kOe/m) alegradienþilor de câmp magnetic în vecinãtatea firelor magneti-zabile permite captarea ºi reþinerea particulelor micronice ºi

14

submicronice nu numai fero- sau ferimagnetice, ci ºi a celorparamagnetice (2, 5, 234).

Cele mai adecvate matrice utilizate pentru separarea îngradient înalt de câmp magnetic sunt construite din fire foartesubþiri, cu secþiune circularã sau cu muchii. Ele sunt obþinute dinaliaje magnetice moi, cum ar fi aliajele de tip FeNi (6, 68, 232).

Împachetarea firelor se poate face în trei moduri: dezor-donat, parþial ordonat, sau prin aºezare într-o reþea ordonatã.

Matricele ordonate prezintã o serie de avantaje faþã de celedezordonate, astfel: au un factor de împachetare constant întot volumul, variaþia vitezei locale a fluxului este mai micã,îndepãrtarea particulelor reþinute este mai eficientã (2, 68).

1.2.2. Factorii care influenþeazã separarea magneticãHGMS

Eficacitatea procesului de separare/filtrare magneticã HGMSdepinde de o serie de factori constructivi ºi funcþionali: intensita-tea câmpului magnetic aplicat; viteza de curgere a lichiduluiprin matrice; factorul de împachetare al matricei feromag-netice F; diametrul mediu al firelor feromagnetice; dimen-siunea medie a particulelor captate.

Intensitatea câmpului magnetic aplicat reprezintã unul dintrecei mai împortanþi parametri în cadrul procesului de separaremagneticã.

Valoarea acesteia determinã mãrimea forþei magnetice exer-citate asupra unei particule magnetice, atât prin valoarea sa defond, cât ºi prin valoarea gradientului de câmp DH, creat de unelement feromagnetic al matricei (1, 2, 6).

La aceiaºi parametri construcitivi ai matricei HGMS ºi laaceeaºi vitezã de trecere (forþa de dragare constantã) a lichi-dului, existã o dependenþã între eficacitatea separãrii ºi valoa-rea câmpului magnetic aplicat (232).

Viteza de curgere a lichidului prin matrice constituie un aldoilea parametru important pentru o funcþionare eficientã asistemului HGMS. Cu cât viteza de curgere a lichidului estemai micã, cu atât separarea este mai eficientã, economicitatea

15

sistemului dictând însã atingerea unor viteze cât mai mari.Vitezele de separare a lichidelor se pot situa între 1,5 m/s ºi 12m/s (5, 68, 234).

Factorul de împachetare al matricei feromagnetice F(densitatea de împachetare) poate varia în limite relativ largi(1,5%-18%), în funcþie de urmãtoarele caracteristici: confi-guraþia de realizare a matricei (ordonatã, parþial ordonatã saudezordonatã); forma ºi dimensiunile elementelor feromagne-tice (fire relativ subþiri sau foarte subþiri, plase din fire etc.);efectul de filtru mecanic; alþi factori ce þin de natura lichiduluiºi de concentraþia de particule magnetice din acesta.

Pentru alegerea unui factor optim de împachetare, trebuiesã se porneascã de la dimensiunea medie a particulelor ce sedoreºte a fi captate. În funcþie de aceastã dimensiune, se deter-minã diametrul, sau diametrul echivalent al firelor feromag-netice din care va fi compusã matricea, ulterior estimându-seºi factorul de împachetare. Acesta din urmã trebuie corelat ºicu concentraþia de particule aflate în lichidul purtãtor ºi cu alþiparametri de funcþionare (1-2, 232).

Dimensiunea medie a particulelor captate. Eficienþa separãriimagnetice este mai scãzutã în cazul particulelor submicronice,comparativ cu cele micronice sau mai mari. Forþa magneticãfiind proporþionalã cu volumul particulei, particulele mai micisunt mai greu de captat, în cazul acestora forþa magneticãexercitatã asupra lor având o valoare mai scãzutã (68).

Lungimea matricei feromagnetice. Pentru a creºte eficienþade captare fãrã un consum suplimentar de energie, se poaterecurge ºi la creºterea lungimii active a matricei separatorului:cu cât aceasta este mai mare, cu atât creºte pe de o parteprobabilitatea de captare a particulelor, iar pe de altã partevolumul util ºi numãrul locurilor de captare (6, 287).

1.2.3. Tipuri de separatoare HGMS

Atât metoda cât ºi dispozitivele HGMS au fost direcþionatespre separarea unor amestecuri compuse din particule foartefine (1-70 µm) ºi în care componenta magneticã are caracter

16

chiar slab paramagnetic, sau spre filtrarea magneticã a unorsuspensii cu conþinut asemãnãtor (232, 238).

Sistemele de separare HGMS se împart din punct de vedereconstructiv în douã categorii: separatoare ciclice ºi separa-toare continue (2, 4).

Separatorul ciclic se caracterizeazã printr-un ciclu de func-þionare ce cuprinde trei faze (fig. 1.28): o fazã de alimentare,o fazã intermediarã de clãtire, urmatã de o fazã de spãlare.

Fig. 1.28. Schema de funcþionare a unui separator HGMSciclic; a � alimentare; b � spãlare(dupã Iacob Gh. 2005, modificat).

În prima fazã, cea de alimentare, în prezenþa câmpuluimagnetic, amestecul ce urmeazã a fi separat este trecut prinmatricea magnetizatã: fracþia magneticã din amestec este reþi-nutã, iar fracþia nemagneticã este evacuatã, constituind pro-dusul purificat (nemagnetic).

Separatorul cu funcþionare continuã a apãrut ca o nece-sitate tehnologicã în prelucrarea minereurilor, necesitate dic-tatã de mãrirea capacitãþii de prelucrare a acestora (2, 5). Aufost realizate separatoare cu matrice mobile, în care procesulde separare se poate realiza continuu, pe mãsurã ce matricease deplaseazã. Acest tip de separatoare sunt cunoscute subdenumirea de separatoare tip carusel (6).

Un separator HGMS carusel are ca piesã principalã uncadru inelar orizontal, în care este montatã matricea feromag-neticã, împãrþitã într-un numãr de compartimente (fig. 1.30).

17

Fig. 1.30. Separator magnetic cu funcþionare continuã, tipcarusel (dupã Gh. Iacob 2005, modificat)

Dispozitivul oscilant de separare magneticã este un dis-pozitiv original, care permite îndepãrtãrtarea fracþiei captatefãrã anularea câmpului magnetic de fond.

Ciclul de funcþionare cuprinde douã faze. Pe parcursul fazeide alimentare matricea are firele feromagnetice perpendicularepe direcþia câmpului magnetic. Dupã ce matricea s-a saturat,prin captarea pe fire a particulelor paramagnetice, se întrerupealimentarea ºi urmeazã operaþia de spãlare în care are locevacuarea particulelor reþinute.

Dispozitivul modular de separare magneticã reprezintão celulã originalã de separare HGMS (fig. 1.32), fiind destinatextragerii, în mod continuu, a unei fracþii magnetice utile ce seaflã în amestec în cantitate mult mai micã decât fracþia nemag-neticã (2, 194-195).

Funcþionarea dispozitivului este continuã. Lichidul în carese aflã atât particule magnetice, cât ºi, preponderent, particulenemagnetice strãbate incinta de sus în jos.

Particulele nemagnetice sunt purtate de lichid prin incintãfãrã a fi reþinute, fiind colectate în partea de jos ca fracþienemagneticã.

Particulele magnetice, sub acþiunea preponderentã a forþe-lor magnetice, ajung pe douã zone din suprafaþa cilindricã abarelor, zone situate în dreptul orificiilor �a�.

18

Fig. 1.32. Dispozitiv modular de separare magneticã:a � secþiune longitudinalã, b � secþiune în trepte A-A,c � secþiune cu un plan B-B, d � capacul de separare;

1 � incintã; 2 � barã feromagneticã; 3,3' - poli magnetici;4 � lame de fixare a barelor; 5 � tub de evacuare; 6 � lame

de fixare a tubului de evacuare; 7 � capac de separare;8 � particulã magneticã; 9 � particulã nemagneticã;

�a� � orificii de intrare pentru particulele magnetice;�m� � muchia capacului de separare

(dupã Gh. Iacob 2005, modificat)

1.3. Aplicaþii biomedicale ale separãrii magnetice

Utilizate iniþial în domeniul limitat al extragerii corpurilorferoase ºi al prelucrãrii minereurilor feroase, tehnologiile deseparare magneticã, din ce în ce mai complexe ºi mai selective,ºi-au dovedit aplicabilitatea ºi utilitatea în cele mai diversedomenii (1-2).

19

Apariþia metodei de separare în gradient înalt de câmpmagnetic (HGMS) a extins domeniul materialelor prelucrabilemagnetic, atât sub raportul proprietãþilor magnetice ale aces-tora, cât ºi din punct de vedere al dimensiunilor lor, permiþândºi separarea unor particule foarte fine ºi cu proprietãþi slabmagnetice (2, 4, 6).

Încã în 1960 Freeman, Arrott ºi Watson (7) au propus trans-portul particulelor fine de fier � cu ajutorul unui câmp mag-netic extern � prin sistemul vascular, în vederea concentrãriiîn anumite zone din organism, dar cercetãrile privind apli-caþiile metodelor de separe magneticã în biologie ºi medicinãau avansat lent, în paralel ºi în strânsã dependenþã cu perfec-þionarea tehnicilor avansate de separare/filtrare în gradientînalt de câmp magnetic. Abia în anul 1996 s-a putut organizala Rostock (Germania) prima Conferinþã internaþionalã consa-cratã aplicaþiilor biomedicale ale metodei purtãtorului magnetic,conferinþã care a consacrat importanþa teoreticã, metodologicãºi practicã a acestui domeniu de cercetare pentru biologie ºimedicinã, marcând punctul de start pentru studii sistematice,fundamentale ºi clinice, cu privire la importanþa ºi impactulmetodelor moderne de separare magneticã, ca potenþiale apli-caþii imediate sau de viitor în domeniul medical ºi biotehnologic.

Dezvoltarea extrem de dinamicã ºi spectaculoasã a dome-niului nanoparticulelor ºi nanotehnologiilor a reprezentat unimpuls ºi o ºansã oferite acestui domeniu de cercetare, care acrescut în mod constant, cu precãdere în ultimul deceniu,fãcându-se remarcat în tot mai numeroase þãri, printre careSUA, Germania, Anglia, Franþa, Japonia, Danemarca, Olanda,Rusia, Ucraina. Pentru aplicaþiile biomedicale ºi biotehno-logice se utilizeazã de cele mai multe ori douã tipuri de sepa-rare magneticã: directã ºi indirectã (1-2, 6).

În separarea directã, corpusculii trebuie sã posede proprie-tãþi magnetice intrinseci. Existã doar câteva exemple în dome-niul bioºtiinþelor, cum ar fi: eritrocitele (ce conþin hemoglobinãcare este slab paramagneticã), unele bacterii (care sintetizeazãmici particule de magnetitã) ºi unele alge. În toate acestecazuri, forþa magneticã se exercitã direct (fig. 1.33).

20

În separarea magneticã indirectã, unei entitãþi nemagnetice(diamagnetice) i se ataºeazã o particulã puternic magneticã(fero- sau ferimagneticã), astfel încât complexul format pre-zintã în ansamblu proprietãþi magnetice, asupra sa putându-seexercita acþiunea unei forþe magnetice (fig. 1.34).

Fig. 1.33. Acþiunea forþei magneticeîn separarea magneticã directã

Fig. 1.34. Acþiunea forþei magneticeîn separarea magneticã indirectã

1.3.1. Separarea magneticã a eritrocitelor

Sângele reprezintã un þesut lichid circulant, format din ele-mente figurate suspendate în plasmã. Deºi posedã un volumrelativ redus, are o deosebitã importanþã funcþionalã. Rolulesenþial al sângelui în homeostazie este subliniat de multitu-dinea funcþiilor pe care le realizeazã: circulatorie, respiratorie,nutritivã, excretorie, de menþinere a echilibrului hidroelec-trolitic, de termoreglare, de protecþe a organismului etc. (239).

1.3.1.1. Proprietãþile eritrocitelor

Eritrocitele (din limba greacã erythros = roºu; kytos = celulã),cu sinonimele hematii, globule roºii, sau normocit, sunt celuleanucleate ale sângelui (la om ºi vertebratele superioare), de

21

culoare roz-roºie, în formã de disc biconcav, aplatizat, defor-mabil, care conþin hemoglobinã ºi sunt specializate în trans-portul gazelor respiratorii sanguine (276).

Provin din linia sau seria eritrocitarã a mãduvii hematogene,precursorul direct fiind eritroblastul. Au culoarea roºie datoritãunui pigment respirator din componenþa lor, numit hemoglo-binã, al cãrui rol principal este acela de a fixa oxigenul mole-cular provenit din respiraþia pulmonarã pentru a-l transporta ladiferitele þesuturi ale organismului, respectiv dioxidul de carbonprovenit din respiraþia tisularã pentru a-l transporta la plãmâni.Sunt singurele celule sanguine care prezintã proprietãþi mag-netice intrinseci, chiar dacã acestea sunt foarte slabe, ceea cepermite separarea acestora prin metode magnetice. Din can-titatea totalã de sânge a unei persoane adulte (5-5,5 litri),aproape jumãtate (2,3-2,5 litri) o reprezintã globulele roºii.

Anthony van Leeuvenhoock remarcã pentru prima datã,utilizând microscopul descoperit în 1674, prezenþa în sânge aunor corpusculi coloraþi, în formã de discuri biconcave, carela nivel de capilare, sunt antrenaþi într-o circulaþie de tip laminar(239, 242). Eritrocitele se coloreazã în roºu viu prin Giemsa,centrul celulei rãmânând mai puþin colorat (fig. 1.36), deoarecestratul de hemoglobinã în aceastã zonã este mai redus.

Fig. 1.36. Eritrocite umane (microscopie opticã, mãrire de600 de ori) (Al. D. Ciochinã, colecþie personalã)

Numãrul de hematii din sânge se exprimã în milioane/mm3

sânge, iar valorile normale varizã în funcþie de specie: 5,5-9,5milioane/mm3, la cabaline; 5-10 milioane/mm3, la bovine; 8-16milioane/mm3, la ovine; 5,5-8,5 milioane/mm3 la câine (64).La om, numãrul de eritrocite este pentru sexul masculin de 5,1

22

milioane ± 500000/mm3, respectiv de 4,6 milioane ± 500000/mm3 sânge la sexul feminin (239).

Eritrocitele mamiferelor au un comportament unic printrevertebrate: acestea prezintã nucleu în fazele timpurii ale eritro-poezei, pe care îl pierd pe parcursul dezvoltãrii lor, pentru aoferi mai mult spaþiu hemoglobinei, transformându-se, atuncicând devin mature, în celule anucleate.

La mamifere, eritrocitele pierd o bunã parte din organitelecelulare, cum ar fi mitocondriile, aparatul Golgi ºi reticululendoplasmatic. În absenþa mitocondriilor, hematiile nu utili-zeazã oxigenul transportat; în schimb, acestea produc ATP dinglucozã prin glicolizã, în prezenþa enzimelor oxidoreductoare.Neavând receptori pentru insulinã, asimilarea glucozei nu estecontrolatã de insulinã (239, 242). Din cauza absenþei nucleuluiºi a organitelor, eritrocitele nu conþin ADN ºi nu pot sintetizanici ARN, deci nu se pot divide, având ºi o capacitate de recu-perare limitatã. Pot fi dezagregate prin acþiunea ultrasunetelor.

Eritrocitul este capabil sã treacã prin mari modificãri devolum, fãrã ca membrana celularã sã fie afectatã. Se carac-terizeazã ºi printr-o plasticitate deosebitã, care îi permite sãtraverseze pori de 2,3-3 µm, mai mici decât diametrul sãu, fãrãa fi distrus. Aceastã proprietate se pierde odatã cu îmbãtrânireacelulei.

Hematiile suspendate în plasmã prezintã un diametru de7,5-8,3 µm, care scade odatã cu îmbãtrânirea celulei. Grosimealor este de aproximativ 1,7 µm, volumul eritrocitar avândvalori de 87±5 µm.

Principala funcþie a eritrocitului este, prin hemoglobinaconþinutã, aceea de transport pentru oxigen ºi pentru o partedin bioxidul de carbon rezultat din arderile tisulare. Oxigenuleste transportat sub formã de oxihemoglobinã, un gram dehemoglobinã putând fixa 1,34 cm3 de oxigen. În acest fel, cele16 grame de hemoglobinã conþinute în 100 cm3 de sânge pottransporta 20,5 cm3 de oxigen. Bioxidul de carbon este trans-portat sub forma carbamatului de hemoglobinã (239, 277).

Eritrocitele mature aflate în suspensie prezintã unele miº-cãri vibratorii, datoritã cãrora capãtã în lumina microscopului

23

un aspect scânteietor. Aceastã proprietate se datoreazã unormici diferenþe dintre densitãþile substanþelor din membranã ºicele din mediul intraeritrocitar, care influenþeazã refracþia.

O altã proprietate specificã hematiilor este deplasarea lorîn fâºicuri sau rulouri (fig. 1.41).

Fig. 1.41. Deplasarea hematiilor în rulouri(Al. D. Ciochinã, colecþie personalã)

Dimensiunea acestor rulouri depinde în mai micã mãsurãde calitatea eritrocitelor, ºi în mai mare mãsurã de o serie defactori plasmatici.

Viteza de sedimentare a hematiilor depinde de lungimeaacestor fâºicuri. Adãugarea în sânge a unor soluþii izotonice(ser fiziologic, unele anticoagulante, produºi pentru conser-varea sîngelui), împiedicã aºezarea eritrocitelor în rulouri,reducând ºi viteza lor de sedimentare.

Fiecare atom de fier (în stare feroasã), atunci când nu esteîn combinaþie cu oxigenul, are un moment magnetic egal cu5,35 µ

B. La 24 0C grupele hem prezintã o susceptibilitate

magneticã c aproximativ egalã cu 3,88 × 10-6 (SI), valoare cedepinde de pH-ul mediului. Methemoglobina, prezentã într-oproporþie foarte micã în eritrocit, are o susceptibilitate mag-neticã mai mare. Susceptibilitatea magneticã a hemoglobineiîn stare redusã este de 3,88 × 10-6 (SI), valoare care se înca-dreazã în domeniul paramagnetismului slab (2, 5).

În cazul oxihemoglobinei, susceptibilitatea magneticã estenegativã, comportamentul acesteia fiind de tip paramagnetic.

Spre deosebire de hematii, celelalte elemente figurate alesângelui sunt diamagnetice (c < 0), traiectoria lor nefiind înprincipiu afectatã la trecerea printr-un câmp magnetic.

24

În câmpuri magnetice foarte intense (B = 4-8 T) hematiile,singulare sau grupate în rulouri, se orienteazã dupã direcþiacâmpului magnetic aplicat, datoritã anizotropiei diamagnetis-mului membranei celulare, ce are ca efect o miºcare de torsiune(68, 191, 198). De asemenea s-a observat cã existã o depen-denþã aproape liniarã între valoarea vâscozitãþii sângelui ºivaloarea intensitãþii câmpului magnetic, vâscozitatea crescândodatã cu câmpul aplicat. La câmpuri foarte intense (B = 2-8 T)eritrocitele se atrag între ele datoritã paramagnetismului hemo-globinei, sângele devenind mai vâscos (2, 68, 191).

Având în vedere caracterul slab paramagnetic ºi dimen-siunile foarte mici ale eritrocitelor, metoda HGMS poate fi oalternativã de succes pentru separarea magneticã a eritrocitelorîn vederea obþinerii de concentrat eritrocitar.

Se poate folosi unul din cele douã procedee standard: pro-cedeul discontinuu (ciclic), sau procedeul continuu.

Procedeul discontinuu se realizeazã în douã etape.Într-o primã etapã are loc captarea eritrocitelor din plasma

în curgere, reþinerea acestora ºi formarea unor depozite pefirele matricei HGMS, magnetizatã prin aplicarea unui câmpmagnetic din exterior.

Într-o a doua etapã, atunci când depozitele de eritrociteajung la saturaþie (nu se mai produce o creºtere a acestora), seprocedeazã la îndepãrtarea/culegerea lor, prin anularea câmpu-lui magnetic. In figura 1.43 este ilustrat un sistem HGMS cufuncþionare ciclicã.

Fig. 1.43. Sistem HGMS pentru separareadiscontinuã a eritrocitelor (190)

25

Acesta are ca parte activã o matrice filamentarã, alcãtuitãdintr-o reþea ordonatã de fire, aºezate paralel cu direcþia decurgere ºi perpendicular pe câmpul magnetic H, realizînd oconfiguraþie denumitã axialã.

Matricea este plasatã într-o incintã etanºã, de formã cilin-dricã. Din sângele care trece prin incintã vor fi captate ºi reþinutepe firele matricei, sub formã de straturi succesive (fig. 1.44),numai eritrocitele, limfocitele ºi celelalte componente plas-matice strãbãtând incinta fãrã a fi deviate de forþa magneticã.Atunci când pe fire s-au format depozite saturate cu hematii,se sisteazã introducerea sângelui în incintã ºi se anuleazãcâmpul magnetic aplicat. Drept consecinþã, firele se vor de-magnetiza, depozitele se vor desface, iar introducerea în incintãa unui lichid de antrenare adecvat (compatibil) va permitecolectarea globulelor roºii.

Fig. 1.44. Depozit de eritrocite formatpe un fir magnetic (191)

Pentru a realiza doar o concentrare de hematii în sângeletratat magnetic este suficient a se trece prin incintã câtevavolume, dupã care se recolteazã ultimul volum de sânge rãmasîn incintã, care va conþine o populaþie crescutã de globule roºii.

Eficacitatea procesului de separare magneticã prin proce-deul discontinuu depinde de o serie de factori constructivi ºifuncþionali.

Parametrii constructivi care necesitã a fi luaþi în calculsunt:

� firele din componenþa matricei trebuie sã fie foarte sub-þiri (diametrul de 15-25 µm), pentru a induce gradienþilocali cât mai accentuaþi (de ordinul 104 T/m), ceea ce arpermite captarea unui numãr însemnat de eritrocite (2,191, 198);

26

� deºi eficienþa captãrii ar putea creºte, în cazul utilizãriiunor fire cu o suprafaþã rugoasã (cu asperitãþi), princrearea unor gradienþi suplimentari, pentru evitarea de-teriorãrii membranei celulare în timpul pocesului decaptare, este esenþial ca firele sã fie cât mai netede.Acoperirea firelor cu un strat de sticlã sau cu straturipolimerice biocompatibile poate reprezenta o soluþieacceptabilã (198);

� factorul de împachetare al matricei (definit ca raportulprocentual dintre volumul efectiv al firelor ºi volumulocupat de acestea) sã se situeze la o valoare de 2-5%,hematiile având o tendinþã foarte slabã de captare purmecanicã (2, 5, 191).

Dintre parametrii funcþionali, cei mai importanþi sunt inten-sitatea H a câmpului magnetic ºi valoarea vitezei medii decurgere a sângelui prin secþiunea transversalã a matricei. Oeficienþã ridicatã a captãrii eritrocitelor (65-90%) se poateobþine la valori mari ale câmpului de fond (19-25 kOe) ºi laviteze relativ mici (0,5-2 mm/s).

Procedeul de separare continuu spre deosebire de cel ante-rior, se bazeazã pe modifirarea traiectoriei de curgere a eritro-citelor, sub acþiunea preponderentã a forþei magnetice ºi nu pecaptarea acestora.

Pentru obþinerea unei acumulãri dense de celule, deci aunui flux de masã cu densitate cât mai mare, este necesar ca,prin geometria sistemului de generare a energiei magnetista-tice, sã se creeze suprafeþe echipotenþiale diferenþiate. Astfel,celulele magnetizate se vor deplasa spre zonele cu energiemagnetostaticã înaltã, spre deosebire de elementele celularediamagnetice, ce nu vor fi perturbate din traiectoria lor decurgere, în final rezultând separarea doritã. O astfel de struc-turã, în care suprafeþele echipotenþiale sunt de formã cilindricã,iar câmpul magnetic este generat de un sistem magnetic tetrapolar,cu piese polare de formã cilindricã este reprezentatã în fig. 1.45.

Pe baza structurii cu suprafeþe echipotenþiale cilindrice sepoate imagina un model de separator magnetic pentru con-centrarea hematiilor în curgere continuã.

27

Modelul ar consta dintr-un sistem magnetic cvadripolar, încare se aflã o camerã de curgere, de formã tubularã (fig. 1.46).

Fig. 1.45. Structurã cu suprafeþe echipotenþialecilindrice pentru obþinerea unui flux de masã

celularã cu densitãþi diferite; densitatea fluxuluicreºte de la centru spre periferie (101, 198)

Fig. 1.46. Model de separator magnetic pentru eritrocite cusistem magnetic cuadripolar ºi camerã de curgere cilindricã:

a � secþiune longitudinalã; b � secþiune transversalã (191)

Devierea exclusivã a eritrocitelor sub acþiunea forþelor mag-netice va face ca la partea inferioarã a tubului, în zona dinapropierea pereþilor sã existe un concentrat eritrocitar, iar înpartea centralã o plasmã foarte sãracã în hematii.

Eficienþa procedeului de separare de tip continuu depindeîn mare mãsurã de caracterul curgerii prin microcamerã ºianume, curgerea trebuie sã fie cât mai laminarã. De asemenea,

28

poziþia de fixare a microcamerei faþã de sistemul magneticexterior poate avea o influenþã asupra eficienþei filtrãrii: tre-buie sã existe o corelaþie între zonele cu energie magnetosta-ticã maximã ºi zonele de colectare a concentratului eritrocitar.

Având în vedere caracterul slab paramagnetic ºi dimen-siunile mici ale eritrocitelor, metoda HGMS poate fi o alter-nativã de succes pentru separarea/concentrarea eritrocitelor(2, 190-191).

1.3.2. Embolizarea terapeuticã prin metode magnetice

Embolizarea în scop terapeutic este o metodã relativ recentã,utilizatã destul de frecvent, fiind o metodã minim invazivã.Este aplicatã cu succes în tratamentul anevrismelor, malfor-maþiilor ºi fistulelor arteriovenoase, în terapia antitumoralã,sau ca embolizare preoperatorie în ablaþia unor organe (67-72).

Embolizarea terapeuticã poate fi realizatã ºi prin procedeemagnetice, în care caz embolusul este obþinut prin depunereaendovascularã a unor nano- sau microparticule magnetice, înprezenþa unui câmp magnetic exterior (26, 27).

Nano- sau microparticulele magnetice utilizate trebuie sãprezinte proprietãþi magnetice cât mai pregnante (sã fie fero-sau ferimagnetice), fiind în acelaºi timp biocompatibile (încor-porate într-un înveliº biocompatibil). Nanoparticulele de mag-netitã (Fe3O4) sau feritã (Fe2O3) � sub formã de dispersieinstabilã într-un lichid, sau sub formã de dispersie coloidalãstabilã (fluide magnetice) � par a fi cele mai indicate pentruembolizarea prin metode magnetice. ªi microparticulele dinaliaje magnetice speciale, cum ar fi aliajele magnetice amorfepot reprezenta o variantã de lucru interesantã (98).

Administrarea nano- sau microparticulelor (inclusiv a fero-fluidelor) este relativ simplã, fãcându-se prin injectare intra-venoasã; dirijarea în zona doritã, precum ºi formarea unordepuneri compacte ºi stabile (embolusuri), capabile sã între-rupã fluxul sanguin intravascular, se poate realiza prin câmpurimagnetice relativ intense, aplicate ºi controlate din exterior. În

29

acest fel durata embolizãrii poate fi gestionatã cu precizie prinmodalitãþile de aplicare ale câmpului magnetic exterior (232).

Un avantaj important al metodei îl reprezintã posibilitateade a efectua concomitent proceduri terapeutice asociate (em-bolizare � chimioterapie ºi/sau radioterapie locoregionalã),dacã nanoparticulele magnetice utilizate pentru obstruarea endo-vascularã ar fi cuplate cu citostatice sau cu radioizotopi.

Foarte recent, în luna mai 2011, un colectiv de medici ºicercetãtori, condus de Johanna Oechtering, a publicat un studiuexperimental, care abordeazã într-o manierã extrem de con-vingãtoare, atât in vitro, cât ºi in vivo, utilizarea nanoparticu-lelor magnetice pentru tratamentul endovascular al anevris-melor intracraniene (72). Au fost utilizate microparticule mag-netice (Magseal; APG Medical Ltd), produse în Marea Britaniecu un diametru de 1,4 µm, suspendate într-o soluþie salinã.Ghidarea acestora, pe parcursul experimentãrilor, s-a fãcut cuun magnet permanent din pãmânturi rare (neodymium), cudimensiunile de 2,5 × 2,5 × 1,25 cm. Câmpul magnetic obþinuta fost de 400 mT la 0 cm, 300 mT la 0,4 cm, 200 mT la 0,8 cmºi 100 mT la 1,6 cm. Administrarea ferofluidului s-a efectuatcu un microcateter (Renegade Hi-Flo-Microcatheter, BostonScientific), produs în Irlanda, prevãzut cu un diametru interiorde 0,685 mm. Pentru experimentele in vitro a fost utilizat unmodel vascular tridimensional din silicon (Elastrat-Sarl), pro-dus în Elveþia, care reproduce la scarã redusã sistemul vascularuman denumit poligonul lui Willis. Cu acest model au fostinvestigate douã tipuri de anevrism: unul localizat pe arterabazilarã, iar celãlalt pe arteara cerebralã mijlocie. Au fostexaminate mai multe poziþii ale microcateterului, în timpuladministrãrii a 150 mg de ferofluid, în prezenþa unui câmpmagnetic constant de 400 mT. Magnetul a fost aplicat în directcontact cu anevrismul, ceea ce nu este posibil in vivo. Celemai bune rezultate au fost obþinute cu cateterul aplicat lanivelul coletului anevrismului.

Dupã îndepãrtarea câmpului magnetic într-un interval de20-90 secunde microparticulele din ferofluid se dezagregã,repermeabilizând anevrismul (fig. 1.49).

30

Pentru experimentele in vivo au fost folosiþi 3 iepuri albi deNoua Zeelandã, anevrismele fiind obþinute pe trunchiul bra-hiocefalic, prin ligatura arterei carotide drepte ºi incubareaintraluminalã cu elastazã.

La trei sãptãmâni dupã inducþia anevrismului, adminis-trarea endovascularã a ferofluidului s-a fãcut prin artera femu-ralã. Câmpul magnetic extern a fost obþinut prin plasarea unuimagnet la suprafaþa corpului iepurilor, la 1 cm de anevrism;intensitatea câmpului magnetic a fost de aproximativ 175 mT,iar magnetizaþia a mãsurat, la acelaºi nivel, 13 T/m.

Administrarea ferofluidului s-a fãcut cu o ratã de aproxi-mativ 1 ml/min, sub control fluoroscopic. Imediat dupã trata-ment ºi la 30 de minute dupã demararea administrãrii feroflui-dului au fost efectuate angiografii cu substracþie digitalã(fig. 1.50). Dupã 12 sãptãmâni, s-a efectuat o ultimã angio-grafie, apoi ºoarecii au fost eutanasiaþi (prin injectarea debarbiturice intravenos) ºi s-au fãcut investigaþii histopatolo-gice, la nivelul ficatului, splinei ºi a anevrismului.

Fig. 1.49. Studiu in vitro pe un model de anevrismtridimensional situat pe artera cerebralã mijlocie:

A � persistenþa microparticulelor magnetice în anevrismdupã îndepãrtarea câmpului magnetic; B � acumulareamicroparticulelor magnetice în vasele mici din modelul

tridimensional vascular sub acþiunea câmpului magnetic (72)

31

Ocluzarea anevrismului a fost completã pentru o valoare acâmpului magnetic de 175 mT ºi o inducþie magneticã de 13 T/mm. Ocluzia anevrismului a rãmas stabilã pentru o perioadãde cel puþin 30 de minute dupã îndepãrtarea câmpului mag-netic, dar dupã 12 sãptãmâni, angiografia finalã a arãtat repe-fuzia anevrismului la un singur animal (fig. 1.51). Explicaþia

Fig. 1.50. Aspecte angiografice ale administrãrii in vivo amicroparticulelor magnetice pe un model de anevrism

intracerebral la iepure: A ºi B � imaginile iniþialeale anevrismului; C � anevrismul dupã administratrea

tratamentului magnetic, cu absenþa circulaþiei sanguine îninteriorul sãu; D � rezultatul se menþine stabil

la 30 de minute dupã îndepãrtarea cîmpului magnetic (72)

Fig. 1.51. Angiografia efectuatã la 12 sãptãmâni de laexperiment care evidenþiazã recanalizarea anevrismului (72)

32

autorilor a fost aceea cã, în acest caz a fost observatã incom-pleta transformare a tombusului primar în trombus organizat(secundar). Examenul anatomopatologic efectuat la 12 sãptã-mâni a prezentat, la nivelul anevrismului, infiltrat inflamatorlimfocitar în adventice unde s-a pus în evidenþã ºi prezenþamicroparticulelor magnetice. A fost evidenþiat material trom-botic neorganizat, fãrã neovascularizaþie, într-o zonã adiacentãcu intima (fig. 1.52).

Fig. 1.52. Anevrism cu focare granulomatoase în peretelevascular (sãgeata verticalã) ºi infiltrat inflamator în

adventice; material trombotic neorganizat la nivelul intimei(sãgeata orizontalã); coloraþie cu hematoxilinã eozinã (72)

Embolizarea magneticã se dovedeºte a fi o realitate, de-monstratã de tot mai numeroase studii experimentale, atât invitro cât ºi in vivo, care deschide noi perspective terapeutice.Evoluþia spectaculoasã ºi extrem de rapidã a domeniului, aduceîn fiecare an contribuþii majore. Este de aºteptat ca, într-unnumãr rezonabil de ani, aceastã metodã sã poatã fi aplicatã cusucces în clinica umanã.

33

1.3.3. Separarea compuºilor biologici activi, celulelorºi agenþilor patogeni prin metode magnetice

1.3.3.1. Metoda purtãtorului magnetic

Aceastã tehnicã de separare magneticã a fost aplicatã iniþial laepurarea apelor uzate ce conþineau particule nemagnetice, sub-stanþe organice sau anorganice precipitate sau dizolvate, inclu-siv o serie de microorganisme patogene (1).

Denumitã iniþial �însãmânþare magneticã�, aceastã tehnicãa fost perfecþionatã ºi adaptatã pentru aplicaþii de mare interesîn biotehnologie ºi medicinã, fiind în prezent cunoscutã dreptmetoda cu �purtãtor magnetic� (PM). Ea constã în ataºareaselectivã, permanentã sau temporarã, de o microparticulã cumoment magnetic mare (�purtãtorul magnetic�), a unor entitãþinemagnetice, cum ar fi: compuºi biologic activi, celule rare,elemente subcelulare, acizi nucleici, microorganisme pato-gene, xenobiotice etc. urmatã de vectorizarea (separarea, diri-jarea sau fixarea) prin sisteme magnetice a complexelor astfelformate. Existã cazuri când o anumitã structurã biologicã,datoritã dimensiunilor mai mari, poate fi �activatã� magneticprin introducerea purtãtorilor în interiorul acesteia (2, 6).

Principiul separãrii unui amestec format din douã com-ponente aflate într-un mediu lichid, utilizând purtãtori mag-netici este prezentat în fig. 1.53.

Fig. 1.53. Principiul separãrii cu purtãtor magnetic :a � amestec de douã tipuri de particule nemagnetice;b � introducerea purtãtorului magnetic ; c � ataºarea

selectivã a purtãtorului de particulele nemagnetice (þintã) ;d � dupã separarea magneticã, rãmân doar particulele

nevizate ca þintã (190)

34

Legãtura prin care se realizeazã complexul magnetic � dintr-unpurtãtor magnetic (PM) ºi o entitate nemagneticã (EN) � poatefi de bioafinitate sau de naturã elecrostaticã (fig. 1.54).

Fig. 1.54. Modalitãþi de cuplare dintreun purtãtor magnetic (PM) ºi o entitate nemagneticã (EN)

(dupã Gh. Iacob, Al. D. Ciochinã, 1999, modificat)

Metodele de complexare depind totodatã de dimensiunileºi de tipul purtãtorului magnetic.

1.3.3.2. Tipuri de purtãtori magnetici

În aplicaþiile biomedicale sunt utilizate mai multe tipuri depurtãtori magnetici, ale cãror proprietãþi diferã în funcþie dediferitele necesitãþi în cadrul tehnicilor ºi metodelor care îiînglobeazã. Biocompatibilitatea acestora se realizeazã în prin-cipal prin procedee de acoperire, sau chiar prin înglobareamaterialului magnetic într-o matrice polimericã (gelatinã, dex-tran, etilenglicol, cianoacrilaþi sau alte substanþe), care devineastfel o structurã magneticã.

Nanoparticulele magnetice

Nanoparticulele magnetice sunt obþinute prin metode meca-nice sau prin procedee fizico-chimice din compuºi pe bazã defier, nichel sau cobalt.

Prin nanotehnologii specifice pot fi acoperite cu diverºipolimeri (gelatinã, dextran, polilactide, cianoacrilat º.a.) saupot constitui material de inserþie într-o structurã nemagneticã,

35

cel mai ades un polimer biocompatibil. Au o bunã capacitatede legare a substanþelor biologic active ºi sunt relativ stabilein vivo.

Nanoparticulele feri- sau feromagnetice intrã de regulã încomponenþa fluidelor magnetice, fiind folosite în general subaceastã formã.

În mediu lichid nanoparticulele au un comportament super-paramagnetic (nu prezintã remanenþã).

Microsferele magnetice

Microsferele magnetice sunt realizate fie prin acoperirea unuimiez magnetic (fier pur sau magnetitã) cu pelicule biocom-patibile, fie prin inserarea, într-un polimer biocompatibil, amaterialului magnetic (oxizi de fier), în proporþie de 15-25%.De exemplu, purtãtorii magnetici de tipul Dynal® (produºi înSuedia, din 1982), conþin în volum 15-20% Fe3O4, ceea ce leconferã o comportare superparamagneticã în medii lichide.

Microsferele din material magnetic amorf constituie o nouãcategorie de purtãtori magnetici (fig. 1.55), obþinutã la Insti-tutul Naþional de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizicã Tehnicã� IFT Iaºi (199).

Fig. 1.55. Purtãtori magnetici amorfi (PMA) (199)

Purtãtorii magnetici din material magnetic amorf (PMA)au fost obþinuþi pe o instalaþie tehnologicã originalã, printr-unprocedeu de atomizare în jeturi încruciºate de gaz inert lichid(2, 199). Aceºtia au proprietãþi magnetice superioare ºi o bunãbiocompatibilitate în stare neacoperitã.

36

Microsfere polimerice pe bazã de polivinil alcool (PVA)

Particulele polimerice pe bazã de polivinil alcool (PVA), deformã sfericã, au fost sintetizate astfel încât sã înglobeze îninterior un coloid magnetic care sã le ofere proprietãþi mag-netice pentru utilizarea ulterioarã în aplicaþii biomedicale.Particulele au fost sintetizate prin dispersarea unui coloidmagnetic ce conþine o substanþã ferimagneticã într-o soluþieapoasã de PVA, bogatã în grupãri reactive hidroxil. Amesteculrezultat este introdus apoi într-o fazã organicã ce conþine unamestec de doi emulgatori (combinaþii între Tetronic 901,Tetronic 904, Teronic 908, Tetronic 1104 ºi Tetronic 1107),peste care se adaugã un agent de reticulare hidrosolubil. Agen-tul de reticulare va reacþiona cu grupele hidroxil ale PVA,formând astfel particulele de polimer. Procedeul a fost denumit�metoda reticulãrii în suspensie�.

Particule fier-carbon

Aceste particule se obþin prin trei procedee: reducerea cata-liticã a fierului ºi carbonului, mãcinarea de lungã duratã afierului împreunã cu pudra de carbon, respectiv prin recon-densarea plasmaticã a fierului ºi carbonului. Dimensiunileparticulelor fier-carbon sunt cuprinse între 0,001 µm ºi 1 µm,fiind alcãtuite dintr-un miez de fier sau oxid de fier, acoperitcu o peliculã finã de carbon.

Faza carbonicã poroasã le conferã o suprafaþã specificãmare, astfel cã acest tip de purtãtor este un excelent absorbant.

Miezul feromagnetic le permite ghidarea ºi aglomerarea încâmpuri magnetice de intensitate relativ scãzutã.

Magnetolipozomii

Lipozomii magnetici (magnetolipozomii) se constituie într-oclasã aparte de purtãtori magnetici. Sintetizaþi pentru primadatã în 1988, acest nou tip de vezicule constã într-un miez deoxid de fier, de dimensiuni nanometrice, înconjurat de un stratbilipidic fosfolipidic.

37

În unele aplicaþii biotehnologice ºi medicale au început sãfie testaþi magnetolipozomii ca suporturi pentru prelucrareaenzimelor, pentru fixarea anticorpilor, dar ºi în tratamentulunor tipuri de tumori maligne.

Magnetolipozomii, clasã aparte de purtãtori magnetici,prezintã numeroase aplicaþii în biologie ºi medicinã, posedândîn acelaºi timp, un important potenþial de a-ºi lãrgi aria deaplicaþii în viitor.

Bacteriile �magnetice�

Bacteriile �magnetice� sau magnetostatice au capacitatea de asintetiza intracelular particule cristaline de oxizi de fier, cudimensiuni cuprinse între 50 µm ºi 100 µm (fig. 1.57).

Fig. 1.57. Bacteria Magnetospirillum Gryphiswaldense:conþine pânã la 60 de particule de magnetitã,aranjate în magnetolipozomi înlãnþuiþi (251)

Aceste particule sunt acoperite cu o membranã fosfolipi-dicã (10-100 nm), formând structuri intracelulare, numite mag-netozomi. Magnetozomii reprezintã o categorie aparte de or-ganite celulare utilizate pentru navigarea geomagneticã a mi-croorganismelor în habitatul lor acvatic, comportament numitmagnetotaxie. Magnetotaxia faciliteazã dispunerea acestui grupde bacterii la nivelul zonelor microoxice (sãrace în oxigen)propice dezvoltãrii lor, zone aflate în general pe fundul apelornaturale cu stratificare chimicã (251).

38

Caracteristicile unice ale magnetozomilor au stârnit un larginteres interdisciplinar, actualmente aceºtia fiind studiaþi avân-du-se în vedere o mare varietate de aplicaþii în diverse domenii,începând cu microbiologia, geobiologia ºi biologia celularã ºiterminând cu bio(nano)tehnologia (253).

Datoritã potenþialului foarte mare al bacteriilor magneto-tactice ºi al magnetosomilor, inclusiv în ceea ce priveºte obþi-nerea de purtãtori magnetici, posibilitatea cultivãrii la scarãindustrialã a acestor microorganisme ºi obþinerea unor cantitãþisuficiente de magnetozomi cu proprietãþi ultrastructurale ºimagnetice de bunã calitate, constituie una din preocupãrilecercetãtorilor pe plan internaþional (163, 252-253).

Fluidele magnetice (ferofluidele)

Ferofluidele sunt nanofluide magnetice, ºi se pot prezenta submai multe forme (254-255):

� suspensii coloidale stabile, (formate din nanoparticulemagnetice introduse într-un mediu de dispersie lichid,care, în prezenþa câmpurilor magnetostatice se comportãca lichide newtoniene omogene);

� emulsii magnetizabile;� compozite magnetofluidice;� lichide magnetice polimerizabile.

Procedeele de elaborare a fluidelor magnetice se bazeazãpe procese de condensare chimicã ºi utilizeazã metoda copre-cipitãrii pentru sintetizarea nanoparticulelor magnetice, res-pectiv metoda stabilizãrii sterice pentru obþinerea unei varie-tãþi foarte largi de ferofluide (peste 50), cu aplicaþii atât îndomeniile tehnice, cât ºi în cel biomedical. Fluidele magneticeau ca mediu de dispersie diferite categorii de lichide de bazã:hidrocarburi uºoare ºi greu volatile (uleiuri minerale), uleiurisintetice (diesteri), alcooli, cetone, amine, apã, uleiuri vege-tale, lubrifianþi º.a., iar magnetizaþia lor, în funcþie de aplicaþiadoritã, variazã de la 1-3 kA/m, pânã la 90-100 kA/m.

Cele mai accentuate proprietãþi magnetice au fost obþinutecu ferofluide ce conþin nanoparticule de magnetitã (Fe3O4),având ca mediu de dispersie apa (fig. 1.59).

39

Procedeul chimic de preparare constã din combinarea, într-oprimã fazã, a unei sãri a fierului bivalent cu o sare a fieruluitrivalent, pentru a se obþine nanocristalele de magnetitã. Pentruca acestea sã nu formeze aglomerãri, sunt acoperite, într-o adoua etapã, cu un surfactant (stabilizator), care este format dinunul sau mai multe straturi de molecule polare. Astfel, nano-particulele de magnetitã capãtã o sarcinã electricã aparentã, ceva determina apariþia unor sarcini electrostatice repulsive,forþe care împiedicã apropierea lor.

Ferofluidele apoase pe bazã de magnetitã sunt cele maiadecvate pentru complexarea, vectorizarea ºi concentrarea mag-neticã (în scop terapeutic) a diferitelor medicamente, cu pre-cãdere a celor antitumorale.

Este unanim acceptat faptul cã nanoparticulele ºi nano-structurile au o serie de proprietãþi specifice, ceea ce necesitãmodificarea tehnicilor de caracterizare standard pentru hemo-compatibilitate. Astfel:

� nanoparticulele au un raport suprafaþã/volum mai mareºi mai mulþi atomi la suprafaþã;

� adsorbþia proteinelor ºi alte interacþiuni guvernate deevenimente moleculare sunt diferite la scalã nanometricã,influenþând rãspunsul în ceece priveºte atât coagularea,cât ºi activarea celularã ºi a complementului.

Deºi nu este o tendinþã sistematicã, studiile în care hemo-compatibilitatea nanoparticulelor a fost mai mult sau mai puþin

Fig. 1.59. Structura unui fluid magnetic pe bazã demagnetitã, având ca mediu de dispersie apa (196)

40

evaluatã, au crescut semnificativ în ultimii ani. Recent, Micha-netzis G, Missirlis YF ºi Antimisiaris SG (295), au publicat oamplã analizã bazatã pe o vastã bibliografie, subliniind faptulcã în majoritatea cazurilor citocompatibilitatea/citotoxicitateaºi testarea in vivo sunt cele mai folosite tehnici de evaluare abiocompatibilitãþii; diferitele tipuri de culturi celulare suntselectate în funcþie de caracteristicile viitoarei aplicãri tera-peutice (calea de administrare, biodisponibilitatea agentuluiterapeutic, dozarea acestuia, etc.). Autorii subliniazã cã testelefolosite pentru studiul hemocompatibilitãþii sunt în cele maimulte cazuri limitate la evaluarea hemolizei, alþi parametri (deex. adezivitatea celulelor sangvine, activarea ºi agregarea pla-chetarã, activarea sistemului de coagulare ºi/sau activarea com-plementului), fiind evaluaþi doar ocazional.

ªi în cea ce priveºte nanoparticulele magnetice evaluareahemocompatibilitãþii este limitatã, în majoritatea situaþiilor, laevaluarea hemolizei, deºi existã ºi alte tehnici uºor accesibile,dar a cãror utilizare sistematicã se impune a fi reglementatãprin protocoale ºi standarde (226, 295).

Testarea in vivo poate fi utilã, dar diferenþele dintre reacti-vitatea sanguinã a diferitelor specii, comparativ cu cea a sân-gelui uman, trebuie avute în vedere, aceste diferenþe putând limitapredictibilitatea (în clinica umanã), a oricãrui test utilizat.

Parametrii ºi reactivitatea sanguinã umanã sunt foarte ase-mãnãtori cu a primatelor non umane, dar reglementãrile Comu-nitãºii Europene interzic utilizarea acestora din urmã pentrutestarea biocompatibilitãþii (inclusiv a hemocompatibilitãþii),instrumentarului medical ºi biomatrialelor.

O altã problemã importantã legatã de testarea hemocompa-tibilitãþii biomaterialelor pe animale constã în lipsa de materialeadecvate pentru testare, de exemplu anticorpii corespunzãtorinecesari investigaþiilor imunologice. Utilizarea sângelui umanpentru evaluarea hemocompatibilitãþii presupune testarea invitro ceea ce necesitã în mod obiºnuit utilizarea anticoagu-lantelor care nu sunt prezente în mod obiºnuit alãturi de instru-mentarul medical sau biomateriale, în situaþiile clinice (cuexcepþia perioadei iniþiale de �implantare�, probabil).

41

Deºi diferenþele dintre specii pot complica evaluarea hemo-compatibilitãþii, utilizarea animalelor pentru testare (pe termenscurt sau lung), este consideratã utilã în special pentru studiultrombozei ºi interacþiunii cu þesuturile.

Evaluarea in vivo a interacþiunii dintre sânge ºi NPM poatefi considerat pasul final înainte de testarea clinicã.

Pentru testarea bio-hemocompatibilitãþii sunt utilizate multespecii animale, acestea fiind alese în funcþie de tipul de testsau de tehnica chirurgicalã. Problemele de bioeticã trebuieidentificate ºi respectate.

Ca ºi studiile in vitro, ºi studiile in vivo sunt eterogene dinpunct de vedere al tehnicilor, metodelor ºi condiþiilor expe-rimentale. Normele ISO 10993 recomandã, pentru evaluareahemocompatibilitãþii, numai un singur test ºi anume �Trombo-genitatea la câine� (297).

Nanoparticulele magnetice ºi-au gãsit în ultimele deceniiimportante aplicaþii în medicinã. Studiile publicate în ultimiiani evocã printre avantajele utilizãrii NPM în administrarea con-trolatã a medicamentelor, reducerea substanþialã a toxicitãþii,administrarea uºoarã ºi nu în ultimul rând o bunã biocompa-tibilitate. În legãturã directã cu aceasta, hemocompatibilitatea,este abordatã încã diferit ºi neunitar, lipsa unei sistematizãri,pe bazã de standarde ºi protocoale de evaluare, fãcându-seresimþitã cu acuitate (96).

1.3.4. Metode de detecþie cu purtãtori magnetici

În prezent, o problemã de cea mai mare importanþã în ºtiinþelebiologice este izolarea, separarea ºi detectarea compuºilorbiologic activi, a unor molecule specifice, a organitelor celu-lare, a unor celule rare, xenobiotice º.a. (14, 190).

Desfãºurarea unui bioproces de izolare ºi/sau separare sebazeazã în mod curent pe tehnici ºi metode care au în vederelegãturile de bioafinitate ºi care reprezintã cea mai preþioasãmodalitate atât sub aspectul selectivitãþii cât ºi al gradului derecuperare a compuºilor intraþi în reacþie.

42

În tabelul 1.2 sunt ilustrate exemple de compuºi imobilizaþipe diferite tipuri de purtãtori magnetici (238).

Tabelul 1.2. Exemple de compuºi imobilizaþi pe purtãtorimagnetici (dupã Safarik et al., 1997, modificat)

Compusul imobilizat Tipulpurtãtorului magnetic

Amilaza Alginat de calciu �magnetic�Alfa-amilaza Poliacroleina paramagneticã

Catalaza Feritã cu stronþiuCelulaza Magnetitã silanizatã

Alfa-chimotripsina Nichel-oxid de nichel + Albumine sericeBeta-galactozidaza Magnetitã +Polietilenemina-glutaraldehida

Glucoamilaza Magnetitã acoperitã cu polietileneminãGlucoamilaza Feritã cu stronþiu acoperitã cu albuminãGlucozoxidaza Magnetitã acoperitã cu polietileneminã, particule

magnetice obþinute din bacterii magneticeBeta-glucozidaza Magnetitã silanizatã, magnetitã activatã cu glutaraldehid-

polietileneminãGlutaminaza Chitinã �magneticã�

Invertaza Magnetitã, particule de nichel acoperite cu siliciuLipaza Derivat �magnetic� de chitosan

Fosfataza Magnetitã, chitinã �magneticã�, chitosan �magnetic�Plasmina Microsfere magnetice acoperite cu amidon

Proteaze (bacteriene) Alginat de calciu �magnetic�Termolizina Magnetitã

Tripsina Chitinã �magneticã�, magnetitã silanizatãUreaza Paturi �magnetice� din polistiren

Ureicaza Particule magnetice din bacterii magnetice

1.3.5. Diagnosticul enzimatic al infarctuluimiocardic acut (IMA)

Testele imunomagnetice au fost încercate cu oarecare succesºi în diagnosticul enzimatic al IMA.

Pornind de la faptul cã atât mioglobina (MIO) cât ºi FABP(Fatty Acid-Binding Protein) au niveluri serice crescute înprimele ore de la declanºarea unui IMA (având o creºteresemnificativã la douã ore de la debut ºi un maxim la patruore), Hayk ºi colab. au conceput ºi testat o metodã imuno-magneticã de tip sandwich pentru determinarea simultanã acelor douã enzime (151). În cadrul metodei s-a folosit o fazãsolidã, standard (ELISA), constând din formarea unui complex

43

prin ataºarea a doi anticorpi diferiþi la doi epitopi diferiþi aiaceluiaºi antigen-þintã.

1.3.6. Eliminarea celulelor leucemice din mãduvahematogenã

Celulele leucemice, asemeni leucocitelor sãnãtoase, nu pre-zintã un magnetism intrinsec, fapt pentru care nu pot fi depla-sate sau concentrate sub acþiunea unui câmp magnetic. Acestfapt nu împiedicã eliminarea lor din mãduva osoasã hema-togenã, care se poate face prin cuplarea prealabilã cu un pur-tãtor magnetic, complexul astfel rezultat putând fi mobilizatcu ajutorul unui câmp magnetic extern. Un asemenea lanþprocedural este prezentat în fig. 1.66. Acesta ar cuprinde prin-cipial trei etape (190, 224).

Fig. 1.66. Schema lanþului procedural pentruformarea unui complex purtãtor magnetic (PM) �

celulã leucemicã (CL) (222)

Într-o primã etapã, purtãtorul magnetic (PM) poate fi cuplatcu anticorpi specifici ce prezintã bioafinitate pentru celulaleucemicã, rezultând un PM activat.

A doua etapã s-ar materializa prin introducerea acestorpurtãtori magnetici activaþi în mãduva hematogenã, rezultândcomplexe PM � CL; aceste complexe vor prezenta proprietãþimagnetice manifeste datorate prezenþei PM.

În a treia etapã, mãduva hematogenã astfel tratatã poate fifiltratã magnetic (prin metoda HGMS), eliminându-se com-plexele magnetice ºi implicit celulele leucemice. Activareapurtãtorului magnetic cu anticorpi poate fi realizatã indepen-dent de celelalte douã etape. Dupã activare, acesta se poateconserva ºi reutiliza.

44

Reuºita eliminãrii pe cale magneticã a celulelor leucemicear permite un eventual autotransplant de mãduvã osoasã hema-togenã, dupã schema prezentatã în fig. 1.67.

Fig. 1.67. Schema unui posibil transplant de mãduvã osoasãhematogenã, purificatã in vitro prin tehnica PM (197)

1.3.7. Radioterapia locoregionalã cu purtãtori magnetici

Radioterapia locoregionalã prin metode magnetice încearcã sãelimine inconvenientele celei clasice, legate de afectarea tegu-mentarã, a þesuturilor ºi a organelor vecine procesului tumoral(190). Iradierea selectivã a unei tumori este posibilã prin teh-nica cu purtãtori magnetici, de regulã fiind folosite microsferemagnetizabile biocompatibile, alcãtuite dintr-o matrice poli-mericã în care sunt inserate nanoparticule de magnetitã (2,215). Acestea sunt cuplate, prin procedee specifice, cu anumitetipuri de izotopi, dupã care sunt dirijate în zona tumoralã.

Un câmp magnetic aplicat din exterior asupra tumorii fixeazãpurtãtorii activaþi cu radioizotopi, astfel încât emisia radio-activã se produce strict intratumoral, pânã la o distanþã fixã,dependentã de tipul de emisie al radioizotopului, sau cel multîn imediata vecinãtate.

Principiul radioterapiei intratumorale prin tehnica purtã-torului magnetic este prezentat în fig. 1.68.

Au fost publicate studii preclinice privind radioterapia locore-gionalã intracavitarã ºi intraspinalã, elaborându-se ºi modelede tratare a tumorilor reziduale mici, solide, restante în urmaintervenþiilor chirurgicale, sau modele pentru terapia unor tumorisituate în zone inabordabile prin procedeele clasice.

45

1.3.8. Hipertermia intratumoralã terapeuticãindusã electromagnetic

Aplicarea unui tratament termic într-o anumitã zonã a corpului,ce are drept consecinþã creºterea temperaturii locale pânã la41-47 °C, se numeºte hipertermie. Cunoscutã ca metodã detratament încã de acum 3000 de ani, când egiptenii ardeautumorile superficiale, hipertermia produce necrozã acutã, coa-gulare proteicã, sau carbonizarea þesutului supus tempera-turilor înalte.

Aplicarea hipertermiei ca metodã terapeuticã în oncologieare la bazã particularitãþile de vascularizare ºi de aport sanguinale tumorilor faþã de þesuturile normale. În general, aportulsanguin în majoritatea tumorilor solide este adesea dezor-ganizat ºi eterogen, având ca rezultat existenþa de arii slabperfuzate în interiorul tumorii. În plus, aceastã deficienþã cir-culatorie prezentã în masa tumoralã conduce la o slabã disiparea cãldurii, tumora putând deveni mai �fierbinte� decât þesu-turile normale înconjurãtoare, atunci când þesutul tumoral estesupus unui tratament termic local.

Hipertermia cu fluide magnetice este un nou domeniu altratamentului tumorilor care, datoritã avantajelor pe care leprezintã faþã de hipertermia clasicã se va impune cu siguranþãîn viitor.Hipertermia intratumoralã se bazeazã pe creºtereatemperaturii nanoparticulelor magnetice, indusã de absorbþiade energie electromagneticã, atunci când acestea sunt plasate

Fig. 1.64. Principiul radioterapiei intratumoraleprin tehnica purtãtorului magnetic

(dupã Gh. Iacob, Al. D. Ciochinã ºi colab., 2001, modificat)

46

în câmpuri de înaltã frecvenþã. Suspensiile coloidale magneticesunt introduse în zona tumoralã, astfel încât nanoparticulele sãse distribuie uniform în volumul tumoral. Aplicarea pe o anu-mitã perioadã de timp (2-4 ore) a unui câmp electromagneticde frecvenþã relativ înaltã (0,5-10 MHz) ºi a cãrui intensitateeste relativ scãzutã, determinã creºterea temperaturii intratumo-rale. Temperatura indusã prin intermediul nanoparticulelormagnetice poate atinge 42-47 0C, valoare suficientã pentru aafecta ireversibil funcþionalitatea celulelor tumorale (fig. 1.69).

Fig. 1.69. Principiul hipertermiei intratumorale indusãelectromagnetic (222)

S-a constatat cã ferofluidele au o ratã mai mare de absorbþiea energiei decât nanoparticulele disperse, numãrul crescut departicule nanometrice din ferofluid producând o energie depo-zitatã uniform în interiorul volumului sãu, spre deosebire denanoparticulele disperse, ce realizeazã un numãr distinct desurse de încãlzire.

1.3.9. Vectorizarea ºi concentrarea locoregionalãa agenþilor terapeutici prin metode magnetice

În ultimii douãzeci de ani s-au cãutat noi tehnici ºi metodecare sã conducã la o mai bunã concentrare locoregionalã aagenþilor terapeutici, cu precãdere a acelora cu indice tera-peutic scãzut, realizându-se cercetãri privind concentrarea me-dicamentelor cu ajutorul antigenelor sau prin încapsulare înlipozomi (15, 65, 110, 197, 226).

Domeniul vizat cu prioritate a fost chimioterapia antitumo-ralã, acolo unde protocoalele terapeutice convenþionale con-stau din administrarea unei cantitãþi mari de medicament cu

47

potenþiale efecte citotoxice locale ºi generale, afectarea þesu-turilor aparent sãnãtoase conducând de multe ori chiar la între-ruperea terapiei.

În ultimii zece ani au fost publicate din ce în ce mai multestudii care abordeazã tratamentul antitumoral prin utilizareaunor noi metode de vectorizare, între care ºi metoda �pur-tãtorului magnetic�, vectorizarea citostaticului complexat cuun purtãtor magnetic efectuându-se cu ajutorul unui câmpmagnetic extern.

Ultimii ani aduc numeroase alte studii experimentale ºiclinice privind vectorizarea magneticã a citostaticelor (20-24,29, 34, 108-109). Pe baza acestora se pot avansa o serie deconcluzii privind vectorizarea ºi concentrarea locoregionalã amedicaþiei citostatice:

� vectorizarea ºi concentrarea locoregionalã a medicaþieiantitumorale prin metode magnetice a permis localizareaîn þesutul �þintã� a peste 70% din doza administratã, cuinteracþiuni minime ºi toxicitate redusã faþã de celulelenormale;

� s-au observat creºteri de pânã la 8 ori a concentraþieimedicamentului în þesutul þintã, dupã administrarea anumai o treime din doza standard de medicament; ceamai mare parte a acestei distribuþii este rezultatul vec-torizãrii magnetice, constatându-se eliberãri minime desubstanþã activã pe durata transportului (în þesuturilenonþintã) ºi o eliberare localã prelungitã în þesutul þintã;

� permeabilitatea vascularã crescutã a þesuturilor neoplazice(de aproximativ opt ori mai mare decât a celor sãnã-toase), alãturi de difuzia mult mai accentuatã (de aproxi-mativ 33 de ori mai mare), permit agenþilor chimiotera-pici eliberaþi sã penetreze foarte uºor þesutul tumoral.

Vectorizarea magneticã ºi concentrarea locoregionalã a me-dicamentelor prin metoda purtãtorului magnetic se aratã a fi ometodã valabilã pentru a fi studiatã ºi eventual aplicatã ºi înalte situaþii cum ar fi tratamentul cu antiinflamatoare sau toni-cardiace, þinându-se cont de avantajele oferite prin reducerea

48

dozei administrate, concomitent cu o creºtere semnificativã aconcentraþiei ºi deci ºi a eficienþei terapeutice în þesuturileþintã. Cercetãrile în domeniul terapiei antitumorale cu purtãtorimagnetici, deºi încã mai necesitã unele clarificãri teoretice ºiexperimentale, se anunþã ca o alternativã încurajatoare, cuprecãdere acolo unde terapia clasicã s-a dovedit ineficientã.

1.3.10. Nanoparticule magnetice � agenþide contrast în imagistica prin rezonanþãmagneticã nuclearã (IRM)

Rezonanþa magneticã nuclearã (RMN) se bazeazã pe proprie-tãþile magnetice ale atomilor, fiind rezultatul absorbþiei în moddiferit de cãtre substanþe a unei radiaþii electromagnetice spe-cifice. Imagistica prin rezonanþã magneticã nuclearã este ometodã de explorare neinvazivã, ce are drept scop realizareaunei imagini bidimensionale dintr-o anumitã secþiune a cor-pului, din care este posibilã apoi obþinerea unei imagini tridi-mensionale, pornind de la un numãr mare de secþiuni, sauchiar a unei înregistrãri tridimensionale care aduce importanteinformaþii cu privire la starea fiziologicã sau patologicã aþesuturilor. Substanþele de contrast paramagnetice folosite înrezonanþa magneticã nuclearã micºoreazã timpii de relaxare aiþesuturilor în care se fixeazã ceea ce conduce la o mai rapidãrevenire a protonilor din starea excitatã în starea iniþialã deechilibru. Scãderea timpilor de relaxare duce la scãderea inten-sitãþii semnalului provenit din zonele în care sunt distribuiþiagenþii de contrast, comparativ cu intensitatea semnalului dinzonele învecinate, realizându-se astfel un contrast ridicat alimaginii (145-147).

În prezent sunt sunt testaþi trei tipuri de agenþi de contrast:macromolecule complexate cu ioni paramagnetici, nanopar-ticule superparamagnetice de oxid de fier, nanoparticule super-paramagnetice acoperite cu surfactant (147).

Aplicaþiile biomedicale ale separãrii magnetice reprezintãun domeniu în plinã expansiune, cãruia i se dedicã tot maimulte colective de cercetare.

49

PARTEA PERSONALÃ

Capitolul 2

MOTIVAREA CERCETÃRII

Un domeniu nou de cercetare, chiar pe plan internaþional,aproape ignorat în þarã, a constituit o provocare ºi a reprezentatmotorul ºi principala motivaþie pentru o implicare susþinutã ºide duratã.

Într-o primã fazã, prin colaborarea dintre Institutul de FizicãTehnicã � IFT Iaºi ºi Facultatea de Bioinginerie Medicalã aUniversitãþii de Medicinã ºi Farmacie �Gr. T. Popa� Iaºi, s-aconstituit un colectiv de cercetare, sub conducerea dr. fiz. Gh.Iacob, care ºi-a propus identificarea ºi soluþionarea unor pro-bleme teoretice, legate de particularitãþile pe care le presu-punea noul domeniu de aplicaþie � cel biomedical � pentrumetodele de separare magneticã.

A urmat cãutarea ºi conturarea unor soluþii practice pentruabordarea separãrii (concentrãrii) în gradient înalt de câmpmagnetic (metoda HGMS) a eritrocitelor, în vederea obþineriide masã eritrocitarã.

În acest sens, accesând mai multe granturi de cercetare, afost pus la punct un prototip original de separator magnetic(ulterior brevetat ºi premiat la Salonul Internaþional de laGeneva) destinat separãrii (concentrãrii) în laborator a eritro-citelor, utilizând metoda HGMS.

Acest prototip l-am utilizat în studiul nostru pentru a de-monstra viabilitatea acestei metode (HGMS) în vederea obþi-nerii de masã eritrocitarã (concentrat eritrocitar).

În acelaºi timp, pe plan internaþional, s-a constatat o creº-tere exponenþialã a studiilor ºi cercetãrilor dedicate domeniului:apariþia unor micromagneþi permaneþi pe bazã de pãmânturi

50

rare, dezvoltarea ºi diversificarea � tipologicã ºi dimensionalã� a diferitelor tipuri de microsfere magnetice, a unor soluþiidisperse (ferofluide magnetice) cu o mare diversitate, cul-minând cu evoluþia extrem de dinamicã, mai ales în ultimuldeceniu, a unui subdomeniu de mare complexitate ºi cu realeperspective: cel al nanoparticulelor magnetice.

Capitolul 3

OBIECTIVELE CERCETÃRII

Pentru abordarea acestui nou domeniu de cercetare a fostnecesarã de la început o activitate susþinutã, în primul rând cuprivire la integrarea într-o echipã coerentã a fizicienilor ºimedicilor, fapt care a solicitat un dialog continuu, pentru înþe-legerea ºi aprofundarea reciprocã a complexitãþii ºi particula-ritãþilor fenomenelor studiate.

Un prim obiectiv preliminar, de maximã importanþã, l-aconstituit omogenizarea colectivului interdisciplinar de lucru,ceea ce a presupus, pe de o parte întelegerea fenomenelorcomplexe ce fac obiectul delicatului domeniu al proprietãþilormagnetice ale substanþelor, iar pe de altã parte modul în careacestea se pot manifesta sau pot influenþa structurile biologice.

Însuºirea unui limbaj comun, acurateþea ºi exactitatea înutilizarea noþiunilor teoretice a reprezentat o etapã esenþialãpentru stabilirea direcþiilor de cercetare ºi pentru construireacelor mai adecvate protocoale de lucru.

Un al doilea obiectiv preliminar a fost acela de a stabilidirecþiile de cercetare, fundamentarea teoreticã pentru temelepropuse a fi abordate, alãturi de stabilirea unor protocoale delucru care sã permitã atât acurateþea unor demonstraþii, cât ºireproductibilitatea rezultatelor prezumate a fi obþinute.

În acest fel s-a putut contura obiectivul principal al cer-cetãrii de faþã, ºi anume, validarea unor aplicaþii medicale aleprocedeelor electromagnetice de separare ºi vectorizare în

51

calitatea lor de tehnici ºi metode a cãror utilizare poate aduceimportante beneficii ºi avantaje certe pentru practica medicalã.

Pentru aducerea la îndeplinire a acestui obiectiv, au foststabilite o serie de obiective secundare, corespunzãtor direc-þiilor ºi temelor propuse a fi abordate.

Pornind de la existenþa unui prototip original de separatormagnetic în gradient înalt de câmp magnetic (metoda HGMS),un prim obiectiv secundar al cercetãrilor noastre l-a constituittestarea acestui prototip pentru separarea (concentrarea) încâmp magnetic a eritrocitelor, cu perspectiva eventualã de aputea valida prin acest procedeu o nouã metodã de obþinere aconcentratului eritrocitar (masã eritrocitarã), produs extrem desolicitat la nivelul Centrelor de Recoltare ºi Transfuzii de Sânge.

Al doilea obiectiv secundar avut în vedere l-a constituittestarea in vitro ºi in vivo a comportamentului unor micro-particule magnetice originale pe bazã de magnetitã, integrateîn douã tipuri dintr-un ferofluid original, conceput ºi realizatla Institutul de Fizicã Tehnicã � IFT Iaºi.

În acest sens au fost abordate urmãtoarele aspecte:

� determinarea, in vivo, a toxicitãþii acute a celor douãsorturi de ferofluid;

� determinarea unui eventual efect antibacterian (bacte-riostatic ºi/sau bactericid) al ferofluidului, dupã cumsugereazã unele date din bibliografia consultatã (32, 97,164, 291, 292);

� influenþa câmpului magnetic permanent, aplicat extern,asupra edemului inflamator experimental.

Al treilea obiectiv secundar se referã la producerea unuimodel experimental de inflamaþie acutã ºi evaluarea influenþeicâmpului magnetic aplicat extern asupra edemului inflamatorprodus experimental.

Al patrulea obiectiv secundar a fost studierea eficienþeivectorizãrii ºi ulterior a concentrãrii locoregionale a unor me-dicamente antiinflamatoare asupra edemului inflamator expe-rimental. Experimentele efectuate in vitro ºi in vivo vor utilizacele douã tipuri de ferofluid original hidrosolubil, obþinute ºi

52

caracterizate anterior, iar antiinflamatoarele alese pentru stu-diu au fost diclofenacul ºi piroxicamul.

Al cincilea obiectiv secundar îl constituie abordarea alteidirecþii de cercetare, în care metodele (electro)magnetice deseparare, vectorizate ºi concentrare ar putea constitui o alter-nativã valabilã ºi eficientã faþã de metodele clasice: detoxi-fierea sângelui prin metode magnetice (hemodializa magneticã).

Al ºaselea obiectiv secundar se referã la testarea eficienþeiprocedeelor de vectorizare ºi concentrare locoregionalã cureferire la embolizarea terapeuticã în anevrismele vascularecerebrale. Este o problemã extrem de delicatã, cãreia micro-neurochirurgia, domeniu de vârf în continuã ºi spectaculoasãascensiune, îi dedicã astãzi o atenþie specialã pe plan inter-naþional.

Prin aceste obiective, au fost trasate direcþiile principalepentru desfãºurarea cercetãrilor noastre conturându-se pre-mizele unei abordãri riguroase ºi diversificate a domeniuluiluat în studiu.

Capitolul 4

MATERIAL ªI METODÃ

O serie de studii ºi cercetãri preliminare (14, 39, 71, 196--200, 220-225, 228), efectuate în cadrul unei echipe multidis-ciplinare, ne-au permis acumularea unor cunoºtinþe ºi deprindericare au stat la baza stabilirii obiectivelor cercetãrii de faþã. Deasemenea, pe baza experienþei acumulate, au fost stabiliteprotocoalele de lucru pentru direcþiile ºi subdomeniile pe carele-am abordat în aceastã cercetare. Considerând, pe baza biblio-grafiei consultate ºi a unei experienþe anterioare acumulate, cãmetodele de separare în gradient înalt de câmp magnetic (metodaHGMS) îºi pot gãsi o serie de aplicaþii importante în medicinãºi biotehnologie, am ales sã utilizãm, în studiile întreprinse,douã tipuri de separare magneticã, cea directã ºi cea indirectã.

53

4.1. Separarea eritrocitelor în gradientînalt de câmp magnetic

Separarea sângelui în componentele sale se bazeazã pediferenþele dintre proprietãþile lor fizice, cum ar fi diferenþadintre densitãþi la separarea prin centrifugare, sau diferenþadintre proprietãþile electrice, în electroforezã.

Având în vedere caracterul slab paramagnetic al eritro-citelor se poate prezuma posibilitatea separãrii ºi concentrãriiacestora prin metoda HGMS.

4.1.1. Prototipul unui separator magnetic original,cu gradient înalt de câmp, pentru eritrocite

Pentru evidenþierea ºi studierea unor aspecte privind separareaeritrocitelor în gradient înalt de câmp magnetic am utilizat unprototip original de separator HGMS, conceput ºi realizat deGh. Iacob ºi N. Rezlescu în conformitate cu un brevet deinvenþie (194, 195).

Acest separator este alcãtuit din trei componente principale,ºi anume: sursa de câmp magnetic de fond, circuitul magneticde retur ºi o matrice magneticã filamentarã (fig. 4.1 ºi fig. 4.2).

Fig. 4.1. Separator magnetic HGMS originalpentru eritrocite (schemã generalã)

54

Matricea magneticã este alcãtuitã dintr-o reþea de fire fero-magnetice foarte subþiri ºi inoxidabile realizând o matriceHGMS filamentarã (fig. 4.3). Factorul de împachetare al ma-tricei magnetice (volumul efectiv al firelor raportat la volumulîn care se gãsesc) este F=0,39.

Fig. 4.2. Prototipul de separator HGMS pentru eritrocite

Fig. 4.3. Matricea magneticã filamentarã

Aspectele experimentale au vizat: în primul rând, determi-narea performanþelor circuitului magnetic, respectiv a induc-þiei de fond în spaþiul de lucru al separatorului, pornind de lafaptul cã aceasta este principalul parametru de care depindecaptarea ºi reþinerea eritrocitelor pe firele feromagnetice alematricei; într-o a doua etapã s-a trecut la evaluarea eficienþeiprocesului de separare magneticã a eritrocitelor.

55

4.1.2. Determinarea performanþelor circuitului magnetic

Inducþia magneticã în întrefierul unde este plasatã matriceamagneticã (inducþia magneticã de fond) a fost determinatãpentru 6 valori ale întrefierului de lucru (fig. 4.4).

Fig. 4.4. Curbele de variaþie ale inducþiei magnetice de fond(B) în spaþiul de lucru al separatorului magnetic original

determinate pentru ºase valori ale întrefierului

Pentru determinarea performanþelor magnetice s-au trasatexperimental curbele de variaþie ale inducþiei magnetice func-þie de curentul de magnetizare al celor douã bobine generatoarede câmp magnetic, B = f (I).

Pentru ridicarea curbelor de variaþie ale inducþiei magnetices-a folosit un montaj experimental (fig. 4.5) alcãtuit din:

� un redresor cu seleniu în dublã punte trifazatã ºi reglajbrut în trepte (tip PTG 220/10);

� un grup de reostate pentru reglajul fin al intensitãþiicurentului;

� ampermetru de curent continuu (AEM tip C 4, clasã 0,2);� gaussmetru digital cu sondã Hall transversalã (tip MG

50P- WSI).

Au fost trasate experimental curbele de variaþie ale induc-þiei magnetice funcþie de curentul de magnetizare al celor douãbobine generatoare de câmp magnetic, B = f (I).

Valorile inducþiei magnetice de fond, mãsurate în spaþiulde lucru, sunt prezentate în tabelul 4.1.

56

Fig. 4.5. Schema montajului experimental utilizat pentrudeterminarea performanþelor magnetice ale modelului de

filtru (198)

Tabelul 4.1. Valorile inducþiei magnetice de fond mãsurateîn spaþiul de lucru

I (A) 0 0,15 0,39 0,56 0,77 1,03 1,51 2 2,52 3 3,5 3,6

B (T)

d = 2,80,06 0,56 1,02 1,33 1,56 1,72 1,85 1,91 1,94 1,96 2,01 2,02

B (T)

d = 3,40,06 0,44 0,87 1,12 1,36 1,57 1,76 1,83 1,89 1,95 1,98 2,01

B (T)

d = 4,10,06 0,4 0,75 0,99 1,23 1,44 1,66 1,77 1,88 1,94 1,97 1,98

B (T)

d = 4,70,06 0,37 0,69 0,9 1,15 1,35 1,61 1,74 1,85 1,93 1,97 1,99

B (T)

d = 5,40,06 0,33 0,62 0,82 1,06 1,26 1,51 1,68 1,82 1,92 1,97 1,98

B (T)

d = 6,70,06 0,26 0,55 0,74 0,93 1,14 1,41 1,6 1,76 1,9 1,98 1,99

Ca urmare a mãsurãtorilor efectuate, s-au impus o serie deobservaþii privind parametrii de funcþionare ai modelului defiltru magnetic ºi anume:

� valoarea inducþiei remanente este micã (0,06 T): firelematricei magnetizate la o inducþie de fond rezidualã de0,06 T nu genereazã o forþã magneticã capabilã sã reþinãeritrocitele, atunci când este anulat curentul de alimen-tare al bobinelor filtrului;

� se poate obþine o inducþie magneticã egalã sau mai marede 1,97 T la o intensitate de 3,5 A ºi la o valoare aîntrefierului situatã pânã la 6,6 mm (acest fapt sugereazãcã s-ar putea modifica grosimea matricei magnetice, fieprin creºterea numãrului de straturi mãrindu-se astfelcapacitatea de captare), fie prin introducerea unui stratizolator termic între piesele polare ºi carcasa matricei,

57

pentru evitarea încãlzirii matricei în cazul funcþionãriiîndelungate a filtrului;

� curbele de magnetizare indicã faptul cã în spaþiul util delucru al modelului de filtru se poate obþine o inducþiefoarte ridicatã de 1,7 � 1,9 T chiar la valori relativ miciale curentului de magnetizare (2 � 2,5 A) datoritã pier-derilor reduse ale circuitului magnetic; acest fapt esteavantajos din punctul de vedere al gradului de încãlzirea filtrului magnetic la o funcþionare îndelungatã;

� s-a obþinut valoarea B ³ T în douã cazuri : la d = 2,8 mmºi I = 3,5 � 3,6 A, precum ºi la d = 3,4 mm ºi I = 3,6 A;în primul caz valoarea întrefierului a fost consideratãprea micã pentru matricele magnetice construite (dato-ritã jocurilor mecanice, în cazul cuplãrii curentului existariscul de �strivire a matricei� având în vedere forþamagneticã extrem de mare exercitatã între cele douãpiese polare); în al doilea caz, valoarea întrefierului esteadecvatã plasãrii matricei ºi constituie varianta optimãde lucru pentru filtrul magnetic.

4.1.3. Stabilirea ºi verificarea vitezei medii de curgereprin matricea magneticã ordonatã

Al doilea parametru important în captarea ºi reþinerea glo-bulelor roºii, dupã valoarea câmpului magnetic de fond, esteviteza medie de curgere a sângelui prin matrice.

Captarea ºi reþinerea unui eritrocit pe un fir feromagneticpoate avea loc doar dacã forþa magneticã exercitatã asupra luieste egalã sau mai mare decât forþa de dragare hidrodinamicã.

Forþa hidrodinamicã depinde de viteza de curgere a lichi-dului, în cazul unei curgeri laminare aceasta fiind direct pro-porþionalã cu viteza relativã a eritrocitului.

Pentru a evalua viteza medie (vm) cu care sângele strãbate

spaþiile libere dintre firele feromagnetice ale matricei, s-a luatîn calcul o secþiune medie reprezentatã de aria lateralã a unuicilindru aplatizat având o grosime 0,6 mm (dimensiune datãde cele 4 straturi de fire suprapuse) ºi un diametru F = 25 mm.

58

4.1.4. Separarea eritrocitelor umane prin metoda HGMS

Probele de sânge, utilizate în cadrul experimentãrilor, au fostrecoltate de la 10 voluntari sãnãtoºi, cu respectarea legislaþieiîn vigoare. Subiecþii, 5 de sex masculin ºi 5 de sex feminin, auavut vârsta cuprinsã între 22 ºi 25 de ani, media fiind 23,5 ani.

Fiecãrui subiect i s-a efectuat un examen clinic complet, cuevidenþierea absenþei din antecedentele personale a oricãreiboli cronice, urmat de o hemoleucogramã completã ºi un exa-men sumar de urinã. Examenul de sânge ºi de urinã, pentrufiecare subiect, au prezentat valori care s-au situat în limitenormale. Dupã recoltare, sângele a fost tratat cu un anticoa-gulant, respectiv EDTA tripotasic (acid etilen-diamino-tetra--acetic). Pentru experimente s-a utilizat sânge integral ºi sângediluat în trei diluþii succesive.

Testele s-au efectuat în diverse condiþii de proces, variin-du-se în principal inducþia magneticã de fond ºi viteza decurgere.Montajul utilizat pentru experimentãri este reprezentatschematic în figura 4.8.

Fig. 4.8. Montajul experimental pentru separareaeritrocitelor (225)

59

În cursul experimentelor au fost modificaþi urmãtorii para-metri:

� valorile inducþiei magnetice de fond (B): cea mai micãvaloare a fost de 1,76 T, iar cea mai mare valoare a fostde 2,01 T;

� viteza de curgere a sângelui prin matricea magneticã, aprezentat valori cuprinse între 0,55 mm/s ºi 1,10 mm/s;

� diluþia sângelui : s-a utilizat sânge integral ºi sângediluat în trei diluþii diferite (1/2, 1/4, 1/8); diluarea afost realizatã cu soluþie MINOTON LM6;

� timpul de staþionare în câmp magnetic: la unele probes-a procedat la oprirea pompei peristaltice ºi staþionareasângelui în matricea magnetizatã un anumit timp; înaceastã situaþie viteza este nulã ºi, drept consecinþã,procesul de captare ar trebui sã fie mai eficient.

Protocolul de lucru a cuprins mai multe etape succesive,dupã cum urmeazã:

� proba de sânge iniþialã, aflatã în eprubeta de alimentare,ºi analizatã în prealabil într-un laborator specializat, afost mai întâi agitatã cu miºcãri blânde pentru omo-genizarea sângelui (o agitare energicã poate provocadistrugerea eritrocitelor);

� s-a reglat apoi sursa de curent continuu pentru alimen-tarea bobinelor generatoare de câmp, stabilindu-se inten-sitatea curentului corespunzãtor inducþiei magnetice delucru dorite ºi s-a cuplat sursa;

� s-a pornit pompa peristalticã, din acel moment sângelefiind absorbit din recipientul de alimentare ºi trimis înmatricea magnetizatã ;

� s-a recoltat, la ieºirea din tubul superior, proba de sângeseparatã magnetic, care a fost apoi analizatã în acelaºilaborator specializat;

� s-a efectuat ºi o probã de separare magneticã prin cir-culare repetatã a sângelui, în acest caz prelevându-se ºiprobe intermediare;

60

� dupã fiecare probã matricea a fost spãlatã cu apã disti-latã ºi alcool etilic, uscatã cu aer cald ºi pregãtitã pentruo altã probã.

4.2. Vectorizarea ºi concentrarea locoregionalãa unor medicamente magnetice

Þinând cont de avantajele potenþiale pe care le prezintãutilizarea ferofluidelor în terapiile loco-regionale (expuse pelarg în PARTEA GENERALÃ), un colectiv interdisciplinarde la Facultatea de Bioinginerie Medicalã a Universitãþii deMedicinã ºi Farmacie Iaºi în colaborare cu Institutul de FizicãTehnicã � IFT Iaºi, a realizat douã variante de ferofluid:

� un ferofluid pe bazã de Fe3O4 acoperit cu oleat de amo-niu (stabilizant ºi conferind hidrosolubilitate);

� un ferofluid pe bazã de Fe3O

4 acoperit cu oleat de sodiu

(stabilizant ºi conferind hidrosolubilitate).

Ferofluidul ca purtãtor de medicament prezintã douã avan-taje faþã de purtãtorii magnetici dispersaþi în lichid: poateîncorpora medicamentul mai uºor ºi prezintã o stabilitate maibunã in vivo. Încorporarea mai uºoarã a medicamentului seexplicã prin pãtrunderea ºi fixarea moleculelor acestuia printreºi/sau de moleculele polare de stabilizant.

4.2.1. Prepararea unui ferofluid original hidrofil,pe bazã de magnetitã

În cadrul unui grant de cercetare finanþat de Academia Românãîn anii 2003 ºi 2004 (196), la Institutul de Fizicã Tehnicã-IFTIaºi s-au preparat douã sorturi de ferofluid pe bazã de mag-netitã, având ca mediu de dispersie apa.

Prepararea unui fluid magnetic cuprinde mai multe etape:prepararea particulelor magnetice, acoperirea acestora cu sur-factant, introducerea particulelor tratate în mediul de dispersieºi tratamentul final al fluidului.

61

4.2.1.1. Prepararea particulelor de magnetitã

Magnetita este un compus oxidic al fierului, cel mai rezistentfaþã de acizi ºi baze, rezultat din cuplarea unei molecule deoxid feros (FeO) cu o moleculã de oxid feric (Fe

2O

3). crista-

lizeazã în sistemul cubic, ºi are formula chimicã Fe3O4.Magnetita se poate obþine prin douã procese fundamentale:

reducerea dimensiunilor în cazul magnetitei naturale ºi preci-pitare apoasã în cazul preparãrii sinteticã.

Pentru prepararea celor douã sorturi de fluid magnetic (fero-fluid) au fost parcurse succesiv urmãtoarele etape procedurale:

� s-a stabilit cantitatea necesarã de magnetitã exprimatãîn moli;

� s-a ales o sare a fierului bivalent solubilã în apã - cloruraferoasã (FeCl

2 × 4H

2O) ºi o sare a fierului trivalent -

clorura fericã (FeCl3 × 6H

2O);

� pentru fiecare mol de magnetitã s-a cântãrit 1 mol declorurã feroasã ºi 2 moli de clorurã fericã ;

� cele douã sãruri s-au dizolvat separat în apã distilatã, încantitate de aproximativ 2 mol/l; astfel, s-a dizolvat0,3967 g de FeCl2.4H2O (2 mmol) ºi 0,5406 g FeCl3.6H2Oîn 150 ml apã deionizatã, raportul Fe2+ /Fe3+ fiind egal cu 1;

� ulterior, soluþiile au fost amestecate ºi omogenizate prinagitare;

� s-a preparat o soluþie alcalinã, hidroxid de sodiu (NaOH)în apã distilatã, cu concentraþia de aproximativ 5 mol/l;

� pentru fiecare mol de magnetitã s-au cântãrit 8 moli dehidroxid de sodiu; astfel, peste amestecul încãlzit la40°C, s-au adãugat 8 ml de NH

3.H

2O (1,5 mol/L);

� pentru ajustarea pH-ului la o valoare de 9-10 se adãugão cantitate suplimentarã de NH3.H2O (1,5 mol/L);

� soluþiile se amestecã într-un vas suficient de mare; seproduce imediat un precipitat de culoare brunã a cãruiculoare trece rapid în negru;

� precipitatul de Fe3O

4 se colecteazã cu un magnet, dupã

care se spalã cu apã deionizatã ºi se disperseazã în150 ml soluþie etanol/apã = 1/1 (raport volumetric).

62

4.2.1.2. Prepararea unui ferofluid având ca surfactantoleatul de sodiu

Conform procedeului descris mai sus, s-au preparat particulede magnetitã cu dimensiune micã (8 � 12 nm) (196).

Dupã spãlare ºi decantare, precipitatul de magnetitã a fostamestecat cu o cantitate de acid oleic (C17H33COOH), sub-stanþã cu molecule polare (formate din lanþuri de câte 18 atomide carbon), nemiscibilã cu apa. Moleculele de acid oleic aderãcu una din extremitãþi la particula de magnetitã. Amestecul afost prelucrat pânã la acoperirea completã a particulelor demagnetitã cu acid oleic ºi eliminarea completã a apei.

Deoarece pelicula de acid oleic nu permite dispersia în apãa microparticulelor, acidul oleic a fost saponificat cu o sub-stanþã alcalinã, în cazul de faþã hidroxid de amoniu, materialuldevenind ulterior dispersabil.

Produsul rezultat, un lichid extrem de vâscos insolubil înapã, a fost tratat la cald cu o soluþie apoasã de hidroxid desodiu. S-a produs reacþia de saponificare a acidului oleic:

C17H33COOH + NaOH = C17H33COONa + H2O

Lichidul magnetic obþinut conþine astfel particule demagnetitã acoperite cu molecule polare de oleat de amoniu(C

17H

33COONH

4), substanþã neutrã ºi stabilã termic.

Particulele de magnetitã acoperite cu oleat de sodiu sedisperseazã uºor în apã ºi, datoritã unor forþe de respingere denaturã electrostaticã, rãmân în suspensie stabilã (fig. 4.12).

Fig. 4.12. Structura ferofluidului preparat (196)

63

Ferofluidul rezultat conþine 40 g Fe total într-un litru deferofluid (sau 26 g Fe

3O

4 într-un litru de ferofluid).

Comparativ cu alte ferofluide realizate pentru vectorizaremedicamentoasã magneticã, ferofluidul preparat este mai con-centrat (40 mg Fe / ml, faþã de 10 -12 mg Fe /ml).

Ferofluidul (FF) preparat a fost caracterizat din punct devedere al proprietãþilor magnetice, proprietãþi ce determinãcapabilitatea lui de vectorizare.

Curbele de magnetizare au fost trasate pentru trei probe deferofluid cu concentraþii diferite: ferofluid nediluat (c = 0,040mg Fe /ml), ferofluid diluat 1 (c = 0,020 mg Fe /ml) ºi ferofluiddiluat 1/10 (c = 0,004 mg Fe /ml). S-a determinat ºi limita dediluþie pânã la care ferofluidul rãmâne stabil. Determinãrile aufost realizate cu ferofluid diluat, pânã la o diluþie de 1/64.

Experimentãrile au fost realizate pornind de la ferofluidulapos pe bazã de magnetitã, având ca surfactant oleatul desodiu, a cãrui concentraþie obþinutã dupã preparare (ferofluidnediluat FF 1/1) a fost c = 0,040 mg Fe/ml.

Testãrile au avut drept scop observarea comportãrii în timpa diluþiilor de ferofluid ºi determinarea limitei de diluþie pânãla care ferofluidul diluat rãmâne stabil.

În acest scop, din ferofluidul concentrat, s-au preparat 6diluþii ale acestuia, dupã cum urmeazã:

� FF 1/2, cu un conþinut de 0,020 mg Fe/ml;� FF 1/4, cu un conþinut de 0,010 mg Fe/ml;� FF 1/8, cu un conþinut de 0,005 mg Fe/ml;� FF 1/16, cu un conþinut de 0,0025 mg Fe/ml;� FF 1/32, cu un conþinut de 0,00125 mg Fe/ml;� FF 1/64, cu un conþinut de 0,00062 mg Fe/ml.

Fiecare probã, constituitã dintr-un ml de ferofluid diluat, afost mai întâi introdusã într-o eprubetã (10 × 50 mm), apoi afost plasatã deasupra unui magnet permanent de înaltã energieNeFeB, cu dimensiunile 40 × 20 × 10 mm. Valoarea inducþieimagnetice mãsuratã la o distanþã de 12 mm faþa de magnet(distanþa echivalentã pânã la suprafaþa ferofluidului) a fost deaproximativ 850 Gs.

64

Peste coloana de ferofluid din fiecare eprubetã s-a introdusprin pipetare câte 1 ml apã distilatã: s-au format douã coloanedistincte: una de ferofluid ºi, deasupra, una de apã distilatã.

În timp, s-a observat aspectul ferofluidului ºi gradul dedifuzie al acestuia în coloana de apã distilatã. Observaþiile aufost fãcute la intervale de 24 h, timp de 10 zile consecutive.

4.2.2. Testarea efectului bacteriostatic ºi/sau bactericidale ferofluidelor preparate pe bazã de oleat deamoniu ºi dextrinã

Studiul a fost efectuat în Laboratorul de Microbiologie alCentrului Medical �Nicolina� din Iaºi printr-o colaborare cudr. L. Lunguleac, medic primar de specialitate (laborator).

Studiul a constat în practicarea antibiogramei difuzimetriceutilizând trusele standard (antibiotice de uz curent), la care s-aadãugat ferofluid concentrat pe bazã de oleat de amoniu ºidiluþiile 3/4, 1/2, 1/4, 1/8, în apã distilatã, ale acestuia(echivalente cu 40 mg, 30 mg, 20 mg, 10 mg ºi 5 mg fier/litruferofluid).

S-a testat sensibilitatea la antibioticele din trusele standardsimultan cu sensibilitatea la ferofluid ºi la diluþiile acestuia,pe urmãtoarele tulpini bacteriene:

� E.coli spp.� Klebsiella spp.� Stafilococ auriu� Streptococ grup D.

Testele au fost validate prin folosirea tulpinilor de control(pentru E.colli ºi pentru Stafilococ auriu).

Mediile însãmânþate pe plãcile de culturã au fost menþinuteîn condiþii standard de laborator.

S-a urmãrit dezvoltarea coloniilor microbiene la 24 - 48 �72 � 96 �120 � 144 ºi 168 ore.

Protocolul a fost urmat identic ºi în cazul utilizãrii fero-fluidului pe bazã de dextrinã.

65

4.2.3. Testarea in vitro a unui complex medicamentosmagnetic format dintr-un ferofluid originalºi diclofenac sodic

În continuare, s-a efectuat un studiu experimental privind for-marea unui complex ferofluid � diclofenac sodic ºi desorbþiamedicamentului din complexul magnetic astfel format.

Scopurile acestui studiu au fost:

� determinarea capacitãþii ferofluidului de a încorporadiclofenacul sodic;

� verificarea stabilitãþii complexului ferofluid � medicament;� modelarea modului de eliberare a medicamentului în

câmp magnetic.

A fost ales diclofenacul sodic (un antiinflamator nesteroi-dian), deoarece acesta prezintã un indice crescut de hidrosolu-bilitate. Din ferofluidul concentrat (40 mg Fe/ml), s-au prepa-rat câte 10 ml de diluþii diferite, prin adãugare de apã distilatã.S-au obþinut astfel 3 diluþii de ferofluid: FF 1/2, FF 1/4 ºi FF 1/8.

Diluþiile au fost omogenizate prin miºcarea moderatã aeprubetelor. A rezultat un lichid omogen de culoare brun închis.

Prin dizolvarea în apã distilatã a substanþei pure, s-a pre-parat o cantitate de 10 ml de soluþie diclofenac sodic a cãreiconcentraþie, mãsuratã prin metoda spectrofotometricã, a fostde 40,02 mg %. Din fiecare diluþie de ferofluid preparatã (FF1/2, FF 1/4 ºi FF 1/8) s-a introdus, în câte ºapte eprubeteidentice (FF 1/2 în P1, P2 ... P7 etc.), o cantitate egalã de 0,5 ml.

În fiecare din cele 7 eprubete cu FF 1/2 s-a introdus ocantitate de 0,5 ml din soluþia de diclofenac sodic (DS) prepa-ratã anterior (eprubetele P

1-P

7). Eprubetele au fost supuse unei

agitãri de intensitate medie pentru omogenizareS-a observat cã indiferent de intensitatea ºi durata agitãrii,

complexul ferofluid�diclofenac sodic (FF 1/2 + DS) se omo-genizeazã rapid ºi nu se produce nici un fel de fenomen dedestabilizare (precipitare).

Eprubetele conþinând complexul FF 1/2 +DS au fost plasatepe un stativ ºi lãsate timp de 24 de ore (fig. 4.13).

66

Dupã aceastã perioadã de timp, eprubetele au fost exa-minate vizual: s-a constatat cã lichidul rãmâne perfect omogen,neproducându-se nici un fel de modificare de culoare sautendinþe de separare - decantare.

Urmãtoarea etapã, a fost reprezentatã din plasarea eprube-telor cu complexul FF 1/2 + DS în câmp magnetic, fiecareeprubetã fiind aºezatã deasupra unui magnet permanent deînaltã energie NdFeB, cu dimensiunile de 40 × 20 × 10 mm.

Valoarea inducþiei magnetice mãsuratã la distanþa d = 15 mm,distanþã aproximativ egalã cu distanþa la care se afla suprafaþalichidului FF 1/2 + DS din eprubetã, a fost B0 = 580 Gs.

Dupã plasarea în câmp magnetic, în fiecare din cele ºapteeprubete a fost introdusã în mod lent o cantitate de 4 ml apãdistilatã, obþinându-se astfel un sistem cu douã faze lichidedistincte, una cu complexul FF 1/2 + DS ºi alta, deasupra, cuapã distilatã.

Momentul în care a fost terminatã operaþia de introducere aapei distilate în eprubetã a fost considerat t0 = 0: de la acestmoment s-a cronometrat timpul de desorbþie a diclofenaculuisodic din complexul FF 1/2 + DS (fig.4.14).

În mod similar celor descrise mai sus au fost preparatecomplexele medicamentoase FF 1/4 + DS (probele P8 � P14) ºiFF 1/8 + DS (probele P15 � P21).

Dupã 24 de ore de expunere în câmp magnetic a comple-xelor cu ferofluid mai diluat (FF 1/4 + DS ºi FF 1/8 +DS) nus-au observat tendinþe de separare ale componentelor com-plexului sau modificãri de culoare.

Fig. 4.13. Obþinerea unui complex ferofluid (FF)-diclofenacsodic (DS)

67

Pentru determinarea evoluþiei desorbþiei diclofenacului sodicdin complexul FF + DS, au fost recoltate probe la anumiteintervale de timp: 0,5 h; 1h; 1,5 h; 2 h, 2,5 h, 3 h ºi 24 h (întotal 21 probe, câte ºapte pentru fiecare dintre cele trei com-plexe). Fiecare probã (2,5 ml) a fost recoltatã, prin extragerecu seringa, din zona mijlocie a coloanei de lichid aflatã dea-supra coloanei cu complex.

De exemplu, în cazul complexului FF 1/2 + DS la 1/2 h afost recoltatã proba P

1 din prima eprubetã, la 1 h a fost recoltatã

proba P2 din a doua eprubetã º.a.m.d. (fig. 4.15).

Fig. 4.14. Plasarea eprubetelor în câmp magneticºi adãugarea apei distilate

Fig. 4.15. Modul de recoltare al probelor pentru evidenþiereadesorbþiei diclofenacului sodic

Analiza probelor a fost fãcutã cu un Spectrofotometru UV� V-530 (Jasco), fiind utilizat un etalon de 0,1% diclofenacsodic (l

max = 275 nm).

68

4.2.4. Testarea in vitro a unui complex medicamentosmagnetic format dintr-un ferofluid originalºi piroxicam

Experimentãrile de complexare a ferofluidului cu piroxicamau fost efectuate similar cu cele pentru complexarea cu diclo-fenac sodic.

Pentru început, a fost preparatã o soluþie de piroxicam (apãdistilatã, alcool etilic, suc gastric natural, clorurã de natriu)având concentraþia de 50 mg%.

Într-o a doua etapã, s-au preparat câte 4 probe identicepentru complexarea soluþiei de piroxicam cu fiecare din dilu-þiile FF 1, FF 1/4 ºi FF 1/8.

4.2.5. Evaluarea toxicitãþii in vivo a ferofluidului preparatpe bazã de oleat de amoniu

Deºi noile tehnici in vitro au redus nevoia de efectuare anenumãratelor studii pe animale, aceste studii contribuie încãsemnificativ la înþelegerea farmacologiei, eficacitãþii, securi-tãþii cât ºi a diverselor aspecte toxicologice ale producerii unornoi medicamente.

Etapele studiului ºi protocolul de lucru pentru testarea toxi-citãþii acute este prezentat schematic în tabelul 4.2.

S-a evaluat toxicitatea acutã dupã o singurã administrare aferofluidului, luând ca obiectiv numãrul de animale moarteîntr-un interval de timp fix (1-7 zile).

Pentru determinarea toxicitãþii acute am ales metoda palie-relor de toxicitate.

ªtiind cã toxicitatea acutã este supusã unor variaþii crono-biologice circadiene care, în funcþie de ora administrãrii potatinge raportul 1/8, administrarea dozelor din substanþa decercetat a fost realizatã la aceeaºi orã respectiv 8:00 a.m.

S-a utilizat o singurã cale de administrare - calea intraperi-tonealã.

69

S-au folosit cinci loturi omogene de ºoareci albi de labo-rator (Swiss):

� Lot 1: cinci ºoareci cu greutatea iniþialã de 20 +/- 1gram;

� Lot 2: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 19 +/- 1gram;

� Lot 3: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 21 +/- 1gram;� Lot 4: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 24 +/- 1

gram;� Lot 5: cinci ºoareci cu greutatea iniþialã de 27 +/- 2

grame.

Conform reþetei de producere, ferofluidul concentrat con-þine 40 g / litru fier total.

La aceste loturi s-au administrat doze descrescãtoare desubstanþã (ferofluid), dupã cum urmeazã:

Tabelul 4.2. Protocolul de lucru pentru testareatoxicitãþii acute

Dozaò

O singurã dozã în 24 ore, minimde 3 ori doza

Animaleò

5 masculi & 5 femele pe grup dedoze

Greutateacorporalã/semne clinice

(început, duratã,severitate)

ò

Terminarea studiuluiò

14 � 28 zile

Histopatologieò

Necropsieò

Profilul toxicitãþii acuteò

Gãsirea dozei pentru

studiile ulterioare

Evaluarea potenþialului

de toxicitate acutã

70

� Lot 1: 0,125 ml ferofluid, echivalentul a 5 mg fier total;� Lot 2: 0,25 ml ferofluid, echivalentul a 10 mg fier total;� Lot 3: 0,5 ml ferofluid, echivalentul a 20 mg fier total;� Lot 4: 0,75 ml ferofluid, echivalentul a 30 mg fier total;� Lot 5: 1 ml ferofluid, echivalentul a 40 mg fier total.

Nu s-a folosit acelaºi volum de soluþie pentru administrareaintraperitonealã la animalele din experiment, pentru a evitariscul de modificare a calitãþii ferofluidului, dar în cadrulfiecãrui lot a fost utilizatã aceeaºi cantitate în volum fix.

Eutanasierea animalelor care au supravieþuit studiului (celedin lotul I) s-a fãcut prin administrarea de tiopenthal sodic,105 mg/kg corp, intravenos (279).

Organele recoltate de la animalele sacrificate (cu excepþiacelor din lotul I), respectiv cord, plãmân, ficat, rinichi ºi peri-toneu, au fost examinate anatomopatologic la Catedra deAnatomie Patologicã a Universitãþii de Medicinã ºi Farmacie�Gr. T. Popa� din Iaºi (conf. dr. Sergiu Teleman). Pentru analizamicroscopicã, piesele recoltate au fost introduse în soluþietampon (4% paraformaldehidã), deshidratate în etanol, fixateîn parafinã, secþionate ºi colorate cu hematoxilen eozinã ºi Perls.Prin metoda Perls se pune în evidenþã prezenþa ionilor de fier.

Prezenþa ionilor de amoniu (NH4+) a fost pusã în evidenþã

printr-o metodã calitativã, in vitro, utilizând reactivul Nessler(reactiv specific pentru identificarea NH4

+). Reacþia a fostpozitivã cu începere de la diluþii de ferofluid foarte mici (1:128)ºi s-a intensificat pe mãsurã ce a fost scãzutã diluþia.

4.2.6. Evaluarea toxicitãþii in vivo a ferofluidului preparatpe bazã de oleat de sodiu

Scopul studiului a fost de a determina toxicitatea in vivo aferofluidului obþinut din Fe3O4 stabilizat cu oleat de sodiu.Acest al doilea tip de ferofluid a fost realizat în aceleaºi con-diþii de acelaºi colectiv care a preparat ºi tipul de ferofluid pebazã de oleat de amoniu.

ªi în acest caz, toxicitatea acutã a fost evaluatã dupã osingurã administrare a ferofluidului, în doze descrescãtoare,

71

luând ca obiectiv numãrul de animale moarte într-un intervalde timp fix (1-7 zile). Pentru determinarea toxicitãþii acute amales ºi în acest caz metoda palierelor de toxicitate. Admi-nistrarea dozelor din substanþa de cercetat (ferofluid), s-a reali-zat la aceeaºi orã, respectiv 8:00 a.m. S-a utilizat o singurãcale de administrare � calea intraperitonealã.

Ferofluidul nediluat conþine 40 gr/litru fier total.Deoarece în studiul precedent rezultatele obþinute cu diluþia

de 1/1 ºi 3/4 au fost identice, în prezentul studiu s-a renunþat laultima diluþie astfel încât experimentele s-au efectuat numaipe 4 loturi de câte 6 ºoareci albi de laborator (Swiss), dupãcum urmeazã:

� Lot 1: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 30 +/- 2grame;

� Lot 2: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 30 +/- 2grame;

� Lot 3: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 30 +/- 2grame;

� Lot 4: ºase ºoareci cu greutatea iniþialã de 30 +/- 2grame.

La aceste loturi s-au administrat doze descrescãtoare desubstanþã (ferofluid), dupã cum urmeazã:

� Lot 1: 0,5 ml ferofluid diluþie 1/8, echivalentul a 5 mgfier total;

� Lot 2: 0,5 ml ferofluid diluþie 1/4, echivalentul a 10 mgfier total;

� Lot 3: 0,5 ml ferofluid diluþie 1/2, echivalentul a 20 mgfier total;

� Lot 4: 0,5 ml ferofluid din soluþia stock, echivalentul a40 mg fier total.

La animalele luate în studiu, pe toatã durata de supra-veghere nu a fost constatat nici un deces. La sfîrºitul perioadeide observaþie au fost sacrificate, randomizat, câte un animaldin fiecare lot, pentru examen anatomopatologic. Eutanasiereaanimalelor s-a fãcut prin administrarea de tiopenthal sodic,105 mg/kg corp, intravenos.

72

Examenul anatomopatologic al principalelor organe (cord,plãmân, rinichi, ficat, splinã, peritoneu), a fost efectuat la laCatedra de Anatomie Patologicã a U.M.F. �Gr. T. Popa� dinIaºi (conf. dr. S. Teleman). Pentru analiza microscopicã, pie-sele recoltate au fost introduse în soluþie tampon (4 % para-formaldehidã), deshidratate în etanol, fixate în parafinã, sec-þionate ºi colorate cu hematoxilen eozinã ºi Perls. Prin metodaPerls se pune în evidenþã prezenþa ionilor de fier.

4.2.7. Testarea in vivo pe model experimentalde inflamaþie acutã a unui medicament magneticobþinut prin complexarea ferofluidului preparat pebazã de oleat de sodiu cu un antiinflamator

Obiectivul studiului a fost investigarea in vivo a activitãþiiantiinflamatoare a ferofluidului complexat cu un antiinfla-mator consacrat.

Studiul a fost efectuat pe patru loturi de cîte ºase ºoarecialbi Swiss, masculi, cu greutatea de 30+/-2grame.

Modelul experimental de inflamaþie a constat în provocareaunui edem inflamator al labei posterioare la ºoareci prin injec-tarea de carrageenan (Sigma Chem Co., USA).

Ca substanþã antiinflamatoare de referinþã a fost utilizatdiclofenacul (Sigma Chem.Co., USA).

Alegerea acestui antiinflamator nesteroidian s-a bazat peurmãtoarele argumente:

� este unul dintre cel mai utilizate antiinflamatoare;� este printre cele mai eficace antiinflamatoare nesteroi-

diene (AINS);� este cel mai hidrofil dintre antiinflamatoarele neste-

roidiene pe care le-am avut la dispoziþie;� în testãrile efectuate anterior, diclofenacul a dovedit cã

realizeazã complexe stabile cu ferofluidul pe bazã deoleat de sodiu având ºi

� o desorbþie satisfãcãtoare (�vârful� de eliberare esteatins la 60-90 minute), favorabilã experimentãrii in vivo.

73

Anestezia generalã a fost realizatã prin administrarea, pecale intraperitonealã, de penthobarbital în dozã de 30mg/kggreutate corporalã (uz uman, Lilly Deutscheland GMBH).

Animalele menþinute în condiþii standard de laborator, aufost repartizate în patru loturi de cîte ºase ºoareci, indivi-dualizaþi în cadrul fiecãrui lot prin marcaje cu soluþie de acidpicric: cap, coadã, flanc drept, flanc sting, spate, alb.

S-a efectuat mãsurãtoarea iniþialã (t0) a volumul labei pos-

terioare stîngi a fiecãrui animal utilizând pletismometrul cumercur. Edemul inflamator a fost provocat prin injectarea, subaponevroza plantarã a membrului posterior stîng, a unui volumde 30 microlitri soluþie 1% carrageenan, urmând protocolulstabilit în 2004, de Immaculada Posadas ºi colab. (280).

La patru ore dupã injectarea carrageenan-ului, a fost mãsu-rat din nou volumul labei posterioare, dupã care s-a efectuat admi-nistrarea intravenoasã a antiinflamatorului (diclofenac), a combi-naþiei de ferofluid cu diclofenac, a ferofluidului singur ºi apeidistilate conform dozelor ºi volumelor menþionate în tabelul 4.3.

Tabelul 4.3. Substanþele, dozele ºi modul de administrare

Lot Substanþa Doza Administrare

1 diclofenac 0,03 mg/30g g.c.* - volum total de 100microlitri

i.v.

2 ferofluid Diluþie 1/4 în apã distilatã (echivalentul a10 mg fier total) � volum de 100 microlitri

i.v.

3 Diclofenacferofluid

0,03 mg/30g g.c.*ferofluid (echivalentul a 10 mg fier total) �volum de 100 microlitri

i.v.

4 Apa distilatã Volum de 100 microlitri i.v.* g.c. = greutate corporalã

Administrarea intravenoasã a fost realizatã sub anesteziegeneralã ºi cu animalul poziþionat cu laba posterioarã stângã(edemul inflamator), deasupra unui magnet permanent ce rea-lizeazã un câmp magnetic de aproximativ 0,36 T. Timpul deexpunere la câmpul magnetic a fost de 120 minute.

S-au efectuat apoi mãsurãtori ale volumului labei la 6, 18,24, 48, 72 ore de la producerea edemului inflamator.

Facem precizarea cã lotul martor (lotul 4) nu a fost expusîn câmp magnetic.

74

4.2.8. Testarea in vivo pe un model experimentalde inflamaþie acutã a efectului câmpuluimagnetic permanent

Rezultatele obþinute în cadrul investigãrii eficacitãþii antiinfla-matoare a complexului obþinut prin complexarea ferofluiduluipe bazã de oleat de sodiu cu diclofenacul sodic, în condiþiilestandard de explorare � testarea pe martor alb, testare pe mar-tor pozitiv ºi testarea componentelor complexului, respectivferofluidului � au sugerat cã efectul antiinflamator s-ar datoranu numai acþiunii diclofenacului, ci ºi altor factori.

Acest fapt ne-a determinat sã extindem cercetarea astfelîncât sã evaluãm, preliminar, contribuþia unora dintre ele-mentele din �ecuaþia� studiatã. Studiul a fost efectuat pe patruloturi de câte ºase ºoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea de30+/-2grame. Anestezia generalã a fost realizatã prin admi-nistrarea, pe cale intraperitonealã, de tiopental în dozã de 1,5mg/kg greutate corporalã. Modelul experimental de inflamaþiea constat în provocarea unui edem inflamator al labei pos-terioare la ºoareci prin injectarea de carrageenan (Sigma ChemCo., USA). Edemul inflamator a fost provocat prin injectarea,sub aponevroza plantarã a membrului posterior stâng, a unuivolum de 30 microlitri soluþie 1% carrageenan (280).

Animalele, menþinute în condiþii standard de laborator, aufost repartizate în ºase loturi de câte ºase ºoareci, individua-lizaþi în cadrul fiecãrui lot prin marcaje cu soluþie de acidpicric: cap, coadã, flanc drept, flanc sting, spate, alb. S-aefectuat mãsurãtoarea iniþialã (t0) a volumul labei posterioarestângi a fiecãrui animal utilizând pletismometrul cu mercur.

4.2.8.1. Influenþa câmpului magnetic asupra edemuluiinflamator experimental

La patru ore dupã injectarea carrageenen-ului, a fost mãsuratdin nou volumul labei posterioare, dupã care animalele au fostanesteziate conform metodei expuse anterior.

75

Laba posterioarã (prezentând edemul experimental), a su-biecþilor din lotul 2 a fost expusã în câmp magnetic permanentpentru 60 minute.

ªoarecii din lotul 1 nu au fost expuºi în câmp magnetic(acesta din urmã reprezentând �martorul� pentru evoluþia natu-ralã a inflamaþiei acute).

4.2.8.2. Influenþa timpului de expunere în câmp magneticpermanent asupra fenomenului inflamator

Animalele cãrora li s-a provocat edem inflamator, au fostexpuse în câmp magnetic permanent pentru durate diferite detimp, sub anestezie generalã: lotul 3 a fost expus pentru 45minute, iar lotul 4 pentru 90 minute (timpul maxim de expu-nere în acest caz a fost dictat de durata anesteziei generale).

4.2.8.3. Influenþa intensitãþii câmpului magnetic permanentasupra fenomenului inflamator

În aceastã etapã a experimentului, am studiat influenþa intensi-tãþii câmpului magnetic permanent asupra edemului inflamator.

Prin realizarea unui sistem de doi magneþi poziþionaþi ladistanþã de 5 mm, am reuºit sã obþinem aproape dublareaintensitãþii câmpului magnetic (de la aproximativ 0,36 T la0,67 T). Laba posterioarã stângã (cu edem experimental), afost fie aplicatã pe un magnet (0,36 T, la animalele din lotul 5),fie între doi magneþi (0,67 T, pentru animalele din lotul 6).

Durata expunerii a fost egalã pentru ambele loturi (60 minute).

4.3. Detoxifierea sângelui cu ajutorulnanoparticulelor magnetice (hemodializa magneticã)

4.3.1. Principiul detoxifierii sângelui prin metode magnetice

Principiul detoxifierii sângelui prin metode magnetice constãdin introducerea în sânge a unor nanoparticule funcþionalizatepentru cuplarea toxinelor, complexele nanoparticule magnetice

76

� toxine astfel formate, fiind eliminate din sânge prin filtrareîntr-un separator în gradient înalt de câmp (HGMS), în timp cesângele purificat este reintrodus în organism (226-227).

Schema unui circuit pentru realizarea detoxifierii sângelui(hemodializei) prin metode magnetice este reprezentatã înfig. 4.16. Dupã formarea în sânge a complexelor formate depurtãtorii magnetici (PM) activaþi împreunã cu diferitele toxine,aceste complexe trec prin dispozitivul de filtrare HGMS, dotatcu o matrice magnetizatã cu ajutorul unei sau a mai multorperechi de magneþi permanenþi de înaltã energie (NeFeBr).

Fig. 4.16. Circuit pentru realizarea detoxifierii sângeluicu nanoparticule superparamagnetice (227)

Matricea HGMS poate fi formatã din fire magnetizabileordonate sau din microbile. La trecerea prin matrice, com-plexele PM- toxine sunt reþinute prin captare magneticã, iarsângele este în acest fel purificat.

4.3.2. Simularea experimentalã a unui sistemde detoxifiere magneticã a sângelui

Montajul experimental realizat pentru simularea unui sistemde detoxifiere cu ajutorul unor nanoparticule superparamag-netice este arãtat în fig. 4.19. S-a fãcut aproximarea cã nano-particulele de oxid roºu de fier sunt echivalente din punct de

77

vedere al susceptibilitãþii magnetice ºi a diametrului dinamiccu complexele nanoparticulelor superparamagnetice de mag-netitã-toxinã (113, 227).

Montajul este alcãtuit dintr-un sistem magnetic pentru ge-nerarea câmpului magnetic de fond, matricea HGMS, pompaperistalticã, tuburile de legãturã ºi douã vase.

Pentru experimente am conceput ºi realizat douã tipuri dematrice HGMS: o matrice cu fire ºi una cu microbile. MatriceaHGMS cu fire a fost confecþionatã din fire din aliaj magneticFe-Ni, uºor magnetizabile, firele având diametrul de 150 µm(fig.4. 20).

Fig. 4.19. Montaj experimental pentru studiul detoxifieriisângelui cu ajutorul unor nanoparticule magnetice (227)

Al doilea tip de matrice HGMS a fost realizat dintr-un tubde sticlã în interiorul cãruia au fost introduse bile mici dinaliaj magnetic, biocompatibile, având diametrul de 3 mm(fig. 4.21). Matricea cu bile magnetizabile a fost construitã îndouã variante. Ambele variante ale matricelor au o rezistenþãhidraulicã neglijabilã, factorul de împachetare fiind cca. 5%(95% din incinta matricei este spaþiu liber).

Fig. 4.20. Matrice HGMS cu fire magnetizabile (227)

78

Pentru efectuarea testelor s-au realizat particule de oxidroºu de fier, acesta având susceptibilitatea magneticã mai micãdecât cea a magnetitei sau a particulelor fier-carbon utilizateîn alte studii experimentale (8, 27, 30, 105, 113).

S-au preparat mai multe concentraþii de oxid de fier însoluþie de glicerinã-apã distilatã, creând vâscozitatea 3,5 cP(vâscozitate echivalentã cu cea a sângelui). Concentraþiile so-luþiilor au variat între 0,16 mg/ml ºi 2 mg/ml.

Testele au fost realizate la diferite viteze de curgere a lichi-dului prin sistem, cea mai micã fiind 1,58 cm/s, iar cea maimare 22,50 cm/s.

Dupã încheierea testului am scos matricea HGMS din cir-cuitul experimental ºi am observat modul de captare a nano-particulelor de oxid roºu de fier în matrice (Fig. 4.23).

Fig. 4.23. Matricea HGMS cu bile dupã captareananoparticulelor de oxid roºu de Fe (227)

Câmpul magnetic de fond (B0) a fost mãsurat cu ajutorul

unui gaussmetru cu sondã Hall, iar modificarea valorilor luis-a realizat fie prin reglarea pieselor polare cilindrice, fie prinadãugarea unor piese polare suplimentare.

Vitezele medii ale lichidului prin matrice au fost deter-minate prin calcul, mãsurându-se debitul lichidului (volumullichidului în timp) prin secþiunea transversalã liberã a matriceiHGMS. Eficacitatea filtrãrii magnetice se poate determina prinrelaþia:

E[%] = (MR/ MTR) × 100,

unde MR este masa particulelor magnetice reþinutã în matrice,iar MTR este masa de particule trecute prin matrice. Cum MR =

79

MTR � MNR, unde MNR este masa de particule nereþinute, atuncirezultã cã:

E[%] = (1- MNR

/MTR

) �100.

Valoarea câmpului magnetic de fond a fost modificatã între0,25 T ºi 0,9 T, pentru a observa eficacitatea filtrãrii la diferiteintensitãþi ale câmpului.

A fost corelatã ºi viteza de curgere cu intensitatea câmpuluimagnetic. S-au efectuat teste atât la viteze de curgere ridicateºi intensitãþi ale câmpului magnetic scãzute, cât ºi la viteze decurgere scãzute ºi intensitãþi ale câmpului magnetic ridicate.

4.4. Embolizarea terapeuticã prin metode magnetice

4.4.1. Testarea in vitro a embolizãrii magneticeintravasculare

Pe baza evaluãrii teoretice a modului de miºcare a micro-particulelor ºi a posibilitãþii de depuneri pe pereþii unui vassanguin, prezentate anterior, am efectuat o serie de experi-mente de laborator în vederea observãrii procesului de embo-lizare magneticã. Montajul experimental utilizat este prezentatschematic în fig. 4.24.

Fig. 4.24. Montajul experimental utilizat pentru testele desimulare ale embolizãrii magnetice (dupã Gh. Iacob, Al. D.

Ciochinã ºi colab., 2005, modificat)

80

Montajul experimental folosit a cuprins:

� un sistem de tuburi din sticlã, pentru modelarea unuivas sanguin;

� o pompã peristalticã cu debit programabil pentru antre-narea lichidului de lucru (Hugo Sachs El.);

� un vas de alimentare în care au fost introduse micro-particulele magnetice;

� douã vase pentru recoltarea ºi mãsurarea lichidului an-trenat prin sistemul de tuburi: un vas pentru mãsurareadebitului D

1 al lichidului care circulã prin tubul în care

s-a efectuat obturarea ºi celãlalt pentru masurarea debi-tului D2 din tubul rãmas neobturat.

Au fost folosite microsfere din material magnetic amorf,realizate pe o instalaþie tehnologicã originalã, printr-un pro-cedeu de atomizare în jeturi încruciºate de gaz inert ºi lichid,la Institutul Naþional de Cercetare-Dezvoltare pentru FizicãTehnicã � IFT Iaºi; acest tip de purtãtori magnetici au pro-prietãþi magnetice superioare ºi sunt biocompatibili în stareneacoperitã (2, 199). Sistemul de tuburi a fost compus dindouã ramuri în paralel, fiecare ramurã fiind construitã dintr-untub care prezintã o zonã spiralatã (3 spire), considerându-se cãaceastã formã modeleazã satisfãcãtor condiþiile de circulaþie asângelui într-un vas sanguin.

Au fost efectuate experimentãri in vitro, în diverse condiþiide proces, prin modificarea urmãtorilor parametri:

� dimensiunile microparticulelor magnetice utilizate pen-tru embolizare;

� vâscozitatea lichidului de antrenare, þinând cont de fap-tul cã vâscozitatea plasmei sanguine este de aproximativ1,5 ori mai mare decât a apei, iar a sângelui integral de3-8 ori mai mare decât a apei, în funcþie de valoareahematocritului (239, 242): ca lichid de antrenare s-afolosit o soluþie de glicerinã în apã distilatã în diferiteconcentraþii;

� debitul lichidului de curgere;� diametrul interior al tubului care a fost obturat;

81

� forma tubului în care s-a realizat obturarea (tub spiralatºi tub drept);

� lungimea coloanei de obturare, formatã din micropar-ticule magnetice;

� valoarea intensitãþii câmpului magnetic aplicat pentruobturare;

� direcþia cîmpului magnetic aplicat pentru a se obþineobturarea.

Etapele urmate în desfãºurarea testelor au fost urmãtoarele:

� programarea debitului pompei peristaltice;� mãsurarea debitelor de curgere liberã ale lichidului, atât

prin tubul ce urma sã fie obturat, cât ºi prin tubul dinparalel, care urma sã rãmânã neobturat;

� plasarea unui magnet permanent de înaltã energie (NdFeB)în vecinãtatea tubului obturat, în vederea concentrãriimicroparticulelor magnetice amorfe pentru a se obþineobturarea (ocluzarea);

� realizarea obturãrii tubului, prin antrenarea micropar-ticulelor magnetice amorfe odatã cu circularea lichiduluipurtãtor din vasul de alimentare;

� determinarea modificãrilor de debit apãrute la nivelulcelor douã ramuri de curgere în paralel, dupã formareadepunerii de microparticule magnetice în interiorul tubu-lui: prin tubul obturat sunt create condiþii de scãdere adebitului, respectiv o creºtere la nivelul tubului neobturat,scãderea debitului prin tubul obturat fiind consideratã omãsurã a eficienþei procesului de obturare magneticãobþinutã cu ajutorul microparticulelor magnetice amorfe.

Eficacitatea de obturare (eficienþa obturãrii) a fost definitãprin raportul dintre reducerea de debit (DD1), rezultatã prinobturarea magneticã cu ajutorul purtãtorilor magnetici (micro-particule magnetice) ºi debitul iniþial D

1:

E = DD1 / D1

În funcþie de condiþiile de lucru � în principal dupã poziþiaîn care este plasat magnetul de înaltã energie (NdFeB) � în

82

interiorul tubului de obturare (spiralat sau drept) au rezultatdiferite forme de coloane formate din microparticule mag-netice, al cãror aspect ºi lungime oferã date suplimentare despreeficienþa obturãrii.

4.4.2. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice pe unmodel de anevrism vascular

Montajul experimental utilizat pentru studierea in vitro a em-bolizãrii unui vas cerebral cu anevrism, prin depunerea com-pactã de microparticule magnetice din material amorf, esteprezentat în fig. 4.25.

Fig. 4.25. Montaj experimental pentru studiul in vitro aembolizãrii unui vas cerebral cu anevrism (71)

Acesta cuprinde urmãtoarele componente:

� un tub de sticlã, modelat dupã forma unui anevrism deformã sferoidalã, cu colet strâmt;

� o seringã pentru absorbþia ºi împingerea lichidului-ve-hicul, ce conþine purtãtorii magnetici, reprezentaþi demicroparticule magnetice din material amorf;

� un recipient ce conþine o soluþie cu microparticule mag-netice;

83

� un tub de silicon în T pentru introducerea micropar-ticulelor magnetice, prevãzut cu douã robinete pentrudirijarea lichidului purtãtor;

� un vas în care este plasat tubul de simulare, umplut cuacelaºi tip de lichid ca ºi lichidul purtãtor;

� un magnet permanent de înaltã energie (NdFeB).

Testarea s-a fãcut cu purtãtori magnetici din material amorfdin clasa (0-100) µm, diametrul interior al tubului de siliconfiind D

int = 0,25 mm. Lichidul purtãtor a fost iniþial apa dis-

tilatã ºi ulterior o soluþie de glicerinã cu o vâscozitate apropiatãde cea a sângelui (h = 3,5 cSt).

În timpul testãrilor, magnetul permanent de înaltã energie afost plasat mai întâi perpendicular pe tub, apoi a fost plasatparalel. Au fost efectuate testãri pentru a se verifica dacã esteposibilã depunerea de microparticule magnetice doar în inte-riorul sferei (anevrismului), dacã particulele captate nu obstrueazãºi lumenul tubului (vasului sanguin) ºi dacã aceste microsferemagnetice pot fi captate în totalitate.

Capitolul 5

REZULTATEªI INTERPRETAREA ACESTORA

5.1. Separarea eritrocitelor în gradient înaltde câmp magnetic

5.1.1. Determinarea performanþelor circuitului magnetic

O primã problemã avutã în vedere a fost cea a stabilirii perfor-manþelor circuitului magnetic. Pentru aceasta a fost determinatãinducþia magneticã de fond � în întrefierul unde este plasatãmatricea magneticã � pentru 6 valori ale întrefierului de lucru.

În cadrul experimentãrilor s-a verificat ºi gradul de încãl-zire al bobinelor pe o perioadã de 30 minute. Dupa aproximativ

84

15 de minute, la un curent I = 3,5 A (corespunzãtor uneiinducþii de peste 1,97 T), bobinele au atins o temperaturã decirca 44o C. Feþele plan paralele ale pieselor polare au atinscirca 40o C dupã 30 minute de funcþionare.

S-a apreciat cã aceastã temperaturã nu influenþeazã stareafiziologicã a elementelor componente ale sângelui uman, încazul în care o probã de sânge ar urma sã parcurgã filtrulmagnetic într-un timp mai mic de 20 minute, avându-se învedere ºi caracterul de izolator termic al carcasei matriceimagnetice (folie de polipropilenã).

5.1.2. Rezultatele obþinute

Tabelul 5.1 prezintã sintetic experimentele efectuate: sunt ilus-trate condiþiile de lucru ºi rezultatele obþinute în separarea(concentrarea) eritrocitelor (densitãþile de eritrocite ºi nivelulde concentrare al acestora).

Experimentãrile privind separarea magneticã în gradientînalt de câmp, efectuate în laborator cu un model (prototip)original de separator, au evidenþiat mai multe aspecte, detaliateîn cele ce urmeazã.

Nivelul de concentrare a eritrocitelor din probele cu sângeintegral sau diluat, la o singurã trecere prin matricea magneticã,s-a situat între 14,51% ºi 29,90%, cu excepþia a douã probe.

La probele efectuate cu sânge integral, concentrarea s-asituat în jurul valorii de 20%, cu excepþia unei singure probe,pe când la probele efectuate cu sânge diluat, concentrarea avariat într-un domeniu mai larg (14,51% � 29,90%), cea maimare concentrare observându-se la o probã diluatã la 1/8 (P14).

S-a observat cã valoarea inducþiei magnetice de fond influen-þeazã eficacitatea separãrii: astfel, la probele P

11 ºi P

12 (B =

1,98 T) concentrarea a fost de aproximativ 22 � 24%, pe cândla proba P

21 (B =1,76 T) concentrarea a fost de aproximativ

8% (în acest caz valoarea foarte micã se datoreazã probabil ºiinfluenþei vitezei de curgere).

În cazul probelor cu sânge diluat s-a observat acelaºi com-portament: de exemplu, la proba P

14 (B = 1,98 T) concentrarea

85

Tab

elul

5.1

. Exp

erim

ente

cu

sâng

e um

an:

cond

iþii

de

expe

rim

enta

re,

dens

itãþ

ile

de e

ritr

ocit

e ºi

niv

elul

de

conc

entr

are

86

a fost de 29,9%, iar la proba P24 (B = 1,76 T) concentrarea afost de 18,57%. Viteza medie de curgere a influenþat de ase-menea eficacitatea procesului de separare: la proba cu sângeintegral P11 (vm = 0,95 mm/s, B = 1,98 T) concentrarea a fostde 22,06%, în timp ce la proba P31 (vm = 1,1 mm/s, B = 2,01 T)concentrarea a fost de 15,35%.

O staþionare a sângelui în matricea magnetizatã (echivalentcu v = 0) a condus în final la o concentrare foarte bunã. Astfel,la proba P

51 concentrarea a fost de 27,10%, iar la proba P

61

concentrarea a fost 24,53% . Staþionarea în câmp magneticpoate avea însã ºi un inconvenient ce constã în creºterea dura-tei procesului de separare magneticã.

S-au fãcut ºi numãrãtori ale eritrocitelor din matrice (lafinalul experimentului ºi dupã decuplarea câmpului magnetic),putându-se calcula ºi direct factorul (gradul) de concentrare aeritrocitelor. Rezultatele au concordat în bunã mãsurã.

S-a considerat o eroare sistemicã de maxim 20% care însãnu afecteazã precizia calculului gradului de concentrare a eri-trocitelor. Cea mai mare concentrare s-a obþinut în cazul cir-culãrii repetate a sângelui prin matricea magneticã: la o recir-culare de trei ori prin matrice, în condiþiile cele mai favorabilede câmp ºi vitezã (B

max=2,01, v

med=0,95 mm/s), s-a constatat o

concentrare de 37,86%.Pentru o diluþie de 1/9, numãrul de eritrocite /mm3 din proba

iniþialã a fost de 5,58 × 106, iar cel din matrice de 7,61 × 106.Factorul de concentrare obþinut utilizând calculul indirect

a fost de 31%, iar cel obþinut utilizând calculul direct a fost de36,38%. În cazul diluþiei de 1/10, numãrul de eritrocite /mm 3 dinproba iniþialã a fost de 5,91 × 106 , iar cel din matrice de 8,2 × 106.

Factorul de concentrare obþinut prin utilizarea calcululuidirect a fost de 38,74%.

5.1.3. Discuþii ºi interpretarea rezultatelor obþinute

Prezumându-se un efect distructiv exercitat asupra hematiilor,de cãtre firele cu o eventualã rugozitate mare de la nivelulmatricei (mai ales în condiþiile recirculãrii sîngelui prin aceasta),

87

s-a optat pentru construirea unei matrice alcãtuitã din straturiechidistante de fire magnetizabile ce prezintã o suprafaþã ne-tedã. Acest fapt constituie o primã limitare, asumatã, a dimi-nuãrii eficienþei de captare (concentrare) a eritrocitelor îngradient înalt de cîmp magnetic.

Un alt aspect important, care a trebuit luat în consideraþie afost influenþa fenomenului de histerezis în procesul de captare--îndepãrtare al eritrocitelor la nivelul matricei.

Dificultatea abordãrii acestei probleme rezidã ºi din faptulcã existã foarte puþine lucrãri publicate, chiar pe plan inter-naþional, care sã abordeze fenomenul de histerezis în procesulde captare în general al unor particule paramagnetice.

În cazul experimentelor efectuate apreciem cã fenomenulde histerezis al depunerii a influenþat eficacitatea procesuluide separare în cazul probei cu sânge integral P

21 (v

m =

1,1 mm/s, B = 1,76 T), unde concentrarea procentualã a fostde aproximativ 8%, ºi în cazul probei cu sânge diluat 1/4, P23

(vm = 1,1 mm/s, B = 1,76 T), la care concentrarea procentualãa fost de 3,37%.

Histerezisul depunerii s-a manifestat în cadrul experimen-telor efectuate, în conformitate cu demonstraþia teoreticã ex-pusã, în cazul unor cîmpuri mai mici sau a unor viteze maimari decât cele iniþiale, influeþând, uneori semnificativ, capa-citatea de acumulare a eritrocitelor în depozit.

O altã observaþie a fost aceea cã, în cazul diluãrilor maiimportante ale sângelui integral, factorul de concentrare aeritrocitelor creºte. Acest lucru este consecinþa scãderii forþeide dragare hidrodinamicã care reprezintã principala forþã ce seopune forþei magnetice de atracþie exercitatã de câmpul mag-netic al firelor. Pentru diluþii, temperatura de lucru poate fiuºor crescutã, deoarece apa (prezentã în serul fiziologic) po-sedã o capacitate caloricã ridicatã, ceea ce face ca diluþiarespectivã sã înmagazineze într-un timp mai îndelungat aceeaºicantitate de cãldurã pe care ar înmagazina-o acelaºi volum desânge integral în aceeaºi perioadã de timp. Cu alte cuvinte,sângele diluat se încãlzeºte mai greu ca sângele integral, ceeace ar reprezenta un avantaj.

88

Analiza probelor de sânge rezultate dupã separarea mag-neticã au arãtat, în toate cazurile, absenþa oricãror distrugeriale elementelor figurate sanguine.

La unele probe, recoltate dupã trecerea prin câmpul mag-netic foarte intens, s-a observat un fenomen inedit ºi anume o�gelifiere� a sângelui, care dispare dupã miºcãri blânde deagitare a eprubetei. Fenomenul l-am explicat prin apariþia unormodificãri ale adezivitãþii membranare eritrocitare, modificãritemporare induse de prezenþa ºi persistenþa unor câmpuri mag-netice foarte intense. Nici în acest din urmã caz nu s-au ob-servat modificãri structurale ale eritrocitelor.

În experimentele efectuate pe modelul original de filtrumagnetic s-au observat, în probele de sânge trecut prin matrice,unele modificãri ale concentraþiei leucocitelor ºi tromboci-telor, sugerând o reþinere mecanicã în depunerile de globuleroºii de pe firele feromagnetice ºi a altor elemente figurate.

În literatura de specialitate a fost publicat totuºi rezultatulunor experimentãri, prin care s-a studiat comportamentul leu-cocitelor sanãtoase ºi a celor bolnave într-un câmp magneticneomogen de 1 T: s-a afirmat în acel studiu cã deplasarealeucocitelor bolnave se face spre zonele cu câmp mai intens,spre deosebire de cele sãnãtoase, care se miºcã spre zona decâmp cu intensitate mai micã. Totuºi, nu s-a dat o explicaþieplauzibilã pentru cele constatate, având în vedere cã leuco-citele nu conþin fier sau alte elemente care le-ar putea induceproprietãþi magnetice.

5.2. Testarea in vitro a celor douã tipuriale unui ferofluid original

Pentru studiile experimentale întreprinse a fost utilizat unferofluid original, în douã sorturi, realizat la institutul de Fizicãtehnicã � IFT Iaºi, al cãrui mod de preparare ºi principalecaracteristici au fost prezentate în capitolul anterior.

Într-o primã etapã, experimentele au avut drept scop obser-varea comportãrii în timp a diluþiilor de ferofluid ºi deter-

89

minarea limitei de diluþie pânã la care ferofluidul diluat rãmânestabil. Experimentele au fost efectuate folosind ferofluiduloriginal pe bazã de magnetitã ºi oleat de amoniu.

Au fost trasate curbele de magnetizare pentru trei probe deferofluid cu concentraþii diferite:

� ferofluid nediluat (c = 0,040 mg Fe /ml);� ferofluid diluat ½ (c = 0,020 mg Fe /ml);� ºi ferofluid diluat 1/10 (c = 0,004 mg Fe /ml).

Evoluþia acestor curbe de magnetizare este prezentatã înfig. 5.11.

Fig. 5.11. Curbele de magnetizarepentru ferofluidul preparat (198)

Se observã cã ferofluidul are o comportare superparamag-neticã, chiar pentru o diluþie de zece ori mai micã decât ceanormalã preparatã.

În continuare a fost determinatã limita de diluþie pânã lacare ferofluidul rãmâne stabil. Determinãrile au fost realizatecu ferofluid diluat pânã la diluþia 1/64.

Experimentãrile au fost realizate pornindu-se de la fero-fluidul apos pe bazã de magnetitã, având ca surfactant oleatulde sodiu, a cãrui concentraþie obþinutã dupã preparare (fero-fluid nediluat FF1/1) a fost c = 0,040 mg Fe/ml.

S-a determinat ºi limita de diluþie pânã la care ferofluidulrãmâne stabil. Determinãrile au fost realizate cu ferofluid diluat,pânã la o diluþie de 1/64.

Experimentãrile au fost realizate pornind de la ferofluidulapos pe bazã de magnetitã, având ca surfactant oleatul de

90

sodiu, a cãrui concentraþie obþinutã dupã preparare (ferofluidnediluat FF1/1) a fost c = 0,040 mg Fe/ml.

Testãrile au avut drept scop observarea comportãrii în timpa diluþiilor de ferofluid ºi determinarea limitei de diluþie pânãla care ferofluidul diluat rãmâne stabil.

În acest scop, din ferofluidul concentrat, s-au preparat 6diluþii ale acestuia, dupã cum urmeazã:

� FF 1/2, cu un conþinut de 0,020 mg Fe/ml;� FF 1/4, cu un conþinut de 0,010 mg Fe/ml;� FF 1/8, cu un conþinut de 0,005 mg Fe/ml;� FF 1/16, cu un conþinut de 0,0025 mg Fe/ml;� FF 1/32, cu un conþinut de 0,00125 mg Fe/ml;� FF 1/64, cu un conþinut de 0,00062 mg Fe/ml.

Fiecare probã, constituitã dintr-un ml de ferofluid diluat, afost introdusã într-o eprubetã (10 × 50 mm) plasatã deasupraunui magnet permanent de înaltã energie NeFeB, cu dimen-siunile 40 × 20 × 10 mm.

Valoarea inducþiei magnetice mãsuratã la o distanþã de 12mm faþa de magnet (distanþa echivalentã pânã la suprafaþaferofluidului) a fost de aproximativ 850 Gs.

Peste coloana de ferofluid din fiecare eprubetã s-a introdusprin pipetare câte 1 ml apã distilatã: s-au format douã coloanedistincte - una de ferofluid ºi, deasupra, una de apã distilatã.

În timp, s-a observat aspectul ferofluidului ºi gradul dedifuzie al acestuia în coloana de apã distilatã.

Observaþiile au fost fãcute la intervale de 24 h, timp de 10zile consecutive (tabelul 5.2).

S-a constatat cã ferofluidul pânã la diluþia de 1/16 fero-fluidul îºi menþine perfect stabilitatea timp de 10 zile (deli-mitarea dintre stratul de ferofluid ºi apa de deasupra a rãmasnemodificatã).

Dupã aproximativ 24 de ore, la proba cu diluþia de 1/32 s-aobservat o difuzie parþialã a ferofluidului în apã, la suprafaþade separaþie apãrând un strat intermediar cu o coloraþie slabmaronie. Fenomenul de difuzie s-a accentuat pe parcursulurmãtoarelor 9 zile de observare, dupã a 10-a zi volumul de

91

lichid de deasupra ferofluidului având o culoare maroniu închis,mai deschisã totuºi decât cea a ferofluidului.

La proba a cãrei diluþie a fost 1/64 s-a produs în apro-ximativ 2 ore o difuzie pronunþatã, urmatã de apariþia unoraglomerãri de particule care au început sã se miºte spre mag-netul plasat sub eprubetã.

Experimentãrile au arãtat ca ferofluidul îºi pãstreazã stabi-litatea ºi implicit capacitatea de vectorizare specificã pânã la odiluþie de 1/16, respectiv pânã la concentraþia c = 0,0025 mgFe /ml. Aceastã valoare limitã a diluþiei are o mare importanþãpentru prepararea unui �medicament magnetic� deoarece com-plexarea ferofluidului cu soluþia apoasã de medicament nutrebuie sã conducã la o depãºire a valorii limitã de diluare.

În cazul ferofluidului hidrofil pe bazã de magnetitã, cuparticule relativ mari, având ca surfactant dextrina (al cãruimod de preparare ºi principale caracteristici au fost prezentateîn capitolul anterior), s-a observat, spre deosebire de primultip de ferofluid preparat, o tendinþã de decantare în timp,lichidul magnetic redevenind omogen dupã o scurtã agitare. Oexplicaþie posibilã ar fi cã particulele de magnetitã, avânddimensiuni mai mari, au tendinþa de decantare gravitaþionalã.

Pentru testarea in vitro a celor douã sorturi ale ferofluiduluioriginal studiat, s-au efectuat douã teste de complexare a fero-fluidului cu un antibiotic ºi de desorbþie a antibioticului dincomplexul format.

Testele au fost fãcute mai întâi cu tetraciclinã, fiind apoireluate pentru rifampicinã.

Cele douã antibiotice au fost alese pentru a observa înspecial procesul de eliberare a antibioticului din ferofluid,deoarece cele douã sunt hidrosolubile ºi colorate. Tetraciclinaprezintã o coloraþie galbenã, iar rifampicina o coloraþie roºie.

Tabelul 5.2. Stabilitatea în timp a ferofluidului (FF) diluatFF1/1

FF1/2

FF1/4

FF1/8

FF1/16

FF1/32

FF1/64

1-10 zile

1-10zile

1-10zile

1-10zile

1-10zile

0 - 24 h 2 -10zile

1 - 10zile

Stabil Stabil Stabil Stabil Stabil Parþialstabil

Instabil Instabil

92

S-a observat cã, dupã o perioadã relativ scurtã de timp (30� 60 min.), antibioticele au început sã fie desorbite din fero-fluidul plasat în câmp magnetic. Colorarea în galben, respectivîn roºu a mediului de desorbþie � apa distilatã � s-a accentuatîn timp, aceasta însemnând cã antibioticul a fost eliberat dinferofluid cu o anumitã ratã.

Comparând coloraþia probelor desorbite cu cea a soluþiilormartor s-a observat cã maximul de concentraþie a fost atinsdupã aproximativ 20 de ore.

5.2.1. Testarea efectului bacteriostatic ºi/sau bactericidale ferofluidelor preparate pe bazã de oleatde amoniu ºi dextrinã

În bibliografia consultatã am gãsit câteva lucrãri în care fero-fluidele studiate in vitro au prezentat proprietãþi bacteriostatice(32, 97, 164), iar unele dintre ele chiar bactericide (291, 292),mecanismul de acþiune, în toate cazurile, rãmânînd însã ipo-tetic. Studiul a fost efectuat în Laboratorul de Microbiologieal Centrului Medical �Nicolina� din Iaºi printr-o colaborarecu dr. L. Lunguleac, medic primar de specialitate (laborator).

Practicarea antibiogramei difuzimetrice utilizând truselestandard, la care s-a adãugat ferofluid concentrat pe bazã deoleat de amoniu ºi diluþiile 3/4, 1/2, 1/4, 1/8, în apã distilatã,ale acestuia (echivalente cu 40 mg, 30mg, 20mg, 10mg ºi 5mgfier/litru ferofluid), ne-a permis evaluarea sensibilitãþii la anti-bioticele din trusele standard simultan cu sensibilitatea la fero-fluid ºi la diluþiile acestuia, pe urmãtoarele tulpini bacteriene:

� E.coli spp.� Klebsiella spp.� Stafilococ auriu� Streptococ grup D.

Validarea testelor s-a efectuat prin folosirea tulpinilor decontrol (pentru E.colli ºi pentru Stafilococ auriu).

Mediile însãmânþate pe plãcile de culturã au fost menþinuteîn condiþii standard de laborator, urmãrindu-se dezvoltarea colo-niilor microbiene la 24 - 48 � 72 � 96 �120 � 144 ºi 168 ore.

93

În urma testãrii nu s-a putut pune în evidenþã nici un efectantibacterian legat de produsul de cercetat (ferofluid), indi-ferent de tulpina pe care s-a efectuat testarea ºi indiferent detipurile de ferofluid sau de diluþiile de ferofluid folosite.

Concluzia a fost cã tipurile de ferofluid studiate de noi nuposedã nici efect bacteriostatic, nici efect bactericid.

În studiile citate anterior, care menþioneazã unele efectebacteriostatice sau chiar efecte bactericide exercitate de unelefluide magnetice, sunt folosite pentru încapsularea particulelorsuperparamagnetice diferite tipuri de polimeri biocompatibili,care, ar putea fi responsabili de o anumitã acþiune antibac-terianã. Pânã în prezent, efectele au fost doar menþionate ca unfapt experimental, neexistând nici un studiu care sã abordezesistematic ºi sã tranºeze aceastã problemã.

5.2.2. Testarea in vitro a unui complex medicamentosmagnetic format dintr-un ferofluid originalºi diclofenacul sodic

Studiul experimental privind formarea unui complex ferofluid� diclofenac sodic ºi desorbþia medicamentului din complexulmagnetic astfel format, a urmãrit:

� determinarea capacitãþii ferofluidului de a încorporadiclofenacul sodic;

� verificarea stabilitãþii complexului ferofluid � medicament;� modelarea modului de eliberare a medicamentului în

câmp magnetic.

A fost ales diclofenacul sodic (un antiinflamator nesteroi-dian), deoarece acesta prezintã un indice crescut de hidroso-lubilitate. Modelarea eliberãrii medicamentului din ferofluid apornit de la premiza cã, dupã formarea complexului ferofluid� medicament, este necesarã scurgerea unei perioade de timppânã la eliberarea medicamentului din complexul format, pe-rioadã de timp care trebuie sã fie mai mare decât cea în care serealizeazã administrarea ºi vectorizarea �medicamentului mag-netic�. Rezultatele obþinute sunt ilustrate în tabelul 5.3.

94

În continuare, a fost urmãritã evoluþia eliberãrii (desorbþiei)diclofenacului din complexul medicamentos într-un intervalde 0,5� 3 ore. Aceastã evoluþie este arãtatã în figura 5.12.

Tabelul 5.3. Evoluþia eliberãrii diclofenacului sodicdin complexul ferofluid - diclofenac sodic

Fig. 5.12. Evoluþia eliberãrii diclofenacului sodicdin complexul medicamentos magnetic în timp de 3 ore

Concentraþia soluþiei de diclofenac sodic în timp[mg %]

ProbaDiluþiafero-

fluidului t = 1 h t = 1 h t = 11 h t = 2 h t = 21 h t = 3 h t = 24 h

P1-7 FF 1/2 0,82 1,41 1,90 1,34 1,30 1,27 6,60

P8-14 FF 1/4 0,97 2,40 2,55 1,62 1,48 1,40 5,10

P15-21 FF 1/8 0,66 0,82 1,75 1,30 1,32 1,34 4,32

Se observã cã eliberarea diclofenacului sodic din com-plexul FF-DS are pe ansamblu o evoluþie crescãtoare în timp.

La toate cele trei complexe studiate, în intervalul 1-2 ores-a observat o concentraþie crescutã de substanþã medicamen-toasã eliberatã, maximul de concentraþie (1,90 mg%; 2,55 mg%;1,75 mg%) fiind la aproximativ 1,5 ore de la începerea pro-cesului de desorbþie. S-a constatat cã valorile desorbþiei suntrelativ apropiate pentru cele trei complexe diferite la t = 0,5ore ºi, de asemenea, dupã 2,5 ore.

95

Apar însã deosebiri de evoluþie a desorbþiei între cele treicomplexe în intervalul 0,5 � 2 ore, cea mai mare diferenþãînregistrându-se dupã o orã (1,41 mg%; 2,40% ºi 0,82).

Se remarcã faptul cã cea mai accentuatã ratã de eliberare adiclofenacului sodic s-a înregistrat la complexul FF 1 + DS ºinu la complexul FF1/2 + DS cum ar fi fost de aºteptat.

O explicaþie posibilã ar consta în cuplarea preponderentã amoleculelor diclofenacului sodic prin fenomenul de pãtrunderea moleculelor acestuia printre moleculele de surfactant ºi maipuþin prin legãturã electrochimicã cu acestea, valoarea den-sitãþii nanoparticulelor de magnetitã din lichid favorizând pro-babil acest tip de complexare. Dupã 24 de ore, diclofenaculsodic s-a desorbit din cele trei complexe studiate, într-o canti-tate de 2-3 ori mai mare decât maximul înregistrat la 1,5 ore,cea mai mare valoare a concentraþiei desorbite (6,60 mg%)fiind în cazul complexului FF1/2 + DS, acesta având cea maimare densitate de nanoparticule.

5.2.3. Testarea in vitro a unui complex medicamentosmagnetic format dintr-un ferofluid originalºi piroxicam

Pentru efectuarea testãrilor s-a folosit o soluþie de piroxicam(apã distilatã, alcool etilic, suc gastric natural, clorurã de natriu)având concentraþia de 50 mg%, din care au fost preparate câte4 probe identice pentru complexarea cu fiecare din diluþiile deferofluid: FF 1/2, FF 1/4 ºi FF 1/8.

Ca urmare a staþionãrii probelor într-un stativ, timp de 24de ore, s-a obþinut omogenizarea complexelor formate dinferofluid � FF ºi antiinflamator (piroxicam � PX).

În faza de omogenizare a complexelor s-a constatat cã douãdintre cele trei complexe au precipitat (fenomenul a apãrut întoate cele 12 eprubete, 6 eprubete cu FF 1/4 + PX ºi6 eprubete cu FF1/8 + PX) formându-se în final pe funduleprubetelor o depunere compactã alcãtuitã din agregate denanoparticule de magnetitã.

96

Experimentãrile pentru determinarea evoluþiei desorbþieipiroxicamului au fost efectuate doar cu complexul FF 1/2 +PX, care a rãmas stabil dupã plasarea în câmp magnetic.

Rezultatele obþinute sunt ilustrate în tabelul 5.4.

Tabelul 5.4. Evoluþia eliberãrii piroxicamuluidin complexul ferofluid � piroxicam

Concentraþia soluþiei de piroxicam desorbitã în timp[mg %]

ProbaDiluþiafero-

fluidului t = 3 h t = 1 h t = 2 h t = 3 h t = 21 h

PX1-4 FF 1/2 1,30 2,10 1,42 1,38 3,75

PX5-8 FF 1/4Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

PX9-12 FF 1/8Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Complexul

aprecipitat

Experimentele efectuate pentru complexarea ferofluiduluicu piroxicam, un antiinflamator mult mai puþin solubil în apãdecât diclofenacul sodic, au arãtat cã acest complex poate fiobþinut doar pentru o diluþie FF 1/2, o diluþie mai mare produ-când destabilizarea complexului format în maximum 24 de ore.

5.2.4. Testarea in vivo a toxicitãþii unui ferofluid originalapos, pe bazã de magnetitã, având ca surfactantoleatul de amoniu

Studiul de toxicitate acutã a urmãrit urmãtoarele aspecte:

� decesul animalelor în intervalul de timp de 1-7 zile dupãdoza administratã;

� comportamentul animalelor pe parcursul studiului, dupãadministrarea dozei de ferofluid;

� examenul anatomopatologic al probelor recoltate dinficat, rinichi, plãmân, cord ºi peritoneu de la animaleledecedate, precum ºi de la animalele care au supravieþuit

97

ºi care au fost sacrificate la sfârºitul perioadei de ob-servaþie (au fost sacrificaþi numai supravieþuitorii dinlotul 2 dupã 7 zile).

Decesul animalelor în intervalul de timp de 1-7 zile dupãdoza administratã. În urma studiului efectuat s-a constatat cãdoza maximã toleratã (DMT) de ferofluid (doza cea mai marela care supravieþuiesc toate animalele din lot) a fost de 0,25 mlferofluid, echivalentul a 10 mg fier total (lotul 2 de ºoareci).

Doza cea mai micã de ferofluid la care au decedat toþiºoarecii din lot, (doza letalã 100%, DL

100), a fost de 0,75 ml

ferofluid (la lotul 4 de ºoareci). Decesul animalelor a survenitcel mai devreme la 24 ore dupã administrarea ferofluidului ºicel mai tîrziu dupã patru zile.

Sinteza observaþiilor este observatã în tabelul 5.5.

Tabelul 5.5. Evoluþia deceselor în intervalul 1-7 zile dupãdoza administratã

Doza administratã Lot 15 mg

Lot 210 mg

Lot 320 mg

Lot 430 mg

Lot 540 mg

Nr. animale / lot4 6 6 6 5

DECESE 0 0 1 6 5a 5mg 10mg 10mg 10mg 10mgb 0 0,5 3,5 5,5

a = diferenþa între douã doze succesive de substanþã administratãb = media numãrului de animale moarte în douã loturi succesive

Comportamentul animalelor. La ºoarecii care au primitdoze mai mari de 0,5 ml s-a remarcat o rapidã ºi profundãalterare a stãrii generale cu caractere comune: hipotermie,diminuarea pânã la abolire a reflexelor somatice, comã profundã.Observaþiile sunt valabile în special pentru loturile 5 ºi 4.

ªoarecii din lotul 3 au prezentat iniþial o simptomatologiemai atenuatã, dar tot cu manifestãri de tip nervos central:

� hipotermie;� hiporeactivitate;� diminuarea accentuatã a reflexelor somatice),

care a evoluat ulterior spre comã ºi deces.

98

Nu s-au consemnat nici modificãri comportamentale la in-divizii din loturile 2 ºi 1 de ºoareci, pe durata supravegherii.

Examenul anatomopatologic. Examenul anatomopatologic,efectuat la Catedra de Anatomie patologicã a UMF �Gr.T.Popa�Iaºi, a relevat urmãtoarele aspecte:

� la animalele din lotul 5 - stazã în principalele organe:ficat, rinichi, plãmân;

� la animalele din lotul 4: ficat de stazã cu infiltrat in-flamator redus în spaþiile porto-biliare, degenerescenþãgranulo-vacuolarã moderatã, macrofage încãrcate cu he-mosiderinã; cord fãrã modificãri, epicard cu vase con-gestionate, infiltrat inflamator, posibil pigment de hemo-siderinã;

� la animalele din lotul 3: plãmân ºi ficat fãrã modificãri;rinichi de stazã cu rare aspecte de degenerescenþã va-cuolarã a epiteliului tubular;

� la animalele din lotul 2: ficat cu degenerescenþã vacuo-larã, infiltrat inflamator în spaþiile porto-biliare, la supra-faþã siderofage, peritoneu cu depozite de hemosiderinã.

Observaþiile clinice au fost coroborate cu examenul anato-mopatologic, examen efectuat la Catedra de Anatomie Patologicãde la UMF �Gr. T. Popa� Iaºi (conf. univ. dr. S. Teleman).Comportamentul ºi evoluþia clinicã a animalelor de experienþã(aspect de encefalopatie portalã), cât ºi leziunile anatomo-patologice (ficat de stazã cu infiltrat inflamator în spaþiileporto-biliare ºi degenerescenþã granulo-vacuolarã) au sugeratcã agresiunea toxicã a ferofluidului s-ar produce prin elibe-rarea ionilor de amoniu din oleatul de amoniu ce acoperã parti-culele de magnetitã (posibilã în urma contactului ferofluiduluicu enzimele din mediul intern al organismului viu).

Prezenþa ionilor de amoniu (NH4

+) a fost pusã ulterior înevidenþã ºi printr-o metodã calitativã utilizând reactivul Nessler(reactiv specific pentru identificarea ionilor NH4

+). Reacþia afost pozitivã de la diluþii de ferofluid foarte mici (1/128) cuintensificare pe mãsura scãderii diluþiei.

Studiul efectuat pentru evaluarea toxicitãtii acute (caresugereazã cã efectele nocive ale ferofluidului s-ar datora elibe-

99

rãrii in vivo a ionilor de amoniu) impune modificarea formuleide obþinere a ferofluidului, prin înlocuirea NH

4+ , eventual

prin folosirea unui alt stabilizator hidrosolubil.

5.2.5. Testarea in vivo a toxicitãþii unui ferofluid originalapos, pe bazã de magnetitã, având ca surfactantoleatul de sodiu

Precedentul studiu de toxicitate acutã, care sugereazã cã efectelenocive ale ferofluidului s-ar datora eliberãrii in vivo a ionilorde amoniu, a impus modificarea formulei de obþinere a feroflui-dului prin înlocuirea oleatului de amoniu cu oleat de sodiu.

Studiul de toxicitate acutã a urmãrit urmãtoarele aspecte:

� decesul animalelor în intervalul de timp de 1-14 ziledupã doza administratã;

� comportamentul animalelor pe parcursul studiului dupãadministrarea dozei de ferofluid;

� examenul anatomopatologic al probelor recoltate dinficat, rinichi, plãmân, cord ºi peritoneu de la animaleledecedate precum ºi de la animalele care au supravieþuit ºicare au fost sacrificate la sfârºitul perioadei de observaþie.

Decesul animalelor în intervalul de timp de 1-14 zile dupãadministrarea ferofluidului. Pe toatã durata de supravegherenu s-a constat nici un deces la animalele luate în studiu.

Comportamentul animalelor. Cu excepþia unei scurte peri-oade de agitaþie motorie ºi agresivitate (20-30 secunde), ime-diat dupã administrarea intraperitonealã a ferofluidului, nus-au remarcat modificãri notabile ale comportamentului ani-malelor aflate în studiu.

Examenul anatomopatologic. La sfârºitul perioadei de obser-vaþie au fost sacrificate, randomizat, câte un animal din fiecarelot pentru examen anatomopatologic. Acesta nu a pus în evidenþãleziuni severe sau moderate la nivelul principalelor organe.

Astfel, la nivelul ficatului s-au observat urmãtoarele leziuni:ficat de stazã cu infiltrat inflamator redus în spaþiile porto-

100

-biliare, degenerescenþã granulo-vacuolarã moderatã, macro-fage încãrcate cu hemosiderinã (fig. 5.17 ºi fig. 5.18). Lanivelul cordului, examenul anatomopatologic a relevat urmã-

evidenþã aspecte de rinichi de stazã cu rare aspecte de degeneres-cenþã vacuolarã a epiteliului tubular (fig. 5.21 ºi fig. 5.22); Lanivelul peritoneului au fost puse în evidenþã depozite de hemoside-rinã (fig. 5.23), iar splina nu a prezentat modificãri (fig. 5.24).

Figura 5.17. Ficat de stazãcu infiltrat inflamator redus

în spaþiile porto-biliare

Figura 5.18. Ficat cu dege-nerescenþã granulo-vacuolarãmoderatã, macrofage încãr-

cate cu hemosiderinã

toarele aspecte: cord fãrã modificãri, epicard cu vase conges-tionate, infiltrat inflamator, posibil pigment de hemosiderinã(fig. 5.19). La nivelul plãmânilor nu s-au semnalat modificãrisemnificative (fig. 5.20). La nivelul rinichilor au fost puse în

Figura 5.19. Cord fãrã modi-ficãri, epicard cu vase con-

gestionate, infiltrat inflamator

Figura 5.20. Plãmân fãrãmodificãri semnificative

101

Figura 5.21. Rinichide stazã

Figura 5.22. Rinichi cuaspecte de degenerescenþã

vacuolarã a epiteliului tubular

Figura 5.23. Peritoneu cudepozite de hemosiderinã

Figura 5.24. Splinã fãrãmodificãri

Evoluþia clinicã a animalelor ºi examenul anatomopatologicne permit sã concluzionãm cã ferofluidul realizat prin acope-rirea magnetitei cu oleat de sodiu are o toxicitate redusã,neproducând decese la 48 de ore sau leziuni anatomopatolo-gice semnificative, indiferent de concentraþia utilizatã.

5.2.6. Testarea in vivo, pe model experimentalde inflamaþie acutã, a unui medicament magneticobþinut prin complexarea unui ferofluid (preparatpe bazã de oleat de sodiu) cu diclofenac sodic

Studiul a fost efectuat pe patru loturi de câte ºase ºoareci albiSwiss, masculi, utilizând un model experimental de inflamaþie,

102

dupã un protocol detaliat în capitolul anterior: administrareaintravenoasã a fost realizatã sub anestezie generalã, iar ani-malele din lotul 2 ºi lotul 3 au fost poziþionate cu laba poste-rioarã stângã (edemul inflamator) deasupra unui magnet per-manent de înaltã energie (NdFeB).

Timpul de expunere la câmpul magnetic a fost de 120minute. S-au efectuat apoi mãsurãtori ale edemului inflamatorla 6 ore ºi 18 ore. Valorile obþinute (pe loturi ºi indivizi) suntredate în tabelul 5.11 pentru animalele din lotul 4 (martorulalb), în tabelul 5.12 pentru animalele din lotul 1 (care au primitdoar diclofenac), în tabelul 5.13 pentru animalele din lotul 2(care au primit doar ferofluid), iar în tabelul 5.14 valorileobþinute pentru animalele din lotul 3 (care au primit ferofluidcomplexat cu diclofenac sodic).

Tabelul 5.11. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 4

Lot 4

(martor alb)

Volumul labei posterioare(exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t18 t24 t48 t72

cap 12.0 17.0 18.0 16.0 14.5 16 16

fl dr 13.0 17.0 18.0 15.0 13 14 15

fl stg 11.0 14.0 14.5 12.0 13 14 14.5

spate 11.0 17.0 18.0 13.0 13.9 14.7 15.2

coada 12.0 15.0 16.0 15.0 14 14.5 15

alb 12.0 15.0 16.0 16.5 15 15 15.5

Media 11.8 15.8 16.8 14.6 13.9 14.7 15.2

Stdev 0.6 1.3 1.5 1.7 0.8 0.7 0.5

Medie % 100.0 133.8 141.5 123.2 117.5 124.2 128.5

Evoluþia edemului este redatã comparativ în figura 5.25.Evoluþia edemului inflamator în primele patru ore, produs

prin injectarea unei soluþii de carrageenan 1% a fost în con-cordanþã cu datele din literaturã (280, 281), constatându-se ocreºtere a volumului labei injectate cu aproximativ 33-38%.

103

Tabelul 5.12. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 1

Lot 1(diclofenac)

Volumul labei posterioare(exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t18 t24 t48 t72

cap 11.0 15.5 15.0 12.0 13 13 13

coada 12.0 15.5 14.5 13.0 14 13.5 13

fl. dr. 10.0 15.0 14.0 12.0 13 12 12.5

fl. stg. 12.0 16.5 17.0 14.5 15 14 12

spate 10.0 14.0 14.0 13.0 14 13 13

alb 11.0 13.5 13.5 13.0 14 14 13

Media 11.0 15.0 14.7 12.9 13.8 13.3 12.8

Stdev 0.9 1.1 1.3 0.9 0.8 0.8 0.4

Medie % 100.0 136.4 133.3 117.4 125.8 120.5 115.9

Tabelul 5.13. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 2

Lot 2(ferofluid)

Volumul labei posterioare(exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t18 t24 t48 t72

cap 11.5 14.5 15.0 15.0 12.0 13.0 13.5

coada 11.0 13.0 13.0 14.5 15.0 12.0 15.0

fl dr 11.0 15.5 16.5 16.0 15.0 14.0 14.0

fl stg 11.0 14.0 13.0 14.5 14.0 14.0 15.0

spate 13.0 15.5 17.0 15.0 13.0 14.0 14.0

alb 12.0 14.5 15.0 15.0 13.8 13.4 14.3

Media 11.6 14.5 14.9 15.0 13.8 13.4 14.3

Stdev 0.9 1.8 1.9 0.6 0.9 0.9 0.5

Medie % 100.0 125.2 128.8 129.5 119.1 115.7 123.5

Dupã administrarea diclofenacului simplu, a complexuluidiclofenac � ferofluid, a ferofluidului simplu ºi a apei distilate,evoluþia edemului inflamator a fost diferenþiatã la cele patruloturi aflate în studiu.

104

Tabelul 5.14. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 3

Lot 3(FF+diclofenac)

Volumul labei posterioare(exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t18 t24 t48 t72

cap 11.0 15.0 14.0 13.5 13.0 12.0 12.0

coada 12.5 13.0 13.0 14.0 14.0 12.5 13.0

flanc drept 11.5 16.5 17.0 13.0 14.0 12.0 11.5

flanc sting 12.0 15.5 15.0 15.0 14.5 13.0 12.0

spate 11.5 15.0 15.0 14.5 14.0 12.5 11.5

alb 11.5 15.5 14.0 13.0 12.5 12.0 11.5

Media 11.7 15.1 14.7 13.8 13.7 12.3 11.9

Stdev 0.5 1.2 1.4 0.8 0.8 0.4 0.6

Medie % 100.0 129.3 125.7 118.6 117.1 105.7 102.1

Fig. 5.25. Evoluþia comparativã a edemului inflamator

La lotul de control (lot 4, martor �alb�) s-a constatat evo-luþia edemului inflamator, cu un �vârf� la 6 ore ºi un al doilea,de mai micã amplitudine, la 72 ore (fig. 5.26 A). Acest aspectal evoluþiei naturale a edemului inflamator provocat cu carra-geenan este descris ºi de alþi autori (282-283).

Dupã 96 de ore s-a constatat tendinþa de scãdere spontanã aedemului inflamator la lotul martor �alb�.

Martorul pozitiv, tratat i.v. cu diclofenac (lot 1, fig. 5.26 B),a avut evoluþia aºteptatã: dupã o creºtere semnificativã a volu-mului edemului provocat (> 4 unitãþi relative de volum), dupãadministrarea antiinflamatorului s-a constatat o scãdere relativ

105

continuã a reacþiei inflamatorii cu revenire la normal dupã72-96 ore.

Spre deosebire de evoluþia lotului martor, dupã 6 ore s-aconstatat la toate celelalte loturi o tendinþã semnificativã dediminuare a ritmului de dezvoltare a reacþiei inflamatorii (cu omedie de aproximativ 4 unitãþi relative).

Lotul 2 (fig. 5.27), la care s-a administrat i.v. numai fero-fluid, a avut o evoluþie mai puþin previzibilã. Dezvoltareaedemului inflamator, dupã administrarea ferofluidului ºi expu-nerea în câmp magnetic extern, a fost mult diminuatã în urmã-toarele 44 ore, aproximativ în parametrii evidenþiaþi de martorulpozitiv (fig. 5.28).

A B

Fig. 5.26. Evoluþia edemului inflamator la lotul 4

Fig. 5.27. Evoluþia edemuluiinflamator la lotul 2

Fig. 5.28. Evoluþia edemuluiinflamator la lotul 3

106

Pe baza experimentelor efectuate se pot stabili o serie deconcluzii:

� ferofluidul stabilizat cu oleat de sodiu are un efect toxicmai redus;

� diclofenacul, diclofenacul complexat cu ferofluid ºi fero-fluidul simplu blocheazã apariþia vârfului inflamator dela 6 ore, iar primele douã ºi vârful de la 72 ore;

� diclofenacul complexat cu ferofluid a avut un efect tera-peutic similar cu cel al diclofenacului simplu la 6 ore,deºi în primul caz doza terapeuticã administratã a fostînjumãtãþitã, ceea ce dovedeºte efectul de þintire mag-neticã al ferofluidului purtãtor de antiinflamator în câmpulmagnetic aplicat asupra zonei edemului inflamator; com-plexul diclofenac � ferofluid este concentrat în zona deaplicare a câmpului magnetic extern, determinând o ac-þiune locoregionalã a medicamentului magnetic;

� în condiþiile experimentului efectuat, nu se poate ex-clude o posibilã sumare a efectelor individuale ale diclo-fenacului, ferofluidului ºi câmpului magnetic extern asu-pra fenomenului inflamator.

5.2.7. Influenþa câmpului magnetic asupra edemuluiinflamator experimental

Studiul a fost efectuat pe patru loturi de câte ºase ºoareci albiSwiss, masculi, cu greutatea de 30+/-2grame, în conformitatecu protocolul expus în capitolul anterior. La patru ore dupãinjectarea carrageenen-ului, a fost mãsurat din nou volumullabei posterioare dupã care animalele au fost anesteziate con-form metodei expuse anterior.

Laba posterioarã (prezentând edemul experimental), a subiec-þilor din lotul 2 a fost expusã în câmp magnetic permanentpentru 60 minute. ªoarecii din lotul 1 nu fost fost expuºi încâmp magnetic (acesta din urmã reprezentând �martorul� pentruevoluþia naturalã a inflamaþiei acute).

Rezultatele obþinute sunt prezentate în tabelele ºi graficelede mai jos.

107

Tabelul 5.15. ªoareci cu edem inflamator,neexpuºi în câmp magnetic

ªoareci cu edem inflamator, ne-expuºi în câmp magnetic

Lot1 Volumul labei posterioare (exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t10 t24 t48 t72 t96 G.c.(g)Cap 14.5 16 20 16 16 14 15 13 34Coadã 14.5 17 21 16 17 16 17 16.5 33Fl.drept 15 18 20 17 18 14 17 16.5 33Fl. stâng 13.5 16 19 15 15.5 14 15 14 33Spate 15 17 20 17 17 14 16 15 33Alb 14.5 18 21 16 17 14 16.5 15.5 33

Media 14.5 17 20.2 16.2 16.9 14.3 16.1 15.1

Media % 100 117 139 112 117 101 113 106

Fig. 5.29. Evoluþia edemului fãrã expunereîn câmp magnetic (lot 1)

Tabelul 5.16. ªoareci cu edem inflamator,expuºi în câmp magnetic 60 minute

ªoareci cu edem inflamator, expuºi în câmp magnetic 60 minute

Lot 2 Volumul labei posterioare (exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t10 t24 t48 t72 t96 G.c.(g)Cap 14 16 16.5 15 15 14 14 14 35Coadã 14.5 17 17.5 16.5 17 14 14.5 13 35Fl. drept 15 18 19 16 17 15 15 14.5 36Fl.stâng 14 18 16.5 16 16 13 13.5 14 34.5Spate 14 16 15.5 14 15 14 15 14.5 36Alb 14 18 17 13 14 15 15.5 14.5 36Media 14.3 17.2 17 15.1 15.7 14.2 14.7 14.1Media % 100 120 119 106 110 98 101 97

108

Fig. 5.30. Evoluþia edemuluicu expunere în câmp magnetic

Fig. 5.31. Evoluþiacomparativã a edemului

la loturile 1 ºi 2

Analiza comparativã a rezultatelor indicã faptul cã edemulinflamator este influenþat în special în primele 24 de ore, cuatenuarea semnificativã a vârfului inflamator la 6 ore dupãadministrarea carrageenan-ului.

5.2.8. Influenþa timpului de expunere în câmp magneticpermanent asupra fenomenului inflamator

În aceastã etapã a cercetãrii a fost studiatã eventuala influenþãpe care intensitatea câmpului magnetic permanent o poateexercita asupra edemului inflamator.

Pentru a rãspunde la aceastã întrebare, animalele cãrora lis-a provocat edem inflamator (dupã aceeaºi metodã), au fostexpuse în câmp magnetic permanent pentru durate diferite detimp, sub anestezie generalã: lotul 3 a fost expus pentru 45minute iar lotul 4 pentru 90 minute (timpul maxim de expunereîn acest caz a fost dictat de durata anesteziei generale).

Rezultatele obþinute sunt înscrise în tabelele ºi graficele demai jos.

Analiza rezultatelor aratã cã durata de expunere în câmpmagnetic nu influenþeazã evoluþia edemului inflamator, celpuþin pentru timpii de expunere utilizaþi de noi.

109

Tabel 5.17. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 3

Lot 3 Volumul labei posterioare(exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t24 t48 t72 t96Cap 10 14 14.5 13.5 15 13 13Coada 10 11 13.5 10 10.5 13 13Fl.dr. 9 14 13 11 13 13 13Fl.stg. 8 11.5 11 10.5 14 13 13.5Spate 10 12 12 12 12.5 13 13Alb 9 12 12.5 10.5 13 13 13Media 9.33 12.42 12.7 11.3 13 13 13.1Media % 100 133 136 121 139 139 140

Fig. 5.32. Expunere45 minute în câmp magnetic

(lot 3)

Fig. 5.33. Expunere90 minute în câmp magnetic

(lot 4)

Fig. 5.34. Evoluþia comparativã a edemului la loturile 3 ºi 4

110

5.2.9. Influenþa intensitãþii câmpului magnetic permanentasupra fenomenului inflamator

În aceastã etapã a experimentului am studiat influenþa inten-sitãþii câmpului magnetic permanent asupra edemului infla-mator. Pentru realizarea unui sistem de doi magneþi care aufost poziþionaþi la o distanþã de 5 mm, a fost obþinutã o creºterea intensitãþii câmpului magnetic (de la aproximativ 0,36 T la0,67 T), respectiv aproape dublarea acestei valori.

Pentru animalele din lotul 5, laba posterioarã stângã (cuedem experimental), a fost aplicatã pe un singur magnet, inten-sitatea câmpului magnetic fiind de 0,36 T. Pentru animaleledin lotul 6, laba posterioarã stângã (cu edem experimental), afost plasatã între doi magneþi, intensitatea câmpului fiind de0,67 T. Durata expunerii a fost egalã pentru ambele loturi(60 minute). Rezultatele experimentelor (evoluþia volumuluilabei posterioare cu edem inflamator) sunt prezentate în tabelul5.19 pentru animalele din lotul 5, respectiv în tabelul 5.20pentru animalele din lotul 6.

Tabelul 5.19. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 5

ªoareci expuºi cu laba posterioarã (edem inflamator), în C.M.P. de 0.36 T

Lot 5 Volumul labei posterioare (exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t24 t48 t72 t96 G.c.(gr)Cap 11.5 15 15 12.5 12.5 12 12.5 25Coadã 11 13.5 14 12 12 13 13 25Fl.drept 10 12 12 11 11.5 11 12 25Fl.stâng 10 12 13 12 11.5 11 10.5 25Spate 10 14 14 11.5 11.5 11 12 25Alb 9 12 12 11 11.5 12 12 25Media 10.25 13.1 13.3 11.7 11.5 11.7 12 25Media % 100 128 130 114 112 114 117

Evoluþia edemului inflamator la animalele din cele douãloturi este reprezentatã în fig. 5.35, pentru lotul 5, respectiv înfigura 5.36, pentru lotul 6.

111

Tabelul 5.20. Evoluþia volumului labei posterioarela animalele din lotul 6

ªoareci expuºi cu laba posterioarã (edem inflamator), în C.M.P. de 0.67 T

Lot 6 Volumul labei posterioare (exprimat în unitãþi relative de volum - U.R.)

Timp (ore) t0 t4 t6 t24 t48 t72 t96 G.c.(gr)Cap 10.5 13 12.5 11.5 11.5 11 11 25Coadã 11 13.5 13 11.5 11 11 12 25Fl. drept 11 13.5 12 10.5 11 11 11.5 25Fl. stâng 10.5 12.5 13 12 11 12 12 25Spate 12 15 16 14.5 12 13 13 25Alb 11 13 12 12 11.5 11 12 25Media 10.8 13.1 12.5 11.5 11.3 11.2 11.7Media % 100 121 116 106 105 104 108

Fig. 5.35. Evoluþia edemului la animalele din lotul 5

Fig. 5.36. Evoluþia edemuluila animalele din lotul 6

Fig. 5.37. Evoluþia com-parativã a edemului

la loturile 5 ºi 6

112

Examinarea rezultatelor obþinute evidenþiazã cã evoluþiaedemului inflamator nu este direct dependentã de intensitateacâmpului magnetic permanent. Aceastã concluzie este vala-bilã cel puþin pentru intensitãþile de câmp utilizate de noi.

Reprezentarea graficã centralizatã a rezultatelor pune înevidenþã o diferenþã importantã a edemului inflamator dez-voltat de ºoarecii din lotul 1 ºi lotul 2, comparativ cu celelalteloturi. Rãmâne totuºi un fapt de observaþie experimentalã,acela cã un cîmp magnetic permanent poate influenþa evoluþiaedemului inflamator în absenþa oricãrui tratament.

5.3. Detoxifierea sângelui cu ajutorulnanoparticulelor magnetice (hemodializa magneticã)

5.3.1. Simularea experimentalã a unui sistemde detoxifiere magneticã a sângelui

Condiþiile de lucru experimentale precum ºi rezultatele obþi-nute sunt ilustrate în tabelul 5.21.

Tabelul 5.21. Condiþiile de lucru ºi eficacitatea filtrãriinanoparticulelor magnetice

Tipul dematriceHGMF

Valoare câmpmagnetic de

fond- B0

(T)

Concentraþiade oxid de fier

(mg/ml)

Viteza mediea lichidului

prin matriceaHGMF(cm/s)

Cantitatea deoxid de fiernereþinutã în

matrice(mg)

Eficacitateafiltrãrii

magnetice(%)

Matrice cufire Fe-Ni(F=3,6%)

0,250,300,450,800,9

0,50,51,01,02,0

1,583,456,289,1818,24

0000

urme

99,9999,9999,9999,9999,99

Matrice cubile tip I(F=8,4%)

0,480,480,480,480,48

0,50,5123

2,824,588,8018,5822,50

000

urmeurme

99,9999,9999,9999,9999,99

Matrice cubile tip II(F=6,25%)

0,480,480,480,480,48

0,50,80,160,240,32

2,184,608,4017,0424,8

000

urmeurme

99,9999,9999,9999,9999,99

113

Din experimentãri a rezultat cã reþinerea nanoparticulelorde oxid roºu de fier poate fi maximã atât într-o matrice HGMScu fire, cât ºi într-o matrice HGMS cu bile.

Din datele experimentale se constatã cã eficacitatea pro-cesului de filtrare magneticã este maximã posibilã (99,99%)în toate condiþiile experimentale date.

Se poate afirma cã acest sistem magnetic de filtrare îngradient înalt de câmp a nanoparticulelor superparamag-netice are o eficacitate maximã ºi ar putea fi utilizat într-uneventual dispozitiv medical de detoxifiere a sângelui.

În concluzie, se poate afirma cã detoxifierea sângelui ar fiposibilã printr-o nouã metodã, care utilizeazã nanoparticulemagnetice funcþionalizate ºi o filtrare magneticã în gradientînalt de câmp (metoda HGMS).

5.4. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice

Pentru a studia in vitro procesul de embolizare cu micro-particule magnetice am utilizat un montaj experimental care afost prezentat în capitolul anterior.

Experimentãrile au fost efectuate cu microparticule sferice,de un tip special � purtãtori magnetici din material amorf �obþinuþi printr-o tehnologie originalã la Institutul Naþional deCercetare-Dezvoltare pentru Fizicã Tehnicã � IFT Iaºi.

Au fost efectuate testãri în diverse condiþii de lucru, obþi-nute prin modificarea urmãtorilor parametri, aºa dupã cum aufost detaliate în capitolul anterior. În funcþie de poziþia în carea fost plasat magnetul permanent de înaltã energie, precum ºiþinând seama ºi de celelalte condiþii de lucru, s-au format îninteriorul tuburilor (atât în tubul spiralat, cât ºi în anumitecazuri ºi în cel drept) diverse forme ale unor coloane alcãtuitedin microparticule magnetice, reprezentate în fig. 5.40.

Condiþiile experimentale, evoluþia parametrilor studiaþi ºieficacitãþile obþinute în urma experimentãrilor in vitro între-prinse în vederea simulãrii unei embolizãri cu microparticulemagnetice sunt sintetizate în tabelul 5.22.

114

Tab

elul

5.2

2. S

inte

za e

xper

imen

tãri

ilor

de

sim

ular

e a

embo

lizã

rii

vase

lor

sang

uine

115

116

La testãrile efectuate cu microparticule magnetice din clasa(150-300) s-a pus în evidenþã faptul cã, dupã îndepãrtareamagnetului, odatã cu dispariþia câmpului magnetic, coloanade obturare române în tub, rezistând la presiunea exercitatã delichidul circulant.

În cadrul experimentelor efectuate cu microparticule mag-netice din clasa (0-150) µm a fost observatã o eficacitate deobturare cuprinsã între 0,67 ºi 1: aceasta s-a dovedit a fi îngeneral mai bunã, comparativ cu prima clasã de microparticule(la care eficacitatea de obturare a variat între 0,67 ºi 0,92).

De asemenea, s-a mai constatat cã dupã îndepãrtarea magne-tului (dispariþia câmpului magnetic), coloana de microparticulemagnetice este evacuatã din tub. Acest fapt se datoreazã atâtunei remenenþe magnetice mai reduse, cât ºi formãrii unui altmod de compactare în timpul conglomerãrii microsferelor.

S-a observat de asemenea, faptul cã obturarea depinde delungimea coloanei de obturare: cu cât lungimea este mai mare,cu atât obturarea este mai bunã. Astfel, pentru o coloanã com-pactã a cãrei lungime a fost de 16 mm eficacitatea obturãrii afost de 0,67, în timp ce pentru o altã coloanã compactã, culungimea de 30 mm, eficacitatea de obturare a fost de 0,95.

Pentru debite de curgere mici, corespunzãtor unor viteze deantrenare mici, depunerea de microparticule s-a dovedit a numai fi compactã, ci sub formã de coloanã fragmentatã: fenomenul

Fig. 5.40. Forme ale coloanelor de PMA depuse în tuburilede obturare (dupã Al. D. Ciochinã ºi colab., 2010, modificat)

117

poate fi explicat prin aceea cã, dupã captarea magneticã aprimelor microparticule, se produce o scãdere de debit datoratãstrangulãrii formate, iar captarea urmãtoarelor microparticulese desfãºoarã la alþi parametri: vitezã de curgere mult maimicã, care favorizeazã o captare magneticã la un câmp maislab, de unde rezultã o compactare mai scãzutã.

În consecinþã, pentru eventuale studii in vivo, dimensiunilemicroparticulelor magnetice folosite trebuie corelate cu dia-metrele interioare ale vaselor sanguine: pentru artere, al cãrordiametru interior este de 2-3 mm, trebuie utilizate microparti-cule magnetice cu dimensiunea maximã de 300 µm; în schimb,pentru arteriole ºi arteriole terminale, al cãror diametru sesitueazã între 6 ºi 20 µm, trebuie utilizate microsfere mag-netice cu dimensiuni de 1-3 µm.

5.4.1. Testarea in vitro a embolizãrii magneticepe un model de anevrism vascular

Embolizarea obþinutã prin depunerea compactã de particulemagnetice ar putea fi folositã pentru tratamentul prin obturaremagneticã al anevrismelor, o afecþiune tot mai frecvent diagnos-ticatã, la orice vârstã, ºi care, prin problemele de morbiditateºi mortalitate pe care le ridicã, constituie una din preocupãrileconstante atât ale chirurgiei vasculare, cât ºi ale neurochirurgiei.

În principiu, tratamentul unui anevrism prin metode mag-netice se bazeazã pe proprietatea nano ºi microparticulelormagnetice de a putea fi introduse pânã la nivelul pungii ane-vrismale cu ajutorul unui microcateter, urmând ca o compac-tare (împachetare) a nano sau microparticulelor sã se realizezecu ajutorul unui câmp magnetic, obþinut prin poziþionareaextracorporealã, la nivel tegumentar, sau intravascular, a unormagneþi permanenþi (72, 107).

În acest context, ne-am propus testarea microparticulelormagnetice din material magnetic amorf (PMA), produs obþinutprintr-o tehnologie originalã de un colectiv de cercetãtori de laInstitutul Naþional de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizicã Teh-nicã � IFT Iaºi, într-un experiment in vitro, utilizând un montajcare a fost prezentat în capitolul anterior.

118

Testãrile au fost efectuate cu microparticule magnetice dinclasa (0-100) µm, iar diametrul tubului de silicon utilizat afost de 0,25 mm.

Plasarea magnetului perpendicular pe tub determinã for-marea unei depuneri care are tendinþa de a obtura tubul, situaþiecare nu este de loc convenabilã (fig. 5.41).

Fig. 5.41. Magnetul extern este aplicat perpendicular pe tub,încât embolizarea formatã prin depunerea microparticulelor

magnetice (MPM) tinde sã obtureze tubul

Fig. 5.42. Magnetul extern este aplicat paralel cu tubul,încât embolizarea formatã prin depunerea MPM are loc

fãrã tendinþa de obturare a tubului

Plasarea magnetului paralel cu tubul determinã depunereade MPM fãrã tendinþã de obturare a tublui, chiar pânã laumplerea completã cu MPM a sferei (fig. 5.42).

Se poate afirma, cã este posibilã o depunere relativ com-pactã de microparticule magnetice, în interiorul unui anevrismde formã sferoidalã, fãrã obturarea vasului care îl alimenteazã,dacã sunt îndeplinite cumulativ urmãtoarele douã condiþii:

� gradientul câmpului magnetic aplicat trebuie sã posedeo valoare crescãtoare spre direcþia anevrismului;

� direcþia câmpului magnetic aplicat extern trebuie sã fieparalelã cu vasul sanguin în zona anevrismalã.

119

Capitolul 6

CONCLUZII

1. Cercetãrile întreprinse fundamenteazã un nou domeniu destudiu, cu referire la aplicaþiile medicale ale procedeelorelectromagnetice de separare ºi vectorizare, domeniu pecare l-am abordat în premierã pe plan naþional, încã dinanii 1999-2000.

2. Experimentãrile efectuate au utilizat o serie de dispo-zitive, componente, ferofluide ºi microparticule originale,concepute ºi realizate de un colectiv de cercetãtori de laInstitutul Naþional de Cercetare-Dezvoltare pentru FizicãTehnicã � IFT Iaºi, coordonat de prof. univ. dr. fiz. GheorgheIacob. Acestea au fost reprezentate de un prototip de sepa-rator magnetic de laborator pentru separarea eritrocitelorîn gradient înalt de câmp magnetic, douã tipuri de ferofluid,douã tipuri de matrice ordonatã (cu fire ºi cu bile magne-tice), precum ºi o serie de microparticule magnetice dinmaterial amorf (PMA) � utilizate ca purtãtori magnetici.

3. Caracterul original al dispozitivelor, componentelor ºimicroparticulelor folosite a impus, pentru fiecare caz înparte, o serie de studii ºi experimente preliminare, atât pentrucaracterizarea ºi determinarea performanþelor lor magne-tice, cât ºi pentru fundamentarea protocoalelor de lucru.

4. Probele de sânge, utilizate în cadrul experimentãrilor, aufost recoltate de la 10 voluntari sãnãtoºi, cu respectarealegislaþiei în vigoare. Dupã recoltare sângele a fost tratatcu un anticoagulant (EDTA tripotasic).

5. Prezenþa ionilor de Fe în structura hemului, conferã eritro-citelor proprietãþi magnetice intrinseci (paramagnetismslab). Datoritã acestei proprietãþi traiectoria hematiilorpoate fi deviatã sub acþiunea unui câmp magnetic aplicatextern. Avându-se în vedere atât caracterul slab paramag-netic cât ºi dimensiunile foarte mici ale eritrocitelor, am

120

considerat cã metoda de separare în gradient înalt de câmpmagnetic (metoda HGMS) poate constitui o alternativãpentru separarea ºi concentrarea magneticã a eritrocitelor.

6. Pentru a studia separarea ºi concentrarea erirocitelor îngradient înalt de câmp magnetic am ales metoda separãriimagnetice directe. Experimentele au fost efectuate cu aju-torul unei matrice feromagnetice filamentare ordonate aflateîn componenþa unui tip de separator magnetic original,conceput de un colectiv de cercetãtori de la InstitutulNaþional de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizicã Tehnicã �IFT Iaºi, condus de prof. dr. fiz. Gheorghe Iacob. Pro-totipul acestui tip de separator a fost brevetat în anul 2002ºi a obþinut în acelaºi an medalia de aur la Salonul Inter-naþional de Inventicã de la Geneva.

7. Prezumându-se un efect distructiv exercitat asupra eritro-citelor de cãtre firele cu o eventualã rugozitate mare de lanivelul matricei, s-a optat pentru construirea unei matricealcãtuitã din straturi echidistante de fire magnetizabile ceprezintã o suprafaþã netedã. Acest fapt a constituit o primãlimitare, asumatã, a diminuãrii eficienþei de captare (con-centrare) a hematiilor în gradient înalt de câmp magnetic.

8. Testele au fost efectuate în diferite condiþii experimentale,variindu-se inducþia magneticã de fond ºi viteza de curgerea sângelui. S-a folosit atât sânge integral, cât ºi sângediluat în trei diluþii succesive.

9. Experimentele desfãºurate au demonstrat cã separarea mag-neticã a eritrocitelor este perfect posibilã prin metodaHGMS. Astfel, în cazul probelor cu sânge integral, concen-trarea hematiilor s-a situat în jurul valorii de 20%, în timpce pentru sângele diluat concentrarea eritrocitelor a variatîntr-un domeniu mai larg (între 14,51% � 29,90%), ceamai mare valoare fiind observatã la o probã diluatã 1/8 (P

14).

10. Valoarea inducþiei magnetice de fond a influenþat în modevident eficacitatea filtrãrii. Astfel, pentru testele efec-tuate cu sânge integral, la probele P11 ºi P12 (la care induc-

121

þia magneticã a fost B = 1,98 T), concentrarea eritrocitelora fost de 22-24%, în timp ce la proba P

21 (la care inducþia

magneticã a fost B = 1,76 T), concentrarea a fost de apro-ximativ 8%. În cazul probelor cu sânge diluat a fost evidenþiatacelaºi tip de comportament: de exemplu, la proba P14

(pentru B = 1,98 T) concentrarea a fost de 29,9%, iar laproba P24 (pentru B = 1,76 T) concentrarea a fost de 18,57%.

11. Viteza medie de curgere a sângelui a influenþat, de ase-menea, eficacitatea procesului de separare ºi concentraremagneticã. Astfel, la proba cu sânge integral P11 (pentruvm = 0,95 m/s ºi B = 1,98 T) concentrarea a fost de 22,06%,în timp ce la proba P31 (pentru vm = 1,1 m/s ºi B = 2,01 T),cu sânge diluat, concentrarea hematiilor a fost de 15,35%.

12. Staþionarea sângelui în matricea magnetizatã (echivalentcu v = 0) a condus în final la obþinerea unei concentrãribune a eritrocitelor. Astfel, la proba P51 concentrarea eri-trocitelor a avut o valoare de 27,10%, iar la proba P61

concentrarea a fost de 24,53%.

13. Cea mai mare concentrare s-a obþinut în cazul recirculãriisângelui prin matricea magneticã. La o recirculare de treiori prin matrice, în cele mai favorabile condiþii de câmp ºivitezã (pentru B = 2,01 T ºi vmed = 0,55 mm/s), eficacitateaconcentrãrii a fost de 37,86%.

14. Analiza probelor de sânge, corelate cu un calcul teoretical numãrului de eritrocite concentrate pentru fiecare cm3

din matrice, a demonstrat cã în procesul de separare mag-neticã nu s-au produs distrugeri celulare.

15. Deºi putem considera cã separarea eritrocitelor în gradientînalt de câmp magnetic reprezintã un succes, semnalãmfaptul cã fenomenul de histerezis al depunerii reprezintãun al doilea factor limitativ al eficienþei concentrãrii (sepa-rãrii) hematiilor. Histerezisul depunerii s-a manifestat încadrul experimentelor efectuate, fie în cazul unor câmpuride intensitate mai micã, fie în cazul unor viteze de curgerea sângelui mai mari decât cele iniþiale, influenþând, uneori

122

semnificativ, capacitatea de acumulare a eritrocitelor îndepozit. Astfel, în cazul probei cu sânge integral P

21 (v

m =

1,1 m/s, B = 1,76 T) concentrarea procentualã a fost de 8%,iar în cazul probei cu sânge diluat 1/4 P

23 (v

m = 1,1 m/s,

B = 1,76 T), concentrarea procentualã a fost de doar 3,37%.

16. Prin realizarea unui prototip de aparat integrat destinatcercetãrii medicale hematologice ºi, în perspectivã, a unuidispozitiv pentru producerea de concentrat eritrocitar, sepoate vorbi de o eficienþã economicã realã a acestei cer-cetãri, cu certe valenþe aplicative.

17. Contactul nemijlocit cu potenþiali utilizatori, a arãtat cãexistã interes pentru un astfel de aparat medical ºi pentruprocedeul magnetic de separare al eritrocitelor, procedeunou, nefolosit pânã în prezent în practica medicalã. Mo-delul funcþional de filtru magnetic cu gradient înalt decâmp magnetic, fãrã modificãri esenþiale ºi fãrã alte verificãrispeciale impuse de standardele pentru aparatura medicalã,ar putea avea aplicabilitate imediatã în unitãþi sau laboratoarede cercetare medicalã fundamentalã, pentru obþinerea unorconcentrate eritrocitare, pentru studii privind comportamen-tul celulelor sanguine normale sau patologice în câmpurimagnetice intense, separabilitatea celulelor leucemice º.a.

18. Pornind de la acest model funcþional realizat ºi de laexperienþa acumulatã în separarea eritrocitelor, s-ar puteaproiecta ºi realiza un aparat destinat separãrii magnetice aeritrocitelor din cantitãþi relativ mici de sânge. Aparatular putea fi unul integrat ºi dotat cu toate utilitãþile necesarefuncþionãrii independente: diferite tipuri de matrice fero-magnetice, pompã peristalticã, sursã de energie electricã,sisteme de comandã ºi semnalizare, un eventual sistem depreluare de imagini.

19. Fluidele magnetice (ferofluidele) sunt tot mai des folositeîn ultimii ani pentru vectorizarea ºi concentrarea loco-regionalã a diferitelor clase de medicamente. În cercetareanoastrã am utilizat douã tipuri de ferofluid original, reali-

123

zate de cercetãtorii de la Institutul Naþional de Cercetare--Dezvoltare pentru Fizicã Tehnicã � IFT Iaºi. Ferofluidulpe bazã de oleat de amoniu s-a dovedit a avea o toxicitateridicatã, probabil prin eliberarea ionilor de amoniu, fapt cea dus la abandonarea studierii acestuia in vivo. Ferofluidulpe bazã de oleat de sodiu având o toxicitate relativ scãzutã apermis utilizarea acestuia în continuare, în studii pe animal.

20. Obiectivul studiului a fost investigarea eficienþei tera-peutice a ferofluidului complexat cu un antiinflamatorconsacrat. Prin complexarea ferofluidului pe bazã de oleatde sodiu, mai întâi cu diclofenacul sodic, apoi cu piro-xicamul, s-au obþinut douã medicamente antiinflamatoare,cu proprietãþi magnetice. Acestea s-au dovedit a fi stabilein vitro ºi au prezentat o vitezã de desorbþie favorabilãutilizãrii experimentale.

21. Studiul in vivo a fost efectuat pe patru loturi de câte ºaseºoareci albi de laborator (Swiss), mascului, cu greutateade 30 +/- 2 grame. Modelul experimental de inflamaþie aconstat în provocarea unui edem inflamator al labei poste-rioare la ºoareci, prin injectarea, sub aponevroza plantarãa membrului inferior stâng, a 30 de microlitri de soluþie1% carrageenan, urmând protocolul stabilit în 2004 deImmaculada Posadas ºi colab. Evoluþia spontanã a ede-mului inflamator realizat prin injectare de carrageenan secaracterizeazã printr-un vârf inflamator la 6 ore de la admi-nistrarea substanþei proinflamatorii, urmat de un al doilea,de mai micã amplitudine, la 72 de ore de la administrare.

22. La 4 ore dupã injectarea carrageenan-ului ºi dupã mãsu-rarea volumului labei posterioare s-a injectat intravenosla ºoarecii din lotul 1 diclofenac sodic (0,03 mg/30g greu-tate corporalã � g.c.), la ºoarecii din lotul 2 (ferofluiddiluat 1/4 în apã distilatã � echivalentul a 10 mg fier total),la lotul 3 ferofluid complexat cu diclofenac (diclofenac0,03 mg/30g greutate corporalã, ferofluid � echivalentul a10 mg fier total), iar la lotul 4 (martorul alb) apã distilatãîntr-un volum de 100 microlitri.

124

23. Complexul ferofluid-antiinflamator a putut fi vectorizat(dupã administrare intravenoasã), cu ajutorul unui câmpmagnetic extern permanent (de aproximativ 0,36 T), cãtrezona de interes (în cazul nostru, zona de edem inflamatorexperimental). Timpul de expunere la efectele câmpuluimagnetic a fost de 120 de minute.

24. În condiþiile noastre experimentale, doar o cantitate de 1/3de diclofenac (raportatã la doza standard de diclofenacadministratã la lotul martor pozitiv) care a fost complexatãcu ferofluid, a produs acelaºi efect asupra edemului infla-mator, reducându-l.

25. Câmpul magnetic permanent, aplicat extern, a influenþatfavorabil evoluþia edemului inflamator experimental, însensul diminuãrii amplitudinii vârfului inflamator de la 6 oreºi a unei rezoluþii mai rapide a fenomenelor inflamatorii.

26. În condiþiile noastre experimentale, nici timpul de expunereºi nici intensitatea câmpului magnetic extern nu par a avea,fiecare în parte, un rol decisiv în efectul antiinflamator.

27. Sunt necesare studii suplimentare pentru evaluarea bene-ficiilor terapeutice pe care le-ar putea aduce utilizareapurtãtorilor magnetici tip ferofluid.

28. Pentru experimentele care au vizat detoxifierea sângeluiprin metode magnetice au fost utilizate douã matrice HGMSoriginale, una confecþionatã din fire magnetizabile ordonate(din aliaj Fe-Ni) ºi cealaltã din microbile din acelaº mate-rial, magnetizabile, cu diametrul de 3 mm. Efectuareatestelor s-a fãcut cu particule de oxid roºu de fier pentrucare a fost determinatã eficacitatea filtrãrii magnetice îndiferite condiþii experimentale. Astfel, valoarea câmpuluimagnetic de fond a fost modificatã între 0,25 T ºi 0,9 T,intensitatea câmpului magnetic fiind corelatã ºi cu vitezade curgere a lichidului de antrenare (care a variat între1,58 cm/s ºi 22,50 cm/s). Experimentele efectuate au arãtatcã reþinerea nanoparticulelor de oxid roºu de fier estemaximã (99,99%) în toate condiþiile experimentale date.

125

29. Rezultatele testelor privind simularea experimentalã a unuisistem de detoxifiere magneticã a sângelui au arãtat cãfiltrarea în gradient înalt de câmp magnetic a unor nano-particule superparamagnetice are o eficacitate maximã ºiar putea fi utilizat într-un eventual dispozitiv medical dedetoxifiere a sângelui.

30. Pentru studierea in vitro a procesului de embolizare a unuivas cu ajutorul unor microparticule magnetice am realizat,din sticlã, un model de vas sanguin cu un anevrism deformã sferoidalã, cu colet strâmt. Montajul experimentalconceput a realizat umplerea anevrismului prin depunerea,sub acþiunea unui magnet permanent (NdFeB), unor mi-croparticule magnetice. Au fost utilizate douã clase demicroparticule sferice (0-150 µm) ºi respectiv (150-300µm), de un tip special � purtãtori magnetici din materialamorf (PMA) � obþinuþi printr-o tehnologie originalã � laInstitutul Naþional de Cercetare-Dezvoltare pentru FizicãTehnicã � IFT Iaºi. Experimentele au fost efectuate încondiþiile unei viteze medii de curgere a lichidului pur-tãtor, echivalentã cu cea mai mare vitezã de circulaþie asângelui prin sistemul vascular (aproximativ 25 cm/s).Valoarea câmpului magnetic extern a avut valori relativscãzute (B0 = 340-1600 Gs).

31. S-a constatat, ca o consecinþã directã a proprietãþilor mag-netice puternice, la care se adaugã forma sfericã a PMA,cã direcþia câmpului magnetic extern nu intervine decisivîn procesul de embolizare: s-a observat cã atât o direcþieperpendicularã a câmpului magnetic, cât ºi o direcþie para-lelã cu tubul în care se gãseºte modelul de anevrism acâmpului magnetic aplicat, produce obturarea cu aproapeaceeaºi eficienþã.

32. Eficacitatea de obturare (definitã prin raportul dintre redu-cerea de debit ?D1 � rezultatã prin obturarea magneticã �ºi debitul iniþial D

1) s-a dovedit a fi influenþatã de dimen-

siunile PMA. Astfel, dimensiunile mai mici conduc la oeficacitate mai ridicatã, iar prin utilizarea particulelor de

126

1µm s-a putut realiza o obturare completã (eficacitatea deobturare E = 1). Pentru PMA din clasa (0-150 µm) eficacita-tea de obturare (cuprinsã între 0,67 ºi 1) a fost mai bunãcomparativ cu cea aferentã clasei (150-300 µm), care ava-riat între 0,67 ºi 0,92.

33. La testãrile efectuate cu PMA din clasa (150-300 µm), s-apus în evidenþã faptul cã, dupã îndepãrtarea magnetului,odatã cu dispariþia câmpului magnetic, coloana de obtu-rare rãmâne în tub, rezistând la presiunea exercitatã delichidul circulant. Acest fenomen se explicã prin faptul cãremanenþa magneticã a PMA faciliteazã menþinerea inter-acþiunilor dintre aceste microparticule, nepermiþându-sedezagregarea aglomerãrilor formate. Efectul a apãrut maievident pe porþiunea spiralatã a tubului de obturare, con-secutiv atenuãrii componentelor axiale ale forþei de împin-gere exercitate de lichid.

34. Dupã îndepãrtarea magnetului, în cazul PMA din clasa(0-150 µm), s-a constatat evacuarea coloanei de obturare,fenomen datorat atât unei remanenþe magnetice mai re-duse, cât ºi formãrii unui alt mod de compactare în timpulconglomerãrii PMA.

35. S-a observat cã obturarea depinde de lungimea coloaneide obturare: cu cât lungimea este mai mare cu atât obtura-rea este mai bunã. De exemplu, pentru o coloanã compactãcu lungimea de 16 mm eficacitatea obturãrii a fost de0,67, în timp ce pentru o altã coloanã compactã, cu lungi-mea de 30 mm, eficacitatea de obturare a fost de 0,95.

36. În cazul coloanelor lungi, de peste 10 mm, formate întubul de obturare drept, s-a observat cã porþiunea dinspremagnetul permanent, acolo unde câmpul magnetic estemai intens, prezintã un grad de compactare (aglomerare)mai redus, faþã de restul coloanei. Fenomenul l-am inter-pretat ca fiind datorat existenþei unor interacþiuni mag-netice foarte puternice, care determinã o anumitã structurã(mai rarefiatã) de compactare a PMA.

127

37. S-a constatat faptul cã, pentru debite mici, corespunzãtorunor viteze de antrenare mici, depunerea de microparti-cule nu se mai produce compact, ci sub formã de coloanãfragmentatã. Fenomenul l-am explicat prin aceea cã, dupãcaptarea magneticã a primelor microparticule se produceo scãdere de debit datoritã strangulãrii formate, captareaurmãtoarelor microparticule desfãºurându-se la alþi para-metri: vitezã de curgere mult mai micã, care favorizeazã ocaptare magneticã mai redusã pentru o valoare de câmpmagnetic mai micã, de unde rezultã o compactare maiscãzutã.

38. În cazul PMA cu dimensiuni în domeniul clasei (150-300µm), peste o anumitã valoare a câmpului magnetic s-aobservat cã obturarea poate deveni mai puþin eficientã. Searatã a exista o interdependenþã între valoarea câmpuluimagnetic aplicat extern ºi debitul lichidului de curgere,debit care la rândul sãu determinã viteza de antrenare aPMA ºi prin aceasta ºi modul lor de aglomerare.

39. Vâscozitatea lichidului de antrenare influenþeazã de ase-menea eficienþa filtrãrii. Astfel, s-au obþinut obturãri maieficace în cazul lichidului mai vâscos.

40. Testarea in vitro a embolizãrii magnetice pe un modelsimplu de anevrism vascular a utilizat PMA din clasa(0-100 µm), diametrul tubului de silicon folosit fiind de0,25 mm. Experimentele efectuate au arãtat cã este posi-bilã o depunere relativ compactã de microparticule mag-netice, în interiorul unui anevrism de formã sferoidalã,fãrã a se obtura lumenul vasului care îl alimenteazã, dacãsunt îndeplinite cumulativ urmãtoarele douã condiþii: gra-dientul câmpului magnetic aplicat sã posede o valoarecrescãtoare spre direcþia anevrismului, iar direcþia câmpu-lui magnetic aplicat extern sã fie paralelã cu vasul sanguinîn zona anevrismalã.

128

Capitolul 7

PERSPECTIVELE CERCETÃRII

Pornindu-se de la prototipul realizat ºi de la experienþaacumulatã în separarea eritrocitelor, s-ar putea proiecta ºi rea-liza un aparat destinat separãrii magnetice a eritrocitelor dincantitãþi relativ mici de sânge. Aparatul ar putea fi unul integratºi dotat cu toate utilitãþile necesare funcþionãrii independente:diferite tipuri de matrice feromagnetice, pompã peristalticã,sursã de energie electricã, sisteme de comandã ºi semnalizare,un eventual sistem de preluare de imagini.

Vectorizarea ºi concentrarea locoregionalã a unor medi-camente �magnetice� este un domeniu cu largi perspective, cuprecãdere în terapia oncologicã, fãrã a neglija eventuala utili-zare în cardiologie sau în toxicologie.

Diversificarea tipologicã ºi dimensionalã a nano ºi micro-particulelor fero ºi ferimagnetice, dar mai ales a celor superpara-magnetice, deschide cãi sigure pentru îmbunãtãþirea perfor-manþelor terapeutice a numeroase clase de medicamente, înraport cu modalitãþile clasice de administrare.

Producerea ºi caracterizarea fizicochimicã a tot mai nume-roase varietãþi de polimeri cu o bunã biocompatibilitate suntpremize extrem de favorabile pentru conceperea ºi testareaunor noi formule de acoperire a diferitelor clase de purtãtorimagnetici, care sã le confere noi proprietãþi ºi o cât mai bunãtoleranþã biologicã. Includerea ulterioarã a acestor nanoparti-cule în diferite tipuri de fluide magnetice, ar conferi acestorape lângã o îmbunãtãþire a parametrilor funcþionali ºi o bunãbiodisponibilitate ºi hemocompatibilitate. În acest sens se im-pune cu necesitate o evaluare a testelor de hemocompatibilitateºi o standardizare a acestora, pentru a facilita evaluarea com-parativã ºi eventuala metaanalizã a diverselor studii ºi cercetãrimulticentrice care încep a fi publicate.

Pe aceastã direcþie ne propunem continuarea cercetãrilor,încercând realizarea unor noi tipuri de ferofluid, beneficiind ºi

129

de o viitoare colaborare cu o parte din absolvenþii Facultãþii deBioinginerie Medicalã a Universitãþii de Medicinã ºi Farmacie�Gr. T. Popa� din Iaºi. Aceºtia, dupã ce ºi-au susþinut lucrãride licenþã sau dizertaþii în cadrul masteratului, cu tematicãreferitoare la aplicaþiile medicale ale separãrii magnetice, ºi-auales teme de cercetare din acest domeniu în cadrul docto-ratului, desfãºurat în cadrul Facultãþii de Inginerie Chimicã ºiProtecþia Mediului de la Universitatea Tehnicã �GheorgheAsachi� din Iaºi. Cadrele didactice ºi cercetãtorii de la aceastãfacultate au pus la punct în ultimii ani mai multe proceduri deobþinere a unor diverse tipuri de nanoparticule polimerice, acãror biodisponibilitate ºi biocompatibilitate sunt în curs deevaluare. Se poate estima o continuare a cercetãrilor în dome-niu, cu reale perspective, inclusiv cu privire la unele aplicaþiidin sfera medicalã.

Embolizarea magneticã terapeuticã reprezintã o altã direc-þie de cercetare cu reale perspective. Calitãþile demonstrate invitro de microsferele magnetice din material amorf (PMA),realizate printr-o tehnicã originalã de cercetãtorii ieºeni, leconferã acestora un statut special, referitor la continuarea cer-cetãrilor în acest domeniu. Ne propunem, pornind de la rezul-tatele obþinute de colectivul condus de Johanna Oechtering, sãprocedãm la efectuarea unui studiu, in vitro ºi in vivo, pe unmodel similar de anevrism intracerebral la iepure, utilizândînsã PMA originali, testaþi deja in vitro pe un model simplu deanevrism vascular, de formã sferoidalã. Vom încerca sã antre-nãm în aceastã abordare colectivele de cadre didactice ºicercetãtori de la disciplinele de Anatomie patologicã (prof.univ. dr. Octavian Oprean) ºi Medicinã Experimentalã (conf.univ. dr. Mihai Condrea) de la Facultatea de Medicinã Vete-rinarã a Universitãþii de ªtiinþe Agricole ºi Medicinã Vete-rinarã �Ion Ionescu de la Brad� din Iaºi, împreunã cu care amºi demarat o serie de teste ºi experimentãri preliminare.

Perspectivele deschide de domeniul de cercetare abordat înlucrarea de faþã se aratã a fi deosebit de generoase, iar con-tinuarea cercetãrilor în acest context devine obligatorie.

130

BIBLIOGRAFIE SELECTIVÃ

1. Rezlescu N, Bãdescu V, Bradu EB, Iacob Gh, Principiile sepa-rãrii magnetice a materialelor, Editura Academiei Române,Bucureºti, 1984, 32-74, 80-100.

2. Iacob Gh, Tehnici magnetice de separare. Aplicaþii biomedicaleºi în protecþia mediului, 2005, Iaºi, Editura Sedcom Libris.

3. Luca E, Ciubotaru C, Zet Gh, Pãduraru A, Fizica genaralã,1981, Ed. Didacticã ºi Pedagogicã, Bucureºti.

4. Liu YA, Industrial Applications of Magnetic Separation, 1979,Ed. IEEE Inc., New York.

5. Gilet G, Base théoretique de la filtration magnetique, 1989,Centre de Recherche sur la valorisation des minerais, Vandeuvre--les-Nancy.

6. Rezlescu N, Bradu EB, Aplicaþiile separãrii magnetice a mate-rialelor, Editura Academiei Române, Bucureºti, 1989, 213-222.

7. Feeman MV, Arrott A, Watson JHL, Magnetism in Medecine, JAppl Phys 1960; 31: S404-405.

8. Pankhurst QA, Connoly J, Jones SK, Dobson J. Applications ofmagnetic nanoparticles in biomedicine. J Phys, 2003, D 36,R167-R181.

9. Alexiou C, Jurgeons R, Seliger C, Iro H, Medical applicationsof magnetic nanoparticles, J Nanosci Nanotechnol, 2006, 9-10:2762-2768.

10. Ali-Zade RA, Structure and magnetic properties of polymermicrospheres filled with magnetite nanoparticles. Inorganic Mate-rials, 2004, 40, 509-515.

11. Deng Y, Wang C, Shen X, Yang W, Jin L, Gao H, Fu S, Prepa-ration, characterization, and application of multistimuli-respon-sive microspheres with fluorescence-labeled magnetic cores andthermoresponsive shells, Chemistry, 2005, 11, 6006-6013.

12. Babicova M, Sourivong P, Chorvat D, Babinec P, Laser TriggeredDrug Release from Magnetoliposomes, JMMM, 1999, 194, 163-166.

13. Huang SH, Liao MH, Chen DH. Direct binding and charac-terization of lipase onto magnetic nanoparticles. BiotechnolProg, 2003, 19, 1095-100.

14. Iacob Gh., O. Bredeþean, Al. D. Ciochinã, Modalitãþi actuale deseparare prin tehnici magnetice a compuºilor biologic activi,celulelor ºi agenþilor patogeni Rev Med Chir, 2001, 105, 1,69-75.

131

15. Kuznetsov AA, Filippov VI, Alyantdin RN, Torshina NL, Kuz-netsov OA, Application of magnetic liposomes for magneticallyguided transport of muscle relaxants and anti-cancer photo-dynamic drugs, JMMM, 2001, 225, 95-100.

16. Rotariu O, Iacob G, Strachan NJC, Chiriac H. Simulating theembolization of blood vessels using magnetic microparticlesand acupuncture needle in a magnetic field. Biotechnol Prog,2004, 20, 299-305.

17. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Modelare experimentalãa embolizãrii vaselor sangvine pe cale magneticã Rev Med Chir,2005, 109, 4: 899-904.

18. Iacob Gh., Ciochinã Al. D., Perspective privind separarea com-ponentelor sângelui uman ºi tratarea tumorilor prin metode mag-netice, Rev Med Chir, 1999, 103, 3-4, 230-235.

19. Ciochinã Al D, Iacob Gh, Rezlescu N, Obþinerea de masã eritro-citarã prin metoda separãrii în gradient înalt de câmp magnetic,Rev Med Chir, 2000, 104, 3, 151-155.

20. Iacob G, Rotariu O, Strachan NJ, Hafeli UO. Magnetizableneedles and wires - modeling an efficient way to target magneticmicrospheres in vivo. Biorheology, 2004, 41, 599-612.

21. Iacob Gh, Rezlescu N, Dispozitiv de separare magneticã cumatrice multiplã, Brevet de invenþie nr. 112414 B1, 1997.

22. Iacob Gh, Rezlescu N, Dispozitiv static de separare magneticã,Brevet de invenþie nr. 113814 B1, 1998.

23. Iacob Gh, Rezlescu N, Popa PD, Filtru magnetic poligradient,Brevet de invenþie nr. 114952 B1, 1999.

24. Contract de Grant Academia Românã nr. 123/2004 ºi nr. 130/2003, Cercetãri privind terapia locoregionalã prin þintire mag-neticã, UMF Iaºi, 2003-2004.

25. Contract de finanþare Grant ANSTI nr. 13041/2000, nr. 33/2001-MEC ºi nr. 33489/2002-MEC, Cercetãri privind trata-mentul leucemiilor ºi a tumorilor maligne prin metoda purtãto-rului magnetic, IFT Iaºi � UMF Iaºi, 2000-2002.

26. Contract nr. 21/ 2001- Competiþie Plan Naþional de Cercetare,Dezvoltare, Inovare � Program INVENT, Filtru magnetic cugradient înalt de câmp pentru separarea globulelor roºii dinsângele uman, IFT Iaºi, 2001-2003.

27. Contract nr. 43 / 2002 � Competiþie Plan Naþional de CercetareDezvoltare Inovare � Program INVENT, Purtãtori magneticidin material magnetic amorf pentru aplicaþii medicale, ParteneriIFT Iaºi - UMF Iaºi, 2002 � 2004.

132

28. Ciochinã Al D, Bredeþean O, Iacob Gh, Considerations on Mag-netic Targeted Chemotherapy, National Conference of RomanianSociety for Pure and Applied Biophysics, Sovata, 24-29 sept.,2001, Rev Med Farm � UMF Târgu-Mureº, vol. 47, Supl. 3, 17.

29. Ciochinã Al D, Herea DD, Bredeþean O, Iacob Gh, ChiruþãRoxana, Magnetic carriers as contrast agents for magnetic resonanceimaging, A XVIII-a Conferinþã Naþionalã a Societãþii Românede ªtiinþe Fiziologice, Cluj-Napoca, 3-5 iunie, 2002, vol. rez.�Stresul oxidativ în procese fiziologice ºi patologice� Ed. MedicalãUniversitarã �Iuliu Haþieganu� Cluj-Napoca, 2002, 15.

30. Ciochinã Al D, Iacob Gh, Bredeþean O, Chiruþã Roxana, MarianCarmen, Magnetic carrier technique in antitumoral treatment,�New research trends in material science� ARM-2, Constanþa,24-26 septembrie, Progr. Ses., 60, 2001.

31. Ciochinã Al D, Iacob Gh, Bredeþean O, Chiruþã Roxana, MarianCarmen, Magnetic carrier technique in antitumoral treatment,Al II-lea Simpozion Naþional �Biomateriale- prezent ºi perspec-tive�, Bucureºti, 21-22 iunie 2001, Vol rez, 6.

32. Ciochinã Al D, Iacob Gh, Herea DD, Barnea ªtefania, DimitriuDaniela Cristina, Chiruþã Roxana, The red blood cells con-centration using high gradient magnetic separation, Al III-leaSimpozion Naþional cu participare internaþionalã �BIOMATE-RIALE � prezent ºi perspective� , Bucureºti, 13 � 14 decembrie,2002, Vol rez S2 �IV-08.

33. Ciochinã Al D, Iacob Gh, Rezlescu N, The use of high gradientmagnetic separation (HGMS) in obtaining red blood cells mass,The VIII-th Congress of the Romanian Society of PhysiologicalSciences, Iaºi, 5-7 iunie 2000, Rez. în Fiziologia, 10, suppl.1, 9.

34. Iacob Gh, Al D Ciochinã, Bredeþean O, Herea DD, Constan-dache Nicoleta, Purtãtorii magnetici în terapia antitumoralã,Volum de articole Simpozionul Naþional de Biomateriale, Bucureºti13�14 Decembrie 2002, 226-230.

35. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Cell�s magnetic sepa-ration physics, National Conference of Romanian Society forPure and Applied Biophysics, Sovata, 24-29 sept., Rev MedFarm � UMF Târgu-Mureº, 47, Supl. 3, 28, 2001.

36. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Herea DD, Constan-dache Nicoleta, Magnetic carriers used in antitumoral therapy,A XIII - a Conferinþã Naþionalã de Hematologie, Iaºi, 8-11 oct.2003, Vol rez, 121.

37. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Herea DD, ConstandacheNicoleta, The magnetic carrier method applied to antitumoral

133

therapy, Al III-lea Simpozion Naþional cu participare internaþio-nalã �BIOMATERIALE � prezent ºi perspective� , Bucureºti,13-14 decembrie, 2002, Vol rez S2 �IV-06).

38. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Marian Carmen, Chemo-therapy by magnetic drug targeting, Conferinþa Naþionalã deFizicã, Iaºi, 18-20 octombrie, 2001.

39. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Chiruþã Roxana, Marian Carmen,Rezlescu N, High gradient magnetic separation of the erythro-cytes, Al II-lea Simpozion Naþional �Biomateriale- prezent ºiperspective�, Bucureºti, 21-22 iunie 2001, Vol. rez., 12.

40. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Hanganu Ecaterina, Rezlescu N, ChiruþãRoxana, A study concerning leucocytes behavior in a polygra-dient magnetic field, The VIII-th Congress of the RomanianSociety of Physiological Sciences, Iaºi, 5-7 iunie 2000, Rez. înFiziologia, 2000, 10, suppl.1, 9.

41. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Herea DD, Barnea ªtefania, DimitriuCristina, Chiruþã Roxana, Vieru Cristina, Studiu experimentalprivind separarea eritrocitelor umane utilizând un filtru mag-netic cu gradient înalt de câmp, A XIX-a Conferinþã Naþionalã aSocietãþii Române de ªtiinþe Fiziologice, Constanþa, 29-31 mai,2003, Vol rez, 27.

42. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Herea DD, Vieru Cristina, Experi-ments on red cells in high gradient magnetic bioseparation, AXIII - a Conferinþã Naþionalã de Hematologie, Iaºi, 8-11 oct.2003, Vol rez, 119.

43. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Herea DD, Zaharia D, Bredeþean O,Terapia antitumoralã prin tehnici magnetice, �A XXII-a Sesiuneªtiinþificã Anualã a Societãþii Naþionale de Biologie Celularã�,Sighiºoara, 10-13 iunie, 2004, Vol rez, 49.

44. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Magnetic separation of the cells,Conferinþa Naþionalã de Fizicã, Iaºi, 18-20 octombrie, 2001.

45. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Marian Carmen, Rezlescu N, Highgradient magnetic separation of the cells, A XVII-a ConferinþãNaþionalã a Societãþii Române de ªtiinþe Fiziologice, Târgu--Mureº, 1-2 iunie, 2001, Rev Med Farm � UMF Târgu-Mureº,47, Supl. 2, 27, 2001.

46. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Roxana Chiruþã, Carmen Marian,Rezlescu N, HGMS of the erythrocytes,�New research trends inmaterial science� ARM-2, Constanþa, 24-26 septembrie, Progr.Ses., 60, 2001.

47. Iacob Gh, Cojocaru Ileana, Herea DD, Gafiþeanu Carmen,Bredeþean O, Ciochinã Al D, Dimitriu Cristina, Constandache

134

Nicoleta, Aspects concerning the formation and �in vitro� behaviorof a ferrofluid � sodium diclophenac complex, Al III-lea Simpo-zion Naþional cu participare internaþionalã �BIOMATERIALE� prezent ºi perspective� , Bucureºti, 13 � 14 decembrie, 2002,Vol.rez. S2 �IV-07.

48. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, High Gradient MagneticSeparation Ordered Matrices, Fourth International Conferenceon the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers,Tallahassee, Florida, U.S.A., May 9-11, 2002 (Program andAbstracts p. 181-183).

49. Iacob Gh, Herea DD, Bredeþean O, Ciochinã Al D, High GradientMagnetic Separation of Red Blood Cells from Whole VenousBlood Using Ordered Matrices, 6th International Conferenceon the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers,Krems - Austria, May 17-20, 2006, Vol Abstr, 127.

50. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Metoda purtãtoruluimagnetic - o perspectivã în tratamentul antitumoral, Rev MedChir, 2001, 105, 4, 815-821.

51. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Herea DD, Sistememagnetice de separare a celulelor, Ram-Medica 2002, 8, 6-7.

52. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, Herea DD, ConstandacheNicoleta, Terapia antitumoralã � metoda �purtãtorului mag-netic�, Ram-Medica, 2003. 4: 12-13.

53. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Herea DD, Dimitriu Cristina, ChiruþãRoxana, Vieru Cristina,. Stratone Ana, Consideraþii asupra sepa-rãrii eritrocitelor în gradient înalt de câmp magnetic, Rev MedChir, 2004, 108, 4, 924-927.

54. Ciochinã Al D, Bredeþean O, Dimitriu Daniela-Cristina, IacobGh, O evaluare asupra metodelor de apreciere a hemocompati-bilitãþii nanoparticulelor magnetice, Rev Med Chir, 2009, 113,1, 279-285.

55. Ciochinã Al D, Untu Alina, Iacob Gh, Detoxifierea sângelui cunanoparticule superparamagnetice (hemodializa magneticã), RevMed Chir, 2010, 114, 1, 277-282.

56. Iacob Gh, Ciochinã Al D, Bredeþean O, High Gradient MagneticSeparation Ordered Matrices, Eur Cells and Mater, 2002, 3,suppl. 2, 167-169.

57. Iacob Gh., Ciochinã Al. D., Bredeþean O., Rãcuciu M., Mag-netite particle utilization for blood vessel embolization � apractical modeling, Optoelectr Adv Mats, 2008, 2, 7, 446-449.