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WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

COURS DE FORMATION SUR

ANALYSE D’ECHANTILLONS ALIMENTAIRES POUR LA PRESENCE D’ORGANISMES GENETIQUEMENT

MODIFIES

MANUEL D’UTILISATION

Édité par Maddalena Querci, Marco Jermini et Guy Van den Eede

La présente publication est également disponible en ligne à l’adresse :

http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm

ISBN: 92-79-02126-5

Numéro de catalogue: LB-X1-06-033-FR-C





COURS DE FORMATION SUR

ANALYSE D’ECHANTILLONS ALIMENTAIRES POUR LA PRESENCE D’ORGANISMES GENETIQUEMENT

MODIFIES



La présente publication est également disponible en ligne à l’adresse : http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm

Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés

II

Ni la Commission Européenne ni aucune personne agissant au nom de la Commission n’est responsable de l’usage qui pourrait être fait des informations données ci-après.

De nombreuses autres informations sur l'Union Européenne sont disponibles sur Internet

via le serveur Europa http://europa.eu

Luxembourg: Office des Publications Officielles des Communautés Européennes, 2006

ISBN-92-79-02126-5

© Communautés Européennes, 2006

Reproduction autorisée, moyennant mention de la source

Printed in Italy


III

ÉDITEURS Maddalena QUERCI Commission européenne Centre commun de recherche Institut pour la santé et la protection des consommateurs Unité Biotechnologie et OGM Chef du secteur Recherche Biotechnologique E-mail: [email protected] Marco JERMINI Repubblica e Cantone Ticino http://www.ti.ch Dipartimento della sanità e della socialità Divisione della salute pubblica Laboratorio Cantonale - Bellinzona E-mail: [email protected] Guy VAN DEN EEDE Commission européenne Centre commun de recherche Institut pour la santé et la protection des consommateurs Unité Biotechnologie et OGM Chef d’unité E-mail: [email protected]


IV


V

Avant-propos L’Institut pour la Santé et la Protection des Consommateurs du Centre Commun de

Recherche de la Commission Européenne et le Programme de Sécurité Alimentaire

du Centre Européen pour l’Environnement et la Santé (ECEH) de l’Organisation

Mondiale de la Santé, établi à Rome, ont organisé ensemble une série de cours de

formation portant sur «l’analyse d’échantillons alimentaires pour la présence

d’organismes génétiquement modifiés».

Le Centre Commun de Recherche fournit aux politiques de l’UE un appui scientifique

et technique par le biais d’une collaboration avec les directions générales de la CE

et d’une interaction avec les institutions, les organisations et les industries

européennes par la mise en réseau des laboratoires des États Membres. L’ECEH de

l’OMS a pour mission générale de fournir un soutien total et coordonné tant aux

décideurs qu’aux citoyens européens dans le domaine de la santé

environnementale. Les présents cours de formation s’inscrivent dans le cadre des

efforts de collaboration déployés par les deux institutions dans le but de promouvoir

les questions liées à la sécurité alimentaire dans la région européenne de l’OMS, à

l’intérieur et au delà des frontières actuelles de l’UE, en tenant compte en particulier

des pays candidats à l’adhésion, ainsi que des pays de l’Europe centrale et orientale

aux économies en transition.

Les cours de formation s’adressent au personnel des laboratoires de contrôle et

doivent leur permettre de se familiariser avec les techniques de détection

moléculaire et d’adapter leurs installations et leurs programmes de travail en y

incluant des analyses conformes aux règlements internationaux dans le domaine de

la biotechnologie. Ces cours ont été conçus pour un personnel de laboratoire

disposant d’une bonne connaissance des techniques analytiques, mais d’aucune ou

quasiment aucune expertise dans ce domaine spécifique.

Le Centre Commun de Recherche s’est engagé à fournir une formation à la

détection et à la quantification des OGM et offre en sus des cours de formation,

comme il l’a déjà fait dans le passé, une formation individuelle en fonction des


VI

besoins spécifiques. Le thème de la présente formation répond à une demande

croissante liée à l’importance du cadre législatif européen actuel et en

développement, et de la nécessité croissante de s’y conformer.

Au fil du temps, l’Unité Biotechnologie et OGM a acquis une connaissance

approfondie des différents aspects associés à la détection et à la quantification

d’OGM et a conçu, adapté ou validé des méthodes pour leur détection et leur

quantification.

La connaissance de ces techniques a été transférée à des laboratoires

collaborateurs par le biais de publications, de projets de collaboration, de formations

individuelles ou de cours spécifiques. Les détails techniques ont également été

communiqués aux stagiaires sous la forme de présentations orales ou de brèves

explications écrites. Conscient de la nécessité de disposer d’une source permanente

d’informations, le personnel de l’Unité Biotechnologie et OGM a élaboré le présent

manuel qui décrit certaines des techniques utilisées dans notre laboratoire.

Les cours couvrent les domaines suivants :

- l’extraction d’ADN de matériaux bruts ou transformés,

- la recherche d’OGM dans des aliments par la technique de la réaction de

polymérisation en chaîne (PCR) et de la réaction de polymérisation en chaîne

nichée (nested PCR),

- la quantification d’OGM dans des ingrédients par la réaction de polymérisation

en chaîne en temps réel,

- et la quantification d’OGM dans des ingrédients par immunoabsorption

enzymatique.

Rédigé par l’Institut pour la Santé et la Protection des Consommateurs (IHCP) du

Centre Commun de Recherche (CCR), le présent manuel doit être considéré par les

participants aux cours comme un document de référence qui vise à leur offrir des

informations théoriques et pratiques sur les méthodologies et protocoles

actuellement en usage. La matière du cours couvre une grande diversité de

techniques de détection, d’identification, de caractérisation et de quantification


VII

d’OGM et inclut des informations théoriques jugées importantes pour toute personne

désireuse d’entrer et de travailler dans le domaine de la détection des OGM.

Nous espérons que la structure et le contenu du présent manuel permettront aux

participants (ainsi qu’à d’autres utilisateurs) de transmettre et de diffuser leurs acquis

dans les différents environnements de travail en fonction des besoins.

Le présent manuel n’entend nullement concurrencer les manuels scolaires ou les

revues scientifiques et n’a d’autre ambition que de compléter les informations

disponibles dans la littérature spécialisée.

Afin de faciliter la diffusion et la consultation, le présent ouvrage est également

publié sur Internet à l’adresse:

http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm.

Les membres du personnel du CCR qui ont collaboré à la préparation du présent

manuel sous la supervision de Maddalena Querci sont mentionnés dans la table des

matières au regard de leurs contributions.

Sans les citer nommément, nous souhaitons exprimer notre gratitude et nos

remerciements sincères à tous les membres de l’unité Biotechnologie et OGM qui

ont contribué à la préparation de ce manuel.

Nous remercions également Chrystele Delobel pour son soutien et sa collaboration à

la révision du présent manuel.

Dr Maddalena Querci

Coordinatrice du cours

Juin 2006


VIII

Remarques introductives de l’Organisation Mondiale de la Santé L’Organisation Mondiale de la Santé accorde une grande priorité à l’utilisation et à

l’application en toute sécurité de la biotechnologie moderne dans la production et la

transformation alimentaires. Depuis les années 1990, l’OMS collabore, dès lors, très

activement à l’organisation de consultations d’experts sur la sécurité des aliments

issus de la biotechnologie. En mai 2000, la 53e Assemblée de la santé mondiale a

adopté une résolution encourageant l’OMS à offrir son soutien aux États membres

en vue de leur permettre d’étoffer la base scientifique des décisions sanitaires

portant sur les aliments génétiquement modifiés. Le comité exécutif de l’OMS a, par

ailleurs, envisagé l’exploration d’autres aspects pertinents en collaboration avec

d’autres agences.

La Commission du Codex Alimentarius (CCA) a été instituée en tant qu’organisme

intergouvernemental dans le but d’établir des normes internationales en matière

d’aliments. Elle a pour mission première de protéger la santé des consommateurs et

de garantir l’application de pratiques équitables dans le commerce alimentaire.

L’OMS est l’une des organisations parentes de la CCA depuis son établissement en

1963. Dans le cadre de l’activité du Codex Alimentarius, l’OMS et son organisation

sœur des Nations Unies, la FAO, participent au groupe de travail

intergouvernemental spécial du Codex sur les aliments dérivés des biotechnologies,

au comité du Codex Alimentarius sur l’étiquetage des aliments et au comité du

Codex Alimentarius sur les méthodes d’analyse et d’échantillonnage.

Le Programme de Sécurité Alimentaire de l’OMS en Europe collabore avec le Centre

Commun de Recherche (CCR) de la Commission Européenne depuis 2000 à

l’organisation de cours de formation aux techniques de détection des organismes

génétiquement modifiés (OGM) dans les aliments. Ces cours ont pour but de fournir

au personnel de laboratoire de contrôle alimentaire les aptitudes requises en

biotechnologie analytique et de promouvoir l’utilisation de méthodes de détection

des OGM validées et harmonisées en Europe et au niveau international.

Des méthodes adéquates d’analyse et d’échantillonnage sont indispensables pour

garantir un étiquetage correct des aliments de façon à accroître la transparence sur


IX

les procédés de fabrication et à faciliter la traçabilité en contribuant ainsi à renforcer

les systèmes de sécurité alimentaire. Afin de permettre un accès plus large à ces

méthodes, il a été décidé de mettre le manuel des travaux dirigés utilisé durant les

cours de formation conjoints du CCR et de l’OMS à disposition sur l’Internet. Les

méthodes présentées dans ce manuel sont conformes aux recommandations du

comité du Codex Alimentarius sur les méthodes d’analyse et d’échantillonnage.

Reconnaissant l’importance d’une collaboration avec le Centre Commun de

Recherche de la Commission Européenne, une institution scientifique de renommée

mondiale dans le domaine des OGM, le Programme de Sécurité Alimentaire de

l’OMS en Europe s’efforcera de promouvoir les activités de renforcement des

capacités en ce qui concerne les méthodes de détection des OGM dans les aliments

en Europe et dans d’autres régions.

Dr Cristina Tirado, DMV Conseillère régionale pour la sécurité alimentaire, Centre Européen de l’OMS


X

COURS DE FORMATION SUR :

L’analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés



Table des matières Module Titre Auteurs

1

Vue d’ensemble, présentation générale des organismes génétiquement modifiés (OGM), législation de l’UE

M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini

2 Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours

M. Querci

3

Échantillons utilisés durant le cours

M. Querci, N. Foti

4

Extraction et purification de l’ADN

M. Somma

5 Électrophorèse sur gel d’agarose M. Somma, M. Querci

6 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) M. Somma, M. Querci

7 Caractéristiques du soja Roundup Ready®, du maïs MON810 et du maïs Bt-176

M. Querci, M. Mazzara

8

Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le manuel


9

Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready® par PCR

M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

10

PCR quantitative pour la détection d’OGM

F. Weighardt

11 Détection quantitative du soja Roundup Ready® par PCR en temps réel

N. Foti

12 Détection quantitative du soja Roundup Ready® par ELISA

F. Eyquem

Annexe

Exemple de programme de travail

M. Querci


ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L’EUROPE




Module 1

Vue d’ensemble, présentation générale des organismes génétiquement modifiés (OGM),

législation de l’UE

M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini

Vue d’ensemble, présentation générale des organismes génétiquement modifiés (OGM), législation de l’UE 2

Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 1

Table des matières

Module 1

Vue d’ensemble, présentation générale des organismes génétiquement modifiés (OGM), législation de l’UE

INTRODUCTION 3 MODIFICATION GENETIQUE DANS LES PLANTES 4 LEGISLATION DE L’UE, 5 LA SECURITE ET L’ETIQUETAGE DES ALIMENTS DERIVES DE LA BIOTECHNOLOGIE MODERNE : LE

POINT DE VUE DE L’OMS 14 ANNEXE 1 – LEGISLATION DE L’UE REGISSANT LA MISE SUR LE MARCHE D’OGM, Y COMPRIS

LES PROGRAMMES D’ETIQUETAGE ET DE CONTROLE ASSOCIES 19



Introduction

En dehors de la plage des lignées de culture génétiquement modifiées qui poussent

dans différentes parties des régions agricoles de la planète, tous les cultivars

exploités à l’heure actuelle sont les produits de la domestication intensive, subissant

à partir de leur état sauvage original une sélection continue et une culture sous

contrôle pour en faire des espèces plus productives et plus résistantes aux parasites

ou un produit d’une qualité meilleure ou différente par rapport aux variétés

ancestrales dont ils sont issus. Ces changements, qui interviennent depuis la

première domestication des végétaux pour l’exploitation par l’homme, impliquent

l’échange ou la recombinaison de caractéristiques souhaitées, également appelés

« gènes », par le croisement continu dans le temps au sein d’une même espèce ou

entre des groupes d’espèces sexuellement compatibles et étroitement liés. Ces

dernières décennies ont permis d’assister à la production non seulement de

croisements entre des végétaux à compatibilité croisée naturelle, mais aussi entre

des végétaux dont le croisement naturel est considéré comme stérile. Parmi les

exemples de techniques utilisées dans de tels cas, citons les techniques de

sauvetage embryonnaire, la culture embryonnaire in vitro/in vivo, les cultures

ovariennes et ovulaires, la pollinisation in vitro et la fertilisation in vitro. Des

changements mutationnels ont également pu être obtenus, par exemple, par

l’irradiation de semences.

Les procédures traditionnelles d’hybridation et de sélection présentent plusieurs

inconvénients, dont l’un est le désir souvent exprimé par les cultivateurs d’introduire

des caractéristiques sélectionnées uniques plutôt que transférer et de recombiner

des génomes entiers. Un autre inconvénient est la lenteur du processus de sélection

et de tri de variétés génétiquement stables.

L’application des technologies de l’ADN recombinant et de la transformation semble

avoir quelque peu remédié à ces inconvénients. Le terme « organisme

génétiquement modifié » (OGM) a été introduit dans le but de décrire des

organismes dont le matériel génétique a été modifié d’une façon qui ne se produit

pas dans la nature, dans des conditions naturelles de croisement ou de

recombinaison naturelle. L’OGM en soi doit être une unité biologique capable de se

reproduire ou de transmettre le matériel génétique. Lorsqu’il est appliqué aux

cultures, le terme fait référence à des plantes dans lesquelles un ou plusieurs gènes

issus d’espèces différentes ont été introduits de façon stable dans un génome hôte à

l’aide de techniques de transfert génétique et dans lesquelles il est apparu que les



gènes ainsi introduits ont donné naissance, dans la majorité des cas, à un produit

génétique (une protéine). Le processus consistant à introduire des gènes dans des

espèces non apparentées et à les rendre opérationnels s’appelle « transformation

génétique ».

L’analyse des notifications à des fins de dissémination expérimentale au sein de l’UE

montre que les caractéristiques les plus fréquemment testées sont les suivantes :

tolérance aux herbicides, restauration de la stérilité/fertilité mâle, résistance aux

insectes dérivés de la souche Bt, résistance aux virus, résistance fongique et

altération de la biosynthèse de l’amidon (pour plus de détails, cf.

http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).

Modification génétique dans les plantes

Bien que le thème de la transformation végétale se décline en de nombreuses

variations, le nombre de méthodes principales de modification génétique des plantes

est limité. Développée dans les années 1980, la plus précoce des technologies

utilise une espèce bactérienne (Agrobacterium tumefaciens) pour introduire le gène

d’intérêt dans la plante hôte.

L’Agrobacterium, un microorganisme pathogène chez la plante, est connu depuis le

début du 20e siècle. Par nature, A. tumefaciens a la capacité exceptionnelle de

transférer un segment d’ADN particulier (ADN-T) de son plasmide inducteur de

tumeur (Ti) vers le noyau de cellules infectées où il est ensuite intégré de façon

stable dans le génome hôte et transcrit, provoquant la maladie de la galle du collet.

Le fragment d’ADN-T est flanqué de répétitions directes de 25 bp agissant en tant

que signal d’élément cis-régulateur pour l’appareil de transfert.

Les scientifiques profitent du fait que tout ADN étranger placé entre ces bordures

d’ADN-T peut être transféré aux cellules végétales pour développer des souches

d’Agrobacterium dans lesquelles les gènes provoquant la maladie ont été remplacés

par un ADN sélectionné de manière spécifique.

Depuis cette découverte, des progrès considérables ont été réalisés dans la

compréhension du processus du transfert génétique aux cellules végétales dirigé par

Agrobacterium. À l’état naturel, l’Agrobacterium tumefaciens n’infecte cependant que

les plantes dicotylédones de sorte que la manipulation génétique est restée

inaccessible à un grand nombre de végétaux importants sur le plan économique, y

compris des céréales (qui sont des monocotylédones). Pour ces cas-là, des

méthodes alternatives de transformation directe ont été élaborées telles que le



transfert médié par le polyéthylène glycol, la microinjection, le protoplaste,

l’électroporation de cellule intacte et la technologie du pistolet génétique (biolistique).

La transformation dirigée par Agrobacterium offre toutefois divers avantages par

rapport aux méthodes de transformation directes. Premièrement, elle réduit le

nombre de copies du transgène, réduisant potentiellement le nombre de problèmes

résultant de la cosuppression de transgène et l’instabilité.

Dans les deux cas, les cellules (qu’elles soient infestées par Agrobacterium ou

bombardées à l’aide du pistolet « biolistique ») sont régénérées en végétaux entiers

porteurs du nouveau ou des nouveaux gènes d’intérêt. Ces végétaux sont testés et

reproduits de manière intensive pour fournir, en finalité, la semence qui servira à une

nouvelle génération de lignées végétales génétiquement modifiées.

Législation de l’UE1,2

L’utilisation d’organismes génétiquement modifiés, en l’occurrence leur dissémination

dans l’environnement, leur culture, leur importation et en particulier leur utilisation en

tant qu’aliments ou ingrédients alimentaires, est régie par un ensemble de

procédures strictes au sein de l’Union Européenne. Les premiers instruments

juridiques communautaires (Directive 90/220/CEE du Conseil et Directive

90/219/CEE du Conseil) ont été établis en 1990 et avaient pour objet spécifique la

protection de la santé de l’homme et de l’animal et l’environnement.

Le principal instrument communautaire, qui constitue le cadre légal horizontal

régissant la biotechnologie au sein de l’UE, est la Directive 2001/18/CE du

Parlement Européen et du Conseil du 12 mars 2001 relative à la dissémination

volontaire d’organismes génétiquement modifiés dans l’environnement. La Directive

2001/18/CE abroge la Directive 90/220/CEE du Conseil et renforce les règles qui

existaient au préalable concernant la dissémination d’OGM dans l’environnement,

notamment l’introduction de principes d’évaluation des risques pour l’environnement,

le contrôle (environnemental) obligatoire après la mise sur le marché, l’information

obligatoire du public, l’étiquetage obligatoire et la traçabilité à tous les stades de la

mise sur le marché et l’établissement d’un registre moléculaire.

Les consentements délivrés au titre de la Directive 90/220/CEE du Conseil et

toujours en vigueur sous la Directive 2001/18/CE doivent être renouvelés afin d’éviter

toutes disparités et de tenir pleinement compte des conditions de consentement

prévues par la Directive 2001/18/CE. Le consentement (renouvelable) est octroyé

1 Cf. la liste quasi-complète, mais non exhaustive des règlements/directives de l’Union Européenne se rapportant aux OGM en annexe 1. 2 Situation au 9 juin 2004



pour une durée de dix ans au maximum à partir de la date d’émission dudit

consentement.

Suite à la mise sur le marché d’un OGM en tant que ou dans un produit, le notifiant

veillera à ce que le contrôle et le rapport suivant la mise sur le marché soient

exécutés conformément aux conditions spécifiées dans le consentement.

La Directive 2001/18/CE, qui est mise en œuvre dans chaque État Membre par des

réglementations nationales, traite à la fois des essais à petite échelle sur le terrain

(disséminations volontaires exécutées à des fins expérimentales, traités sous la

partie B de la directive) et des dispositions de commercialisation d’OGM (traitées

dans la partie C). Dix-huit OGM, énumérés dans le Tableau 1, ont été autorisés au

titre de l’ancienne procédure 90/220/CEE (quinze des dix-huit végétaux concernés,

dont trois consentements donnés par des États membres). À ce jour, plus de vingt-

cinq demandes d’autorisation de mise sur le marché d’OGM ont été introduites au

titre de la Directive 2001/18/CE (pour obtenir des informations actualisées à ce sujet

et connaître le statut des dossiers: http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).

Une directive « sœur » régit l’utilisation confinée d’organismes génétiquement

modifiés (Directive 98/81/CE du Conseil du 26 octobre 1998 modifiant la Directive

90/219/CEE du Conseil relative à l’utilisation confinée d’organismes génétiquement

modifiés).

En plus des directives susmentionnées, une série d’instruments juridiques ont été

élaborés et mis en œuvre au fil du temps, traitant plus spécifiquement de

l’autorisation et de l’utilisation sûre d’OGM destinés à la consommation humaine. La

mise sur le marché de la Communauté de nouveaux aliments ou de nouveaux

ingrédients alimentaires était réglementée jusqu’il y a peu par une législation

verticale, en l’occurrence le Règlement (CE) 258/97 qui concernait spécifiquement :

- les aliments et ingrédients alimentaires contenant des organismes génétiquement

modifiés au sens de la Directive 90/220/CEE ou consistant en de tels organismes ;

- les aliments et ingrédients alimentaires produits à partir d’organismes

génétiquement modifiés, mais n’en contenant pas ;

- les aliments et ingrédients alimentaires présentant une structure moléculaire

primaire nouvelle ou délibérément modifiée ;

- les aliments et ingrédients alimentaires composés de micro-organismes, de

champignons ou d’algues ou isolés à partir de ceux-ci ;



Tableau 1. Plantes génétiquement modifiées autorisées à la mise sur le marché au sein de l’UE au titre de la Directive 90/220/CEE

Produit Lignée Notifiant Principales caractéristiques

Décision de la Commission n°/date

Œillet Florigène Couleur de fleur modifiée 20.10.98 (autorisation EM)

Œillet Florigène Durée de vie en vase modifiée 20.10.98 (autorisation EM)

Œillet Florigène Couleur de fleur modifiée 01/12.97 (autorisation EM)

Maïs Zea mays L. lignée MON 810

Monsanto Expression du gène Bt cryIA(b)

98/294/CE du 22 avril 1998

Maïs* Zea mays L. lignée Bt-11

Novartis Tolérance au glufosinate-ammonium et expression du gène Bt cryIA(b)

98/292/CE du 22 avril 1998

Maïs Zea mays L. T25 AgrEvo Tolérance au glufosinate-ammonium

98/293/CE du 22 avril 1998

Colza de printemps*

Brassica napus L. ssp. Oleifera

AgrEvo Tolérance au glufosinate-ammonium

98/291/CE du 22 avril 1998

Colza Brassica napus L. oleifera Metzg. MS1, RF2

Plant Genetic Systems

Tolérance au glufosinate-ammonium

97/393/CE du 6 juin 1997

Colza Brassica napus L. oleifera Metzg. MS1, RF1



97/392/CE du 6 juin 1997

Maïs Zea mays L. lignée Bt-176 (maïs Maximizer)

Ciba-Geigy Tolérance au glufosinate-ammonium et expression du gène endotoxine Bt

97/98/CE du 23 janvier 1997

Chicorée stérile male**

Cichorium intybus L. Bejo-Zaden BV


96/424/CE du 20 mai 1996

Soja* Glycine max L. (Roundup Ready)

Monsanto Tolérance au glyphosate 96/281/CE du 3 avril 1996

Colza Brassica napus L. oleifera Metzg. MS1Bn x RF1Bn



96/158/CE du 6 février 1996

Tabac Variété ITB 1000 OX

SEITA Tolérance au bromoxynil 94/385/CE du 8 juin 1994

* Culture non autorisée au sein de la CE ; ** Pour la production de semence uniquement

- les aliments et ingrédients alimentaires composés de végétaux ou isolés à partir de

ceux-ci et les ingrédients alimentaires isolés à partir d’animaux, à l’exception des

aliments et des ingrédients alimentaires obtenus par des pratiques de multiplication

ou de reproduction traditionnelles et dont les antécédents sont sûrs en ce qui

concerne l’utilisation ;

- les aliments et ingrédients alimentaires auxquels a été appliqué un procédé de

production qui n’est pas couramment utilisé, lorsque ce processus entraîne dans la



composition ou dans la structure des aliments ou des ingrédients alimentaires des

modifications significatives de leur valeur nutritive, de leur métabolisme ou de leur

teneur en substances indésirables.

La question spécifique de l’étiquetage des aliments génétiquement modifiés a été

traitée par plusieurs instruments légaux. Des exigences d’étiquetage ont été

mentionnées pour la première fois dans le Règlement (CE) 258/97 (règlement relatif

aux nouveaux aliments), mais les lignées de maïs et de soja GM spécifiques ont été

soumises à l’étiquetage ultérieurement par l’introduction du Règlement (CE) 1139/98

du Conseil.

Deux OGM (soja Roundup Ready® et maïs Maximizer) ayant été mis sur le marché

avant l’entrée en vigueur du Règlement (CE) 258/97, les exigences d’étiquetage

spécifiques à ces OGM ont été traitées a posteriori par le Règlement (CE) 1139/98 du Conseil.

Dans le Règlement (CE) 258/97, des exigences d’étiquetage spécifiques ont été

établies dans le but de garantir que le consommateur final serait informé de tout

changement intervenant dans les caractéristiques ou les propriétés alimentaires

telles que la composition, la valeur nutritive ou les effets nutritionnels ou l’usage

auquel l’aliment est destiné qui aurait pour conséquence que l’aliment nouveau ou le

nouvel ingrédient alimentaire n’est plus équivalent à l’aliment ou l’ingrédient

alimentaire existant. Des produits issus de dix-sept événements GM ont été

approuvés à l’heure actuelle et peuvent être mis légalement sur le marché de l’UE

(cf. Tableau 2). Un soja GM et un maïs GM ont été approuvés au titre de la Directive

90/220/CEE avant l’entrée en vigueur du Règlement sur les nouveaux aliments. Les

autres ingrédients, en l’occurrence des aliments transformés dérivés, entre autres,

de sept colzas GM, cinq maïs GM et de l’huile tirée de deux semences de coton GM,

ont tous été notifiés en tant qu’ingrédients substantiellement équivalents

conformément au règlement sur les nouveaux aliments et autorisés via la procédure

simplifiée.

Le Règlement (CE) 1139/98 du Conseil a fourni un modèle pour l’étiquetage sur la

base du principe qu’un aliment ou ingrédient alimentaire GM n’est plus considéré

comme un ingrédient non GM ou existant si l’ADN ou la protéine résultant de la

modification génétique est détectable. Les additifs ont été exclus des exigences

d’étiquetage jusqu’à l’introduction du Règlement (CE) 50/2000 de la Commission.



Le Règlement (CE) 1139/98 a ensuite été modifié par le fameux « règlement des

seuils » (Règlement (CE) 49/2000 de la Commission du 10 janvier 2000 modifiant le

Règlement (CE) 1139/98 du Conseil) qui a essayé de faire face au problème de la

contamination involontaire et a introduit le concept de seuil.

Ce règlement stipulait que les denrées alimentaires ne sont pas soumises aux

exigences spécifiques d’étiquetage supplémentaires lorsque du matériel issu des

organismes génétiquement modifiés est présent dans leurs ingrédients alimentaires

dans des proportions ne dépassant pas 1% des ingrédients considérés

individuellement.

Pour établir que la présence de ce matériel est accidentelle, les opérateurs doivent

être en mesure de démontrer qu’ils ont pris les mesures appropriées pour éviter

d’utiliser les organismes génétiquement modifiés.

Plusieurs raisons, notamment l’avis controversé de différentes associations

d’utilisateurs en rapport avec les OGM, une difficulté dans l’interprétation et

l’application des instruments légaux publiés au fil du temps, le fait qu’aucune

législation européenne spécifique aux aliments GM n’était en place, entre autres, a

mis en lumière la nécessité d’instruments juridiques unifiés, actualisés et complets

sur cette question. Enfin, en octobre 2003, deux règlements modifiant ou abrogeant

les précédents instruments légaux ont été publiés et ont fourni une orientation plus

complète et informative sur ces questions.

Il s’agit plus spécifiquement du Règlement (CE) 1829/2003 du Parlement Européen

et du Conseil du 22 septembre 2003 concernant les denrées alimentaires et les

aliments pour animaux génétiquement modifiés et du Règlement (CE) 1830/2003 du

Parlement Européen et du Conseil du 22 septembre 2003 concernant la traçabilité et

l’étiquetage des organismes génétiquement modifiés et la traçabilité des produits

destinés à l’alimentation humaine ou animale produits à partir d’organismes

génétiquement modifiés, et modifiant la Directive 2001/18/CE.

Dans le Règlement (CE) 1829/2003, les règles pour l’évaluation de la sécurité ont

été renforcées et étendues. Ce règlement introduit pour la première fois des règles

spécifiques sur les aliments pour animaux GM et contient des exigences d’étiquetage

pour les denrées alimentaires et les aliments pour animaux GM qui n’étaient couverts

jusque là que partiellement par le Règlement (CE) 1139/98 du Conseil et le

Règlement (CE) 49/2000 de la Commission.



Tableau 2. Aliments génétiquement modifiés (GM) autorisés au sein de l’Union Européenne3

Événement Culture Demandeur Caractéristique Usages Alimentaires Potentiels Date Base

Légale

1 GTS 40/3/2 Soja Monsanto Tolérance aux insecticides et aux herbicides

Aliments à base de soja. Ceux-ci peuvent inclure les boissons à base de soja, le tofu, l’huile de soja, la farine de soja et la lécithine.

03.04.1996 Dir. 90/220/CEE Art. 13

2 Bt 176 Maïs Ciba-Geigy Tolérance aux insecticides et aux herbicides

Aliments à base de maïs. Ceux-ci peuvent inclure les grains, l’huile, la farine de maïs, le sucre et le sirop.

23.01.1997 Dir. 90/220/CEE Art. 13

3 TOPAS 19/2 Colza AgrEvo Tolérance aux herbicides 24.06.1997 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

4 MS1 / RF2 Colza Plant Genetic Systems

Tolérance aux herbicides 24.06.1997 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

5 MS1 / RF1 Colza Plant Genetic Systems


258/97 Art. 5

6 GT 73 Colza Monsanto Tolérance aux herbicides

Huile de colza. Les produits fabriqués à base d’huile de graines de colza peuvent inclure les aliments frits, les produits cuisinés et les en-cas.

21.11.1997 Règl. (CE) 258/97 Art. 5

7 MON 810 Maïs Monsanto Protection contre les insectes

06.02.1998 Règl. (CE) 258/97 Art. 5

8 T 25 Maïs AgrEvo Tolérance aux herbicides 06.02.1998 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

9 Bt 11 Maïs Novartis Protection contre les insectes

06.02.1998 Règl. (CE) 258/97 Art. 5

10 MON 809 Maïs Pioneer Protection contre les insectes

Dérivés du maïs. Ceux-ci peuvent inclure l’huile de maïs, la farine de maïs, le sucre et le sirop. Les produits fabriqués à base de dérivés de maïs peuvent inclure les en-cas, les aliments cuisinés, les aliments frits, les bonbons et les boissons sucrées.

23.10.1998 Règl. (CE) 258/97 Art. 5

11 Falcon GS 40/90 Colza Hoechst /

AgrEvo Tolérance aux herbicides 08.11.1999 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

12 Liberator L62 Colza HŒchst / AgrEvo


258/97 Art. 5

13 MS8/RF3 Colza Plant Genetic Systems

Tolérance aux herbicides

Huile de graines de colza. Ceux-ci peuvent inclure les aliments frits, les aliments cuisinés et les en-cas. 26.04.2000 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

14 1445 Coton Monsanto Tolérance aux herbicides 19.12.2002 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

15 531 Coton Monsanto Protection contre les insectes

Huile de graines de coton. Les produits fabriqués à base d’huile de graines de coton peuvent inclure les aliments frits, les aliments cuisinés et les en-cas.

19.12.2002 Règl. (CE) 258/97 Art. 5

16 pRF69/pRF93 Bacilles subtilisa

F. Hoffmann La Roche Riboflavine Vitamine B2 23.03.2000 Règl. (CE)

258/97 Art. 5

17 Bt11 Maïs Syngenta Résistance aux insectes Maïs sucré 19.05.2004 Règl. (CE)

258/97 Art. 7

3 Source: Commission Européenne (http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm) (Janvier 2010)



En guise caractéristique principale, ce règlement met en œuvre l’approche « une

porte, une clé » : une seule autorisation couvre à la fois l’usage en tant que denrée

alimentaire et l’usage en tant qu’aliment pour animaux, comblant ainsi le vide

juridique pour l’autorisation des produits entrant dans la composition des denrées

animales, tout en abandonnant la procédure simplifiée basée sur le concept de

« substantiellement équivalent ».

Au titre du Règlement (CE) 1829/2003 (en vigueur depuis le 18 avril 2004), le

demandeur soumettra un dossier complet, y compris une méthode de détection de

l’événement génétiquement modifié particulier. Le dossier, et en particulier, les

parties consacrées à l’évaluation du risque de sécurité environnementale et à

l’évaluation du risque de sécurité alimentaire seront évalués par l’Autorité

Européenne de Sécurité Alimentaire (établie par le Règlement (CE) 178/2002 du

Parlement Européen et du Conseil du 28 janvier 2002). Les méthodes de détection

prévues par le demandeur seront évaluées et validées par le Laboratoire

Communautaire de Référence (établi par le Règlement (CE) 1829/2003).

Le règlement arrête de nouveaux seuils de minimis pour l’étiquetage. Le seuil de 1%

spécifié sous le Règlement (CE) 49/2000 de la Commission pour la présence

accidentelle d’OGM autorisés a été abaissé à 0,9%. En outre, un seuil de 0,5% pour

la présence accidentelle d’OGM non autorisés a été établi à titre temporaire, pour

autant qu’ils aient bénéficié d’un avis favorable du comité scientifique compétent.

L’UE reconnaît le droit des consommateurs à l’information et à l’étiquetage en tant

qu’outil pour faire un choix informé. Depuis 1997, l’étiquetage indiquant la présence

d’OGM comme tel ou dans un produit est obligatoire. Le Règlement (CE) 1830/2003 renforce toutefois les règles d’étiquetage actuelles pour les aliments GM :

l’étiquetage obligatoire est étendu à toutes les denrées alimentaires et tous les

aliments pour animaux indépendamment de la détectabilité et définit la traçabilité

comme étant la capacité de suivre des OGM et des produits élaborés à partir

d’OGM, à tous les stades de leur mise sur le marché, le long de la chaîne de

production et de distribution.

Des méthodes s’imposent, dès lors, non seulement pour détecter la présence

éventuelle d’un OGM dans une matrice alimentaire, mais aussi pour identifier l’OGM

spécifique et en quantifier la quantité dans les différents ingrédients composant les

denrées alimentaires et les aliments pour animaux.

Des méthodes de détection qualitatives peuvent être utilisées en tant que dépistage

initial de produits alimentaires afin d’examiner si des composants spécifiques aux

OGM (ADN ou protéines) sont présents. L’analyse qualitative pourrait donc se faire



sur des produits, échantillonnés à partir des rayons des supermarchés, des stocks

d’entrepôts ou de points situés plus en amont dans la chaîne d’approvisionnement.

Si l’analyse qualitative fournit une indication de la présence d’OGM, un test

quantitatif subséquent pourrait fournir une réponse décisive concernant l’exigence

d’étiquetage.

Comme indiqué précédemment, un nouveau composant intégral essentiel de la

procédure législative s’inscrit dans le cadre statutaire : le Laboratoire

Communautaire de Référence (CRL). Dans le contexte du Règlement (CE)

1829/2003, le CCR, assisté du Réseau Européen de Laboratoires pour les OGM, a

été nommé en tant que Laboratoire Communautaire de Référence (http://gmo-

crl.jrc.ec.europa.eu/).

Le CRL a pour mandat d’évaluer et de valider les méthodes analytiques de façon à

garantir qu’elles « garantissent la conformité au cadre réglementaire » et de formuler

des avis scientifiques et techniques en cas de litiges.

Un thème faisant partie intégrante de la législation demande la disponibilité de

méthodes d’analyse saines, précises et fiables. Ceci exige une activité de recherche

pour aider à garantir une approche harmonisée et standardisée et un ensemble de

procédures et de performances analytiques dans tous les laboratoires de mise en

œuvre et de contrôle des OGM au sein de l’UE.

Le CCR a déjà identifié la nécessité d’une harmonisation et d’une standardisation

des procédures et des performances au sein des laboratoires de contrôle européens

en tant qu’élément essentiel du succès de tout élément de la législation de contrôle

depuis quelques années.

Depuis 1999, l’Unité Biotechnologie et OGM de l’Institut de la Santé et de la

Protection des Consommateurs du CCR propose et encourage, en effet, la formation

d’un réseau de mise en œuvre composé de laboratoires impliqués dans les

questions associées aux OGM.

Le Réseau Européen de Laboratoires pour les OGM (ENGL) a été officiellement

inauguré en décembre 2002 (http://engl.jrc.ec.europa.eu/). La direction et le

fonctionnement du secrétariat sont coordonnés par la Commission Européenne (DG

Centre Commun de Recherche - CCR). Englobant initialement 47 laboratoires de

contrôle issus des États Membres, l’ENGL a été élargi à 71 laboratoires récemment

suite à l’ajout de 24 établissements représentant les nouveaux adhérents. La

présidence et le secrétariat du réseau relèvent de la responsabilité de l’Unité

Biotechnologie et OGM de l’Institut de la Santé et de la Protection des

Consommateurs du CCR.



Le Réseau Européen de Laboratoires pour les OGM a pour mission de créer une

plate-forme unique permettant aux experts impliqués dans l’échantillonnage, la

détection, l’identification et la quantification d’OGM dans les semences, les graines,

les denrées alimentaires, les aliments pour animaux et les prélèvements, et lorsque

des éléments techniques peuvent être avancés et discutés, assurant notamment :

le développement de méthodes pour l’analyse qualitative et quantitative ;

le transfert de technologies, la formation et le renforcement des capacités ;

des études de validation et d’expertise de méthodes convenant soit au dépistage

de diverses matrices pour la présence d’OGM, soit à l’estimation des quantités

d’OGM présents ;

la fourniture des matériaux de référence (la responsabilité de ces tâches relève

de l’Institut des Matériaux et Mesures de Référence du CCR) ;

la mise à disposition de stratégies et de procédures d’échantillonnage pour

différents produits OGM (semences, graines, matériau brut, produits destinés aux

consommateurs finaux et aux restaurateurs de masse) ;

des bases de données et outils de bioinformatique, ainsi que des exigences pour

l’identification unique d’OGM et la mise en place de bases de données contenant

de telles données moléculaires.

Dans le cadre des activités de réseau, les cours de formation doivent être considérés

comme l’un des principaux outils pour atteindre les objectifs susmentionnés.



La sécurité et l’étiquetage des aliments dérivés de la biotechnologie moderne : le point de vue de l’OMS4

La dissémination d’OGM dans l’environnement et la commercialisation d’aliments à

base d’OGM ont déclenché un débat public dans de nombreuses parties du monde.

Ce débat devrait se poursuivre, probablement dans le contexte plus large d’autres

utilisations de la biotechnologie (par exemple, en médecine humaine) et de leurs

conséquences pour les sociétés humaines. Bien que les questions débattues soient

généralement de nature très similaire (coûts et bénéfices, questions de sécurité),

l’issue du débat diffère d’un pays à l’autre. Sur les questions telles que l’étiquetage et

la traçabilité des aliments GM en tant que moyen pour répondre aux préoccupations

des consommateurs, aucun consensus ne s’est dégagé à ce jour, comme on a pu

s’en apercevoir lors des discussions qui se sont tenues au sein de la Commission du

Codex Alimentarius ces dernières années. La Commission du Codex Alimentarius

(Codex: http://www.codexalimentarius.net/web/index_en.jsp) est l’organisme conjoint

de la FAO et de l’OMS qui est chargé d’établir les normes, les codes de bonne

pratique, les lignes directrices et les recommandations qui constituent le Codex

Alimentarius, c’est-à-dire le code alimentaire international. Malgré le manque de

consensus sur ces thèmes, d’importants progrès ont été réalisés dans

l’harmonisation des points de vue concernant l’évaluation du risque. Le Codex est

toutefois sur le point d’adopter des principes concernant l’évaluation de risques

préliminaires à la mise sur le marché, révélant une compréhension croissante au

niveau international (cf. publication anticipée des « Principes pour l’analyse des

risques liés aux aliments dérivés des biotechnologies modernes », CAC/GL 44-2003

à l’adresse: ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf).

Différents organismes GM incluent différents gènes insérés de diverses manières.

Ceci implique que les aliments GM individuels et leur sécurité devraient être évalués

au cas par cas et qu’il n’est guère possible de formuler des déclarations générales

sur la sécurité de tous les aliments GM. Selon l’OMS, les aliments GM actuellement

disponibles sur le marché international ont réussi les évaluations de risques et ne

devraient, dès lors, présenter aucun risque pour la santé de l’homme. La

consommation de tels aliments par la population générale dans les pays où ils ont

été approuvés n’a, en outre, révélé aucun effet sur la santé de l’homme. L’utilisation

4 Pour des informations exhaustives sur les activités de l’OMS et des autres agences des NU sur les aliments dérivés des biotechnologies modernes, cf. http://www.who.int/foodsafety/en/.



continue d’évaluations de risques basées sur les principes du Codex et incluant, le

cas échéant, le contrôle après la mise sur le marché, devrait constituer la base de

l’évaluation de la sécurité des aliments GM.

L’étiquetage d’aliments produits par la biotechnologie peut être associé ou non à la

sécurité alimentaire en soi, mais l’OMS le considère comme un outil pour accroître la

transparence des procédés de production alimentaire. Un tel étiquetage peut

également stimuler le développement de stratégies de traçabilité qui pourraient être

perçues comme une contribution à l’amélioration de programmes nationaux de

sécurité alimentaire et donc une contribution indirecte à la sécurité alimentaire en

général. L’importance de méthodes adéquates d’analyse et d’échantillonnage est

ainsi évidente.

L’OMS participe activement au développement de principes et de recommandations

pour la sécurité et l’évaluation de risques de denrées alimentaires dérivées de la

biotechnologie. Les résultats développés au cours de diverses consultations

d’experts constituent la base de lignes directrices élaborées au niveau national et

sont, dès lors, intégrées aujourd’hui dans des lignes directrices internationalement

reconnues. L’approche basée sur le principe du « substantiellement équivalent » a

été développée pour évaluer la sécurité de la première génération de cultures

génétiquement modifiées (GM) et a été perçue par un grand nombre de personnes

comme une approche adéquate. Le concept est toutefois soumis à des critiques

permanentes. Les activités contemporaines doivent prendre ces arguments en

considération et contribuer au développement d’adaptations et d’améliorations

basées sur la science.

La consultation experte de l’OMS/FAO sur les aspects de la salubrité des aliments

génétiquement modifiés d’origine végétale, qui s’est tenue en 2000, a reconnu que le

concept de l’équivalence substantielle peut être utilisé comme une approche

comparative se concentrant sur les similitudes et les différences entre les aliments

génétiquement modifiés et leur contrepartie traditionnelle. Parallèlement, elle a

estimé que le concept de l’équivalence substantielle n’est ni une évaluation de la

sécurité en soi ni une finalité, mais simplement le point de départ de l’évaluation de

la sécurité (http://www.fao.org/ag/agn/food/risk_biotech_aspects_en.stm).

La génération suivante d’aliments GM se composera de cultures ayant une valeur

nutritionnelle améliorée et traversant ainsi la limite vers les aliments fonctionnels et

les nutraceutiques. Les futures stratégies d’évaluation de la sécurité alimentaire

devront faire face à des changements métaboliques plus complexes provoqués par



les modifications génétiques données. Les évaluations devront tenir compte de plus

en plus de l’impact d’un aliment GM sur le statut nutritionnel global en prenant en

considération les différents besoins dans les pays développés et en développement.

Aucun système réglementaire international spécifique n’est actuellement en place.

Plusieurs organisations internationales sont toutefois impliquées dans le

développement de protocoles pour les OGM. Comme indiqué ci-dessus, le Codex

développe des principes pour l’analyse des risques des aliments GM pour la santé

de l’homme. Les hypothèses sur lesquels sont ébauchés ces principes produisent

une évaluation préalable à la commercialisation, réalisée sur une base de cas par

cas et incluant une évaluation tant des effets directs (du gène inséré) que des effets

indésirables (pouvant découler de l’insertion d’un nouveau gène). Les principes en

sont à un stade avancé de développement, mais n’ont pas encore été adoptés (cf.

publication anticipée des « Principes pour l’analyse des risques liés aux aliments

dérivés des biotechnologies modernes », CAC/GL 44-2003 à l’adresse:

ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_en.pdf). Ces principes, ainsi que d’autres

principes du Codex en cours d’élaboration (notamment ceux qui portent sur les

méthodes d’analyse et l’échantillonnage) n’ont pas d’effet contraignant sur les

législations nationales, mais il y est fait spécifiquement référence dans l’Accord

sanitaire et phytosanitaire (accord SPS) de l’Organisation Mondiale du Commerce

qui peut être utilisé comme référence en cas de litige commercial.

Tenant compte des travaux publiés entre 1999 et 2003 par le groupe de travail

intergouvernemental spécial du Codex sur les aliments dérivés des biotechnologies

(http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp), le comité du Codex

Alimentarius sur l’étiquetage des aliments et le comité du Codex Alimentarius sur les

méthodes d’analyse et d’échantillonnage, le développement de lignes directrices

généralement acceptées pour l’évaluation de la sécurité des aliments dérivés des

biotechnologies, la notification des risques (par exemple, l’étiquetage) et, partant de

là, le développement de méthodes d’analyse adéquates resteront un point de

concentration pour les activités de l’OMS.

L’OMS continue donc d’organiser des consultations d’experts

(http://www.who.int/foodsafety/biotech/consult/en/) dans le but d’élaborer des

principes et méthodologies d’évaluation des risques, de gestion du risque et de

communication du risque associé aux aliments produits par la biotechnologie et

coordonne la collaboration entre les pays développés et les pays en développement

dans le domaine des méthodes de détection.



Le département de la sécurité alimentaire de l’OMS apporte la touche finale à une

étude, basée sur des preuves, des implications de la biotechnologie alimentaire

moderne sur la santé humaine et le développement. L’étude a été inspirée par une

résolution de la 53e Assemblée mondiale de la santé, tenue en mai 2000, prévoyant

que l’OMS devrait renforcer sa capacité d’aide aux États Membres dans le but

d’établir la base scientifique des décisions sur la biotechnologie alimentaire moderne

et de garantir la transparence, l’excellence et l’indépendance des avis fournis.

L’étude (http://www.who.int/foodsafety/biotech/who_study/en/index.html) vise à

compléter les efforts déployés par d’autres agences internationales en recueillant les

informations déjà existantes et en les analysant dès lors qu’elles concernent le

mandat de l’OMS. Afin de promouvoir la transparence dans le processus, l’OMS a

collaboré avec la FAO et a impliqué toute une fourchette de parties prenantes et de

groupes d’intérêt. L’objectif primaire est de créer une base de connaissances

accessible pour aider les États Membres, les organismes internationaux de

normalisation et les autres parties prenantes à parvenir à un consensus transparent

et complet sur l’évaluation et l’application de la biotechnologie. Enfin, l’OMS cherche

à établir les fondements, étayés par des preuves, d’une évaluation plus holistique de

la biotechnologie à l’avenir.

Cette étude cherchait à replacer dans un contexte la contribution globale que la

biotechnologie alimentaire moderne peut apporter à la santé et au développement de

l’homme. Elle inclut l’application de la biotechnologie alimentaire moderne aux micro-

organismes, aux végétaux et aux animaux. Une approche (holistique) intégrée a été

adoptée afin d’identifier les grandes questions qui ont un impact direct ou indirect sur

la santé et le développement de l’homme et d’asseoir les preuves disponibles. Les

grandes questions pour lesquelles des preuves ont pu être obtenues incluaient :

la recherche et le développement,

l’impact sur la santé de l’homme (sécurité alimentaire et effets sur

l’environnement),

la sécurité alimentaire, les coûts et l’accès à la technologie,

les questions éthiques, légales et sociales et

les initiatives de renforcement des capacités.

Les informations ont été recueillies par le biais d’une littérature détaillée, d’une

cyberenquête basée sur des questionnaires soutenue par 120 réponses environ à un

questionnaire distribué à une vaste plage de parties prenantes et d’experts en mai

2002. Les observations reçues lors d’une discussion électronique entre différentes

acteurs entre janvier et avril 2003 ont également été intégrées. Les avis de



participants se composant de représentants du gouvernement, des consommateurs,

de l’industrie, du secteur de la recherche et d’organisations non gouvernementales

(ONG) en provenance des pays développés et en développement qui ont participé à

une réunion de parties prenantes les 5 et 6 juin 2003 à Genève ont également été

pris en compte.

Le rapport établi à partir de ce processus de consultation sera utilisé directement par

l’OMS afin de planifier ses activités futures en ce qui concerne l’utilisation et

l’application de la biotechnologie moderne dans la santé et le développement de

l’homme.



Annexe 1 – Législation de l’UE régissant la mise sur le marché d’OGM, y compris les programmes d’étiquetage et de contrôle associés

Directive 90/220/CEE du Conseil, du 23 avril 1990, relative à la dissémination volontaire

d’organismes génétiquement modifiés dans l’environnement

(JO L 117, 8.5.1990, p. 15)

Abrogée par :

Directive 2001/18/CE du Parlement Européen et du Conseil du 12 mars 2001 relative à la

dissémination volontaire d’organismes génétiquement modifiés dans l’environnement et

abrogeant la Directive 90/220/CEE du Conseil

(JO L 106, 17.4.2001, p. 1)

Directive 90/219/CEE du Conseil, du 23 avril 1990, relative à l’utilisation confinée de micro-

organismes génétiquement modifiés

(JO L 117, 8.5.1990, p. 1)

Modifiée par :

Directive 98/81/CE du Conseil du 26 octobre 1998 modifiant la Directive 90/219/CEE relative

à l’utilisation confinée de micro-organismes génétiquement modifiés

(JO L 330, 5.12.1998, p. 13)

Règlement (CE) 258/97 du Parlement Européen et du Conseil du 27 janvier 1997 relatif aux

nouveaux aliments et aux nouveaux ingrédients alimentaires

(JO L 43, 14.2.1997, p. 1)

Règlement (CE) 178/2002 du Parlement Européen et du Conseil du 28 janvier 2002

établissant les principes généraux et les prescriptions générales de la législation alimentaire,

instituant l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments et fixant des procédures relatives à

la sécurité des denrées alimentaires

(JO L 31, 1.2.2002, p. 1)

Règlement (CE) 1139/98 du Conseil du 26 mai 1998 concernant la mention obligatoire, dans

l’étiquetage de certaines denrées alimentaires produites à partir d’organismes

génétiquement modifiés, d’informations autres que celles prévues par la Directive

79/112/CEE



(JO L 159, 3.6.1998, p. 4)

Directive 97/4/CE du Parlement Européen et du Conseil du 27 janvier 1997 modifiant la

Directive 79/112/CEE relative au rapprochement des législations des États Membres

concernant l’étiquetage et la présentation des denrées alimentaires ainsi que la publicité

faite à leur égard

(JO L 43, 14.2.1997, p. 21)

Directive 96/21/CE du Conseil, du 29 mars 1996, modifiant la Directive 94/54/CE de la

Commission relative à l’indication sur l’étiquetage de certaines denrées alimentaires d’autres

mentions obligatoires que celles prévues par la directive 79/112/CEE

(JO L 88, 5.4.1996, p. 5)

Directive 94/54/CE de la Commission, du 18 novembre 1994, relative à l’indication sur

l’étiquetage de certaines denrées alimentaires d’autres mentions obligatoires que celles

prévues dans la Directive 79/112/CEE du Conseil

(JO L 300, 23.11.1994, p. 14)

Règlement (CE) 49/2000 de la Commission, du 10 janvier 2000, modifiant le Règlement

(CE) 1139/98 du Conseil concernant la mention obligatoire, dans l’étiquetage de certaines

denrées alimentaires produites à partir d’organismes génétiquement modifiés, d’informations

autres que celles prévues par la Directive 79/112/CEE

(JO L 006, 11.1.2000, p. 13)

Règlement (CE) 50/2000 de la Commission, du 10 janvier 2000, concernant l’étiquetage des

denrées et ingrédients alimentaires contenant des additifs et arômes génétiquement

modifiés ou produits à partir d’organismes génétiquement modifiés

(JO L 006, 11.1.2000, p. 15)

Directive 89/397/CEE du Conseil, du 14 juin 1989, relative au contrôle officiel des denrées

alimentaires

(JO L 186, 30.06.1989, p. 23)

Directive 93/99/CEE du Conseil, du 29 octobre 1993, relative à des mesures additionnelles

concernant le contrôle officiel des denrées alimentaires

(JO L 290, 24.11.1993, p. 14)



Recommandation de la Commission du 25 janvier 2002 relative à un programme coordonné

pour le contrôle officiel des denrées alimentaires pour 2002 (2002/66/EC)

(JO L 26, 30.1.2002, p. 8)

Règlement (CE) 1829/2003 du Parlement Européen et du Conseil du 22 septembre 2003

concernant les denrées alimentaires et les aliments pour animaux génétiquement modifiés

(JO L 268, 18.10.2003, p. 1)

Règlement (CE) 1830/2003 du Parlement Européen et du Conseil du 22 septembre 2003

concernant la traçabilité et l’étiquetage des organismes génétiquement modifiés et la

traçabilité des produits destinés à l’alimentation humaine ou animale produits à partir

d’organismes génétiquement modifiés, et modifiant la Directive 2001/18/CE

(JO L 268, 18.10.2003, p. 24)

Règlement (CE) 641/2004 de la Commission du 6 avril 2004 fixant les modalités

d’application du Règlement (CE) 1829/2003 du Parlement Européen et du Conseil en ce qui

concerne la demande d’autorisation de nouvelles denrées alimentaires et de nouveaux

aliments pour animaux génétiquement modifiés, la notification de produits existants et la

présence fortuite ou techniquement inévitable de matériel génétiquement modifié ayant fait

l’objet d’une évaluation du risque et obtenu un avis favorable

(JO L 102, 7.4.2004, p. 14)

Directive 79/112/CEE du Conseil, du 18 décembre 1978, relative au rapprochement des

législations des États membres concernant l’étiquetage et la présentation des denrées

alimentaires destinées au consommateur final ainsi que la publicité faite à leur égard

(JO L 33, 8.2.1979, p. 1)

Règlement (CE) 65/2004 de la Commission du 14 janvier 2004 instaurant un système pour

l’élaboration et l’attribution d’identificateurs uniques pour les organismes génétiquement

modifiés

(JO L 10, 16.1.2004, p. 6)

Règlement (CE) 882/2004 du Parlement européen et du Conseil du 29 avril 2004 relatif aux

contrôles officiels effectués pour s'assurer de la conformité avec la législation sur les

aliments pour animaux et les denrées alimentaires et avec les dispositions relatives à la

santé animale et au bien-être des animaux

(JO L 165, 30.4.2004, p. 141)






Module 2

Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours

M. Querci

Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours 2


Table des matières

Module 2

Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours

COMMENT DETECTER LES OGM 3 AVANTAGES INHERENTS ET LIMITATIONS DES APPROCHES BASEES SUR L’ADN ET SUR LES

PROTEINES 4 REMARQUES GENERALES ET PRESENTATION DU MANUEL 7 REFERENCES 11



Comment détecter les OGM

Comme indiqué précédemment, les végétaux transgéniques se caractérisent par

l’insertion d’un nouveau gène (ou d’un nouvel groupe de gènes) dans leur génome.

Les nouveaux gènes sont ensuite transcrits et la nouvelle protéine est exprimée.

Ceci donne au végétal une nouvelle caractéristique telle que la résistance à certains

insectes ou la tolérance aux herbicides. La base de tout type de technologie de

détection d’OGM consiste à exploiter la différence entre la variété non modifiée et la

plante transgénique. Ceci peut se faire en détectant le nouvel ADN transgénique qui

a été introduit ou la nouvelle protéine exprimée ou, si la protéine joue le rôle

d’enzyme, en procédant à une analyse chimique pour détecter le produit de la

réaction enzymatique.

Deux approches scientifiques sont généralement utilisées aujourd’hui pour détecter

la modification génétique dans des cultures telles que le soja, le blé, le coton et

d’autres. L’une d’elles, ELISA (essai d’immunoabsorption enzymatique), implique la

recherche de la présence de protéines spécifiques en exploitant la spécificité de

liaison entre l’antigène exprimé et l’anticorps cible ; l’autre, la PCR (réaction de

polymérisation en chaîne), repose sur la détection de nouvelles séquences d’ADN

insérées dans le génome de plantes cultivées. Ces méthodes révèlent l’absence ou

la présence d’OGM dans l’échantillon, mais peuvent aussi fournir une indication sur

la quantité (pourcentage) présente dans un échantillon testé.

La première méthode validée au niveau de l’UE était une technique de contrôle

basée sur la PCR qui permettait de détecter la plupart des OGM actuellement

approuvés pour la commercialisation (Lipp et al., 1999). Mise au point par Pietsch et

al. (1997), cette méthode repose sur la détection des séquences de contrôle qui

accompagnent le gène nouvellement introduit, en l’occurrence le promoteur 35S et le

terminateur nos. La validation a été coordonnée par l’Unité Produits Alimentaires et

Biens de Consommation de l’IPSC du Centre Commun de Recherche, et exécutée

en collaboration avec l’Institut des Matériaux et des Mesures de Référence (IRMM)

du CCR, qui était responsable de la production de matériaux de référence certifiés.

Comme indiqué ci-dessus, des efforts de recherche ont été également dirigés vers le

développement de méthodes reposant sur les protéines. Une méthode très

spécifique à l’examen du soja Roundup Ready® basée sur le test ELISA a été

validée (Lipp et al., 2000), tandis que d’autres ont été mises au point

(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).



Avantages inhérents et limitations des approches basées sur l’ADN et sur les protéines

L’approche basée sur l’ADN

L’utilisation des méthodes analytiques basées sur la technologie PCR pour détecter

des séquences d’ADN associées aux OGM est de plus en plus courante.

La PCR permet d’amplifier sélectivement des fragments spécifiques d’ADN qui se

trouve en faible quantité dans un mélange complexe d’autres séquences d’ADN.

Dans la PCR, les petits éléments d’ADN complémentaires sont appelés des amorces

et s’utilisent en paires. Ces amorces sont conçues pour s’hybrider sur des sites de

reconnaissance de séquence complémentaires situés sur le brin opposé du gène

d’intérêt. Par le biais d’une série de cycles thermiques différentiels répétitifs, un

enzyme de polymérase d’ADN aide à répliquer et à amplifier la séquence de manière

exponentielle entre la paire d’amorces. Ces gènes amplifiés sont enfin soumis à une

électrophorèse sur gel standard de manière à pouvoir en détecter la présence en se

basant sur la détermination de leur taille.

Diverses méthodes basées sur la PCR ont été élaborées dans le but de détecter et

de quantifier les OGM dans des espèces cultivées pour l’alimentation humaine et

animale. La détermination de l’identité génétique permet, en outre, la ségrégation et

la traçabilité (préservation de l’identité) sur toute la chaîne d’approvisionnement des

cultures GM.

Afin de pouvoir détecter les OGM, il est essentiel de connaître le type de modification

génétique, notamment la constitution moléculaire du gène introduit et les éléments

régulateurs connexes (promoteurs et terminateurs). Une quantité minimale du

matériau d’échantillon contenant un ADN intact comportant le gène cible s’impose

pour pouvoir procéder à l’analyse.

La PCR est une technique de laboratoire qui nécessite un personnel formé et un

équipement spécialisé.

Les caractéristiques principales du diagnostic PCR sont, entre autres, les suivantes :

- Il peut être extrêmement sensible, capable de détecter une ou plusieurs répliques

d’un gène ou d’une séquence cible d’intérêt dans le matériel génétique complet d’un

organisme (ou génome). Cette sensibilité élevée a pour résultat que des taux de

contamination accidentelle très faibles peuvent produire de faux positifs. En

conséquence, il est très important de veiller à prévenir toute contamination croisée.



- Par rapport aux essais immunologiques (synthèse de l’amorce par rapport à la

production d’anticorps), il requiert un temps de développement par réactif

relativement limité.

- La plupart des réactifs nécessaires sont disponibles dans le commerce et peuvent

être aisément obtenus auprès d’un grand nombre de fournisseurs. Une licence est

toutefois parfois réclamée afin de pouvoir utiliser certains de ces réactifs dans des

applications diagnostiques commerciales.

- L’analyse de l’échantillon prend environ un jour.

- La PCR peut établir une distinction entre divers types de modification génétique

(également appelés « événements de transformation ») si elle est correctement

développée. Les méthodes diagnostiques permettant d’identifier des événements de

transformation spécifiques requièrent un temps de développement et des efforts de

validation supplémentaires.

L’approche basée sur les protéines La méthode de test basée sur les protéines utilise des anticorps spécifiques à la

protéine d’intérêt. Le test ELISA détecte ou mesure la quantité de protéine d’intérêt

présente dans un échantillon, lequel peut en contenir diverses autres. Le test ELISA

utilise un anticorps unique pour établir la liaison avec la protéine spécifique, un

second anticorps pour amplifier la détection (facultatif) et un anticorps conjugué à un

enzyme dont le produit génère une réaction colorée facile à visualiser et à quantifier

en la comparant à une courbe standard de la protéine d’intérêt.

Pour être correct, l’essai doit être exécuté par un personnel dûment formé sur un

équipement spécialisé.

Les caractéristiques principales du test ELISA sont les suivantes :

- Une moins grande sensibilité que la PCR et donc un moins grand risque de « faux

positifs » induits par de faibles niveaux de contamination.

- Des coûts en amont élevés pour le développement des essais et la génération des

anticorps et des protéines de référence.

- Un coût peu élevé par échantillon à partir du moment où les réactifs sont

développés.

- Il ne peut établir de différence entre des modèles et des modes d’expression

différents entre divers événements transgéniques exprimant des caractéristiques

protéiniques similaires.

- Les méthodes basées sur les protéines ont un temps de production important pour

le développement des réactifs et la mise au point de la méthode.



- Les essais basés sur les protéines constituent une méthode de test efficace et

pratique lorsqu’une protéine détectable est produite. Certains produits issus de

modification génétique ne s’expriment cependant qu’au cours de certains stades de

développement ou dans certaines parties du végétal et il est, dès lors, improbable

qu’un test ELISA permette une détection aisée de ces OGM. La transformation

industrielle dénature, par ailleurs, facilement les protéines, ce qui peut poser

problème lors de l’utilisation de la méthode ELISA pour analyser des fractions

d’aliments transformés.

Compte tenu de tous ces éléments, il est clair que le test ELISA et la PCR devraient

être considérés comme complémentaires plutôt que comme des méthodes

s’excluant l’une l’autre.

Tableau 1 : synthèse comparative des méthodes ELISA et PCR

Méthode Élément testé

Durée Facilité d’utilisation Résultats

ELISA Protéine 2 à 8 heures Moyenne ; nécessite une familiarité avec les pratiques de laboratoire ; les tests sont spécifiques et varient en fonction de la culture et de la variété.

Confirment la modification génétique spécifique et permettent de quantifier.

PCR ADN 1 à 3 jours Difficile ; nécessite un équipement et une formation spécialisés.

Très sensibles avec un risque de faux positifs ; confirment la présence d’ADN GM et permettent de quantifier.



Remarques générales et présentation du manuel

La méthode de validation est capitale tant pour les laboratoires que pour les

autorités de contrôle. Dans l’idéal, le contrôle de la performance de chaque méthode

devrait être confirmée par un nombre limité de laboratoires spécialisés afin d’obtenir

des résultats reproductibles, sensibles et spécifiques. Le Centre Commun de

Recherche de la Commission Européenne a été le premier à valider l’utilisation des

méthodes ELISA et PCR pour tester les matières premières composées de soja

Roundup Ready® et d’une méthode PCR pour le maïs Maximizer (Bt-176) et à

valider une méthode PCR pour le soja Roundup Ready® et le maïs Maximizer (Bt-

176) dans des fractions d’aliments transformés (Lipp et al., 1999, 2000 et 2001).

Depuis lors, plusieurs autres méthodes d’analyse qualitative et quantitative ont été

développées et validées. Afin d'obtenir des informations actualisées sur les

méthodes validées en vue de la détection et la quantification d’OGM, veuillez

consulter le site : http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm. La

préparation d’un échantillon est essentielle pour la détection et la quantification tant

avec la méthode basée sur l’ADN qu’avec celle reposant sur la protéine. Il est

important de connaître les limitations de chaque procédure en fonction de la réponse

souhaitée (ex. : qualitative ou quantitative). Tant la taille de l’échantillon que les

procédures d’échantillonnage influencent considérablement les conclusions à tirer de

chacune de ces méthodes de test.

Une exigence fondamentale pour chacune des méthodes de détection est la

disponibilité de matériaux de référence certifiés. Produits par l’IRMM du CCR

(Trapmann et al., 2002 et 2001), les échantillons utilisés durant la formation sont des

matériaux de référence certifiés. Les caractéristiques et les certificats

correspondants sont présentés dans le module 3. Un autre élément critique, sur

lequel nous ne nous attarderons pas durant ce cours, mais qu’il est important de

mentionner, est l’homogénéisation de l’échantillon.

La Figure 1 résume les différentes étapes suivies durant le cours. L’extraction d’ADN optimisée est fondamentale pour garantir la présence et la qualité de l’ADN

extrait et amplifiable par le biais de la PCR. Cet aspect est particulièrement

important, car la majorité des denrées alimentaires présentes sur le marché et

fabriquées à partir de soja ou de maïs ont subi une importante transformation. Il est

notoire que l’ADN peut se dégrader considérablement durant la transformation

alimentaire, en particulier sous l’influence d’un traitement thermique effectué en

présence d’eau. Plus l’aliment est transformé, plus la quantité de fragments d’ADN



suffisamment longs et renfermant, à l’état intact, la cible dont on a besoin pour

détecter des OGM dans l’aliment transformé, risque d’être limitée. Une méthode

d’extraction d’ADN adéquate et correcte devrait, en outre, veiller à supprimer les

substances inhibitrices présentes dans l’échantillon. Ce point sera abordé dans le

module 4. Plusieurs méthodes d’extraction de l’ADN ont été élaborées et diverses

entreprises commerciales ont mis au point des kits spécialisés, prêts à l’emploi. La

performance et la validité des différents protocoles disponibles seront présentés

durant le cours. Afin d’éviter toutes implications directes avec une quelconque firme

commerciale, il a toutefois été décidé de procéder à l’extraction d’ADN en utilisant la

méthode au CTAB, un protocole validé et souple qui a fait ses preuves avec une

grande variété de matrices.

Après l’extraction d’ADN, les échantillons (ainsi que les produits de la PCR) seront

analysés par l’électrophorèse sur gel d’agarose (module 5).

Les principes, les avantages et les inconvénients de la réaction de polymérisation en chaîne seront présentés dans le module 6.

Comme mentionné ci-dessus, l’utilisation efficace de techniques modernes pour la

détection d’OGM dépend de la disponibilité d’informations précises. La détection

d’OGM nécessite au minimum une connaissance partielle de la séquence génétique

cible et du type de modification génétique. Les caractéristiques spécifiques des

lignées transgéniques du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup

Ready® seront présentées dans le module 7.

Différentes approches de la PCR ont été élaborées pour la détection d’OGM

autorisés. La spécificité de la PCR dépend du choix précis des amorces. Les

amorces de PCR peuvent être dirigées vers différents éléments utilisés dans le

processus de transformation. Une « vaste gamme » de systèmes de détection PCR,

généralement appelés « méthodes de criblage », peut être obtenue en désignant des

amorces spécifiques aux séquences les plus fréquemment utilisées dans la

transformation. Il s’agit généralement de séquences régulatrices (promoteurs et

terminateurs). Des végétaux génétiquement modifiés peuvent aussi être subdivisés

en « catégories » en fonction du gène structurel qui y est inséré. Un moyen

supplémentaire pour diriger la spécificité de la réaction consiste à choisir des

amorces spécifiques aux séquences d’ADN situées dans divers éléments génétiques

(par exemple, promoteur-gène structurel ou gène structurel-terminateur). Enfin, pour

autant que l’on dispose d’informations spécifiques et complètes sur la séquence afin

d’obtenir des méthodes réellement spécifiques à une plante génétiquement modifiée,

il est possible de mettre au point des systèmes « spécifiques de la lignée » (ou de

l’événement de transformation) en sélectionnant une combinaison de séquences



« uniques » présentes exclusivement dans cette lignée transformée. Pour y parvenir,

on conçoit des amorces s’hybridant dans la région de l’ADN qui établit la jonction

avec le site d’insertion. La jonction entre l’ADN inséré (ADN-T) et l’ADN hôte offre

une séquence de nucléotides unique qui constitue une cible idéale pour la réalisation

d’un test PCR très spécifique. Les méthodes utilisées durant le cours sont résumées

dans la Figure 1 et seront décrites en détail dans le module 8. La partie

expérimentale des méthodes et des protocoles est reprise dans le module 9.

Comme indiqué ci-dessus, la nécessité de quantifier la quantité d’OGM présents

dans un échantillon a conduit au développement de nombreux protocoles basés sur

la PCR, qui fournissent non seulement une réponse qualitative (présence/absence),

mais aussi une indication plus ou moins précise (en fonction de la méthode choisie)

de la quantité relative d’OGM présents dans un échantillon donné. Les deux

approches basées sur l’ADN les plus courantes sont la PCR compétitive et la PCR en temps réel (module 10). Cette dernière s’effectue à l’aide d’instruments

spécifiques et sophistiqués qui ne sont disponibles actuellement qu’auprès de

quelques entreprises commerciales. Les protocoles qui seront appliqués durant la

formation sont décrits dans le module 11.

Enfin, le module 12 présente, dans les grandes lignes, l’approche sérologique de la

détection d’organismes génétiquement modifiés. La technique ELISA y sera en

particulier exposée, tandis que le protocole permettant d’exécuter un test ELISA

spécifique au Roundup Ready® sera détaillé.



Non exécutée durant le

cours Matériaux bruts et matériaux transformés

PCR des gènes de la lectine pour le soja et de la zéine pour le maïs

ADN végétal présent Pas d’ADN végétal détectable

Détection d’éléments régulateurs (promoteur 35S et terminateur nos)

Végétal GM Végétal non GM

Figure 1 : schéma des méthodes appliquées durant le cours

Extraction d’ADN

Contrôle de l’ADN du végétal par PCR

+

PCR de dépistage

Homogénéisation de l’échantillonnage

-

+ -

Détection spécifique d’OGM par la PCR nichée

Quantification de l’OGM par la PCR

en temps réel

Quantification de l’ADN par

spectrophotométrie

Détection d’OGM avec la méthode

ELISA



Références

Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for

detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food

fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC

International 83, 919–927.

Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and

Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction

for the detection of genetically modified organisms in various processed

foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC

collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and

maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.

Pietsch, K., Waiblinger, H.-U., Brodmann, P. and Wurz, A. (1997). Screening-

Verfahren zur Identifizierung „gentechnisch veränderter” plfanzlicher

Lebensmittel. Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35–38.

Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,

Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,

Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. and Anklam, E.

(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soja powder with

different mass fractions of Roundup Ready™ soja. Certified Reference Materials

IMMR-410S.

(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta

chements/ERM-BF410_report.pdf). (Dernière connection Janvier 2010)

Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,

Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). The

certification of reference materials of dry mixed maize powder with different mass

fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IMMR-413.








Module 3


M. Querci, N. Foti

Échantillons utilisés durant le cours 2


Table des matières

Module 3


MATERIAUX DE REFERENCE CERTIFIES 3 COMPOSITION DES MATERIAUX BRUTS ET TRANSFORMES DISTRIBUES AUX PARTICIPANTS 4 LISTE DES ECHANTILLONS DISTRIBUES DURANT LE COURS 6 RESULTATS ESCOMPTES PAR PCR 6 REFERENCES 7




Durant le cours, nous testerons différentes méthodes permettant de détecter la

présence de maïs MON810 et de soja Roundup Ready® dans divers matériels. Pour

cela nous utiliserons des mélanges de maïs (MON810) et de graines de soja (soja

Roundup Ready®) GM et non GM respectivement en différentes concentrations.

Deux types de matériau seront utilisés :

• d’une part, des matériels de référence certifiés

• et d’autre part, différents matériels bruts et transformés qui seront distribués

aux participants.

Matériels de Référence Certifiés

Les extraits de végétaux bruts qui seront utilisés durant le cours sont des Matériels

de Référence Certifiés (CRM) IRMM-410S (soja Roundup Ready®) et IRMM-413

(maïs MON810). L’IRMM-410S et l’IRMM-413 se composent deux séries de CRM à

base de poudre déshydratée de soja et de maïs respectivement avec différentes

fractions de masse (0, 0,1, 0,5, 1, 2 et 5%) de poudre déshydratée préparée à partir

de soja Roundup Ready® et de maïs MON810 génétiquement modifiés. Les CRM

ont été fabriqués par l’Institut de Matériaux et de Mesures de Référence (IRMM -

http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm) pour le compte de Fluka Chemie

AG (Buchs, Suisse) dans le cadre d’une collaboration avec l’Institut de la Santé et de

la Protection des Consommateurs (IHCP -http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) du Centre

Commun de Recherche de la Commission Européenne (Ispra, Italie) (Trapmann et

al., 2002 et 2001). Ces matériels servent à valider les méthodes utilisées pour

détecter les aliments génétiquement modifiés. Vu que la quantification de l’ADN ou

des protéines peut dépendre des variétés, il convient de faire preuve de prudence au

moment de tirer des conclusions quantitatives à partir des mesures effectuées sur

des échantillons inconnus.

La poudre de soja déshydratée à base de Roundup Ready® génétiquement modifié

est produite à partir de graines entières d’une lignée de soja non modifiée (Asgrow

A1900) et de soja Roundup Ready® 40-3-2 issu de l’événement génétiquement

modifié (lignée Asgrow AG5602 RR). La poudre de maïs déshydratée à base de

maïs GM MON810 a été obtenue à partir de grains entiers du cultivar DK512 non

modifié et du cultivar MON810 DK513.



Composition des matériels bruts et transformés distribués aux participants

Nous testerons différents matériels : des biscuits, des petits gâteaux cuits, des en-

cas écrasés et de la farine.

Matériels bruts

Farine mélangée : afin d’obtenir 0,5% de chaque événement OGM (poids total sec),

1% de soja RR (IRMM-410S) a été ajouté à 1% de maïs MON810 (IRMM-413). 50

mg des deux farines ont été pesés et ajoutés directement dans des tubes de réaction

prêts pour l’extraction d’ADN. La farine MON810 à 1% est un matériau de référence

certifié IRMM-413 (1% de maïs MON810).

En-cas écrasés Cet échantillon est tiré de tests d’aptitude de détection d’OGM (système GeMMA,

Round 06, matériel de test GMO-06B). Le matériau a été préparé à partir d’en-cas

déshydraté à base de soja sans GM disponibles dans le commerce et d’en-cas à

base de soja GM.

En-cas écrasé

1372 g d’en-cas écrasé sans GM, 28 g d’en-cas écrasé avec GM

Avant d’être malaxés, les deux matériels ont été moulus, puis tamisés afin d’obtenir

un mélange de mie homogène, puis mélangés pendant la nuit. Le mélange a enfin

été malaxé pendant environ une heure dans un malaxeur rotatif. Les matériels ont

été conservés à -20 °C.

Biscuits Le matériel a été produit par l’Institut de la santé et de la protection des

consommateurs du CCR et utilisé en vue de valider une méthode PCR pour le soja

Roundup Ready® et pour le maïs Maximizer (Bt-176) dans des fractions d’aliment

transformé (Lipp et al., 2001).

Le soja déshydraté et la farine extraite du maïs ont été pesés et mélangés avec les

autres ingrédients dans les proportions indiquées ci-dessous.

Les ingrédients ont été soigneusement mélangés avec 600 ml d’eau jusqu’à

obtention d'une masse homogène.



Biscuits n° 1

250 g de maïs (0% d’OGM), 250 g de soja (0% d’OGM), 300 g de farine de

froment, 200 g de sucre, 100 g de beurre, 10 g de sel, 16 g de poudre

fermentante à la vanille, 2 œufs

Celle-ci a ensuite été étalée uniformément sur une plaque de cuisson, puis cuite

pendant 10 minutes dans un four à chaleur tournante préchauffé à 180°C. La masse

a été retirée du four, couverte en vue d’éviter toute contamination et mis à refroidir

jusqu’à température ambiante. La conservation s’est faite à -20°C.

Poudre de lait de soja Cet échantillon provient du test d’aptitude de détection d’OGM Round 05 GeMMA.

1 700 g de poudre de lait de soja d’origine américaine ont été mélangés pendant

toute la nuit avec 300 g d’isolat de protéine de soja Roundup Ready®. Des sous-

échantillons individuels (10 g) ont été dispersés dans des récipients en plastique

fermés par un bouchon à visse, puis stockés à température ambiante avant la

distribution.

Biscuits MON810 Ce matériel est issu de la fabrication de l’unité Biotechnologie et OGM du CCR.

De la farine extraite de maïs déshydraté a été pesée et mélangée aux autres

ingrédients dans les proportions indiquées ci-dessous.

Biscuits MON810

200 g de farine de froment, 100 g de farine de maïs* (2*% OGM), 150 g de

sucre, 100 g de beurre, 1 œuf

* La farine de maïs MON810 à 2% a été obtenue en ajoutant de la farine de maïs

conventionnel à de la farine 100% MON810 et en malaxant le tout pendant 30

minutes.

Les ingrédients ont été soigneusement mélangés, puis étalés uniformément sur une

plaque et cuits pendant 10 minutes dans un four à chaleur tournante préchauffé à

180°C. Le matériel a ensuite été retiré du four, puis couvert pour éviter la

contamination et mis à refroidir jusqu’à température ambiante. La conservation s’est

faite à 4°C aussi longtemps que nécessaire.



Liste des échantillons distribués durant le cours

Caractéristiques % d’OGM (ingrédient spécifique)

Échantillon

Soja RR Maïs MON810

Biscuits #1 0% 0% Farine mélangée 1% 1% Farine MON810 - 1% En-cas écrasé 2,2% - Poudre de lait de soja 8,9% - Biscuits MON810

- 2%

Résultats escomptés par la PCR

Échantillon zéine lectine 35S nos E35S/hsp70(b) CTP/EPSPS

IRMM- 410S-0 (0%) - + - - - - IRMM- 410S-1 (0,1%) - + + + - + IRMM- 410S-2 (0,5%) - + + + - + IRMM- 410S-3 (1%) - + + + - + IRMM- 410S-4 (2%) - + + + - + IRMM- 413-0 (0%) + - - - - - IRMM- 413-1 (0,1%) + - + - + - IRMM- 413-2 (0,5%) + - + - + - IRMM- 413-3 (1%) + - + - + - IRMM- 413-4 (2%) + - + - + - Biscuits #1 + + - - - - Farine mélangée + + + + + + Farine MON810 + - + - + - En-cas écrasé - + + + - + Poudre de lait de soja - + + + - + Biscuits MON810

+ - + - + -



Références








Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,

Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,

Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. and Anklam, E.

(2002). The certification of reference materials of dry-mixed soja powder with

different mass fractions of Roundup Ready™ soja. Certified Reference Materials

IRMM-410S.



Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,

Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). The

certification of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass

fractions of MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413.



GeMMA Scheme-GMO analysis Round 06. GMO Proficiency Testing, (October

2001). Report N. GMO 06.

GeMMA Scheme-GMO analysis Round 05. GMO Proficiency Testing, (October

2001). Report N. GMO 05.






Module 4

Extraction et purification de l’ADN

M. Somma

Extraction et purification de l’ADN 2


Table des matières

Module 4

Extraction et purification d’ADN

INTRODUCTION 3

METHODES D’EXTRACTION 4 METHODES DE PURIFICATION 4 METHODE D’EXTRACTION ET DE PURIFICATION AU CTAB 6 QUANTIFICATION DE L’ADN PAR SPECTROPHOTOMETRIE 9 PRINCIPES DE LA DETERMINATION SPECTROPHOTOMETRIQUE DE L’ADN 10 DETERMINATION DE LA CONCENTRATION EN ACIDES NUCLEIQUES 11 EXPERIENCE 14

REFERENCES 18



Introduction

L’extraction et la purification des acides nucléiques sont les premières étapes dans la

plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les techniques d’ADN

recombinant. L’objectif des méthodes d’extraction des acides nucléiques dans le cas

présent est d’obtenir des acides nucléiques purifiés, tirés de sources diverses, afin

de pouvoir mener une analyse spécifique de détection d’OGM en utilisant la réaction

de polymérisation en chaîne (PCR). La qualité et la pureté des acides nucléiques

comptent parmi les facteurs les plus critiques pour l’analyse PCR. Afin d’obtenir des

acides nucléiques hautement purifiés exempts de tout contaminant visibles, des

méthodes d’extraction adéquates devraient être appliquées. Les contaminants

susceptibles d’inhiber la réaction PCR sont énumérés dans le Tableau 1. Afin d’éviter

un résultat « faux-négatif » du fait de la présence d’inhibiteurs de PCR dans

l’échantillon, il est vivement recommandé de réaliser une expérience de contrôle

visant à tester l’inhibition de la PCR. On recourt généralement à cette fin à une

analyse PCR spécifique pour les végétaux (eucaryotes ou chloroplastes) ou

spécifique à l’espèce.

Tableau 1. Quelques inhibiteurs de la PCR

Inhibiteur Concentration inhibitriceSDS > 0,005% Phénol > 0,2% Éthanol > 1% Isopropanol > 1% Acétate de sodium > 5 mM Chlorure de sodium > 25 mM EDTA > 0,5 mM Hémoglobine > 1 mg/ml Héparine > 0,15 i.m/ml Urée > 20 mM Mélange de réactifs > 15%

Vu qu’il existe une grande diversité de méthodes d’extraction et de purification des

acides nucléiques, le choix de la technique la plus adéquate repose généralement

sur les critères suivants :

• L’acide nucléique cible,

• L’organisme source,

• Le matériel de départ (tissu, feuille, graine, matériel transformé, etc.),

• Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de purification requis, etc.),



• L’application en aval (PCR, clonage, étiquetage, transfert d’ADN, RT-PCR,

synthèse d’ADNc, etc.)

Les principes de certaines des méthodologies les plus utilisées aujourd’hui pour

extraire et purifier des acides nucléiques sont décrits dans les sections suivantes.

Méthodes d’extraction

L’extraction d’acides nucléiques d’un matériau biologique requiert la lyse cellulaire,

l’inactivation des nucléases cellulaires et la séparation de l’acide nucléique souhaité

de débris cellulaires. La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de

techniques et doit être suffisamment rigoureuse pour briser le matériau de départ

complexe (par exemple, le tissu), mais suffisamment douce pour préserver l’acide

nucléique cible. Les procédures de lyse courantes sont les suivantes :

• le rupture mécanique (ex. : broyage ou lyse hypotonique),

• le traitement chimique (ex.: lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des

thiols)

• et la digestion enzymatique (ex.: protéinase K).

La rupture de la membrane et l’inactivation des nucléases intracellulaires peuvent

être combinées. À titre d’exemple, une solution simple peut contenir des détergents

pour solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour

inactiver les enzymes intracellulaires. Après la lyse cellulaire et l’inactivation du

nucléase, les débris cellulaires peuvent être aisément retirés par filtrage ou par

précipitation.

Méthodes de purification

Les méthodes de purification des acides nucléiques issus d’extraits cellulaires sont

généralement des combinaisons de deux ou plusieurs des techniques suivantes :

• extraction/précipitation,

• chromatographie,

• centrifugation et

• séparation par affinité.

Une brève description de ces techniques sera donnée dans les paragraphes suivants

(Zimmermann et al., 1998).



Extraction/Précipitation

L’extraction par solvants est souvent utilisée pour éliminer les contaminants d’acides

nucléiques. À titre d’exemple, une combinaison de phénol et de chloroforme sert

fréquemment à supprimer les protéines. La précipitation par l’isopropanol ou l’éthanol

est généralement utilisée pour concentrer les acides nucléiques. Si la quantité

d’acides nucléiques cibles est faible, un véhicule inerte (tel que le glycogène) peut

être ajouté au mélange afin d’accroître l’efficacité de la précipitation. D’autres

méthodes de précipitation des acides nucléiques incluent la précipitation sélective à

l’aide de fortes concentrations de sel (« relargage ») ou la précipitation de protéines

en utilisant les changements au niveau du pH.

Chromatographie

Les méthodes chromatographiques peuvent utiliser différentes techniques de

séparation, telles que la filtration sur gel, l’échange d’ions, l’adsorption sélective ou la

liaison par affinité. La filtration sur gel exploite les propriétés du tamisage moléculaire

de particules de gel poreuses. Une matrice avec des pores d’une taille définie permet

aux petites molécules de traverser les pores par diffusion, tandis que les plus

grosses molécules sont exclues et éluées. Les molécules sont donc éluées afin de

diminuer la taille moléculaire. La chromatographie par échange d’ions est une autre

technique qui a recours à l’interaction électrostatique entre une molécule cible et un

groupe fonctionnel sur la matrice à colonne. Les acides nucléiques (polyanions

linéaires à forte charge négative) peuvent être élués des colonnes d’échange d’ions

grâce à de simples tampons de sel. Dans la chromatographie par adsorption, les

acides nucléiques sont fixés sélectivement par adsorption sur des silices ou du verre

en présence de certains sels (ex. : des sels chaotropiques), alors que d’autres

molécules biologiques ne se fixent pas. Un tampon ou une eau faible en sels peut

ensuite éluer les acides nucléiques et produire ainsi un échantillon à utiliser

directement dans des applications en aval.

Centrifugation

La centrifugation sélective est une méthode de purification puissante. À titre

d’exemple, l’ultracentrifugation isopycnique en gradients de CsCl à des forces g

élevées a été longtemps utilisée pour la purification de plasmides. La centrifugation

est souvent combinée à une autre méthode. Un exemple d’une telle utilisation est la

chromatographie à colonne rotative qui combine la filtration sur gel et la

centrifugation afin de débarrasser l’ADN ou l’ARN des contaminants de plus petit



format (sels, nucléotides, etc.), pour l’échange de tampon ou pour la sélection de

taille. Certaines procédures combinent l’adsorption sélective sur matrice

chromatographique (cf. paragraphe ci-dessus « Chromatographie ») à l’élution

centrifuge pour purifier sélectivement un type d’acide nucléique.

Séparation par affinité

Ces dernières années, un nombre croissant de méthodes de purification ont combiné

l’immobilisation par affinité d’acides nucléiques à la séparation magnétique. À titre

d’exemple, des poly(A) + mARN peuvent être liés à des particules magnétiques

revêtues de streptavidine par des oligo(dT) marqués à la biotine et le complexe de

particules peut être extrait de la solution (et des contaminants non liés) à l’aide d’un

aimant. Cette technique à phase solide simplifie la purification de l’acide nucléique,

étant donné qu’elle peut remplacer plusieurs étapes de la centrifugation, de

l’extraction organique et de la séparation de phase par une opération de séparation

magnétique unique et rapide.

Méthode d’extraction et de purification au CTAB

élaboré pour la première fois par Murray et Thompson en 1980 (Murray et

Thompson, 1980), le protocole du test au cétyltriméthylammonium bromure (CTAB) a

été publié ultérieurement, et plus précisément en 1987, par Wagner et ses collègues

(Wagner et al., 1987). La méthode convient pour l’extraction et la purification d’ADN

de végétaux et d’aliments tirés des végétaux et convient particulièrement pour la

suppression des polysaccharides et des composés polyphénoliques qui affectent la

pureté de l’ADN et donc la qualité. Cette procédure a été largement appliquée dans

la génétique moléculaire des végétaux et a déjà été testée dans des essais de

validation dans le but de détecter les OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Plusieurs autres

variantes ont été élaborées dans le but d’adapter la méthode à une vaste plage de

matrices alimentaires brutes et transformées (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999;

Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001).

Principes de la méthode au CTAB : lyse, extraction et précipitation

Des cellules végétales peuvent être lysées en utilisant le détergent ionique

cétyltriméthylammonium bromure (CTAB), qui forme un complexe insoluble avec les

acides nucléiques dans un environnement à faible teneur en sels. Dans ces



conditions, les polysaccharides, les composés phénoliques et les autres

contaminants restent dans le liquide surnageant et peuvent être lavés. Le complexe

d’ADN est solubilisé en élevant la concentration en sels et précipité avec de l’éthanol

ou de l’isopropanol. Nous décrirons dans cette partie les principes des trois

principales étapes, à savoir la lyse de la membrane cellulaire, l’extraction de l’ADN

génomique et sa précipitation.

Lyse de la membrane cellulaire : comme nous l’avons mentionné précédemment,

la première étape de l’extraction d’ADN est la rupture de la cellule et de la membrane

nucléaire. À cette fin, l’échantillon homogénéisé est tout d’abord traité avec le

tampon d’extraction contenant de l’EDTA, du Tris/HCl et du CTAB. Toutes les

membranes biologiques ont une structure générale commune comprenant des

molécules de lipide et de protéines maintenues ensemble par des interactions non

covalentes.

Figure 1. Représentation simplifiée des membranes cellulaires1

Comme le montre la Figure 1, les molécules de lipides sont agencées sous forme de

double couche continue dans laquelle les molécules de protéine sont « dissoutes ».

Les extrémités des molécules de lipides se composent de « têtes » hydrophiles et de

« queues » hydrophobes. Dans la méthode au CTAB, la lyse de la membrane est

accomplie par le détergent (CTAB) contenu dans le tampon d’extraction. Comme la

composition des lipides et celle du détergent sont semblables, le composant CTAB

du tampon d’extraction a pour fonction de piéger les lipides qui constituent la cellule

et la membrane nucléique. Le mécanisme de solubilisation des lipides en utilisant un

détergent est illustré dans la Figure 2.

1 Les illustrations reprises sur cette page et sur les pages suivantes ont été mises à disposition par le Genetic Science Learning Center de l’université d’Utah, http://gslc.genetics.utah.edu.



Figure 2. Solubilisation des lipides

La Figure 3 montre comment le détergent piège les lipides et les protéines,

autorisant ainsi la libération de l’ADN génomique, lorsque la membrane cellulaire est

exposée au tampon d’extraction au CTAB. Dans une concentration salique (NaCl)

spécifique, le détergent forme un complexe insoluble avec les acides nucléiques.

L’EDTA est un composant de chélation qui lie le magnésium, entre autres métaux.

Le magnésium est un cofacteur pour la DNAse. En liant le Mg à l’EDTA, l’activité de

la DNAse présente est diminuée. La combinaison Tris/HCl donne à la solution une

capacité d’atténuation du pH (un pH faible ou un pH élevé endommage l’ADN). Il est

important de souligner qu’étant donné le risque de dégradation aisée des acides

nucléiques à ce stade de la purification, le temps écoulé entre l’homogénéisation de

l’échantillon et l’ajout de la solution tampon au CTAB devrait être limité. La

purification de l’ADN est réalisée dès que la cellule et les membranes de l’organelle

(comme celles qui entourent les mitochondries et les chloroplastes) sont séparées.

Figure 3 : rupture de la membrane cellulaire et extraction de l’ADN génomique

Extraction : dans cette phase, les polysaccharides, les composés phénoliques, les

protéines et les autres lysats cellulaires dissous dans la solution aqueuse sont

séparés du complexe acide nucléique / CTAB. L’élimination des polysaccharides,

ainsi que des composés phénoliques est particulièrement importante en raison de

leur capacité à inhiber un grand nombre de réactions enzymatiques. Dans une

concentration à faible teneur en sels (< 0,5 M NaCl), les contaminants du complexe



d’acide nucléique ne précipitent pas et peuvent être enlevés par l’extraction hors de

la solution aqueuse au moyen de chloroforme. Ce dernier dénature les protéines et

facilite la séparation des phases aqueuses et organiques. Normalement, la phase

aqueuse constitue la phase supérieure. Mais si la phase aqueuse est dense, en

raison de sa concentration en sels (> 0,5 M), elle constituera la phase inférieure.

L’acide nucléique aura, en outre, tendance à se dissoudre dans la phase organique

si le pH de la solution aqueuse n’a pas été équilibré comme il se doit à une valeur de

pH comprise entre 7,8 et 8,0. Au besoin, l’extraction au chloroforme est répété deux

ou trois fois afin d’enlever complètement les impuretés de la couche aqueuse. Pour

parvenir à la meilleure récupération possible de l’acide nucléique, une rétro-

extraction de la phase organique peut être réalisée à l’aide d’une solution aqueuse

qui est ajoutée ensuite à l’extrait précédent. Une fois que le complexe d’acide

nucléique a été purifié, la dernière étape de la procédure peut être accomplie. Il s’agit

de la précipitation.

Précipitation : à ce stade final, l’acide nucléique est libéré du détergent. À cette fin,

la solution aqueuse est tout d’abord traitée à l’aide d’une solution de précipitation

composée d’un mélange de CTAB et de NaCl à concentration élevée (> 0,8 M NaCl).

Le sel est indispensable à la formation d’un précipité d’acide nucléique. L’acétate de

sodium peut être préféré au NaCl pour sa capacité de tamponnage. Dans ces

conditions, le détergent, qui est plus soluble dans l’alcool que dans l’eau, peut être

élué, tandis que l’acide nucléique précipite. Le traitement successif par 70%

d’éthanol permet une purification ou élution supplémentaire des sels résiduels.

Quantification de l’ADN par spectrophotométrie

L’ADN, l’ARN, les oligonucléotides et même les mononucléotides peuvent être

mesurés directement dans des solutions aqueuses sous forme diluée ou non diluée

en mesurant l’absorption A (également définie comme état la densité optique, DO)

en lumière ultraviolette (mais aussi dans le spectre visible). Si l’échantillon est pur

(autrement dit, s’il ne contient pas de quantité significative de contaminants tels que

des protéines, du phénol ou de l’agarose), la mesure spectrophotométrique de la

quantité de rayons ultraviolets absorbés par les bases est une opération facile et

précise. L’idéal pour cette méthode sont des tampons aqueux à faibles

concentrations ioniques (par exemple, un tampon TE). La concentration d’acides

nucléiques est généralement déterminée par une mesure effectuée à 260 nm contre

un échantillon appelé « blanc ». L’interférence par des contaminants se reconnaît par



calcul d’un « ratio ». Les protéines absorbant à 280 nm, le ratio A260/A280 est utilisé

pour estimer la pureté de l’acide nucléique. L’ADN pur devrait avoir un ratio d’environ

1,8, tandis que l’ARN pur devrait avoir une valeur d’environ 2,0. L’absorption à 230

nm reflète la contamination de l’échantillon par des substances telles que les

hydrates de carbone, les peptides, les phénols ou les composés aromatiques. Dans

le cas d’échantillons purs, le ratio A260/A230 devrait être d’environ 2,2.

Une méthode alternative, en l’occurrence la méthode de la plaque d’agarose au

bromure d’éthidium, est utile lorsqu’on ne dispose que de faibles quantités d’acide

nucléique. La quantité d’acide nucléique peut être estimée par comparaison à une

gamme de concentrations en utilisant l’intensité de la fluorescence émise par le

bromure d’éthidium lorsque celui-ci est irradié par la lumière UV.

Principes de la détermination spectrophotométrique de l’ADN

Un spectrophotomètre utilise la transmission de la lumière à travers une solution

pour déterminer la concentration d’un soluté à l’intérieur de la solution. L’appareil

fonctionne suivant un principe simple dans lequel de la lumière d’une longueur

d’onde connue traverse un échantillon et où la quantité d’énergie lumineuse

transmise est mesurée à l’aide d’une cellule photoélectrique placée de l’autre côté de

l’échantillon.

Comme le montre la Figure 4, la conception du spectrophotomètre à simple faisceau

implique l’utilisation d’une source lumineuse, d’un prisme, d’un support d’échantillon

et d’une cellule photoélectrique. Les mécanismes électriques ou mécanismes

adéquats pour contrôler l’intensité d’éclairage, la longueur d’onde et la conversion

d’énergie reçue au niveau de la cellule photoélectrique à diverses tensions sont

reliés à chacun des composants. La fluctuation des tensions s’affiche ensuite sur une

échelle exprimée en mètres ou est enregistrée sur un ordinateur à l’aide d’une

connexion en vue d’un examen ultérieur.

Figure 4. Représentation schématique de la transmission lumineuse



Toutes les molécules absorbent de l’énergie radiante à une longueur d’onde

spécifique à partir de laquelle il est possible d’extrapoler la concentration d’un soluté

à l’intérieur d’une solution. Selon la loi de Beer-Lambert, il existe une relation linéaire

entre l’absorption A (également appelée densité optique, DO) et la concentration de

la macromolécule qui est donnée par l’équation suivante :

A = OD = εlc, (1)

où ε est égal au coefficient d’extinction molaire, c indique la concentration et l

représente la longueur de parcours de la cuvette. Les protéines et les acides

nucléiques absorbent la lumière dans la plage des ultraviolets dans des longueurs

d’onde comprises entre 210 et 300 nm. Comme expliqué précédemment,

l’absorbance maximale de solutions ADN et ARN est fixée à 260 nm, tandis que

l’absorbance maximale de solutions à base de protéines est de 280 nm. Dès lors,

tant les solutions d’ADN que les solutions d’ARN absorbent partiellement la lumière à

280 nm, tandis que les solutions de protéines l’absorbent partiellement à 260 nm. Le

ratio entre les valeurs à 260 nm et à 280 nm (A260/A280) fournit une estimation du

degré de pureté des acides nucléiques. Des préparations pures d’ADN et d’ARN ont

des valeurs à A260/A280 de 1,8 et 2,0 respectivement. Sur une longueur de parcours

de 10 mm avec une longueur d’onde de 260 nm, l’absorption A = 1 correspond à

environ 50 µg/ml de dsADN, environ 37 µg/ml de ssADN, 40 µg/ml d’ARN ou environ

30 µg/ml d’oligonucléotides. En cas de contamination par une protéine, le rapport

A260/A280 sera nettement inférieur aux valeurs données ci-dessus et une

quantification précise de la quantité d’acide nucléique ne pourra être envisagée. Il est

important de préciser ici que des impuretés dans les solutions d’ADN provoqués par

l’ARN ne peuvent être identifiées de manière fiable par la spectrophotométrie. Une

absorbance de 325 nm peut être utilisée pour indiquer la présence de débris dans la

solution ou révéler que la cuvette elle-même est sale.

Détermination de la concentration en acides nucléiques

Choix de la cuvette : la quantité de solution d’acide nucléique utilisée pour mesurer

l’absorbance A dépend de la capacité de la cuvette. Pour être adéquate, la cuvette

devrait être sélectionnée en fonction du taux de concentration de l’échantillon, du

facteur de dilution et du volume d’échantillon disponible. Dans la majorité des

procédures utilisées pour détecter les OGM, le volume d’ADN génomique recueilli se

situe entre 50 et 100 µl. Plusieurs types de cuvette à microvolume, d’une capacité



comprise entre 5 et 70 µl, sont utilisés pour la quantification spectroscopique de

petits volumes d’acides nucléiques.

Réglage : afin de calibrer le spectrophotomètre, il est essentiel de :

• sélectionner la longueur de chemin optique de la cuve,

• choisir le bon facteur (faire une sélection entre dsADN, ssADN, ARN),

• mesurer une solution vierge (référence) constituée soit d’eau, soit d’une solution

tampon (A260 = 0),

• veiller à ce que la référence réglée soit renouvelée périodiquement,

• mesurer une quantité connue d’acide nucléique pur afin de contrôler la fiabilité de

la référence fixée.

Mesure d’un échantillon inconnu : en fonction de la capacité de la cuvette utilisée,

des quantités spécifiques de solution d’ADN sont utilisées afin d’évaluer la

concentration (par exemple, pour une cuvette d’une capacité inférieure à 0,2 ml, on

dilue 5 µl d’ADN dans 195 µl d’eau). Après étalonnage du spectrophotomètre et de la

solution d’acide nucléique à ajouter, la cuvette est bouchonnée, la solution est

mélangée et l’absorbance est mesurée. Afin de réduire les erreurs de pipetage, la

mesure devrait être répétée au minimum deux fois en utilisant à chaque fois 5 µl de

la solution d’ADN au minimum. Des valeurs A260 inférieures à 0,02 ou comprises

entre 1 et 1,5 (en fonction de l’instrument utilisé) ne sont pas recommandées en

raison du risque d’une marge d’erreur élevée.

La concentration c d’un acide nucléique spécifique présent dans une solution se

calcule à l’aide des équations suivantes :

• ADN monobrin: c(pmol/µl) = A260/0,027

• ADN à double brin: c(pmol/µl) = A260/0,020

• ARN monobrin c(pmol/µl) = A260/0,025

• Oligonucléotide: c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG + 0,84NT

où A260 désigne l’absorbance mesurée à 260 nm.

Un exemple de valeurs d’absorbance d’ADN dans un ris de veau (calf thymus)

hautement purifié en suspension dans un tampon de TNE (1x) en partant du principe

que l’ADN de référence est dsADN où A260 = 1 pour 50 µg/ml dans une cuvette d’une

longueur de parcours de 10 mm est illustré dans le Tableau 2. La concentration

nominale de l’ADN était de 25 µg/ml.



Tableau 2. Valeur d’absorbance de l’ADN de ris de veau hautement purifié dans un tampon de TNE (1x)

Longueur d’onde

Absorbance A260/A280 Conc. (µg/ml)

325 0,01 - - 280 0,28 - - 260 0,56 2,0 28 230 0,30 - -



Expérience

Matériel

REMARQUE Tout le matériel utilisé doit être stérilisé avant son utilisation et tout résidu d’ADN doit

être éliminé. Afin d’éviter toute contamination, il est recommandé d’utiliser des

embouts de pipette stériles avec barrière aérosol.

• Instruments réducteurs tels qu’une lame de scalpel stérile ou un mortier

• Bain-marie ou bloc chauffant

• Microcentrifugeuse

• Micropipettes

• Mixer Vortex

• Tubes de 1,5 ml pour microcentrifugeuse

• Plateaux de pesage ou équivalents

• Spatules

• Une balance d’une précision de 0,01 g

• Tigettes

• Rack pour tubes de microcentrifugeuse

• Facultatif: dessiccateur sous vide pour sécher les culots d’ADN

Réactifs

REMARQUE Tous les produits chimiques devraient être de qualité de biologie moléculaire. L’eau

déionisée et les tampons devraient être stérilisés à l’autoclave avant leur utilisation.

Tous les produits chimiques devraient, en outre, être exempts d’ADN et d’ADNase.

• Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) CAS 124-03-8

• Chloroforme

• Isopropanol

• Na2EDTA CAS 6381-92-6

• Éthanol

• NaCl



• Protéinase K

• RNAse A

• Hydrochlorure de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris-HCl)

• Eau déionisée stérile

Tampon au CTAB

20 g/l CTAB 4 g

1,4 M NaCl 16,4 g

0,1 M Tris-HCl 3,5 g

20 mM Na2EDTA 1, g

• Ajoutez 100 ml d’eau déionisée.

• Ajustez le pH à 8,0 en ajoutant 1M NaOH.

• Complétez pour obtenir 200 ml et stérilisez.

• Conservez le tampon à 4°C pendant maximum 6 mois.

Solution de précipitation au CTAB

5 g/l CTAB 1 g

0,04 M NaCl 0,5 g

• Ajoutez 100 ml d’eau déionisée.

• Ajustez le pH à 8,0 en ajoutant 1M NaOH.

• Complétez pour obtenir 200 ml et stérilisez.

• Conservez le tampon à 4°C pendant maximum 6 mois.

NaCl 1,2 M

• Dissolvez 7,0 g de NaCl dans 100 ml d’eau déionisée.

• Stérilisez et conservez à température ambiante.

Solution d’éthanol 70 % (v/v)

Mélangez 70 ml d’éthanol pur à 30 ml d’eau déionisée stérile.

RNase A 10 mg/ml Conservation à -20 °C



Protéinase K 20 mg/ml Conservation à -20 °C

Procédure

La procédure requiert des conditions stériles. La contamination peut être évitée

durant la préparation des échantillons en utilisant un équipement à usage unique et

des solutions de décontamination et en évitant la formation de poussières.

• Transférez 100 mg d’un échantillon homogène dans un tube stérile de 1,5 ml

pour microcentrifugeuse.

• Ajoutez 300 µl d’eau déionisée stérile et mélangez avec une tigette

• Ajoutez 500 µl de tampon au CTAB et mélangez avec une tigette.

• Ajoutez 20 µl de protéinase K (20 mg/ml), mélangez et placez dans un incubateur

à 65°C pendant 30 à 90 minutes*. • Ajoutez 20 µl de RNAse A (10 mg/ml), mélangez et laissez incuber à 65°C

pendant 5 à 10 minutes*. • Centrifugez pendant 10 minutes à environ 16 000 xg.

• Transférez le liquide surnageant dans un tube pour microcentrifugeuse contenant

500 µl de chloroforme. Mélangez pendant 30 secondes.

• Centrifugez pendant 10 minutes à 16 000 xg jusqu’au moment où la séparation

de phase se produit.

• Transférez 500 µl de la couche supérieure dans un nouveau tube de

microcentrifugation contenant 500 µl de chloroforme et mélangez.

• Centrifugez pendant 5 minutes à 16 000 xg.

• Transférez la couche supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation.

• Ajoutez 2 volumes de solution de précipitation au CTAB et mélangez par

pipetage.

• Laissez incuber pendant 60 minutes à température ambiante.


• Jeter le liquide surnageant.

* Ces étapes facultatives supplémentaires sont désormais reprises communément dans la méthode d’extraction au CTAB afin d’améliorer le rendement de l’ADN génomique à partir de matrices très complexes.



• Dissolvez le précipité dans 350 µl NaCl (1,2 M).

• Ajoutez 350 µl de chloroforme et mélangez pendant 30 secondes.

• Centrifugez pendant 10 minutes à 16 000 xg jusqu’à ce que la séparation de

phase se produise.

• Transférez la couche supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation.

• Ajoutez 0,6 volume d’isopropanol et mélangez.


• Jetez le liquide surnageant.

• Ajoutez 500 µl de solution d’éthanol à 70% et mélangez délicatement.


• Jeter le liquide surnageant.

• Séchez les culots et redissolvez l’ADN dans 100 µl d’eau stérile déionisée.

La solution d’ADN peut être conservée au réfrigérateur pendant deux semaines au

maximum ou au congélateur à -20 °C pendant des périodes plus longues.



Références

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residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified

ingredients. European Food Research Technology 209, 192-196.

Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic

modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.

Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207.








Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in

processed food products: development and validation of PCR assay for the

specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia

(Eds.). Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1).

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1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN : 3-9521414-0-2.

Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight

plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.

Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of

specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research

Technology 213, 361-365.

Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and

Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines



and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84,

2097–2100.

Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative

evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean

food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,

81–90.






Module 5

Électrophorèse sur gel d’agarose

M. Somma, M. Querci

Électrophorèse sur gel d’agarose 2


Table des matières

Module 5

Électrophorèse sur gel d’agarose

INTRODUCTION 3

PRINCIPES PHYSIQUES DE L’ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE 3 COMPOSANTS DE L’ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE 6 EXPERIENCE 8

REFERENCES 12



Introduction

L’électrophorèse sur gel est une méthode de séparation des macromolécules en

fonction de leur taille, de leur charge électrique et d’autres propriétés physiques. Le

terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence

d’un champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine

« phorèse » vient du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ».

L’électrophorèse sur gel fait référence à une technique où les molécules sont

obligées de traverser une couche de gel sous l’impulsion d’un courant électrique.

L’énergie motrice de l’électrophorèse est la tension qui est appliquée à des

électrodes placées de part et d’autre de la couche de gel. Les propriétés d’une

molécule déterminent la rapidité avec laquelle un champ électrique peut traverser un

milieu gélatineux.

Diverses macromolécules biologiques importantes (ex.: acides aminés, peptides,

protéines, nucléotides et acides nucléiques) possèdent des groupes ionisables qui, à

un pH donné, se transforment en espèces chargées électriquement sous forme

tantôt de cations (+), tantôt d’anions (-). En fonction de la nature de la charge du

réseau, les particules chargées migreront soit vers la cathode, soit vers l’anode. À

titre d’exemple, lorsqu’un champ électrique traverse un gel de pH neutre, les groupes

de phosphates chargés négativement de l’ADN provoquent la migration de celui-ci

vers l’anode (Westermeier, 1997).

L’électrophorèse à travers l’agarose est une méthode utilisée de façon standard pour

séparer, identifier et purifier des fragments d’ADN. La technique est simple et facile à

réaliser et peut dissoudre des fragments d’ADN que d’autres procédures ne

permettent pas de séparer correctement. La position de l’ADN dans le gel peut, par

ailleurs, être déterminée en teintant celui-ci avec une faible concentration de bromure

d’éthidium, un fluorochrome s’intercalant entre les bases de l’ADN.

Les paragraphes suivants présenteront les principes physiques, les composants

(matrice du gel, tampon, tampon de charge et marqueur) et les méthodes de

préparation de l’électrophorèse sur gel d’agarose (Sambrook et al., 1989).

Principes physiques de l’électrophorèse sur gel d’agarose

La technique de l’électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer les acides

nucléiques et les protéines. La séparation de macromolécules dépend de deux

variables : la charge et la masse. Lorsqu’un échantillon biologique tel qu’un ADN est

mélangé à une solution tampon et appliqué sur un gel, il se produit une interaction



des deux variables. Les molécules repoussées d’un côté par le courant électrique

produit par une électrode sont attirées simultanément par le courant produit par

l’autre électrode. La force de friction du matériau composant le gel joue le rôle de

« tamis moléculaire » et sépare les molécules en fonction de leur taille. Durant

l’électrophorèse, les macromolécules sont poussées à travers les pores. Leur vitesse

de migration à travers le champ électrique dépend des facteurs suivants :

• la résistance du champ,

• la taille et la forme des molécules,

• l’hydrophobicité relative des échantillons,

• la force ionique et la température du tampon dans lequel les molécules se

déplacent.

Afin de bien comprendre la séparation des particules chargées dans l’électrophorèse

sur gel, il est important d’examiner de plus près les équations simples applicables à

l’électrophorèse. Lorsqu’une tension est appliquée entre les électrodes, un gradient

de potentiel E est généré et peut être exprimé par l’équation

E = V/d (1)

où V, mesuré en volts, désigne la tension appliquée et d, la distance en cm entre les

électrodes.

Lorsque le gradient de potentiel E est appliqué, une force F est générée sur une

molécule chargée et exprimée par l’équation :

F = Eq (2)

où q est égal à la charge en coulombs qui pèse sur la molécule. C’est cette force,

mesurée en newtons, qui pousse une molécule chargée vers une électrode.

Il existe également une résistance de friction qui ralentit le mouvement des

molécules chargées. Cette force de friction est fonction de :

• la taille hydrodynamique de la molécule,

• la forme de la molécule,

• la taille de pore du milieu dans lequel se produit l’électrophorèse,

• la viscosité du tampon.

La vélocité v d’une molécule chargée dans un champ électrique est fonction du

gradient de potentiel, de la charge et de la force de friction de la molécule et peut

être exprimée par l’équation :

v = Eq / f (3)

où f indique le coefficient de friction.

La mobilité électrophorétique M d’un ion peut alors être définie par la vélocité de l’ion

divisée par le gradient de potentiel :



M = v / E (4)

L’équation (3) permet, en outre, de voir que la mobilité électrophorétique M peut être

exprimée de manière équivalente comme étant la charge de la molécule q divisée

par le coefficient de friction f :

M = q / f. (5)

Lorsqu’une différence potentielle s’applique, les molécules dotées de différentes

charges globales vont commencer à se séparer en raison de leur mobilité

électrophorétique différente. Cette mobilité électrophorétique est un paramètre

important et caractéristique d’une molécule ou d’une particule chargée et dépend de

la valeur pK du groupe chargé et de la taille de la molécule ou de la particule. Même

des molécules ayant des charges similaires commenceront à se séparer si elles ont

des tailles moléculaires différentes, attendu qu’elles auront des forces de friction

différentes. L’ADN linéaire à deux brins traverse les matrices de gel à des vitesses

qui sont inversement proportionnelles au log10 du nombre de paires de base. Les

molécules de plus grosse taille migrent plus lentement en raison de leur plus grande

traînée de frottement et de leur mouvement moins efficace à travers les pores du gel.

Le courant traversant la solution entre les électrodes est conduit principalement par

les ions du tampon, une faible proportion étant conduite par les ions de l’échantillon.

La relation entre le courant I, la tension V et la résistance R est exprimée comme

dans la loi d’Ohm :

R = V / I. (6)

Cette équation démontre que pour une résistance donnée R, il est possible

d’accélérer une séparation électrophorétique en augmentant la tension V appliquée,

ce qui pourrait engendrer une augmentation correspondante de la circulation du

courant I. La distance parcourue lors de la migration sera proportionnelle au courant

et au temps. L’augmentation de la tension V et l’augmentation correspondante du

courant I provoqueront cependant l’un des principaux problèmes posés par la plupart

des formes d’électrophorèse, en l’occurrence la génération de chaleur. Ceci peut être

illustré par l’équation suivante où le courant W (mesuré en watts) généré durant

l’électrophorèse est égal au produit de la résistance multiplié par le carré du courant :

W = I2R. (7)

Vu que la plus grande partie de l’électricité produite dans le processus

électrophorétique est dissipée sous forme de chaleur, les effets préjudiciables

suivants peuvent se produire:

• un taux accru de diffusion d’ions d’échantillon et d’ions de tampon, entraînant un

élargissement des échantillons séparés ;



• la formation de courants de convection, ce qui conduit à un mélange

d’échantillons séparés ;

• l’instabilité thermique des échantillons qui sont plutôt sensibles à la chaleur (ex.:

dénaturation de l’ADN) ;

• une diminution de la viscosité du tampon et donc une réduction de la résistance

du milieu.

Composants de l’électrophorèse sur gel d’agarose

Agarose

L’agarose, un colloïde naturel extrait d’une algue, est un polysaccharide linéaire

(masse moléculaire moyenne : ~12 000 Da) composé de l’unité de répétition

fondamentale agarobiose, elle-même composée d’unités alternantes de galactose et

de 3,6-anhydrogalactose. L’agarose est très fragile et se détruit facilement sous

l’effet de manipulations. Les gels d’agarose ont de grands « pores » et sont utilisés

essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse moléculaire

supérieure à 200 kDa.

Les gels d’agarose se transforment rapidement, mais avec une résolution limitée,

étant donné que les liens qui s’y forment ont tendance à être flous/diffus et à s’étaler

en se disloquant. Ceci est dû au format du pore et ne peut être contrôlé. Les gels

d’agarose sont obtenus en mettant la poudre d’agarose déshydraté en suspension

dans un tampon aqueux, puis en faisant bouillir le mélange jusqu’à ce que l’agarose

se transforme en une solution claire. Celle-ci est ensuite versée sur un moule et

mise à refroidir à température ambiante jusqu’à formation d’un gel rigide. En

durcissant, l’agarose forme une matrice dont la densité est déterminée par sa

concentration.

Tampon d’électrophorèse

La mobilité électrophorétique de l’ADN est affectée par la composition et la

résistance ionique du tampon d’électrophorèse. En l’absence d’ions, la conductance

électrique est minimale et l’ADN migre lentement, voire pas du tout. Dans un tampon

à résistance ionique élevée, la conductance électrique est très efficace et une

quantité importante de chaleur est générée. Dans le pire des cas, le gel se met à

fondre et l’ADN se dénature.

Il existe plusieurs tampons pour l’électrophorèse de l’ADN natif double brins. Ces

tampons contiennent de l’EDTA (pH 8,0) et du tris-acétate (TAE), du tris-borate



(TBE) ou du tris-phosphate (TPE) à une concentration avoisinant les 50 mM (pH 7,5-

7,8). Les tampons d’électrophorèse sont généralement préparés sous forme de

solutions concentrées et conservés à température ambiante. Le TBE a été utilisé

initialement à une force de travail d’1x pour l’électrophorèse sur gel d’agarose. Une

solution fonctionnelle de 0,5x a toutefois déjà un pouvoir tampon plus que suffisant et

la quasi-totalité des électrophorèses sur gel d’agarose sont désormais exécutées en

utilisant cette concentration tampon.

Concentration d’agarose

Un fragment d’ADN d’une taille donnée migre à travers des gels à différents taux en

fonction de la concentration d’agarose. En fonction de la concentration spécifique de

l’agarose ou du tampon, des segments d’ADN contenant entre 20 et 50 000 bp

peuvent être séparés. Dans les gels horizontaux, l’agarose est généralement utilisé à

des concentrations comprises entre 0,7% et 3% (cf. Tableau 1).

Tableau 1. Concentration de gel d’agarose recommandée pour différencier des molécules d’ADN linéaires

% d’agarose Éventail de tailles d’ADN (bp)

0,75 10 000 – 15 000

1,0 500 – 10 000

1,25 300 – 5 000

1,5 200 – 4 000

2,0 100 – 2 500

2,5 50 – 1 000

ADN marqueur

La distance de migration, pour une tension, un gel d’agarose et des concentrations

de tampon donnés, dépend du poids moléculaire du matériau de départ. Les puits

situés à gauche et à droite du gel devraient, dès lors, être remplis avec un ADN

marqueur d’une taille connue. Un marqueur contient généralement un nombre défini

de fragments d’ADN connus, ce qui permet de déterminer plus facilement la taille

des ADN inconnus si une distorsion systématique du gel devait se produire en cours

d’électrophorèse.



Tampon de chargement

Les échantillons d’ADN à charger sur le gel d’agarose sont tout d’abord mélangés à

un tampon de chargement composé généralement d’eau, de saccharose et d’une

teinture (par exemple, du xylène cyanol, du bleu de bromophénol, du vert de

bromocrésol, etc.). La quantité maximale d’ADN pouvant être chargée dépend du

nombre de fragments. La quantité minimale d’ADN pouvant être détectée par la

photographie des gels teintés au bromure d’éthidium tourne autour des 2 ng sur une

bande de 0,5 cm de largueur. Si une largeur de bande renferme plus de 500 ng

d’ADN, le sillon sera surchargé, ce qui produira une traînée. Le tampon de

chargement a un triple objectif :

• il augmente la densité de l’échantillon en faisant en sorte que les gouttes d’ADN

tombent de façon harmonieuse dans le puits ;

• il ajoute de la couleur à l’échantillon, simplifiant ainsi le processus de

chargement ;

• il attribue une teinture à l’échantillon qui, dans un champ électrique, évolue vers

l’anode à une vitesse prévisible.

Expérience

Attention : le bromure d’éthidium est un mutagène/carcinogène puissant et modérément toxique. Veillez à toujours porter des gants lors de la manipulation de solutions et de gels contenant du bromure d’éthidium.

Matériel

• Une unité d’électrophorèse horizontale avec bloc d’alimentation électrique

• Un four à micro-ondes ou un agitateur chauffant

• Des micropipettes

• Des tubes de réaction de 1,5 ml

• Une balance précise à 0,1 g

• Des spatules

• Un rack pour tubes de réaction

• Une verrerie de laboratoire

• Un diaphanoscope (rayons UV, 312 nm)

• Du matériel d’enregistrement (par exemple, un appareil photo Polaroid ou une

caméra vidéo)



Réactifs

• Agarose convenant pour l’électrophorèse d’ADN

• Tris[hydroxyméthyl] aminomethane (Tris) CAS 77-68-1

• Acide borique

• Na2EDTA CAS 6381-92-6

• Bromure d’éthidium CAS 1239-45-8

• Saccharose

• Xylène cyanole FF CAS 2650-17-1

• Marqueurs d’ADN:

Lambda ADN EcoRI/HindIII digéré (ou un autre marqueur similaire

adéquat)

Marqueur d’ADN de 100 bp

10x tampon TBE (1 litre)

Tris[hydroxymethyl] aminomethane (Tris) 54,0 g

Acide borique 27,5 g

Na2EDTA 7,44 g

• Mélangez le réactif à l’eau déionisée afin d’obtenir une solution d’un litre à pH de 8,3.

• Conservez à température ambiante.

6x tampon de chargement (10 ml)

Xylène cyanole FF 0,025 g

Saccharose 4 g

• Ajoutez du saccharose et du xylène cyanole FF à de l’eau déionisée afin d’obtenir 10

ml de solution.

• Mélangez la solution, passez à l’autoclave et conservez à 4°C.



Procédure

• À l’aide d’une bande adhésive ou d’un autre moyen, scellez les extrémités d’un

moule en plastique propre et sec. Positionnez le peigne adéquat de façon à

former des puits complets au moment de couler la solution d’agarose.

• Diluez le tampon TBE 10x afin de préparer la quantité adéquate de tampon TBE

de 0,5 pour remplir le réservoir d’électrophorèse et préparez le gel.

• Pesez l’agarose en poudre en suivant les indications du Tableau 2 et ajoutez-y

une quantité adéquate de 0,5 x tampon TBE dans un Erlenmeyer garni d’un

couvercle lâche (généralement 150 ml de solution à base de gel pour un moule

de 15 x 15 cm et 100 ml de gel pour un moule à gel de 15 x 10 cm).

Tableau 2. Concentrations de gel d’agarose utilisées durant le cours

GM

O3

GM

O4

ZEIN

3

ZEIN

4 p3

5S-c

f3

p35S

-cr4

H

A-n

os11

8-f

HA

-nos

118-

r C

RYI

A3

CR

YIA

4 G

M07

GM

08

mg3

mg4

A

DN

géno

miq

ue

0,8 - 1% X

1,5% X X

2,0% X X X X X

• Chauffez la masse dans un four à micro-ondes ou dans un bain-marie jusqu’à

dissolution de l’agarose (contrôlez le volume de la solution après l’avoir

chauffée).

• Laissez refroidir le mélange jusqu’à une température de 50-60 °C, puis ajoutez

du bromure d’éthidium (avec une solution de réserve de 10 mg/ml) afin d’obtenir

une concentration finale de 0,2 µg/ml et mélangez le tout convenablement.

• Versez la solution sur le moule du gel et laissez le gel se figer. La quantité de gel

utilisée devrait correspondre à une épaisseur d’environ 3 à 5 mm.

• Lorsque le gel est complètement figé, retirez soigneusement le peigne et la

bande adhésive et placez le gel dans un réservoir d’électrophorèse.

• Ajoutez un tampon de 0,5 x TBE en quantité suffisante dans l’unité

d’électrophorèse pour recouvrir le gel d’une épaisseur de 2 à 5 mm.



Préparez les échantillons et un marqueur pour l’ADN génomique en procédant comme suit :

Échantillon Marqueur

eau 3 µl eau 6 µl tampon de chargement 2 µl tampon de charge 2 µl échantillon 5 µl λ DNA EcoR I / Hind III 2 µl 10 µl 10 µl

Préparez les échantillons et un marqueur pour les produits PCR en procédant comme suit:

Échantillon Marqueur

tampon de chargement 2 µl Marqueur ADN 100 bp 15 µl échantillon 8 µl

10 µl

• Chargez 10 µl de chaque échantillon dans des puits consécutifs et placez le

marqueur d’ADN adéquat dans le premier et le dernier puits.

• Fermez le couvercle du réservoir à gel et raccordez les fils électriques jusqu’au

moment où l’ADN migre vers l’anode, puis appliquez une tension de 5 à 10 V/cm.

• Faites migrer le gel jusqu’au moment où le xylène cyanole a migré à l’intérieur du

gel sur la distance voulue (± 40 à 60 minutes).

• Coupez le courant, retirez les fils et ôtez le couvercle du réservoir à gel.

Positionnez le gel sur une boîte d’éclairage UV et photographiez le gel.

• Jetez le gel dans la poubelle pour déchets solides à base de bromure d’éthidium

qui a été fournie.



Références

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Gel electrophoresis of DNA. In:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a

Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring

Harbor, NY, USA, chapter 6.

Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in Practice: a Guide to Methods and

Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.






Module 6

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

M. Somma, M. Querci

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 2


Table des matières

Module 6

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

INTRODUCTION 3

CONSTITUANTS, STRUCTURE ET REPLICATION DE L’ADN 3 PRINCIPES DE LA PCR 8 INSTRUMENTATION ET COMPOSANTS POUR LA PCR 12 CONCEPTION DES AMORCES POUR LA PCR 17 PCR SPECIALISEE 22 LA PCR DANS LA PRATIQUE 23

REFERENCES 30 BIBLIOGRAPHIE COMPLEMENTAIRE 32



Introduction

La mise au point de la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) par

K. Mullis et ses collaborateurs en 1985 a révolutionné la biologie moléculaire et la

médecine moléculaire (Saiki et al., 1985). La réaction de polymérisation en chaîne

est une technique in vitro utilisée pour amplifier à l’aide d’enzymes une région

déterminée de l’ADN qui se trouve entre deux régions de séquence ADN connue.

Alors qu’autrefois seules de très petites quantités d’un gène spécifique pouvaient

être obtenues, la PCR permet maintenant d’amplifier même une seule copie de gène

à un million d’exemplaires en quelques heures.

Les techniques PCR sont devenues essentielles pour beaucoup de procédures

communes, telles que le clonage de fragments d’ADN spécifiques, la détection et

l’identification de gènes à des fins de diagnostic et en médecine légale ainsi que

dans la recherche sur les modes d’expression génique. Plus récemment, la PCR a

permis l’exploration de nouveaux domaines, tels que le contrôle de l’authenticité de

denrées alimentaires, la présence d’ADN génétiquement modifié et la contamination

microbiologique. Pour comprendre les principes de la PCR et de ses applications, il

faut examiner d’abord la nature de la molécule d’ADN. C’est pourquoi la structure et

la réplication de l’ADN sont décrites dans la section suivante.

Constituants, structure et réplication de l’ADN

Constituants. Une molécule d’ADN est constituée de deux brins complémentaires

enroulés sous forme d’hélice et composés alternativement d’acide phosphorique et

de désoxyribose, reliés transversalement par des bases (purines et pyrimidines),

prenant la forme d’une structure hélicoïdale droite qui porte des informations

génétiques encodées dans la séquence des bases. Dans les cellules eucaryotes, la

majeure partie de l’ADN est contenue dans le noyau et est appelée ADN

chromosomique. Il est séparé du reste de la cellule (cytoplasme) par une double

membrane (l’enveloppe nucléaire). D’autre part, les mitochondries et les

chloroplastes contiennent de l’ADN extrachromosomique.

Les éléments constitutifs de l’ADN, appelés nucléotides, sont les suivants:

• dATP, désoxyadénosine triphosphate;

• dGTP, désoxyguanosine triphosphate;

• dTTP, désoxythymidine triphosphate;

• dCTP, désoxycytidine triphosphate.



Par commodité, ces quatre nucléotides sont appelés dNTP (désoxynucléoside

triphosphates). Un nucléotide comporte essentiellement les trois parties suivantes:

une base purine (adénine, A, et/ou guanine, G) ou une base de pyrimidine (cytosine,

C, et/ou thymine, T), une molécule de sucre pentose (désoxyribose) et un groupe

triphosphate. Comme le montre la Figure 1, une base purine ou pyrimidine est liée à

un cycle pentose par une liaison N-glucosidique et un groupe phosphate est lié à

l’atome de carbone 5 du sucre par une liaison diester. Dans l’acide ribonucléique,

ARN, la thymine est remplacée par l’uracile (U) et la molécule de désoxyribose est

remplacée par le ribose.

Figure 1. Les composants des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999)

Structure. La Figure 2 montre comment les nucléotides forment une chaîne d’ADN.

L’ADN se forme par le couplage des nucléotides entre le groupe phosphate d’un

nucléotide (qui est situé sur le cinquième atome C de la molécule de sucre) avec

l’hydroxyle sur le troisième atome C de la molécule de sucre du nucléotide

précédent. À cet effet, un groupe diphosphate se détache (avec libération d’énergie).

Cela signifie que de nouveaux nucléotides sont toujours ajoutés du côté 3' de la

chaîne. La Figure 3 montre que l’ADN est bicaténaire (sauf dans certains virus) et

que les deux brins s’apparient de manière très précise. Chaque base dans un brin



s’appariera avec un seul type de base dans le brin opposé pour former une paire de

bases (pb): A est toujours apparié à T par deux liaisons hydrogène; C est toujours

apparié à G par trois liaisons hydrogène. De cette façon, les deux chaînes sont

complémentaires entre elles et une chaîne peut servir de modèle pour la production

de l’autre.

Figure 2. Formation d’une chaîne d’ADN à partir des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999)

Les bases forment un noyau hydrophobe à l’intérieur de la double hélice. Les sucres

et les groupes phosphate (sous leur forme anionique) constituent la couche

hydrophile externe de la molécule. Dans les conditions physiologiques, l’hélice

d’ADN bicaténaire est plus stable qu’une hélice d’ADN monocaténaire.

Réplication. L’ADN contient l’information génétique complète qui définit la structure

et la fonction d’un organisme. Trois processus différents sont responsables de la

transmission de l’information génétique:

• la réplication;

• la transcription;

• la traduction.



Figure 3. Structure de l’ADN dans une cellule (image: Andy Vierstraete, 1999)

Au cours de la réplication, un acide nucléique bicaténaire est dupliqué pour donner

des copies identiques. Ce processus perpétue l’information génétique. Lors de la

transcription, un segment d’ADN constituant un gène est lu et transcrit en une



séquence monocaténaire d’ARN. L’ARN se déplace du noyau vers le cytoplasme.

Enfin, pendant la traduction, la séquence d’ARN est traduite en séquence d’acides

aminés lors de la formation de la protéine (Alberts et al., 1983).

La réplication de l’ADN est le processus sur lequel la PCR est basée, et est décrite

en détail ci-après.

Pendant la réplication, la molécule d’ADN se déroule, chaque brin devenant un

modèle (matrice) pour la synthèse d’un nouveau brin complémentaire. Chaque

molécule fille, consistant en un ancien et un nouveau brin d’ADN, est une copie

exacte de la molécule parent.

Figure 4. La fourche de réplication

Plusieurs enzymes sont nécessaires pour dérouler la double hélice et pour

synthétiser un nouveau brin d’ADN. La topoisomérase et l’hélicase sont

responsables du déroulement de l’ADN par rupture de la structure superenroulée et

coupure d’un seul brin de l’ADN. Ensuite, la primase (une partie d’un agrégat de

protéines appelé primosome) fixe une petite amorce d’ARN sur l’ADN

monocaténaire, pour servir d’extrémité 3’OH à partir de laquelle l’ADN polymérase

commence la synthèse. Cette amorce d’ARN est finalement enlevée par la RNase H

et la brèche est comblée par l’ADN polymérase I. À ce stade, l’ADN

polymérase progresse le long d’une molécule monocaténaire d’ADN, incorporant des

dNTP libres pour les lier par liaison hydrogène à leur dNTP complémentaire

approprié sur le brin solitaire (A avec T et G avec C), formant une liaison

phosphodiester covalente avec le nucléotide précédent du même brin. L’énergie

stockée dans le triphosphate est utilisée pour lier de manière covalente chaque



nouveau nucléotide au deuxième brin en cours de formation. Il y a différentes formes

d’ADN polymérase, mais c’est l’ADN polymérase III qui est responsable de la

synthèse progressive de nouveaux brins d’ADN. L’ADN polymérase n’agit que de 5'

vers 3'. Comme un brin de la double hélice est de sens 5'-3' et l’autre de sens 3'-5',

l’ADN polymérase synthétise une deuxième copie du brin 5'-3' (brin retardé) par

petits fragments (fragments d’Okazaki) (Ogawa et Okazaki, 1980). La synthèse des

nouvelles copies du brin 5'-3' est montrée à la Figure 4. L’autre brin (brin avancé)

peut procéder à la synthèse directement, de 5' vers 3', à mesure que l’hélice se

déroule. L’ADN polymérase ne peut pas commencer à synthétiser ex novo sur un

brin unique nu, mais a besoin d’une amorce avec un groupe 3’OH libre sur lequel il

peut fixer un dNTP.

Une ligase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre l’hydroxyle en 3’

et le phosphate en 5’. Le trou qui se forme lorsque l’amorce d’ARN est éliminée peut

ainsi être comblé. Il convient de noter que les protéines de liaison monocaténaires

sont importantes pour maintenir la stabilité de la fourche de réplication. Comme

l’ADN monocaténaire est très labile, c’est-à-dire instable, ces protéines s’y

fixent alors qu’il reste monocaténaire, le protégeant ainsi contre la dégradation.

Principes de la PCR

La PCR est basée sur le mécanisme de la réplication de l’ADN in vivo: l’ADN

bicaténaire est déroulé en ADN monocaténaire, puis dupliqué et «réenroulé». Cette

technique comprend les cycles répétitifs suivants:

• dénaturation de l’ADN par fusion à haute température pour convertir l’ADN

bicaténaire en ADN monocaténaire;

• hybridation à l’ADN cible de deux oligonucléotides utilisés comme amorces;

• extension de la chaîne d’ADN par addition de nucléotides à partir des

amorces en utilisant l’ADN polymérase comme catalyseur en présence d’ions

Mg2+.



Les oligonucléotides consistent généralement en séquences relativement courtes qui

sont différentes les unes des autres et complémentaires des sites de

reconnaissance flanquant le segment d’ADN cible à amplifier. Les étapes de

dénaturation de la matrice, d’hybridation des amorces et d’extension des amorces

constituent un «cycle» dans la méthode de réaction de polymérisation en chaîne. La

Figure 5 illustre les trois étapes principales du processus d’amplification PCR.

Figure 5. Les étapes de l’amplification PCR (image: Andy Vierstraete, 1999)

Après chaque cycle, les brins d’ADN nouvellement synthétisés peuvent servir de

matrices dans le cycle suivant. Comme le montre la Figure 6, le principal produit de

cette réaction exponentielle est un segment d’ADN bicaténaire dont les extrémités

sont définies par les extrémités 5' des amorces d’oligonucléotides et dont la longueur

est définie par la distance entre les amorces. Les produits d’un premier cycle

d’amplification réussi sont des molécules d’ADN de taille hétérogène dont la

longueur peut dépasser la distance entre les sites de fixation des deux amorces.

Dans le deuxième cycle, ces molécules produisent des brins d’ADN de longueur

définie qui s’accumuleront de façon exponentielle lors de cycles d’amplification

ultérieurs et formeront les produits dominants de la réaction. Ainsi, l’amplification, en

tant que nombre final de copies de la séquence cible, est exprimée par l’équation

suivante:

(2n-2n)x (1)



où n est le nombre de cycles, 2n est le premier produit obtenu après le premier cycle

et le deuxième produit obtenu après le deuxième cycle avec une longueur indéfinie,

et x est le nombre de copies de la matrice originelle. Potentiellement, après 20 cycles

de PCR, il y aura une amplification d’un facteur de 220, en supposant une efficacité

de 100 % pendant chaque cycle. L’efficacité d’une PCR variera d’une matrice à

l’autre et selon le degré d’optimisation atteint.

Une description détaillée des trois étapes de l’amplification PCR (dénaturation de la

matrice, hybridation des amorces et extension) est donnée dans les paragraphes ci-

après (Sambrook et al., 1989).

Figure 6. L’amplification exponentielle de l’ADN dans la PCR

Dénaturation de la matrice

Au cours de la dénaturation, le double brin s’ouvre pour donner de l’ADN

monocaténaire, et toutes les réactions enzymatiques s’arrêtent (c’est-à-dire

l’extension d’un cycle précédent). Les deux chaînes complémentaires sont séparées

par une augmentation de température. C’est ce qu’on appelle la dénaturation. Pour

obtenir la dénaturation de l’ADN, on augmente généralement la température à

environ 93 – 96 °C. De cette façon, les fortes liaisons H sont rompues et le nombre

de bases non appariées augmente. La réaction est complète lorsque tout l’ADN

bicaténaire est devenu de l’ADN monocaténaire. La température à laquelle la moitié

de l’ADN bicaténaire devient monocatenaire est appelée température de fusion, Tf.

Le type de solvant, la concentration de sel et le pH utilisés influencent le processus



de dénaturation. Par exemple, à faible concentration de sel, à pH élevé et en

présence de solvants organiques tels que le formaldéhyde, la température de fusion

Tf diminue. La concentration de G/C et T/A peut également influencer la valeur de la

Tf. La Tf de la structure de l’ADN contenant une quantité élevée de G/C est

supérieure à celle de l’ADN riche en T/A. Par exemple, Serratia marecescens a une

concentration de G/C approximativement d’environ 60 % et une Tf d’environ 94 °C,

tandis que Pneumococcus a approximativement 40 % de G/C et une Tf d’environ

85 °C.

Hybridation des amorces

L’hybridation, ou réhybridation, des brins d’ADN a lieu à une température plus basse

(généralement 55 – 65 °C). Une fois que la température est abaissée, les deux

chaînes complémentaires d’ADN monocaténaire se reformeront en une molécule

d’ADN bicaténaire. Au cours de cette phase, les amorces se déplacent librement et

des liaisons ioniques sont constamment formées et rompues entre l’amorce

monocaténaire et la matrice monocaténaire. Les liaisons plus stables durent un peu

plus longtemps (amorces qui correspondent exactement à l’ADN matrice) et sur ce

petit morceau d’ADN bicaténaire (matrice et amorce), la polymérase peut se fixer et

commencer à copier la matrice. Une fois que quelques bases sont incorporées, la

liaison ionique est si forte entre la matrice et l’amorce qu’elle ne se rompra pas.

Extension des amorces

Au cours de cette étape, les amorces sont étendues sur la séquence cible en

utilisant une ADN polymérase thermostable (souvent l’ADN polymérase Taq) en

présence de dNTP, ce qui aboutit à une duplication du matériel cible de départ. La

température de travail idéale pour l’ADN polymérase Taq est 72 °C. Lorsque les

amorces ont été étendues de quelques bases, elles possèdent une plus forte

attraction ionique pour la matrice, ce qui réduit la probabilité de survenue du

processus inverse. Les amorces qui ne correspondent pas exactement se détachent

de nouveau (en raison de la température plus élevée) et n’entraînent pas une

extension du fragment. Les bases (complémentaires de la matrice) sont couplées à

l’amorce du côté 3’ (la polymérase ajoute des dNTP de 5’ vers 3’ en lisant la matrice

de 3’ vers 5’). La durée des étapes d’extension des amorces peut être augmentée si

la région de l’ADN à amplifier est longue; cependant, pour la majorité des réactions

PCR, une durée d’extension de 1 minute est suffisante pour obtenir une extension

complète.



Instrumentation et composants pour la PCR

Instruments

Deux progrès majeurs ont permis d’automatiser le processus de la PCR:

a. L’utilisation d’ADN polymérases thermostables, qui résistent à l’inactivation aux

hautes températures. Ainsi, une partie aliquote initiale de polymérase peut durer

pendant un grand nombre de cycles du protocole.

b. Le développement des bains de température, qui peuvent augmenter et abaisser

rapidement leur température de manière automatisée et programmée. On les

appelle des thermocycleurs ou machines PCR.

Plusieurs types de dispositifs de variation de la température sont utilisés. Par

exemple: chauffage et refroidissement par des fluides, chauffage par résistance

électrique et refroidissement par un fluide, chauffage par résistance électrique et

refroidissement par semi-conducteurs. La Figure 7 montre un profil typique de cycles

de température pour un protocole en trois étapes.

Figure 7. Profil de cycles de température PCR

Les paramètres des cycles de température, comme la dénaturation, l’hybridation des

amorces et l’extension des amorces, déjà mentionnés, ainsi que les composants

utilisés et le nombre de cycles, décrits dans les paragraphes ci-dessous, sont

essentiels pour le succès de la PCR.



ADN cible

En principe, la PCR peut être effectuée si au moins une copie intacte du gène cible

est présente. Un plus grand nombre de copies cibles améliore la probabilité de

succès l’amplification de l’ADN. Tout dommage, tel qu’une entaille dans l’ADN cible,

bloquera la PCR. La taille de la séquence cible peut se situer entre moins de 0,1 et

quelques kilobases. La quantité totale d’ADN généralement utilisée pour la PCR est

de 0,05 à 1,0 µg, ce qui permet la détection de copies uniques de la séquence cible.

Même si un échantillon ne doit pas être hautement purifié, certains contaminants,

tels que l’héparine, des hèmes, le formol, des chélateurs Mg2+, ainsi que des

détergents, doivent être éliminés pour éviter l’inhibition du processus d’amplification.

Amorces

D’une façon générale, les amorces utilisées ont une longueur de 16–30 nucléotides,

ce qui autorise une température d’hybridation raisonnablement élevée. Les amorces

doivent être exemptes de suites de séquences de polybases (poly-dG, par exemple)

ou de motifs répétitifs, ceux-ci pouvant s’hybrider de manière inadéquate avec la

matrice. Il convient d’éviter les séquences répétées inversées afin d’empêcher la

formation de structures secondaires dans l’amorce, ce qui empêcherait l’hybridation

avec la matrice. Les séquences complémentaires d’autres amorces utilisées dans la

PCR devraient également être évitées afin d’empêcher l’hybridation entre amorces

ou la formation de dimères d’amorce (particulièrement important pour l’extrémité 3’

de l’amorce). Si possible, l’extrémité 3’ de l’amorce devrait être riche en bases de G

et C pour une meilleure hybridation de l’extrémité qui sera étendue. La distance entre

les amorces devrait être inférieure à 10 Kb. En général, on observe une réduction

substantielle du rendement lorsque les amorces sont distantes de plus de 3 Kb

environ. Des oligonucléotides sont généralement utilisés à la concentration de 1 µM

dans la PCR, ce qui est suffisant pour au moins 30 cycles d’amplification. Une

concentration plus élevée d’oligonucléotides peut entraîner l’amplification de

séquences non cibles indésirables. Inversement, la PCR est inefficace lorsque la

concentration d’amorce est trop faible.

ADN polymérase

La méthode PCR originelle utilisait le fragment Klenow de l’ADN polymérase d’E. coli

(Saiki et al., 1985). Toutefois, cette enzyme se dénature à des températures plus



basses que celle requise pour la dénaturation de la plupart des matrices

bicaténaires. Ainsi, dans les premières expériences, de l’enzyme fraîche devait être

ajoutée à la réaction après chaque cycle. En outre, les échantillons devaient être

déplacés d’un bain de température à un autre pour permettre les différentes étapes

de dénaturation, d’hybridation et de polymérisation. Il est évident que l’utilisation

d’ADN polymérase thermorésistante a facilité le processus, car l’ajout d’enzymes

après chaque étape de dénaturation n’est plus nécessaire. En général, les ADN

polymérases ne peuvent incorporer que des nucléotides de l’extrémité 3’ d’un

polynucléotide. La première ADN polymérase thermostable utilisée était l’ADN

polymérase Taq, isolée dans la bactérie Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Bien

que cette enzyme soit probablement celle qui est la plus largement utilisée dans les

applications de la PCR, plusieurs autres ADN polymérases sont commercialisées. Le

Tableau 1 indique les propriétés de certains ADN polymérases thermostables

actuellement utilisées pour la PCR (Newton et Graham, 1994).

Tableau 1. Caractéristiques de certaines ADN polymérases utilisées pour la PCR

Taq/ AmpliTaq® Vent™ Deep-

Vent™ Pfu Tth UITma™

Source Thermus aquaticus

Thermo-coccus litoralis

Pyrococcus GB-D

Pyrococcus Furiosus

Thermus thermophilus

Thermotoga maritima

Application

Taq: AmpliTaq naturelle: pour génie génétique

Pour génie génétique

Pour génie génétique Naturelle Pour génie

génétique Pour génie génétique

T½ d’activité à 95 ºC (mn) 40 1380 400 >120 20 >50a

Activité exonucléase 5’ 3’

Oui

Non

Non

Non

Oui

Non

Activité exonucléase 3’ 5’

Non

Oui

Oui

Oui

Non

Oui

Processivité 50-60 ? 7 ? 30-40 ? Vitesse d’extension (nt/s)

75 ? >80 60 >33 ?

Extrémités d’ADN résultantes

3’A >95 % franches

>95 % franches ? 3'A franches

PM en kDa 94 ? ? 92 94 70



ADN polymérase Taq/AmpliTaq®. Comme indiqué plus haut, cette enzyme a été

isolée chez la bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans une source thermale dans le

parc national Yellowstone aux États-Unis, à des températures proches de 85 °C. La

température de travail optimale de cette enzyme est de 70–80 °C. À cette

température, la bactérie synthétise l’ADN à une vitesse de 35–100

nucléotides/seconde. Le nombre moyen de nucléotides qu’une enzyme incorpore

dans l’ADN avant de se détacher de la matrice est appelé processivité. L’ADN

polymérase AmpliTaq® est une enzyme génétiquement modifiée exprimée par E.

coli. Comme AmpliTaq® est recombinante, la pureté et la reproductibilité de cette

enzyme sont plus élevées que celles du type sauvage. Toutefois, une contamination

potentielle peut se produire pendant l’amplification de l’ADN avec certaines

séquences homologues d’E. coli. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser une ADN

polymérase qui n’a pas été exprimée, avec E. coli comme organisme hôte. Les ADN

polymérases tant Taq qu’AmpliTaq® possèdent une activité exonucléase 5’ 3’, qui

élimine les nucléotides en avant de la chaîne en progression.

ADN polymérases Vent™, DeepVent™, Pfu et UITma™. Ces enzymes ont une

activité exonucléase 3’ 5’ qui permet l’élimination des résidus mésappariés jusqu’à

ce qu’il se forme un terminus à bases correctement appariées. Cependant, l’activité

exonucléase 3’ 5’ peut causer une dégradation des amorces. Par conséquent, il

convient de n’ajouter l’enzyme qu’après que la réaction a commencé ou d’utiliser des

amorces chimiquement modifiées.

ADN polymérase AmpliTaqGold™. Cette enzyme consiste en une ADN

polymérase AmpliTaq inactive à la température ambiante et ne peut être activée

qu’au cours d’une période d’incubation à 94 °C. Dans ce cas, le programme du

thermocycleur devrait comprendre une période de pré-incubation à une température

de 92–95 °C. Pour la PCR « à libération contrôlée », la pré-incubation peut être

éliminée, mais au moins 10 cycles de plus que dans la PCR classique doivent être

exécutés.

Tampons de réaction et MgCl2 dans les réactions PCR

Outre les réactifs qui interviennent directement dans la réaction, la PCR requiert un

tampon approprié. La composition du tampon dépend du type et des caractéristiques



de l’enzyme utilisée et la plupart des fournisseurs fournissent généralement un

tampon 10x pour utilisation avec l’enzyme respective. Le tampon de réaction le plus

couramment utilisé avec l’ADN polymérase Taq/AmpliTaq® contient:

• 10 mM de Tris, pH 8,3

• 50 mM de KCl

• 1,5-2,5 mM de MgCl2

La présence de cations bivalents dans la PCR est essentielle. La concentration de

MgCl2 dans le mélange de réaction final est généralement de 0,5 à 5,0 mM, et la

concentration optimale est déterminée empiriquement (Innis et Gelfand, 1990).

Les ions Mg2+:

• forment un complexe soluble avec les dNTP, ce qui est essentiel pour

l’incorporation des dNTP,

• stimulent l’activité polymérase,

• augmentent la Tf de l’interaction amorce/matrice (et stabilisent par conséquent

l’interaction entre les deux chaînes).

En général, une faible concentration de Mg2+ conduit à un faible rendement (ou à une

production nulle), alors qu’une concentration de Mg2+ élevée entraîne une

accumulation de produits non spécifiques («mésamorçage»). Il est important d’éviter

la présence, dans la solution d’ADN matrice, d’une concentration élevée de

chélateurs tels que l’EDTA ou de groupes ioniques à charge négative tels que le

phosphate. On trouve dans la littérature actuelle des discussions sur différents

tampons et suppléments PCR, tels que le DMSO, le PEG 6000, le formamide, le

glycérol, la spermidine et des détergents non ioniques, utilisés pour accroître la

spécificité ou l’efficacité de la réaction (Roux, 1995). Certaines ADN polymérases

atteindront en effet leur niveau d’activité optimal (Rolfs et al., 1992) seulement en

présence de ces suppléments.

Désoxyribonucléoside triphosphates

Des désoxyribonucléoside triphosphates libres (dNTP) sont nécessaires pour la

synthèse de l’ADN. Les concentrations de dNTP pour la PCR devraient être de 20 à

200 µM pour chaque dNTP et les quatre dNTP devraient être utilisés à des

concentrations équivalentes pour réduire au minimum les erreurs de

mésincorporation (Innis et al., 1988). Des dNTP de grande pureté sont fournis par

plusieurs fabricants sous forme soit de quatre stocks individuels, soit de mélange des



quatre dNTP. Les solutions de stock de dNTP (généralement 100 mM) devraient être

ajustés à un pH de 7,0–7,5 avec 1 M de NaOH pour que le pH de la réaction finale

ne tombe pas au-dessous de 7,1 (Sambrook et al., 1989); cependant, beaucoup de

solutions de stock de dNTP sont maintenant fournies avec un pH déjà ajusté.

Nombre de cycles et effet plateau

Le nombre de cycles d’amplification nécessaires pour produire une bande visible sur

un gel dépend en grande partie de la concentration initiale d’ADN cible. Pour

amplifier 50 molécules cibles, 40–45 cycles sont recommandés, tandis que 25–30

cycles sont suffisants pour amplifier 3x105 molécules de la même concentration

(Innis et Gelfand, 1990). Cette non-proportionnalité est due à l’effet plateau, qui est

l’atténuation du taux exponentiel d’accumulation de produit dans les dernières étapes

d’une PCR, lorsque le produit atteint 0,3–1,0 nM. Cela peut être dû à la dégradation

des réactifs (dNTP, enzyme), à l’épuisement de réactifs (amorces – problème avec

les produits courts, dNTP – problème avec les produits longs), à l’inhibition du

produit final (formation de pyrophosphate), à la compétition pour les réactifs par les

produits non spécifiques, compétition pour la liaison avec les amorces par

réhybridation du produit concentré (10 nM) (Innis et Gelfand, 1990). Si le produit

désiré n’est pas obtenu en 30 cycles, un petit échantillon (1 µl) du produit amplifié

devra être prélevé, mélangé et ré-amplifié en 20–30 cycles dans un nouveau

mélange réactif, plutôt que d’augmenter le nombre de cycles. Dans certains cas où la

concentration de matrice est faible, cette ré-amplification peut produire un bon

produit, contrairement à la prolongation à 40 cycles ou plus.

Conception des amorces pour la PCR

La conception des amorces est sans doute le paramètre le plus important pour le

succès de la PCR. Toutes choses égales par ailleurs, une amorce mal conçue peut

empêcher le fonctionnement de la réaction PCR. La séquence d’amorce détermine

plusieurs choses, telles que la position et la longueur du produit, sa température de

fusion et finalement le rendement (Innis et Gelfand, 1994). Une amorce mal conçue

peut conduire à une production faible, voire nulle, en raison d’une amplification non

spécifique et/ou à la formation de dimères d’amorce, qui peuvent devenir

suffisamment compétitifs pour inhiber la formation de produit. Cette note

d’application a pour but d’établir des règles dont il convient de tenir compte lors de la



conception d’amorces pour la PCR. Ce sujet est traité plus en détail dans d’autres

publications (Dieffenbach et al., 1995).

Sélection des amorces

Plusieurs variables doivent être prises en considération lors de la conception des

amorces pour la PCR. En voici quelques-unes des plus importantes:

• longueur de l’amorce,

• température de fusion (Tf),

• spécificité,

• séquences d’amorce complémentaires

• teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G),

• séquence à l’extrémité 3’.

Chacun de ces éléments essentiels est examiné dans les sections suivantes.

Longueur de l’amorce

Comme la spécificité, la température et le temps d’hybridation dépendent en partie

de la longueur de l’amorce, ce paramètre est essentiel pour le succès de la PCR. En

général, les oligonucléotides entre 18 et 24 bases sont extrêmement spécifiques de

la séquence, à condition que la température d’hybridation soit optimale. La longueur

de l’amorce est également proportionnelle à l’efficacité de l’hybridation. En général,

plus l’amorce est longue, moins l’hybridation est efficace. Le nombre de matrices

amorcées diminuant à chaque étape, cela peut aboutir à une diminution sensible de

produit amplifié. Les amorces ne devraient toutefois pas être trop courtes, à moins

que l’application l’exige spécifiquement. Comme indiqué ci-dessous, l’objectif est de

concevoir une amorce dont la température d’hybridation est d’au moins 50 °C.

La relation entre la température d’hybridation et la température de fusion est l’une

des «boîtes noires» de la PCR. Une règle générale est d’utiliser une température

d’hybridation qui est 5 °C plus basse que la température de fusion. Souvent, la

température d’hybridation déterminée de cette façon ne sera pas optimale et il faudra

procéder empiriquement pour déterminer la température optimale. À cet effet, le plus

facile est d’utiliser un thermocycleur à gradient.



Température de fusion (Tf)

Il est important de se rappeler que deux amorces sont ajoutées à une PCR dirigée

sur un site ou une cible. Les deux amorces d’oligonucléotides doivent être conçues

de sorte qu’elles aient des températures de fusion semblables. Si les amorces ne

concordent pas en termes de Tf, l’amplification sera moins efficace ou peut ne pas

fonctionner du tout, car l’amorce avec la Tf la plus élevée haut va mésamorcer aux

basses températures et l’amorce avec la Tf plus basse peut ne pas fonctionner aux

hautes températures. Les températures de fusion des oligonucléotides sont

déterminées le plus exactement à l’aide de calculs thermodynamiques du type «plus

proches voisins» avec la formule suivante:

Tfamorce = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273.15°C + 16.6 log 10 [K+] (2)

où H est l’enthalpie et S est l’entropie pour la formation de l’hélice, R est la constante

molaire des gaz et c est la concentration d’amorces.

Le plus simple est d’utiliser les logiciels de conception d’amorces déjà disponibles

sur le marché (Sharrocks, 1994). Heureusement, une bonne approximation de cette

valeur (généralement valide pour les oligonucléotides de 18–24 bases) peut être

obtenue à l’aide de la formule suivante:

Tf = 2(A+T) + 4(G+C) (3)

où A, T, G et C sont les bases purine et pyrimidine.

Au Tableau 2 figurent des valeurs calculées pour des amorces de différentes

longueurs à l’aide de cette équation (appelée formule de Wallace) et en supposant

une teneur en GC de 50 % (Suggs et al., 1981).



Tableau 2. Calcul de la température de fusion des amorces avec l’équation de Wallace


Tf = 2 (A+T) + 4(G+C)


Tf = 2 (A+T) + 4(G+C)

4 12 °C 22 66 °C

6 18 °C 24 72 °C

8 24 °C 26 78 °C

10 30 °C 28 84 °C

12 36 °C 30 90 °C

14 42 °C 32 96 °C

16 48 °C 34 102 °C

18 54 °C 36 108 °C

20 66 °C 38 114 °C

Les températures calculées à l’aide de la règle de Wallace sont imprécises pour les

valeurs extrêmes de ce Tableau. Lors du calcul des températures de fusion des

amorces, il convient de veiller à ce que la température de fusion du produit est

suffisamment basse pour obtenir une fusion de 100 % à 92 °C. Bien que ce

paramètre contribue à assurer une PCR plus efficace, il n’est pas toujours

nécessaire pour le succès de la PCR. En général, les produits entre 100 et 600

paires de base sont efficacement amplifiés dans de nombreuses réactions PCR. En

cas de doute, la Tf du produit peut être calculée à l’aide de la formule suivante:

Tf =81.5 + 16.6 (log10[K+] + 0.41 (%G+C)-675/longueur (4)

Spécificité

Comme mentionné plus haut, la spécificité de l’amorce dépend au moins

partiellement de la longueur de l’amorce. Il est évident qu’il y a beaucoup plus

d’oligonucléotides uniques à 24 paires de bases qu’à 15 paires de bases. Ceci dit,

les amorces doivent être choisies de telle sorte qu’elles aient une séquence unique

dans l’ADN matrice qui doit être amplifié. Une amorce conçue avec une séquence

hautement répétitive conduira à une traînée lors de l’amplification d’ADN génomique.



Toutefois, la même amorce peut donner une bande unique si un clone unique d’une

bibliothèque génomique est amplifié. Comme l’ADN polymérase Taq est active dans

une large gamme de températures, l’extension de l’amorce se produira aux basses

températures d’hybridation. Si la température est trop basse, un amorçage non

spécifique peut se produire, qui peut être étendu par la polymérase s’il y a

une homologie courte à l’extrémité 3’. En général, une température de fusion de 55–

72 °C donne les meilleurs résultats (à noter que cela correspond à une longueur

d’amorce de 18–24 bases avec la règle de Wallace).

Séquences d’amorce complémentaires

Les amorces doivent être conçues absolument sans aucune homologie intra-amorce

au-delà de 3 paires de bases. Si une amorce possède une telle région d’auto-

homologie, des structures partiellement doubles brin en «épingles à cheveux»

peuvent se former, qui perturberont l’hybridation avec la matrice. Un autre risque

connexe est l’homologie inter-amorce. L’homologie partielle dans les régions

centrales de deux amorces peut interférer avec l’hybridation. Si l’homologie se situe

à l’extrémité 3’ de l’une ou de l’autre amorce, la formation de dimères d’amorce se

produira, ce qui, par compétition, empêchera le plus souvent la formation du produit

désiré.

Teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G)

Les amorces devraient être composées à 45-55 % de GC. La séquence d’amorce

doit être choisie de telle sorte qu’il n’y ait aucune suite poly-G ou poly-C pouvant

promouvoir une hybridation non spécifique. Les suites poly-A and poly-T doivent

également être évitées, car elles «respireront» et ouvriront des parties du complexe

amorce-matrice. Cela peut réduire l’efficacité de l’amplification. Les suites

polypyrimidine (T, C) et polypurine (A, G) devraient également être évitées.

Idéalement, l’amorce présentera un mélange presque aléatoire de nucléotides, une

teneur de 50 % en GC et une longueur d’environ 20 bases. La Tf se situera alors

entre 56 et 62 °C (Dieffenbach et al., 1995).



Séquence à l’extrémité 3’

Il est établi que la position terminale 3’ dans les amorces PCR est essentielle pour

empêcher le mésamorçage. Le problème des homologies d’amorce se produisant

dans ces régions a déjà été examiné. Une autre variable à considérer est l’inclusion

d’un résidu G ou C à l’extrémité 3’ des amorces. Ce « crampon GC » contribue à la

fixation correcte à l’extrémité 3’ en raison de la liaison hydrogène plus forte des

résidus G/C. Cela contribue également à une plus grande efficacité de la réaction en

réduisant au minimum la «respiration» qui pourrait se produire.

PCR spécialisée

Outre l’amplification d’une séquence d’ADN cible par les procédures PCR habituelles

déjà décrites, plusieurs types spécialisés de PCR ont été mis au point pour des

applications spécifiques.

PCR nichée

Des séries d’amorces successives peuvent être utilisées pour améliorer le

rendement PCR de la séquence d’ADN cible (Newton et Graham, 1994). La PCR

nichée est effectuée en 15 à 30 cycles avec une série d’amorces, puis en 15 à 30

cycles supplémentaires avec une deuxième série d’amorces, pour une région interne

du premier produit ADN amplifié. Ainsi, le plus grand fragment produit lors des

premiers cycles de la PCR est utilisé comme matrice pour la seconde PCR. La PCR

nichée peut augmenter considérablement la sensibilité et la spécificité de

l’amplification de l’ADN. La spécificité est particulièrement améliorée parce que cette

technique élimine presque toujours tout faux produit d’amplification non spécifique.

Cela est dû au fait qu’après la première PCR il est peu probable que les produits non

spécifiques soient suffisamment complémentaires des amorces successives pour

pouvoir servir de matrice pour une amplification supplémentaire, la séquence cible

désirée étant dès lors amplifiée préférentiellement. Toutefois, le risque accru de

contamination est un inconvénient de cette sensibilité extrême et l’exécution de ces

PCR doit avoir lieu avec le plus grand soin, particulièrement en laboratoire

diagnostique.



PCR multiplex

Alors que la PCR standard utilise généralement une paire d’amorces pour amplifier

une séquence spécifique, la PCR multiplex utilise des paires multiples d’amorces

pour amplifier simultanément un grand nombre de séquences. La présence de

nombreuses amorces PCR dans un seul tube pourrait poser beaucoup de

problèmes, tels que la formation accrue de produits PCR mésamorcés, de dimères

d’amorce et la discrimination d’amplification de fragments d’ADN plus longs (Atlas et

Bey, 1994).

Pour ce type d’amplification PCR, on choisit des amorces ayant des températures

d’hybridation semblables. Les longueurs des produits amplifiés devraient être

semblables; de grandes différences de longueur des ADN cibles favoriseront

l’amplification de la cible courte par rapport à la cible longue, ce qui aboutit à des

différences de rendement de produits amplifiés. En outre, les tampons utilisés pour la

PCR multiplex contiennent la polymérase Taq, qui diminue la compétition entre les

amplicons et la discrimination de fragments d’ADN plus longs pendant la PCR

multiplex.

Les produits de la PCR multiplex peuvent subir une hybridation supplémentaire avec

une sonde spécifique du gène pour vérification.

La PCR dans la pratique

Comme déjà indiqué dans les sections précédentes, la PCR est une puissante

technique analytique et préparatoire qui est largement utilisée. Cependant, en raison

de la nature de cette procédure, des traces de contaminants de l’ADN pourraient

servir de matrices, ce qui conduirait à l’amplification du mauvais acide nucléique

cible (faux positifs). Par conséquent, il est essentiel d’effectuer l’amplification PCR

dans un environnement exempt d’ADN. Les zones de travail physiquement séparées

et dotées d’équipements spécialisés réduisent le risque de contamination. Le respect

strict des exigences en matière de décontamination (décontamination des acides

nucléiques, prévention des aérosols, etc.) est la condition préalable la plus

importante pour réduire au maximum le taux de faux positifs. La contamination PCR

peut provenir de plusieurs sources:

• paillasses de laboratoire, équipements et dispositifs de pipetage, qui peuvent

être contaminés par des préparations ADN précédentes ou par des fragments

de restriction épurés,



• contamination croisée entre échantillons,

• produits d’amplifications PCR précédentes.

Cette section contient un certain nombre de recommandations, le but étant de définir

les exigences habituelles pour l’établissement et l’entretien d’un environnement

propre pour tout système de dosage basé sur la PCR, indépendamment du nombre

d’échantillons traités (Roth et al., 1997).

Méthodes physiques de prévention

Équipements de laboratoire. Afin d’éviter une contamination, des zones de travail

physiquement séparées devront être établies de la manière suivante.

1. Zone de préparation des échantillons

Cette pièce consiste en une zone où ont lieu toutes les étapes précédant

l’amplification de l’ADN matrice (par exemple, isolement et purification de l’ADN).

2. Zone de préparation de la PCR

Cette pièce «propre» est consacrée aux procédures de préparation de la PCR

(par exemple, mastermix, dilution des amorces, etc.).

3. Zone post-PCR

La zone est consacrée à l’amplification de la séquence d’ADN cible ainsi qu’à la

détection et à l’analyse des produits PCR.

En outre, il convient de respecter les règles générales suivantes.

• Toutes les pièces doivent contenir des équipements spécialisés (tabliers, gants,

réactifs et fournitures).

• Les réactifs et appareils doivent être étiquetés avec indication du contenu et de la

date de préparation.

• Utiliser un système de flux unidirectionnel, c’est-à-dire ne jamais transférer des

matières, des échantillons ou des équipements des zones post-PCR vers les

zones pré-PCR.

• Utiliser des tubes PCR jetables qui sont exempts de DNase et de RNase.

• Utiliser des embouts de pipette spéciaux résistants aux aérosols et un ensemble

de pipettes réservé exclusivement à la PCR, de préférence des pipettes à

déplacement positif.

• Si possible, préparer la PCR sous une hotte d’aspiration équipée d’un éclairage

UV. Sous la hotte d’aspiration, placer une microcentrifugeuse et des gants

jetables utilisés uniquement pour la PCR.



• Laver périodiquement les paillasses et les étagères à l’eau de Javel à 10 %, puis

à l’éthanol à 70 %.

Manipulation des échantillons

• Toujours utiliser des techniques stériles et porter des gants neufs lors du travail

dans les zones décrites précédemment. Changer les gants fréquemment,

particulièrement si on suspecte qu’ils ont été contaminés par des solutions

contenant l’ADN matrice.

• Toujours utiliser des ustensiles en verre/plastique et des pipettes neufs ou

stérilisés pour la préparation des réactifs PCR et de l’ADN matrice.

• Stériliser à l’autoclave tous les réactifs et solutions qui peuvent subir ce

traitement sans problème pour leur performance. Bien sûr, les amorces, les

dNTP et l’ADN polymérase Taq ne devront pas être stérilisés à l’autoclave.

• Avoir à disposition son propre ensemble de réactifs et de solutions PCR qui ne

sont utilisés que pour la PCR, et stocker ces réactifs en petites parties aliquotes.

• Lors du pipetage d’ADN, éviter de créer des aérosols qui peuvent transporter des

contaminants.

• Toujours prévoir des réactions de contrôle, par exemple un contrôle négatif («pas

d’ADN») qui contient tous les composants de la réaction sauf l’ADN matrice, et

un contrôle positif qui a été utilisé avec succès dans des PCR antérieures.

Méthodes biochimiques de prévention

Uracile-ADN glycosylase. La PCR peut amplifier un milliard de fois une seule

molécule. Par conséquent, même des quantités infimes d’un contaminant peuvent

être amplifiées et conduire à un faux positif. Ces contaminants sont souvent des

produits d’amplifications PCR antérieures (contamination par transfert). C’est

pourquoi des méthodes permettant d’éviter cette contamination ont été mises au

point.



Une méthode couramment utilisée consiste à substituer le dUTP au dTTP pendant

l’amplification PCR pour produire de l’ADN contenant de l’uracile (U-ADN) (Longo et

al., 1990). Le traitement des mélanges PCR par l’uracile-ADN glycosylase (UNG)

avant l’amplification PCR, suivi du clivage des polynucléotides pyrimidine à haute

température (95 °C) dans des conditions alcalines (pendant l’étape de dénaturation

initiale) débarrassera l’échantillon de l’U-ADN contaminant (voir Figure 8).

Figure 8. Réaction à l’uracile-ADN glycosylase

Cette méthode exige bien sûr que toutes les PCR dans le laboratoire soient

effectuées avec le dUTP au lieu du dTTP.

Remarques concernant l’utilisation de produits PCR contenant du dUTP dans les

applications en aval:

• les performances des produits PCR contenant du dUTP sont aussi bonnes que

celles des produits contenant du dTTP lorsqu’ils sont utilisés comme cibles

d’hybridation ou comme matrices pour le séquençage didésoxy;

• les produits PCR contenant du dUTP peuvent être clonés directement s’ils sont

transformés en hôtes bactériens reconnaissant l’UNG;

• un substrat contenant du dUTP est aisément digéré par certaines enzymes de

restriction courantes (EcoR I et BamH I, par exemple), tandis que d’autres

présentent une activité réduite (Hpa I, Hind II, Hind III, par exemple) sur ces

substrats;

• l’utilisation d’ADN contenant du dUTP n’est pas recommandée pour les études

sur la fixation des protéines ou les interactions ADN-protéines.



DNase I, exonucléase III. D’autres méthodes biochimiques sont basées sur le

traitement de l’ADN contaminé par la DNase I, l’exonucléase III ou par une enzyme

de restriction contenant une séquence de reconnaissance dans l’ADN cible.

Cependant, en raison des strictes conditions de réaction exigées, ces enzymes

présentent l’inconvénient de réduire l’efficacité de l’amplification PCR.

Préparation du mélange pour la réaction PCR (mastermix)

Les composants réactifs essentiels pour la PCR sont l’eau, le tampon de réaction,

une ADN polymérase thermostable, des amorces d’oligonucléotides, des

désoxynucléotides (dNTP), de l’ADN matrice (cible) et des ions magnésium (Mg2+).

En général, tous les réactifs (sauf l’ADN matrice) sont mélangés dans un seul tube

en quantités suffisantes pour le nombre de réactions à effectuer (mastermix). Le

mastermix est ensuite réparti en parties aliquotes dans plusieurs tubes et l’ADN

matrice est ajouté. L’utilisation d’une solution mastermix réduit le risque de

contamination et améliore la performance de la réaction PCR pour les raisons

suivantes:

• une qualité uniforme de la solution est garantie pour tous les réactifs pour une

série d’analyses,

• le risque de contamination du parent et des solutions résultantes est réduit,

• de plus grands volumes peuvent être prélevés par pipette,

• les pipetages sont moins nombreux, ce qui fait gagner du temps.

Le succès de l’amplification de la région d’intérêt dépend de la quantité et de la

qualité de l’ADN matrice. La quantité de matrice nécessaire dépend de la complexité

de l’échantillon d’ADN. Étant donné que la taille du génome nucléaire varie d’un

organisme à l’autre, la concentration en ADN doit être maintenue constante

(généralement 10 ng/µl). Au Tableau 3 figure une comparaison de la taille du

génome d’espèces végétales fréquemment utilisées dans la transformation de

plantes et du nombre correspondant de copies du génome dans une quantité définie

d’ADN.

Par exemple, dans un plasmide de 4 kb contenant un insert de 1 kb, 25 % de l’ADN

de départ constituent la cible d’intérêt. Inversement, un gène de 1 kb dans le génome

du maïs (5 x 109 pb) représente approximativement 0,00002 % de l’ADN de départ.

Environ 1 000 000 plus d’ADN génomique de maïs est nécessaire pour maintenir le

même nombre de copies cibles par réaction. Pour des résultats optimisés, plus de



104 copies de la séquence cible doivent être utilisées comme matrice initiale pour

obtenir un signal en 25–30 cycles.

Tableau 3. Comparaison de la taille du génome de certaines espèces végétales et copies correspondantes du génome dans une quantité définie d’ADN

Échantillon Taille du

génome

Copies du génome dans

1 µg d’ADN

Copies du génome dans

1 ng d’ADN

Maïs 5 x 109 pb 1,85 x 105 185

Soja 1,55 x 109 pb 5,98 x 105 598

Tabac 3,8 x 109 pb 2,43 x 105 245

Riz 4 x 108 pb 2,31 x 106 2 310

Même si, dans la pratique, moins de 10 copies d’une séquence cible peuvent être

amplifiées, dans ce cas davantage de cycles PCR peuvent être nécessaires pour

détecter un signal par électrophorèse sur gel. Les protocoles généraux couramment

appliqués considèrent un certain nombre de cycles de 30 à 40. Il convient d’être

prudent lorsqu’on augmente encore le nombre de cycles, car cela peut accroître

l’amplification non spécifique.

Contrôles

Comme indiqué dans la section précédente, on trouve des sources potentielles de

contamination partout dans le laboratoire. Les échantillons, le personnel du

laboratoire, la climatisation, les équipements et les réactifs peuvent tous être une

source de contamination. Parmi les agents contaminants, on peut citer les suivants:

1. contamination par transfert d’ADN cible amplifié lors de PCR antérieures;

2. contamination croisée entre échantillons, ce qui conduit au transfert d’ADN cible

d’un échantillon à l’autre;

3. ADN génomique de préparations d’échantillons antérieures;

4. produits de dégradation de réactions de décontamination.

Alors que les trois premières formes de contamination produisent des faux positifs, le

dernier type conduit à des faux négatifs. Cette forme de contamination, observée

pour la première fois par Niederhauser et collaborateurs en 1994, provoque

l’inhibition des réactions PCR (Niederhauser et al., 1994). En fait, la décontamination

selon la méthode UNG favorise la formation de complexes avec les amorces.



Pour obtenir des résultats fiables, des contrôles tant positifs que négatifs doivent

toujours être utilisés pendant une réaction PCR. Le Tableau 4 indique quelques-uns

des contrôles les plus couramment utilisés pour assurer la performance des

procédures d’amplification d’acide nucléique.

Tableau 4. Contrôles à introduire dans les tests basés sur la PCR

Contrôle Méthode

Contamination des réactifs par l’ADN cible

Contrôle négatif sans ADN matrice (seulement mastermix)

Spécificité de la réaction Contrôles pour trouver les produits secondaires et non spécifiques

Développement et sensibilité de la réaction

Contrôles positifs/négatifs pour vérifier que les conditions et les rendements désirés sont obtenus

Intégrité du mélange PCR Contrôle positif pour l’ADN

Contrôles positifs

L’efficacité de l’extraction de l’ADN et de son amplification doit être vérifiée au moyen

de contrôles positifs. Idéalement, les limites de détection devraient être données en

tant qu’équivalents génomiques, ce qui permettrait la production de contrôles à

sensibilité définie, avec de petits nombres de copies. En règle générale, il faut

disposer d’une préparation de référence contenant une concentration connue de

l’ADN cible à l’étude.

Contrôles négatifs

Une contamination (transfert de produits ou acides nucléiques amplifiés) peut se

produire pendant l’isolement et la purification de l’ADN cible, ainsi que pendant la

préparation du mélange de la réaction d’amplification. Il est donc nécessaire

d’ajouter un contrôle négatif au mélange de la réaction d’amplification.



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Module 7

Caractéristiques du soja Roundup Ready®, du maïs MON810 et du maïs Bt-176


Caractéristiques du soja Roundup Ready®, du maïs MON810 et du maïs Bt-176 2


Table des matières

Module 7

Caractéristiques du soja Roundup Ready®, du maïs MON810 et du maïs Bt-176

CARACTERISTIQUES DU SOJA ROUNDUP READY® 3 CARACTERISTIQUES DU MAÏS MON810 8 CARACTERISTIQUES DU MAÏS BT-176 12

REFERENCES 18



Caractéristiques du soja Roundup Ready®1

Identification

Désignation GTS 40-3-2

Demandeur Monsanto Canada Inc.

Espèce végétale Glycine max L. (soja)

Nouvelles

caractéristiques Tolérance nouvelle au glyphosate, matière active

de l’herbicide Roundup®

Méthode d’introduction

des caractéristiques Accélération de particules (biolistique)

Utilisation proposée Production de soja pour l’alimentation animale

(essentiellement de la farine déshuilée grillée et

des flocons) et la consommation humaine

(essentiellement de l’huile, des fractions

protéiques et des fibres alimentaires).

Contexte

Monsanto Canada Inc. a mis au point la lignée de soja GTS 40-3-2 afin de permettre

l’utilisation de glyphosate en tant que solution alternative pour le désherbage dans le

cadre de la production de soja.

La mise au point de la lignée GTS 40-3-2 repose sur la technique de l’ADN

recombinant, le principe consistant à introduire dans la variété commerciale de soja

« A5403 » (société Asgrow Seed) un gène EPSPS (5-énolpyruvyl-shikimate-3-

phosphate synthétase) tolérant au glyphosate, isolé de la souche CP4

d’Agrobacterium tumefaciens.

1 Source : Agence Canadienne d’Inspection des Aliments, Décision DD95-05.



Description des nouvelles caractéristiques

Tolérance au glyphosate

Le glyphosate, matière active du Roundup®, est un désherbant systémique de post-

levée utilisé dans le monde entier en tant qu’herbicide total. Le glyphosate agit en

tant qu’inhibiteur compétitif de la synthétase 5-énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate

synthétase (EPSPS), une enzyme essentielle de la voie métabolique du shikimate,

qui joue un rôle dans la production des acides aminés aromatiques phénylalanine,

tyrosine et tryptophane (Figure 1). Cette inhibition de l’EPSPS provoque un arrêt de

la croissance ainsi que la mort de la plante.

Le gène inséré conférant la tolérance au glyphosate code une version bactérienne

(dérivée de la souche CP4 de l’Agrobacterium tumefaciens) de cette enzyme

essentielle, omniprésente chez les végétaux, les champignons et les micro-

Phosphoénolpyruvate + Eritrose-4-phosphate

Shikimate-3-phosphate

Phosphoénolpyruvate

Phénylalanine Tyrosine Tryptophane

Glyphosate (Roundup) N-(phosphonométhyl) glycine

5-énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate

Figure 1 L’EPSPS catalyse la réaction du shikimate-3-phosphate et du phosphoénolpyruvate (PEP) pour former du 5-énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate (EPSP) et du phosphate. L’EPSP est un élément intermédiaire dans le cadre de la synthèse des acides aminés aromatiques. Suite à l’inhibition de cette voie métabolique, la synthèse des protéines est interrompue, provoquant la mort de la plante. L’EPSPS est la seule cible physiologique du glyphosate dans les plantes, et aucune autre enzyme utilisant du PEP n’est inhibée par le glyphosate.



organismes, et est extrêmement insensible au glyphosate, répondant ainsi aux

besoins métaboliques de la plante en matière d’acides aminés aromatiques.

Le gène EPSPS est sous le contrôle d’un puissant promoteur constitutif du virus de

la mosaïque du chou-fleur (P- CaMV E35S) et se termine par le terminateur du gène

de la nopaline synthase (T-nos) d’Agrobacterium tumefaciens (Figure 2). Une

séquence d’ADN d’origine végétale codant un peptide de transport vers les

chloroplastes (CTP4 de Petunia hibrida) a été clonée au 5’ du gène de tolérance au

glyphosate. Ce peptide signal, associé au gène EPSPS, facilite l’importation de

l’enzyme nouvellement traduite dans les chloroplastes, où sont situés à la fois la voie

métabolique du shikimate et les sites d’activité du glyphosate. Après son importation,

le peptide de transport est éliminé et rapidement dégradé par une protéase

spécifique.

L’EPSP synthétase est omniprésente dans la nature et ne devrait pas avoir d’effet

toxique ou allergène. Dans le cadre d’analyses comparatives avec des bases de

données sur les séquences de polypeptides toxiques ou allergènes, la séquence

d’acides aminés de l’enzyme ne présentait d’homologie majeure avec aucune toxine

ni aucun allergène connus.

Figure 2. Représentation schématique de la cassette génique du soja Roundup Ready® (modifié par Padgette et al., 1995).

Méthode de développement

La variété commerciale de soja A5403 (société Asgrow Seed) a été transformée par

le biais d’un processus de bombardement de particules d’or, à l’aide du vecteur

plasmidique PV-GMGT04 recueilli sur Escherichia coli (cf. Figure 3). Le plasmide PV-

GMGT04 contenait le gène EPSPS CP4 codant la tolérance au glyphosate, le gène

gus pour la production de ß-glucuronidase en tant que marqueur de sélection, et le

gène nptII pour l’antibiorésistance (kanamycine). Le transformant original sélectionné

présentait deux sites d’intégration, l’un avec le marqueur de sélection gus et l’autre

avec le gène de la tolérance au glyphosate. Il y a eu ségrégation indépendante de

CTP4 P-E35S CP4 EPSPS T-nos



ces deux sites à la génération sexuée suivante et une analyse a montré que la lignée

GTS 40-3-2 ne présentait qu’un seul site d’insertion dans lequel est uniquement

intégré le gène de la tolérance au glyphosate.

Figure 3. Carte plasmidique comprenant les éléments génétiques du vecteur PV-GMGT04 mis en œuvre dans le cadre de la transformation de la lignée 40-3-2 du soja RR (source : Monsanto, 2000)

Stabilité de l’insertion des nouvelles caractéristiques

Les données initiales (Padgette et al., 1995, 1996) indiquaient que la lignée GTS 40-

3-2 contenait une cassette génique fonctionnelle EPSPS CP4 unique, comprenant le

promoteur E35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), un peptide de

transport vers les chloroplastes, la séquence codante de l’EPSPS CP4 et le signal de

polyadénylation nos.

Aucune intégration d'une région codante de l’extérieur du gène de fusion par le

vecteur plasmidique original n’a été observée. Les générations suivantes n’ont révélé

aucune ségrégation supplémentaire du gène de fusion décrit ci-dessus, indiquant

que la lignée GTS 40-3-2 était homozygote pour ce dernier. Des analyses d’ADN sur

six générations ont démontré que l’intégration était stable.

Des études de caractérisation plus récentes ont montré que lors de l’introduction de

l’ADN, plusieurs réaménagements sont survenus, et qu’outre l’insert fonctionnel

primaire, la lignée 40-3-2 du soja Roundup Ready® contient deux petits segments



non fonctionnels d’ADN inséré, respectivement de 250 bp et 72 bp (Monsanto, 2000 ;

Windels et al., 2001).

Décision réglementaire

Le soja Roundup Ready® (RR) est actuellement la seule lignée de soja transgénique

homologuée pouvant être commercialisée dans l’UE. Après avoir été autorisée aux

Etats-Unis en 1994, l’importation dans l’Union Européenne a également été

accordée suite à la Décision 96/281/CE de la Commission du 3 avril 1996. Cette

décision prévoit l’importation de graines dans l’UE en vue de leur transformation en

produits non viables, englobant exclusivement l’alimentation animale, les produits

alimentaires et tout autre produit contenant des fractions de soja.



Caractéristiques du maïs MON8102

Identification

Désignation Maïs MON810 (appellation commerciale

YieldGard®)

Demandeur Monsanto Canada Inc.

Espèce végétale Zea mays L. (maïs)

Nouvelles

caractéristiques Résistance à la pyrale du maïs (Ostrinia nubilalis)


des caractéristiques

Accélération de particules (biolistique)

Utilisation proposée Production de Z. mays destiné à la consommation

humaine (mouture sèche ou humide ou huile de

graines), la production de farine et l’ensilage pour

l’alimentation animale.

Contexte

La société Monsanto Canada Inc. a créé une lignée de maïs MON810 (YieldGard®)

résistant spécifiquement à la pyrale du maïs (Ostrinia nubilalis), permettant ainsi de

réduire les pertes de rendement dues aux dégâts causés par la chenille de pyrale,

sans avoir à recourir aux pesticides classiques.

La lignée MON810 a été mise au point par la technique de l’ADN recombinant et en

bombardant les cellules végétales de microprojectiles, ce qui permet d’y introduire un

gène codant la production d’une protéine insecticide naturelle (dérivée du Bacillus

thuringiensis ssp. kurstaki). Cette protéine lutte activement contre certaines espèces

de lépidoptères (ordre d’insectes comprenant les papillons et les mites), dont la

pyrale du maïs. Plus précisément, la protéine de la lignée MON810 est une forme

tronquée de la protéine insecticide δ-endotoxine CRYIA(b), qui protège les plants de

maïs contre les dégâts dus à l’alimentation de la chenille de la pyrale au niveau des

feuilles et des tiges.

2 Source : Agence Canadienne d’Inspection des Aliments, Décision 97-19.




Résistance à la pyrale du maïs

Le Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki est une bactérie terricole à Gram positif qui

produit des endospores. Au stade de la sporulation, il produit (outre les endospores)

plusieurs cristaux de protéines insecticides, dont la protéine δ-endotoxine CRYIA(b),

qui lutte activement contre certains insectes lépidoptères comme la pyrale du maïs,

la tordeuse des bourgeons de l’épinette, la livrée, le bombyx disparate (connu

également sous le nom de spongieuse), la fausse teigne des crucifères, l’arpenteuse

du chou, la noctuelle verdoyante et la piéride du chou. Il a été démontré à maintes

reprises que cette protéine n’est pas toxique pour les humains, les autres vertébrés

et les insectes utiles (Lee et al., 1995).

La lignée MON810 a été transformée avec une copie du gène cryIA(b) sous le

contrôle du puissant promoteur constitutif 35S amélioré du virus de la mosaïque du

chou-fleur, et la séquence de tête de l’intron HSP70 du maïs (Figure 4).

La séquence codante cryIA(b) de la souche HD-1 du Bacillus thuringiensis ssp.

kurstaki a été modifiée afin d’optimiser l’expression de la protéine δ-endotoxine

CRYIA(b) des plantes. La protéine devient toxique pour les chenilles de lépidoptères

suite à une scission en plusieurs fragments, dont le noyau bioactif qui résiste à la

trypsine. On pense que l’activité insecticide résulte du fait que le fragment actif se

fixe à des récepteurs spécifiques situés au niveau des cellules épithéliales de

l’intestin moyen des insectes sensibles, ce qui provoque la formation de pores,

déséquilibre l’équilibre osmotique et finit par entraîner la lyse des cellules. Les

lépidoptères ravageurs du maïs spécifiquement sensibles à la protéine sont la pyrale

du maïs et le ver de l’épi de maïs.

La séquence d’acides animés de la toxine exprimée dans le maïs modifié s’est

révélée être identique à la séquence naturelle, et équivalente à la protéine produite

en tant que biopesticide répandu dans l’industrie des aliments biologiques.



Figure 4. Représentation schématique du gène chimère cryIA(b) du plasmide PV-ZMBK07 utilisé dans le cadre de la transformation de la lignée MON810, y compris le promoteur 35S amélioré du virus de la mosaïque du chou-fleur, l’intron 1 hsp70 du maïs et le gène synthétique δ-endotoxine cryIA(b) suivi du terminateur nos (modifié par le BATS, 2003).


La lignée MON810 résulte du génotype Hi-II du maïs à la suite d’une transformation

biolistique avec un mélange d’ADN plasmidiques : le plasmide PV-ZMBK07 porteur

du gène cryIA(b) (Figure 5) et le plasmide PV-ZMGT10 porteur des gènes EPSPS

CP4 et gox. Les deux plasmides étaient également porteurs du gène nptII (pour la

sélection bactérienne) sous le contrôle d’un promoteur bactérien, et une origine de

réplication d’un plasmide pUC (ori-pUC) nécessaire pour la réplication des plasmides

dans E. coli. Les deux vecteurs ont été introduits dans des cellules végétales

cultivées par bombardement de microprojectiles. Les cellules ayant ainsi acquis une

tolérance au glyphosate ont été sélectionnées puis cultivées dans un milieu de

culture tissulaire en vue de la régénération du végétal (Armstrong et al., 1991).

Des analyses moléculaires fournies par les auteurs indiquent que seuls les éléments

du gène chimère PV-ZMBK07 ont été intégrés dans le génome de la lignée MON810

en tant qu’insert unique, comprenant le promoteur 35S amélioré du virus de la

mosaïque du chou-fleur, la séquence de tête de la hsp70 et le gène tronqué cryIA(b).

Le signal de terminaison nos 3’, présent dans le plasmide PV-ZMBK07, s’est perdu

suite à une troncature 3’ de la cassette génique et n’a donc pas été intégré dans le

génome hôte (BATS, 2003).


Les données fournies par les auteurs montrent que la ségrégation et la stabilité

correspondaient avec un site d’insertion unique du gène cryIA(b) dans le génome

P-E35S hsp70 cryIA(b) T-nos



MON810. La stabilité de l’insertion a été confirmée par de nombreuses générations

de croisement.

Figure 5. Représentation schématique du plasmide PV-ZMBK07 utilisé pour la modification de la lignée MON810 (source : base de données Agbios sur la biosécurité essentielle)

La lignée de maïs a été croisée avec divers génotypes de maïs pendant 4

générations et a conservé ses propriétés de résistance contre la pyrale du maïs. La

lignée MON810 est issue de la troisième génération de rétrocroisement. La stabilité

de l’intégration de l’insert unique a été démontrée dans les trois générations par

analyse Southern Blot.


Les plantations de maïs (lignée MON810) ont été approuvées aux Etats-Unis en

juillet 1996 par l’Agence pour la protection de l’environnement. La commercialisation

de cette lignée de maïs dans l’Union Européenne a été autorisée suite à la Décision

98/294/CE de la Commission du 22 avril 1998.

L’Agence Canadienne d’Inspection des Aliments a émis la Décision 97-19 en vue de

son homologation en tant qu’aliment et fourrage. La lignée MON810 est également

homologuée en Argentine, en Australie, au Japon, en Afrique du Sud et en Suisse.

Cette lignée de maïs est destinée à la consommation humaine (mouture humide ou

sèche ou huile de graines), la production de farine et l’ensilage pour l’alimentation

animale.

CryIA(b)



Caractéristiques du maïs Bt-1763

Identification

Désignation Maïs Bt-176

Demandeur Ciba Seeds, filiale de Ciba-Geigy et Mycogen

Corporation

Espèce végétale Zea mays L. (maïs)

Nouvelles

caractéristiques

Résistance à la pyrale du maïs (Ostrinia nubilalis) ;

tolérance à l’herbicide glufosinate-ammonium


des caractéristiques Bombardement d’embryons immatures par

accélération de particules (biolistique)

Utilisation proposée Culture à titre de maïs-grain hybride

Contexte

Ciba Seeds et Mycogen Corporation ont mis au point conjointement une lignée de

maïs résistant à la pyrale du maïs. Cette lignée, baptisée Bt-176, a été transformée

par la technique de l’ADN recombinant et par bombardement d’embryons au moyen

de microprojectiles, afin qu’elle produise une protéine insecticide issue de Bacillus

thuringiensis ssp. kurstaki, active contre certaines espèces de lépidoptères (ordre

d’insectes comprenant les papillons et les mites), dont la pyrale du maïs. Cette

protéine, forme tronquée de la δ-endotoxine CRYIA(b), protège spécifiquement les

plants de maïs contre les dégâts dus à l’alimentation des chenilles de pyrale. De

plus, cette lignée de maïs a été co-transformée par l’ajout d’un gène conférant une

tolérance à l’herbicide glufosinate-ammonium, utilisé pour sélectionner les plantes

transformées à un stade très précoce de leur développement.


Résistance à la pyrale du maïs

Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki est une bactérie terricole à Gram positif qui

produit des endospores. Au stade de la sporulation, il produit (outre les endospores)

plusieurs cristaux de protéines insecticides, dont la protéine δ-endotoxine CRYIA(b),

3 Source : Agence Canadienne d’Inspection des Aliments, Décision DD96-09.



active contre certains insectes lépidoptères comme la pyrale du maïs, la tordeuse

des bourgeons de l’épinette, la livrée, le bombyx disparate (connu également sous le

nom de spongieuse), la fausse teigne des crucifères, l’arpenteuse du chou, la

noctuelle verdoyante et la piéride du chou. Il a été démontré à maintes reprises que

cette protéine n’est pas toxique pour les humains, les autres vertébrés et les insectes

utiles (Lee et al., 1995).

Un gène synthétique cryIA(b) a été élaboré à partir de la souche HD-1 de Bacillus

thuringiensis ssp. kurstaki, codant une forme tronquée de la δ-endotoxine CRYIA(b),

et modifié de manière à mieux s’exprimer chez le maïs. Ce gène synthétique

présente une homologie d’environ 65% au niveau des nucléotides avec le gène

naturel (Koziel et al., 1993). La protéine CRYIA(b) tronquée conserve la région

insecticide de la CRYIA(b) naturelle. On pense que l’activité insecticide résulte du fait

que le fragment actif se fixe à des récepteurs spécifiques situés au niveau des

cellules épithéliales de l’intestin moyen des insectes sensibles, ce qui provoque la

formation de pores, déséquilibre l’équilibre osmotique, entraîne la lyse des cellules,

interrompt l’alimentation de l’insecte et finit par le tuer.

Le maïs Bt-176 a été transformé par l’ajout de deux gènes chimères cryIA(b)

synthétiques. L’un est lié au promoteur de transcription de la phosphoénolpyruvate

carboxylase du maïs (P-PEPC), assurant son expression dans les tissus verts. Le

second est lié au promoteur d’une protéine kinase du maïs dépendante du calcium

(P-CDPK), assurant son expression dans le pollen. Ces deux chimères se terminent

par un terminateur du virus de la mosaïque du chou-fleur (T-CaMV 35S) et

comprennent également un intron 9 du gène phosphoénolpyruvate carboxylase du

maïs (cf. Figure 6 et Figure 7).

Figure 6. Représentation schématique du gène synthétique cryIA(b) sous le contrôle du promoteur CDPK (source : Matsuoka et al., 2000).

L’expression de la protéine CRYIA(b) dans les tissus verts vise à rendre la plante

résistante contre les chenilles de la pyrale de la première génération, qui se

P-CDPK cryIA(b)

Intr. PEPC N° 9

T-35S



nourrissent de feuilles. Son expression dans le pollen vise les chenilles de la pyrale

de la seconde génération, qui consomment du pollen.

La protéine CRYIA(b) produite par les feuilles de maïs Bt-176 a été soumise à des

essais de digestibilité in vitro en présence de substances simulant les sucs

gastriques des mammifères. On a constaté que cette protéine est digérée de la

même manière que les protéines normalement présentes dans le régime alimentaire.

Figure 7. Représentation schématique du gène synthétique cryIA(b) sous le contrôle du promoteur PEPC (source : Matsuoka et al., 2000).

Tolérance à l’herbicide glufosinate-ammonium

Le gène bar, conférant une tolérance au glufosinate-ammonium, provient d’une

bactérie terricole commune : Streptomyces hygroscopicus. Ce gène code la

phosphinotricine acétyltransférase (PAT) sous le contrôle de transcription du

promoteur constitutif 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, actif dans tous les

tissus de la plante, à l’exception du pollen. La phosphinotricine, un inhibiteur de la

glutamine synthétase, est la partie active du glufosinate-ammonium. L’activité

herbicide de la phosphinotricine se caractérise par une inhibition de la glutamine

synthétase, ce qui provoque une accumulation létale d’ammoniaque dans la plante.

La PAT catalyse l’acétylation de la phosphinotricine, éliminant ainsi l’activité

herbicide de cette dernière.

L’isomère L de la phosphinotricine (L-PPT) est couramment utilisé en tant

qu’herbicide total. Le L-PPT est la matière active de l’herbicide glufosinate-

ammonium mis au point par Hoechst et est connu sous le nom de BASTA. Cet

isomère est un analogue structural du glutamate, le substrat de la glutamine

synthétase (cf. la comparaison entre le L-PPT et le glutamate à la Figure 8).

T-35S cryIA(b)

Intr. PEPC N° 9

P-PEPC



O H H

CH3 — P — CH2 — CH2 — C — COOH HOOC — CH2— CH2 — C— COOH

OH NH2 NH2

Figure 8. L’isomère L de la phosphinotricine (à gauche) comparé au glutamate (à droite)

Le L-PPT était initialement isolé de Streptomyces viridochromogenes, qui synthétise

uniquement l’isomère L de la phosphinotricine. Le glufosinate-ammonium synthétique

est un mélange racémique équimolaire des isomères D et L du PPT (le D-PPT ne

présente aucune activité herbicide). On a démontré que la PAT agit spécifiquement

sur la phosphinotricine, aucune autre activité n’ayant été observée pour les autres

substrats ordinaires d’acétyltransférase, dont le pyruvate, la choline ou la sérine.

La PAT produite par E. coli a été soumise à des essais de digestibilité in vitro en

présence de substances simulant les sucs gastriques des mammifères. On a

constaté que cette protéine est digérée de la même manière que les protéines

normalement présentes dans le régime alimentaire.

Le gène de tolérance au glufosinate-ammonium a été co-introduit en tant que

marqueur de sélection afin que les embryons transformés puissent être identifiés en

milieu sélectif et que les gènes introduits puissent être suivis durant la sélection des

plantes. Selon un rapport de l’organisme Food Standards Australia New Zealand

(FSANZ, 2000), les données moléculaires ont révélé que la lignée Bt-176 contient

une copie du gène bar, sous le contrôle de transcription du promoteur 35S et du

terminateur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (respectivement P-CaMV 35S

et T-CaMV 35S) (Figure 9).

Figure 9. Représentation schématique du gène bar (source : Matsuoka et al., 2000)

P-35S

bar T-35S




Le maïs Bt-176 résulte de la transformation biolistique de la lignée de maïs

consanguine CG00526 (Zea mays L.) avec deux plasmides. Les deux gènes

chimères synthétiques cryIA(b) ont été insérés par clonage dans un même vecteur

plasmidique (pCIB4431). Un second vecteur plasmidique (pCIB3064) renfermait le

gène bar conférant la tolérance à l’herbicide, isolé de la bactérie terricole

Streptomyces hygroscopicus. Ces deux vecteurs ont ensuite été introduits dans la

lignée de maïs CG00526 par bombardement d’embryons immatures au moyen de

microprojectiles. Des analyses moléculaires de la plante transformée ont révélé

qu’au moins deux copies de chaque construction plasmidique ont pu s’insérer dans

le génome de la lignée de maïs. Des essais ainsi que des analyses Northern Blot ont

révélé que le gène conférant la résistance à l’ampicilline (gène bla), sous le contrôle

d’un promoteur bactérien (utilisé pour la sélection des vecteurs dans les milieux

bactériens) ne s’est exprimé ni dans les feuilles, ni dans le pollen de la plante. Deux

lignées de maïs transgénique indépendantes ont été sélectionnées en vue

d’améliorer le croisement et la caractérisation : 171 et 176 (Koziel, et al., 1993).

Des études de caractérisation supplémentaires ont confirmé la présence dans le

maïs Bt-176 des gènes cryIA(b) (Koziel et al 1993), bar et bla (Privalle, 1994). Les

données communiquées par Food Standards Australia New Zealand (FSANZ, 2000)

ont également révélé qu’il peut y avoir jusqu’à six copies des gènes cryIA(b) et bla

présents dans le Bt-176, et au moins deux copies du gène bar (avec le promoteur

35S), comme démontré par l’analyse de transfert d’ADN de type Southern contre

l’ADN du maïs Bt-176 (Privalle, 1994).


Selon Food Standards Australia New Zealand (FSANZ, 2000), la production de

protéines CRYIA(b) et PAT dans les feuilles et le pollen des plantes de serre a été

jugée stable sur quatre générations de rétrocroisement successives. Des analyses

de ségrégation ont révélé une co-ségrégation mendélienne des caractéristiques de

résistance à la pyrale du maïs et de tolérance à l’herbicide. Une étude de 3240

plantes a révélé que seules cinq d’entre elles (0,15%) ont été identifiées comme

étant tolérantes au glufosinate-ammonium mais susceptibles de subir des dégâts

causés par la chenille de la pyrale du maïs.




En août 1995, l’Agence pour la protection de l’environnement aux Etats-Unis a

approuvé à certaines conditions la commercialisation du maïs dérivé de la lignée

176, jusqu’à l’an 2000.

La commercialisation de cette lignée de maïs a été autorisée dans l’UE suite à la

décision 97/98/CE de la Commission du 23 janvier 1997. Cette lignée de maïs est

destinée à la culture, à la production de graines, à l’ensilage, à la production de

fourrage pour l’alimentation animale et à la production de graines en vue d’un

traitement industriel (Décision 97/98/CE de la Commission).



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(http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9719e.shtml) (Dernière


Décision 97/98/CE de la Commission du 23 janvier 1997 concernant la mise sur le

marché de maïs génétiquement modifié (Zea mays L.) ayant subi la modification

combinée lui assurant les propriétés insecticides conférées par le gène Bt-

endotoxine et une meilleure tolérance à l’herbicide glufosinate-ammonium, en

application de la directive 90/220/CEE du Conseil (JO L 31, 1.2.1997, p. 69).



Décision 96/281/CE de la Commission du 3 avril 1996 concernant la mise sur le

marché de fèves de soja (Glycine max L.) génétiquement modifiées pour

améliorer la résistance à l’herbicide glyphosate, présentée conformément à la

directive 90/220/CEE du Conseil (JO L 107, 30.4.1996, p. 10).

Décision 98/294/CE de la Commission du 22 avril 1998 concernant la mise sur le

marché de semences de maïs génétiquement modifié (Zea mays L. lignée

MON810) en application de la directive 90/220/CEE du Conseil (JO L 131,

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Module 8



Caractéristiques des systèmes PCR qualitatifs décrits dans le manuel 2


Table des matières

Module 8


CARACTERISTIQUES DES SYSTEMES PCR QUALITATIFS DECRITS DANS LE MANUEL 3 PCR SPECIFIQUE AUX PLANTES 3 DETECTION DU GENE LECTINE 3 DETECTION DU GENE ZEIN 3 METHODE DE CRIBLAGE : DETECTION DU PROMOTEUR CAMV 35S ET DU TERMINATEUR NOS 4 DETECTION DU PROMOTEUR CAMV 35S 5 DETECTION DU TERMINATEUR NOS 5 PCR SPECIFIQUE AUX OGM 7 DETECTION SPECIFIQUE DE LA CASSETTE GENIQUE CTP/EPSPS DANS LE SOJA ROUNDUP

READY® 7 DETECTION DU GENE SYNTHETIQUE CRYIA(B) DU MAÏS BT-176 7 DETECTION SPECIFIQUE DE LA CASSETTE PROMOTEUR E35S/EXON-INTRON HSP70 DU MAÏS

MON810 9

REFERENCES 11




Dans le cadre de cette formation, différents systèmes de détection seront utilisés :

1) des amorces spécifiques aux plantes seront utilisées pour confirmer la présence

et la qualité (amplifiabilité) de l’ADN extrait des échantillons ; 2) la méthode dite « de

criblage », basée sur la détection spécifique des séquences régulatrices les plus

courantes, du promoteur 35S et du terminateur nos. Ces deux méthodes seront

appliquées suivant un protocole PCR simple. Enfin, les amorces spécifiques aux

OGM seront utilisées dans la technique dite de « PCR nichée » pour la détection et

l’identification sélectives des différentes lignées transgéniques. Ce chapitre contient

une brève introduction aux différents systèmes utilisés pour la détection et la

caractérisation du soja Roundup Ready®, du maïs MON810 et du gène cryIA(b)

contenu dans le maïs Bt-176. Pour de plus amples informations concernant les

séquences et la composition des amorces, cf. la module 9.

PCR spécifique aux plantes

Détection du gène lectine

Pour identifier l’ADN du soja, on utilisera les amorces GMO3 et GMO4 (Meyer et al.,

1996), qui amplifient un fragment du gène lectine (Le1), spécifique du soja.

Comme indiqué ci-dessus, l’objectif consiste à confirmer la présence et la qualité de

l’ADN issu d'échantillons contenant du soja, où la qualité de l’ADN vise ici

l’amplifiabilité par PCR. Les amorces GMO3 et GMO4 utilisées dans ce test sont

issues de la PCR nichée (la seconde PCR de soja) présentée par Meyer et Jaccaud

(1997) sur l’ADN issu d'aliments traités. Le produit escompté est un amplicon de 118 bp.

Détection du gène zein

Les amorces ZEIN3 et ZEIN4 (Studer et al., 1997) spécifiques du gène zein du maïs

(Ze1, codant une protéine 10-kb) seront utilisées pour confirmer la présence et la

qualité de l’ADN issu des échantillons contenant du maïs. Comme pour le gène

lectine, les amorces ZEIN3 et ZEIN4 ont été conçues initialement en tant qu’amorces



internes (PCR secondaire) dans un système de PCR nichée en vue de détecter

l’ADN du maïs issu d'aliments transformés. Si l’ADN cible extrait est présent, intact et

amplifiable, on peut s'attendre à l’amplification d’une bande de 277 bp.

Méthode de criblage : détection du promoteur CaMV 35S et du terminateur nos

La détection du promoteur 35S et du terminateur nos par PCR constitue la méthode

dite « de criblage » en vue de l’identification d’aliments d’origine végétale

génétiquement modifiés. L’utilisation du promoteur 35S et du terminateur nos en tant

que séquences cibles permet de détecter la plupart des aliments génétiquement

modifiés, étant donné qu’ils sont présents jusqu’à présent dans quasiment toutes les

plantes génétiquement modifiées approuvées par l’UE (Hemmer, 1997). Les

caractéristiques de certaines lignées de maïs approuvées pour être commercialisées

dans l’UE sont listées dans le Tableau 1 à titre d’exemple. Les amorces spécifiques

au promoteur 35S et au terminateur nos employées dans le cadre de la formation ont

été utilisées pour valider une méthode PCR de détection du soja Roundup Ready®

et le maïs Maximizer (Bt-176) dans des fractions d’aliments transformés (Lipp et al.,

2001).

Tableau 1. Caractéristiques de certaines lignées de maïs transgénique dont la mise sur le marché dans l'UE est autorisée

Nom Société Nature Promoteur Gène(s) introduit(s) Terminateur

Lignée 176 Ciba-Geigy Bt, bar 35S

PEPC CDPK

bar cryIA(b)/int.9 PEPC cryIA(b)/int.9 PEPC

35S 35S 35S

Lignée Bt-11 Novartis Bt, pat 35S cryIA(b)/int. IVS6 nos

Lignée T25 AgrEvo pat 35S pat 35S

Lignée MON810 Monsanto Bt E35S

E35S cryIA(b)/int.hsp70 cryIA(b)/int.hsp70

- -



Détection du promoteur CaMV 35S

Ce promoteur régule l’expression génique d’un grand nombre de plantes

transgéniques, par exemple le soja Roundup Ready® et la lignée de maïs Bt-176.

Les amorces p35S-cf3 et p35S-cr4 seront utilisées en vue de sa détection

spécifique (Lipp et al., 2001). L’amplicon escompté est un fragment de 123 bp

comme indiqué ci-dessous à la Figure 1, où les amorces p35S-cf3 et p35S-cr4 ont

été placées dans la région correspondante de la séquence du promoteur CaMV 35S. ID A18053_3; parent: A18053 AC A18053; FT promoteur 396..1779 FT /note="séquence promoteur 35S3 résultant du virus FT de la mosaïque du chou-fleur isolé CabbB-JI" SQ Séquence 1384 BP; nnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn nnnnnnnnn 1140 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 1200 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg 1260 p35S-cf3 atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 1320 p35S-cr4 atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat 1380 aacc 1384 //

Figure 1. Séquence partielle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et sites d’hybridation des amorces p35S-cf3 et p35S-cr4

Détection du terminateur nos

Les amorces HA-nos118-f et HA-nos118-r (Lipp et al., 2001) sont utilisées pour

détecter le terminateur nos. Le terminateur nos est présent dans le soja Roundup

Ready® et d'autres lignées de plantes transgéniques (par ex. lignée de maïs Bt-11).

L’amplification du terminateur nos entraînera la production d’un fragment d’ADN de

118 bp. Dans la Figure 2, les amorces HA-nos118-f et HA-nos118-r ont été placées

à l’intérieur de la séquence de la partie transgénique du soja Roundup Ready®.



Soja Roundup Ready® de Monsanto Séquence de la partie transgénique selon le brevet WO 92/04449

HA-nos118-r > 151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc

201 gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt

< HA-nos118-f 251 attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat

301 aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag

351 aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga

/ / 1601 gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg

1651 ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc

GM09 > 1701 gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga

1751 cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg

1801 cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact

1851 gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt

1901 tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa

GM08 > 1951 aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa

2001 ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat

p35S-cr4 > 2051 tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga

< GM07 2101 aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg

< GM05 < p35S-cf3 2151 tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg

2201 aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg

2251 ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt

2301 tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta

2351 tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt

2401 ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg

Figure 2. Séquence de la partie transgénique du soja Roundup Ready® de Monsanto selon le brevet WO 92/04449



PCR spécifique aux OGM

Les amorces d’amplification utilisées pour l’identification du soja Roundup Ready®,

du maïs Bt-176 et du maïs MON810 ont été choisies pour leur capacité à détecter

d’une manière spécifique la structure génétique insérée respectivement dans les

génomes du soja Roundup Ready®, du maïs Bt-176 et du maïs MON810.

Détection spécifique de la cassette génique CTP/EPSPS dans le soja Roundup Ready®

Les paires d’amorces GMO9/GMO5 et GMO8/GMO7 ont été conçues en vue de la

détection spécifique du transgène de soja Roundup Ready® par PCR nichée (Meyer

et Jaccaud, 1997). Les amorces externes GMO9 et GMO5 sont complémentaires de

la séquence d’ADN correspondant au gène EPSPS CP4 et au promoteur CaMV 35S.

L’amplification d’ADN avec ces deux amorces entraîne un amplicon de 447 bp. Les

amorces internes, GMO8 et GMO7, sont complémentaires du gène pétunia epsps et

du promoteur CaMV 35S. L’amplification d’ADN avec ces amorces internes entraîne

un fragment de 169 bp, comme indiqué à la Figure 2.

Détection du gène synthétique cryIA(b) du maïs Bt-176

Les paires d’amorces CRYIA1/CRYIA2 et CRYIA3/CRYIA4 ont été conçues pour la

détection spécifique du gène synthétique cryIA(b) par PCR nichée (Studer et al.,

1997). Les amorces externes CRYIA1 et CRYIA2 ainsi que les amorces internes

CRYIA3 et CRYIA4 sont complémentaires de la séquence d’ADN du gène cryIA(b).

Comme indiqué à la Figure 3, les deux amorces externes (CRYIA1/CRYIA2)

délimitent un fragment de 420 bp, tandis que les amorces CRYIA3/CRYIA4

produisent un fragment de 189 bp.



ID I41419 standard; ADN; UNC; 1947 BP. AC I41419; ……… DE Séquence 3 du brevet US 5625136. ……… RA Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola S.V., RA Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J., RA Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.; RT "Séquence d’ADN synthétique ayant une activité insecticide améliorée dans le maïs"; RL Brevet N° US5625136-A/3, 29-AVR-1997. ……… FT source 1..1947 FT /db_xref="taxon:12908" FT /organisme="non classifié" SQ Séquence 1947 BP; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 autre; atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60 gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120 agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180 gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240 gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300 gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360 cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420 ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480 tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540 cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600 ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660 cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720 ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780 agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840 cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900 aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960 atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020 CRYIA1 amorce avant PCR ext. atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080 accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140 CRYIA3 amorce avant PCR interne (nichée) agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200



taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260 CRYIA4 amorce inverse PCR interne (nichée) ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320 agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380 gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440 CRYIA2 amorce inverse PCR externe aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500 cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560 cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620 atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680 ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740 agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800 cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860 cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920 accgactacc acatcgatca ggtgtag

Figure 3. Gène cryIA(b) optimisé inséré dans le maïs Bt-176 : séquence du gène cryIA(b) SEQ ID N° 3 selon le brevet US N° 5625136 et Accès à la Banque de Gènes N° 141419

Détection spécifique de la cassette promoteur E35S/exon-intron hsp70 du maïs MON810

Les paires d’amorces mg1/mg2 et mg3/mg4 ont été conçues pour la détection

spécifique de la cassette E35S/exon-intron 1 hsp70 par PCR nichée (Zimmermann et

al., 1998). Cette construction génique est spécifique au maïs MON810. Les amorces

externes mg1 et mg2 s’hybrident respectivement à la séquence du promoteur E35S

et de la région intron 1 de la hsp70, tandis que les amorces internes sont

respectivement complémentaires de la séquence d’ADN du promoteur E35S et de la

région exon 1 de la hsp70. Comme indiqué à la Figure 4, les deux amorces externes

(mg1/mg2) produisent un fragment de 401 bp, tandis que les amorces mg3/mg4

produisent un fragment de 149 bp.



Figure 4. Représentation schématique d’une partie de la cassette du maïs MON810, y compris le promoteur CaMV 35S amélioré et l’intron hsp70 du maïs, et position relative des amorces mg1, mg2, mg3, et mg4 (modifié par Zimmermann et al., 1998)

Plant ADN

401 bp

149 bp mg1 mg2

mg3 mg4

P-E35S

exon 1 hsp70

exon 2 hsp70

intron 1 hsp70

intron hsp70



Références

Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and

Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts

of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61 pages.

http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (Dernière






Meyer, R., Chardonnens, F., Hubner, P. and Luthy, J. (1996). Polymerase chain

reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya in

processed meat products. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -

Forschung A 203, 339-344.

Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in

processed food products: development and validation of a PCR assay for the

specific detection of Glyphosate-Tolerant Soybeans. Proceedings of the EURO

FOOD CHEM IX Conference, Interlaken, Switzerland, Event No. 220 1, 23–28.

Studer, E., Dahinden, I., Lüthy, J. and Hübner, P. (1997). Nachweis des

gentechnisch veränderten “Maximizer"-Mais mittels der Polymerase-

Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und

Hygiene 88, 515–524.

Zimmermann, A., Liniger, M., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). A sensitive detection

method for genetically modified MaisGardTM corn using a nested-PCR system.

Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 31, 664-667.






Module 9


M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready® par PCR 2


Table des matières

Module 9


EXPERIMENTATION 3

INTRODUCTION 3

PCR SPECIFIQUE AUX PLANTES : LECTINE DE SOJA 6 PCR SPECIFIQUE AUX PLANTES : ZEIN DU MAÏS 10 METHODE DE CRIBLAGE POUR LA DETECTION DE PLANTES GENETIQUEMENT MODIFIEES 13 DETECTION DU PROMOTEUR 35S 13 DETECTION DU TERMINATEUR NOS 16 DETECTION SPECIFIQUE DU MAÏS MON810, DU MAÏS BT-176 ET DU SOJA ROUNDUP READY® PAR

PCR NICHEE 19 DETECTION DU MAÏS MON810 19 DETECTION DU MAÏS BT-176 23 DETECTION DU SOJA ROUNDUP READY® 27



Expérimentation

Introduction Les protocoles suivants sont des méthodes basées sur la technique PCR permettant le

criblage des OGM (à l’aide du promoteur 35S et du terminateur nos) ainsi que la détection

d’OGM spécifiques (soja Roundup Ready®, maïs MON810 et maïs Bt-176) dans les

matières premières et transformées, en les comparant avec des échantillons correspondants

qui ne sont pas génétiquement modifiés (soja et maïs).

Les méthodes suivantes permettent uniquement d’obtenir un résultat qualitatif indiquant la

présence ou l’absence de la séquence cible dans l’échantillon.

Equipement

• Micropipettes

• Thermocycleur


• Agitateur vortex

• Portoir pour tubes de réaction

• Tubes de réaction PCR de 0,2 ml

• Tubes microcentrifuges de 1,5 ml

• Chambre stérile séparée avec capot UV

REMARQUE L’ensemble de l’équipement doit être exempt d’ADN et, dans la mesure du possible, stérilisé

avant toute utilisation.

Afin d’éviter toute contamination, il convient d’utiliser des pipettes dont les extrémités

comportent des filtres de protection contre la formation éventuelle d’aérosols.

Réactifs

• dATP CAS1923-31-7

• dCTP CAS102783-51-7

• dGTP CAS93919-41-6

• dTTP CAS18423-43-3

• Tampon PCR 10x (généralement livré par le même fournisseur que l’ADN

polymérase Taq)



• 25 mM de MgCl2

• ADN polymérase Taq

• Oligonucléotides amont et aval

• Huile minérale (requise en cas d’utilisation d’un thermocycleur sans couvercle chaud)

• Eau exempte de nucléase

Solution mère de 4 mM de dNTP

• Les dNTP peuvent être fournis en solutions pré-mélangées, contenant des

concentrations équivalentes de dATP, de dCTP, de dGTP et de dTTP, ou séparés en

solutions concentrées individuelles. Si les solutions individuelles sont utilisées,

chaque dNTP doit être dissous dans de l’eau déionisée stérile afin d’obtenir une

solution mère finale de 4 mM de dNTP.

• Diviser en parties aliquotes et conserver à -20 °C. Les dNTP restent stables pendant

plusieurs mois.

Solution d’amorce de 20 µM

Les oligonucléotides d’amorce sont généralement fournis sous forme lyophilisée et doivent

être dilués jusqu’à une concentration finale de 20 µM.

• Préparer une solution d’amorce de 20 µM en tenant compte des consignes du

fournisseur.

- 1 µM = 1 pmol/µl so 20 µM = 20 pmol/µl

- Xnmol d’amorce + 10X µl d’eau stérile = 100 pmol/µl = 100 µM

- Incuber pendant 5 mn à 65 °C, remuer et incuber pendant encore 3 mn à 65 °C

- Dilution 1:5 → Préparer 1 tube microcentrifuge avec 400 µl d’eau stérile et ajouter

100 µl de la solution d’amorce (100 µM) → Concentration finale : 20 µM

• Diviser en petites parties aliquotes et conserver à -20 °C. Les parties aliquotes

conservées à -20 °C restent stables pendant au moins 6 mois ; les amorces

lyophilisées restent stables à -20 °C pendant trois ans maximum.



Tampon PCR 10x

• En général, le tampon PCR 10x, contenant 500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl

(pH 9,0 à 25 °C) et 1% de Triton X-100 est fourni avec l’ADN polymérase Taq et est

prêt à être utilisé. Le tampon doit être mélangé et centrifugé rapidement avant

chaque utilisation.

• Les parties aliquotes sont stockées à -20 °C et restent stables pendant plusieurs

mois.

Solution de 25 mM de MgCl2

Une solution de MgCl2 de « classe PCR » est généralement fournie avec l’ADN polymérase

Taq et est prête à être utilisée. La solution doit être mélangée (vortex) avant chaque

utilisation et centrifugée rapidement (destruction du gradient de concentration pouvant se

former en cas de conservation prolongée). Conserver à -20 °C.

Parties aliquotes d’eau exempte de nucléase

Les parties aliquotes d’eau déionisée stérile exempte de nucléase sont préparées pour le

Mastermix et la dilution de l’ADN. Il convient d’utiliser une nouvelle partie aliquote pour

chaque série d’analyses.



PCR spécifique aux plantes : lectine de soja L’identification de l’ADN du soja s’effectue en ciblant le gène lectine.

La PCR avec les amorces GMO3/GMO4 permet de déterminer si l’échantillon contient ou

non de l’ADN de soja amplifiable.

Caractéristiques des amorces GMO3 et GMO4

GMO3 Séquence GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Longueur 22 Poids moléculaire (g/mol) 6471,6 Point de fusion * (G/C) 65,1

GMO4 Séquence GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Longueur 23 Poids moléculaire (g/mol) 6981,1 Point de fusion * (G/C) 59,6

*sur la base d’un [Na+] de 50 mM

Contrôles

Il est impératif d’effectuer des essais pour chaque analyse PCR. Les contrôles négatifs

permettent de vérifier si les réactifs PCR sont contaminés par de l’ADN. Les contrôles

positifs avec des échantillons caractérisés sont également essentiels pour déterminer

l’efficacité et la spécificité de la PCR.

Les contrôles suivants doivent être effectués dans le cadre de l’analyse réalisée avec la

PCR :

• Contrôle positif : ADN pur, isolé du soja classique

• Contrôle négatif : ADN pur, isolé des autres variétés, exempt du gène lectine

• Absence de matrice : contrôle négatif du Mastermix, où l’ADN est remplacé par

de l’eau



Préparation du Mastermix

Les réactifs requis pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles

positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du

Tableau 1.

La procédure suivante s’applique à un échantillon contenant 48 µl de Mastermix

GMO3/GMO4 et 2 µl d’une solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la

glace durant la préparation du Mastermix.

Tableau 1. Mastermix GMO3/GMO4

Concentrationfinale

Mastermix pour un

échantillon

Mastermix pour 10

échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides GMO3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides GMO4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl

TOTAL 48 µl 480 µl

• Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml

• Ajouter les réactifs suivant les consignes énoncées dans le Tableau 1

• Mélanger doucement le Mastermix GMO3/GMO4 en pipetant et centrifuger brièvement

• Diviser le Mastermix en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de

0,2 ml

• Ajouter 2 µl de la solution d’ADN aux parties aliquotes précédentes

• Mélanger doucement et centrifuger brièvement

• Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur



Programme PCR* (GMO3/GMO4)

Température Durée Dénaturation initiale 95 ˚C 3 mn

Dénaturation 95 ˚C 30 s Hybridation 63 ˚C 30 s Extension 72 ˚C 30 s Nombre de cycles 40 Extension finale 72 ˚C 3 mn 4 ˚C ∞

Suite à l’amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace.

* Note : Durant la formation, les thermocycleurs Perkin Elmer Gene Amp PCR system

9600, ABI 9700 seront utilisés. L’utilisation d’autres modèles ou marques de

thermocycleurs permettra d’obtenir les mêmes résultats, à condition que les

programmes PCR soient adaptés et testés en conséquence1.

Analyse des produits de PCR

Après amplification de la séquence cible, les produits de la PCR sont analysés par

électrophorèse sur gel d’agarose en présence de bromure d’éthidium. 8 µl d’une PCR sont

mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; les échantillons sont ensuite chargés sur le gel

d’agarose (1,5%). La migration s’effectue à 100 V pendant une durée d’1 heure. Des étalons

de masse moléculaire (15 µl d’échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin

de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l’opération, une transillumination

avec lumière UV permet de visualiser l’ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin

de fournir un enregistrement permanent du résultat de l’essai.

1 Le CCR et l’OMS n’approuvent aucun équipement utilisé dans le cadre des formations ou mentionné dans ce manuel. Les analyses effectuées dans nos laboratoires doivent pouvoir être reproduites facilement à l’aide d’équipements différents, à condition de prendre en compte les caractéristiques divergentes du système utilisé.



Interprétation des résultats

La paire d’amorces GMO3/GMO4 pour la détection du gène lectine naturel est utilisée en

tant que contrôle du système ; la présence d’une bande spécifique lectine à 118 pb confirme

la qualité de l’ADN extrait.

Le contrôle positif amplifiera une bande à 118 pb. Le contrôle négatif et l’absence de matrice

ne devraient pas donner de bande visible.

Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l’analyse PCR des

échantillons sélectionnés n’est pas valable.

Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l’échantillon n’a pas de bande à

118 pb, cela signifie que cet échantillon ne contient pas d’ADN de soja amplifiable. Il est à

noter que ce protocole ainsi que d’autres protocoles décrits dans ce module sont des

méthodes qualitatives et ne permettent par conséquent d’obtenir que des résultats qualitatifs

(oui/non).



PCR spécifique aux plantes : zein du maïs

L’identification de l’ADN du maïs implique le ciblage du gène zein.

La PCR avec les amorces ZEIN3/ZEIN4 détermine si l’échantillon contient de l’ADN de maïs

présentant une qualité suffisante pour son amplification.

Caractéristiques des amorces ZEIN3 et ZEIN4

ZEIN3 Séquence AGTGCGACCCATATTCCAG Longueur 19 Poids moléculaire (g/mol) 5772,3 Point de fusion * (G/C) 55,2

ZEIN4 Séquence GACATTGTGGCATCATCATTT Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6410,9 Point de fusion * (G/C) 51,7


Contrôles

• Contrôle positif : ADN pur, isolé du maïs classique

• Contrôle négatif : ADN pur, isolé des autres espèces, exempt de gène zein


de l’eau


Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles


Tableau 2.


ZEIN3/ZEIN4 et 2 µl de solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace

durant la préparation du Mastermix.



Tableau 2. Mastermix ZEIN3/ZEIN4

Concentrationfinale

Mastermixpour un

échantillon

Mastermix pour 10 échantillons

Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides ZEIN3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides ZEIN4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl


• Ajouter les réactifs dans l’ordre indiqué au Tableau 2

• Mélanger doucement le Mastermix ZEIN3/ZEIN4 en pipetant et centrifuger brièvement


0,2 ml




Programme PCR (ZEIN3/ZEIN4)

Température Durée Dénaturation initiale 95 ˚C 3 mn Dénaturation 96 ˚C 1 mn Hybridation 60 ˚C 1 mn Nombre de cycles 40 Extension finale 72 ˚C 3 mn 4 ˚C ∞

Après l’amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace.



Analyse des produits de la PCR

Après amplification de l’ADN, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur

gel d’agarose en présence de bromure d’éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2

µl de tampon de charge. Le mélange est ensuite chargé sur un gel d’agarose (1,5%). La

migration doit s’effectuer à 100 V pendant une durée d’1 heure. Des étalons de masse

moléculaire (15 µl d’échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de

déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l’opération, une transillumination




La paire d’amorces ZEIN3/ZEIN4 est utilisée pour détecter le gène zein naturel du maïs en

tant que contrôle de la qualité d’amplification de l’ADN extrait. Si la qualité d’amplification de

l’ADN extrait est suffisante, une bande spécifique zein de 277 pb sera observée sur le gel.

Le contrôle positif doit également s’amplifier en présentant une taille de bande de 277 pb.

Le contrôle négatif et l’absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible.



Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l’échantillon n’a pas de bande à

277 pb, cela signifie que cet échantillon ne contient pas d’ADN de maïs amplifiable.



Méthode de criblage pour la détection de plantes génétiquement modifiées Les gènes sont régulés par des promoteurs et des terminateurs. Les séquences les plus

répandues pour la régulation d’un transgène sont le promoteur 35S (dérivé du CaMV) et le

terminateur nos (dérivé du Agrobacterium tumefaciens). L’identification de l’une de ces

séquences régulatrices dans un échantillon contenant du soja et/ou du maïs dont le cas est

à l’étude indique la présence d’OGM.

Dans le cas du soja Roundup Ready®, l’identification du promoteur 35S et du terminateur

nos est possible, alors que seul le promoteur 35S est présent dans les lignées de maïs Bt-

176 et MON810.

Détection du promoteur 35S

Caractéristiques des amorces p35S-cf3 et p35S-cr4

p35S-cf3 Séquence CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6414,5 Point de fusion * (G/C) 57,4

p35S-cr4 Séquence TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7544,2 Point de fusion * (G/C) 56,3


Contrôles

• Contrôle positif : ADN de la matière de référence (maïs 0,5% GM)

• Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (maïs 0% GM)


de l’eau






Tableau 3.

La procédure suivante s’applique à un échantillon contenant 48 µl de Mastermix p35S-

cf3/p35S-cr4 et 2 µl de solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace


Tableau 3. Mastermix p35S-cf3/p35S-cr4

Concentrationfinale

Mastermix pour un échantillon

Mastermix pour 10

échantillons

Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides p35S-cf3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides p35S-cr4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Mélanger doucement le Mastermix p35S-cf3/p35S-cr4 en pipetant et centrifuger

brièvement


0,2 ml






Programme PCR (p35S-cf3/p35S-cr4)

Température Durée Dénaturation initiale 95 ˚C 3 mn Dénaturation 95 ˚C 25 s Hybridation 62 ˚C 30 s Extension 72 ˚C 45 s Nombre de cycles 50 Extension finale 72 ˚C 7 mn 4 ˚C ∞



Après l’amplification, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel

d’agarose en présence de bromure d’éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl

de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur le gel d’agarose (2,5%). La







La paire d’amorces p35S-cf3/p35S-cr4 est utilisée pour détecter le promoteur CaMV 35S,

produisant un fragment de 123 pb. Ce promoteur régule l’expression génique d’un grand

nombre de plantes transgéniques comme le soja Roundup Ready® soja et la lignée de maïs

Bt-176.

Le produit d’amplification du contrôle positif présentera une bande à 123 pb. Le contrôle

négatif et l’absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles

positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l’analyse PCR des échantillons

sélectionnés n’est pas valable.

Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l’échantillon donne une bande à

123 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l’ADN modifié.



Détection du terminateur nos

Caractéristiques des amorces HA-nos 118-f et HA-nos 118-r

HA-nos 118-f Séquence GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Longueur 24 Poids moléculaire (g/mol) 7462,8 Point de fusion * (G/C) 56,2

HA-nos 118-r Séquence GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Longueur 24 Poids moléculaire (g/mol) 7296,9 Point de fusion * (G/C) 61,2


Contrôles

• Contrôle positif : ADN de la matière de référence (RRS 0,5% GM)

• Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (soja 0% GM)


de l’eau




Tableau 4.

La procédure suivante s’applique à un échantillon contenant 48 µl de Mastermix HA-nos118-

f/HA-nos118-r et 2 µl de solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace




Tableau 4. Mastermix HA-nos118-f/HA-nos118-r

Concentrationfinale

Mastermixpour un

échantillon


Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides HA-nos118-f 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides HA-nos118-r 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Mélanger doucement le Mastermix HA-nos118-f/HA-nos118-r en pipetant et centrifuger

brièvement


0,2 ml




Programme PCR (HA-nos118-f/HA-nos118-r)








de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur un gel d’agarose (2,5%). La







La paire d’amorces HA-nos118-f/HA-nos118-r est utilisée pour détecter le terminateur nos,

produisant un fragment de 118 pb. Ce terminateur est présent dans le soja Roundup

Ready® et d’autres lignées de plantes transgéniques (par ex. la lignée de maïs Bt-11).

Le contrôle positif s’amplifiera en présentant une bande à 118 pb.





118 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l’ADN modifié.



Détection spécifique du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready® par PCR nichée

Détection du maïs MON810 Le système de détection est spécifique au maïs MON810. Les éléments cibles sont le

promoteur CaMV 35S et la région exon1/intron1 hsp70, qui sont respectivement une

séquence régulatrice constitutive et un gène de protéine de choc thermique pour un niveau

de transcription accru.

Caractéristiques des amorces mg1, mg2, mg3 et mg4

mg1 Séquence TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7665,1 Point de fusion * (G/C) 59,6

mg2 Séquence TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7560,2 Point de fusion * (G/C) 57,9

mg3 Séquence ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7472,2 Point de fusion * (G/C) 61,2

mg4 Séquence GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7722,9 Point de fusion * (G/C) 59,6




Contrôles

• Contrôle positif : ADN de la matière de référence (MON810 0,1%)



de l’eau

Préparation du Mastermix n° 1



Tableau 5.

La procédure suivante s’applique à un échantillon contenant 48 µl de Mastermix mg1/mg2 et

2 µl de solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans de la glace durant la

préparation du Mastermix.

Tableau 5. Mastermix mg1/mg2

Concentrationfinale

Mastermixpour un

échantillon


Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides mg1 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides mg2 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Mélanger doucement le Mastermix mg1/mg2 en pipetant et centrifuger brièvement


0,2 ml






Programme PCR (mg1/mg2)

Température Durée Dénaturation initiale 95 ˚C 3 mn Dénaturation 95 ˚C 45 s Hybridation Extension

60 ˚C 72 ˚C

50 s 50 s

Nombre de cycles 35 Extension finale 72 ˚C 3 mn 4 ˚C ∞



Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons sont mélangés conformément

aux instructions du Tableau 6. La procédure suivante s’applique à un échantillon contenant

49 µl de Mastermix mg3/mg4 et 1 µl de solution d’ADN pré-amplifiée de la première PCR.

Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du Mastermix.

Tableau 6. Mastermix mg3/mg4

Concentrationfinale

Mastermixpour un

échantillon


Eau déionisée stérile 33,75 µl 337,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides mg3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides mg4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl



• Mélanger doucement le Mastermix mg3/mg4 en pipetant et centrifuger brièvement




0,2 ml




Programme pour la PCR nichée (mg3-mg4)


Dénaturation 95 ˚C 45 s Hybridation Extension

60 ˚C 72 ˚C

50 s 50 s













Les paires d’amorces mg1/mg2 et mg3/mg4 ont été mises au point pour détecter

spécifiquement la lignée MON810 par PCR nichée, produisant un fragment final de 149 pb.

La spécificité réside dans le fait que les amorces sont conçues dans la région couvrant le

promoteur E-35S et le gène exon/intron hsp70. Le contrôle positif s’amplifiera en présentant



une bande à 149 pb. Le contrôle négatif et l’absence de matrice ne devraient pas donner de

bande visible.




149 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l’ADN de maïs MON810.

Détection du maïs Bt-176 Le gène cible est le gène cryIA(b), qui protège la plante contre les insectes tels que la pyrale

du maïs.

Caractéristiques des amorces CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 et CRYIA4

CRYIA1 Séquence CGGCCCCGAGTTCACCTT Longueur 18 Poids moléculaire (g/mol) 5394,6 Point de fusion * (G/C) 59,5

CRYIA2 Séquence CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6519,2 Point de fusion * (G/C) 57,6

CRYIA3 Séquence CCGCACCCTGAGCAGCAC Longueur 18 Poids moléculaire (g/mol) 5397,6 Point de fusion * (G/C) 61,7

CRYIA4 Séquence GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6479,2 Point de fusion * (G/C) 57,6




Contrôles

• Contrôle positif : ADN de la matière de référence (Bt-176 0,1%)



de l’eau




Tableau 7. La procédure suivante s’applique à un échantillon contenant 48 µl de Mastermix

CRYIA1/CRYIA2 et 2 µl de solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la

glace durant la préparation du Mastermix.

Tableau 7. Mastermix CRYIA1/CRYIA2

Concentrationfinale

Mastermix pour un échantillon

Mastermix pour 10

échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides CRYIA1 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides CRYIA2 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Mélanger doucement le Mastermix CRYIA1/CRYIA2 en pipetant et centrifuger

brièvement


0,2 ml






Programme PCR (CRYIA1/CRYIA2)

Température Durée Dénaturation initiale 95 ˚C 3 mn Dénaturation 95 ˚C 40 s Hybridation Extension

60 ˚C 72 ˚C

40 s 40 s





aux instructions du Tableau 8.


CRYIA3/CRYIA4 et 1 µl de solution d’ADN pré-amplifiée de la première PCR. Toutes les

solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du Mastermix.

Tableau 8. Mastermix CRYIA3/CRYIA4

Concentrationfinale

Mastermixpour un

échantillon

Mastermix pour 10

échantillons Eau déionisée stérile 33,75 µl 337,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides CRYIA3 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides CRYIA4 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl





• Mélanger doucement le Mastermix CRYIA3/CRYIA4 en pipetant et centrifuger

brièvement


0,2 ml




Programme pour la PCR nichée (CRYIA3/CRYIA4)


Dénaturation 95 ˚C 40 s Hybridation Extension

60 ˚C 72 ˚C

40 s 40 s



Analyse de produits PCR

Suite à l’amplification, les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose

en présence de bromure d’éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon

de charge ; la solution est ensuite chargée sur un gel d’agarose (2,5%). La migration doit

s’effectuer à 100 V pendant une durée d’1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl

d’échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision

la taille des amplicons. Après l’opération, une transillumination avec lumière UV permet de

visualiser l’ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement

permanent du résultat de l’essai.




Les paires d’amorces CRYIA1/CRYIA2 et CRYIA3/CRYIA4 ont été mises au point pour

détecter spécifiquement le gène cryIA(b) synthétique par PCR nichée, produisant un

fragment de 189 pb. Ce gène est présent dans la lignée de maïs Bt-176 et d’autres lignées

(par ex. Bt-11).






189 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l’ADN de maïs Bt-176.

Détection du soja Roundup Ready®

La cible est le gène EPSPS CP4, qui confère la résistance à l’herbicide Roundup®.

Caractéristiques des amorces GMO5, GMO9, GMO7 et GMO8

GMO5 Séquence CCACTGACGTAAGGGATGACG Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6479,4 Point de fusion * (G/C) 59,5

GMO9 Séquence CATGAAGGACCGGTGGGAGAT Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6559,4 Point de fusion * (G/C) 59,5

GMO7 Séquence ATCCCACTATCCTTCGCAAGA Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6309,6 Point de fusion * (G/C) 55,8

GMO8 Séquence TGGGGTTTATGGAAATTGGAA Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6579,8 Point de fusion * (G/C) 51,7




Contrôles

• Contrôle positif : ADN de la matière de référence (RRS 0,1% GM)

• Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (soja 0% GM)


de l’eau




Tableau 9.


GMO5/GMO9 et 2 µl de solution d’ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace



Concentrationfinale

Mastermix pour un

échantillon

Mastermix pour 10

échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides GMO5 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides GMO9 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl

TOTAL 48 µl 480 µl





0,2 ml






Programme PCR (GMO5/GMO9)





aux instructions énumérées dans le Tableau 10.


GMO7/GMO8 et 1 µl de solution d’ADN pré-amplifiée de la première PCR. Toutes les

solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du Mastermix.


Concentrationfinale

Mastermix pour un

échantillon

Mastermix pour 10

échantillons Eau déionisée stérile 33,75 µl 337,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mM de MgCl2 2,5 mM 5 µl 50 µl 4 mM de dNTP 0,2 mM 2,5 µl 25 µl 20 µM d’oligonucléotides GMO7 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl 20 µM d’oligonucléotides GMO8 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl







0,2 ml




Programme pour la PCR nichée (GMO7/GMO8)















Les paires d’amorces GMO5/GMO9 et GMO7/GMO8 ont été mises au point pour détecter

spécifiquement le gène chimère du soja Roundup Ready® par PCR nichée, produisant un

fragment de PCR nichée de169 pb. Les amorces GMO5 et GMO7 sont complémentaires du

promoteur CaMV 35S, l’amorce GMO9 s’hybride avec le gène EPSPS CP4 de la souche

CP4 du Agrobacterium sp. et l’amorce GMO8 avec le gène EPSPS CTP.


Le contrôle négatif et l’absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les

contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l’analyse PCR des



169 pb, cela signifie que cet échantillon de soja Roundup Ready® contient de l’ADN.






Module 10


F. Weighardt

PCR quantitative pour la détection d’OGM 2


Table des matières

Module 10


INTRODUCTION 3

METHODES DE QUANTIFICATION PCR 4

HISTORIQUE DES TECHNIQUES DE PCR EN TEMPS REEL 7

PRINCIPES DE PCR EN TEMPS REEL 7

PRINCIPES DE QUANTIFICATION AVEC PCR EN TEMPS REEL 13

REFERENCES 20



Introduction

Lorsqu’un produit alimentaire est déterminé positif pour une ou plusieurs lignées GM

(soja Roundup Ready®, maïs Bt-176, maïs Bt-11, maïs MON810 et maïs T25), les

étapes analytiques suivantes consistent à évaluer la conformité avec la législation en

vigueur (Règlement (CE) 1829/2003, Règlement (CE) 1830/2003) en mesurant la

quantité de chaque lignée d’OGM présente dans chaque ingrédient (Figure 1).

Les règlements susmentionnés disposent que tous les produits contenant des OGM,

consistant en de tels organismes ou produits à partir d’OGM doivent être marqués en

conséquence.

L’étiquetage n’est pas requis pour les produits à base de matières contenant des

OGM, consistant en OGM ou produits à partir d’OGM dans une proportion ne

dépassant pas 0,9 % des ingrédients alimentaires pris individuellement, à condition

qu’une telle présence soit fortuite ou techniquement inévitable.

Tous les ingrédients (farine, huile, etc.) dérivés d’une espèce unique (par ex. maïs,

soja, colza, etc.) sont considérés collectivement en tant qu’ingrédient unique (par ex.

maïs).

Figure 1. Aucun marquage requis. La quantité de soja GM et de maïs GM est inférieure au seuil autorisé.

Par exemple, si un ingrédient dérivé exclusivement du maïs contient moins de 0,9 %

de maïs GM, aucun étiquetage n’est nécessaire pour les aliments dérivés de ce

dernier. En revanche, s’il contient plus de 0,9 % de maïs GM, les produits

alimentaires dérivés doivent être étiquetés en conséquence. Cela vaut également si,

en tenant compte de l’ensemble des ingrédients dérivés de variétés différentes (par

ex. soja et maïs), la quantité relative de maïs GM tombe en dessous de 0,9 % dans

Maïs non GM 99,4%

Maïs GM 0,6%Soja non GM

99,4%

Soja GM 0,6%



le produit final. Si au moins deux variétés de maïs GM sont présentes, leurs

concentrations respectives doivent être ajoutées et le pourcentage total utilisé pour

déterminer l’exigence pour l’étiquetage (Figure 2). Si le résultat est inférieur à 0,9 %,

aucun étiquetage n’est requis.

Figure 2. Etiquetage requis pour l’ingrédient maïs. Les sommes des lignées Bt-11 (0,6 %) et Bt-176 (0,6 %) dépassent le seuil de 0,9 % requis pour l’étiquetage.

La teneur relative en OGM (sous forme de pourcentage) est déterminée en divisant

le nombre de copies de séquences spécifiques de l’OGM par le nombre de copies de

gènes spécifiques d’une plante (par ex. lectine pour le soja et invertase ou zéine pour

le maïs). Le pourcentage d’OGM qui en résulte s’exprime par conséquent sous la

forme suivante : OGM (%) = ADN GM/ADN référence x 100.

Méthodes de quantification PCR

Un des inconvénients majeurs de la PCR classique réside dans le manque

d’informations quantitatives précises en raison de l’efficacité de l’amplification. Si

l’efficacité de la réaction pour chaque cycle d’amplification demeure constante, la

concentration d’ADN après la PCR serait directement proportionnelle à la quantité

d’ADN cible initiale. Malheureusement, l’efficacité de l’amplification varie en fonction

des diverses réactions, ainsi que dans les cycles consécutifs au cours d’une seule et

même réaction. En particulier, lors des derniers cycles de la PCR, les résultats de

l’amplification sont générés de manière non exponentielle à un rythme de réaction

inconnu.

Maïs non GM 98,8%

Maïs Bt 176 0,6%

Soja non GM 100%

Maïs Bt 11 0,6%



La quantification d’ADN basée sur une PCR classique repose sur des mesures de

valeurs limites pour obtenir une sensibilité optimale, lorsque l’amplification atteint le

rendement maximum (appelé « phase stationnaire »). A ce stade, la réaction a

dépassé la phase exponentielle, notamment en raison de la diminution des réactifs et

de l’inactivation thermique progressive de la polymérase utilisée. La corrélation

résultante entre la concentration de produit finale et le nombre de molécules cibles

initiales est ainsi limitée.

Afin de surmonter ce problème, des techniques telles que la PCR quantitative

compétitive et la PCR en temps réel ont été mises au point pour résoudre les

problèmes liés à l’établissement d’un rapport entre la concentration d’ADN cible et la

quantité de produit PCR résultant de l’amplification.

PCR quantitative compétitive L’une des premières méthodes PCR quantitatives mises au point est celle de la PCR

quantitative compétitive (Giacca et al., 1994 ; Studer et al., 1998 ; Hardegger et al.,

1999). Cette méthode est basée sur la co-amplification de la matrice d’ADN cible et

de quantités données d’un ADN standard interne (compétiteur) portant les mêmes

sites de fixation d’amorces. Etant donné que la quantité initiale du compétiteur est

connue et que les niveaux d’amplification de la cible et de l’ADN compétiteur sont les

mêmes, la quantité des deux produits PCR, déterminée par ex. par électrophorèse

sur gel, est représentative du taux d’ADN cible et de compétiteur présents dans

l’échantillon de réaction avant l’amplification.

En règle générale, un compétiteur est un plasmide linéarisé porteur de la même

séquence de nucléotides que l’ADN cible, à l’exception d’une suppression ou d’une

insertion afin d’obtenir, après co-amplification, deux bandes de tailles distinctes après

électrophorèse sur gel standard.

ADN amplifié de la cible

ADN amplifié du compétiteur

Figure 3. Co-amplification d’une quantité fixe d’ADN cible avec différentes quantités d’ADN compétiteur.



La PCR compétitive a été mise en œuvre avec succès pour quantifier à la fois l’ADN

et l’ARN, mais sa plage dynamique est limitée à un taux cible/compétiteur situé

approximativement entre 1:10 et 10:1. En fait, pour obtenir une précision optimale, il

convient de trouver le point d’équivalence auquel le taux cible/compétiteur est de 1:1

(Figure 3). A cet effet, plusieurs dilutions doivent être testées pour obtenir un taux

cible/compétiteur approprié.

Un autre inconvénient de cette approche réside dans la nécessité de construire et de

caractériser un compétiteur différent pour chaque cible à quantifier. En fait, la

moindre différence au niveau de l’efficacité de l’amplification compromettra

sérieusement la précision d’une quantification par PCR quantitative compétitive.

Enfin, à la fin de la réaction, la PCR compétitive nécessite une quantification précise

des amplicons de la cible et du compétiteur, ce qui implique généralement des

étapes de traitement post-PCR laborieuses.

La PCR compétitive est une méthode semi-quantitative qui implique une

comparaison entre un standard (le compétiteur) et l’échantillon. Les résultats ne

peuvent indiquer qu’une valeur inférieure, égale ou supérieure à une concentration

standard donnée.

Le système de PCR compétitive comporte toutefois l’avantage suivant : les

laboratoires n’ont pas besoin d’acquérir un équipement spécialisé, étant donné qu’on

utilise généralement du matériel de laboratoire standard pour les processus PCR et

de biologie moléculaire.

PCR en temps réel Il existe une technique de PCR quantitative plus précise et plus répandue : la PCR

en temps réel. Contrairement aux mesures de valeurs limites, les systèmes de PCR

en temps réel contrôlent la réaction en temps réel, au fur et à mesure qu’elle se

déroule. Avec ce type de système, la PCR est couplée à l’émission d’un signal

fluorescent proportionnel à la quantité de produit PCR généré au cours de cycles

consécutifs. Ce signal augmente proportionnellement à la quantité de produit PCR

généré au cours de chaque cycle de réaction successif. L’enregistrement de la

quantité d’émission fluorescente lors de chaque cycle permet de contrôler la PCR

durant sa phase exponentielle. La première augmentation de fluorescence majeure

correspond à la quantité initiale de matrice cible. (Ahmed, 2002)



Historique des techniques PCR en temps réel

Higuchi et al. (1992, 1993) ont été les premiers à analyser la cinétique de la PCR en

mettant au point un système capable de détecter les produits PCR au fur et à mesure

de leur accumulation. Ce système « en temps réel » comprenait l’intercalant bromure

d’éthidium dans chaque mélange réactionnel. Les opérations étaient effectuées à

l’aide d’un thermocycleur approprié permettant d’irradier les échantillons de lumière

UV et de détecter la fluorescence résultante à l’aide d’une caméra CCD refroidie

(caméra à dispositif de transfert de charge) assistée par ordinateur. Lors du

processus d’amplification, des quantités croissantes d’ADN double brin généré et

intercalé en présence de bromure d’éthidium entraînaient un accroissement de la

fluorescence. En restituant graphiquement le rapport entre l’émission de lumière

fluorescente et le nombre de cycles, le système générait des graphiques

d’amplification donnant un tableau plus complet du processus de la PCR qu’une

analyse de l’accumulation du produit après un nombre de cycles fixe.

Principes de la PCR en temps réel

La spécificité d’une méthode de PCR en temps réel dépend à la fois des principes

chimiques utilisés pour générer et contrôler la réaction d’amplification et l’équipement

utilisé pour contrôler le signal. Divers principes chimiques ont été mis au point à cet

effet : intercalants (bromure d’éthidium, SYBR Green I) et sondes d’hybridation

(sondes TaqMan, sondes de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes,

balises moléculaires, sondes Scorpion et sondes TaqMan MGB).

PCR en temps réel à base de colorant SYBR Green I La première application de la PCR en temps réel est directement dérivée des

expériences de Higuchi et al. (1992, 1993), consistant à remplacer le bromure

d’éthidium par un agent intercalant d’ADN double brin fluorescent moins toxique, plus

spécifique et plus sensible (de 10 à 25 fois), le SYBR Green I (Haugland, 2002).

Le colorant SYBR Green I se lie au petit sillon de l’ADN double brin, mais pas à

l’ADN simple brin. Suite à cette liaison, la fluorescence (excitation env. 488 nm et

254 nm ; émission env. 560 nm) augmente considérablement (de 800 à 1000 fois

env.). Au début de la PCR, la quantité croissante d’ADN nouvellement synthétisé

génère un signal fluorescent croissant (Figure 4). Une limitation du système de

détection de séquence à base de SYBR Green I est représentée par son mode de

reconnaissance d’ADN non spécifique. En fait, chaque molécule d’ADN double brin



présente dans une PCR est quantifiée, y compris donc les produits PCR non

spécifiques et les dimères d’amorce. Afin de surmonter le problème et de soustraire

l’élément de quantification dû aux ADN non spécifiques et aux dimères d’amorce sur

certains dispositifs, il est possible d’effectuer une analyse de la courbe de fusion.

Après l’étape finale de la PCR, les produits sont dissociés lentement et les données

relatives à la fluorescence sont recueillies. Étant donné que chaque ADN double brin

possède une température de fusion spécifique, il est possible de quantifier les

éléments ayant différentes températures de fusion dans un seul et même mélange

réactionnel, et par conséquent d’éliminer les éléments non spécifiques de la

quantification.

Méthodes de PCR en temps réel basées sur des sondes spécifiques de la séquence

Le problème de la spécificité de détection par fluorescence des amplicons a été

résolu par l’utilisation de sondes spécifiques des séquences avec un marquage

fluorescent conçu à l’intérieur de la paire d’amorces PCR. Le processus d’hybridation

des sondes (et leur dégradation finale) n’interfère généralement pas avec

l’accumulation exponentielle du produit de la PCR. Plusieurs principes différents sont

maintenant utilisés pour réaliser des réactions de quantification basées sur une PCR

en temps réel spécifique.

Sondes de transfert d’énergie entre molécules fluorescentes Le transfert d’énergie entre molécules fluorescentes (FRET) est basé sur le transfert

d’énergie d’un fluorophore donneur à un fluorophore accepteur (Figure 4) (Haugland,

2002). Les conditions de base pour le FRET sont les suivantes :

• Les molécules donneuses et accepteuses doivent être proches l’une de l’autre

(généralement 10 à 100 Å).

• Le spectre d’absorption de l’accepteur doit chevaucher le spectre d’émission de

fluorescence du donneur.

• Les orientations des dipôles de transition du donneur et de l’accepteur doivent être à

peu près parallèles.

Si le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur sont proches l’un de l’autre,

l’excitation du donneur avec de la lumière bleue génère un transfert d’énergie vers

l’accepteur, qui peut alors émettre une longueur d’onde lumineuse plus importante.

La formation de produits PCR peut être contrôlée en utilisant deux sondes



oligonucléotidiques spécifiques de la séquence avec un marquage fluorescent,

appelées sondes d’hybridation, en plus des amorces PCR. Les sondes d’hybridation

sont conçues en tant que paire, l’une des sondes étant marquée avec le donneur (3’-

fluorescéine) et l’autre avec l’accepteur (5’-Red 640 ou 5’-Red 705). Étant donné que

le FRET est proportionnel à l’inverse de la puissance 6 de la distance, les sondes

d’hybridation doivent être conçues de manière à s’hybrider avec les régions

adjacentes de l’ADN matrice (elles sont généralement séparées par un intervalle de

1 à 5 nucléotides). Si les deux sondes s’hybrident, les deux colorants sont

rapprochés et le FRET vers le colorant de l’accepteur se traduit par un signal

mesurable par fluorimétrie.

Sondes de dégradation (principe TaqMan) L’essai TaqMan exploite l’activité exonucléase 5’-3’ de l’ADN polymérase Taq pour

cliver une sonde de dégradation durant la PCR (Lie et Petropoulos, 1998). La sonde

de dégradation (ou TaqMan) est généralement un oligonucléotide d’une longueur de

20-30 bases (habituellement avec une température de fusion de 10 °C plus élevée

que celle des amorces) contenant un colorant fluorescent rapporteur à l’extrémité 5’

et un colorant d’extinction de fluorescence à l’extrémité 3’ (Figure 4). Étant donné

que l’extrémité 3’ est bloquée, la sonde ne peut être prolongée comme une amorce.

Durant la PCR, en présence d’une cible, la sonde s’hybride spécifiquement entre les

sites d’hybridation des deux amorces. Lorsque la sonde est intacte, la proximité du

colorant rapporteur par rapport au colorant d’extinction de fluorescence entraîne la

suppression de la fluorescence du rapporteur essentiellement par transfert d’énergie

de type Forster (Forster, 1948 ; Lakowicz, 1983). Pendant la réaction, l’activité

exonucléase 5’-3’ de l’ADN polymérase Taq dégrade la sonde entre le colorant

rapporteur et le colorant d’extinction de fluorescence seulement si la sonde s’hybride

avec la cible. Cela entraîne un accroissement de la fluorescence au fur et à mesure

de l’amplification. L’accumulation de produit PCR est détectée en contrôlant

l’augmentation de fluorescence du colorant rapporteur. Ce processus survient durant

chaque cycle et n’interfère pas avec l’accumulation exponentielle de produit.

Contrairement aux sondes FRET, les sondes de dégradation libèrent des

fluorochromes à chaque cycle, ajoutant un nouveau colorant au colorant libéré

précédemment. Par conséquent, le signal fluorescent augmente considérablement à

chaque cycle. Dans l’essai TaqMan, on utilise des paramètres de cycles thermiques

et des conditions de réaction PCR universels. Une exigence spécifique applicable

aux sondes fluorogéniques est qu’il ne peut y avoir de G à l’extrémité 5’. Un « G »



adjacent au colorant rapporteur éteint la fluorescence du rapporteur, même après

division.

Balises moléculaires Les balises moléculaires sont des sondes d’ADN conçues pour contenir une

structure en forme d’épingle à cheveux. La séquence de la boucle est

complémentaire de la cible spécifique de la sonde et les séquences des bras sont

conçues de manière à être complémentaires l’une de l’autre (Figure 5) (Tyagi et

Kramer, 1996). Les extrémités 5’ et 3’ de la sonde sont liées de façon covalente à un

fluorophore et à un extincteur. Lorsque la structure en épingle à cheveux est fermée,

le fluorophore et l’extincteur sont rapprochés. Dans ce cas, tous les photons émis par

le fluorophore sont absorbés par l’extincteur. En présence d’une séquence

complémentaire, la sonde se déploie et s’hybride avec la cible. Le fluorophore est

déplacé par l’extincteur et la sonde commence à fluorescer.

Figure 4. Différents principes de PCR en temps réel. I. Vert SYBR I. II. Sondes de transfert d’énergie de résonance par fluorescence. III. Sondes de dégradation TaqMan 5`-3`.



Figure 5. Principe des balises moléculaires.

Scorpions La famille des sondes appelées « Scorpions » constitue une évolution

supplémentaire. Une sonde Scorpion comprend une séquence de sonde spécifique

avec une structure en épingle à cheveux (Figure 6) (Thelwell et al., 2000). Un fluorophore fixé à l’extrémité 5’ émet un signal fluorescent qui est désactivé dans

la configuration en épingle à cheveux par une fraction attachée à l’extrémité 3’.

L’épingle à cheveux est liée à l’extrémité 5’ d’une amorce. Après l’élongation de

l’amorce Scorpion, durant l’amplification, la séquence de sonde spécifique est

capable de se lier à son complément dans le même brin d’ADN. Cette hybridation

ouvre la boucle en épingle à cheveux, de telle sorte que la fluorescence n’est plus

désactivée et un accroissement du signal est observé. Un stoppeur PCR entre

l’amorce et la séquence des bras évite la translecture de la boucle en épingle à

cheveux, ce qui pourrait entraîner l’ouverture de celle-ci en l’absence de la séquence

cible spécifique. La nature monomoléculaire de l’hybridation comporte des avantages

par rapport aux systèmes de sondes homogènes. Contrairement aux balises

moléculaires, aux essais TaqMan ou FRET, les essais Scorpion ne nécessitent pas

de sonde séparée en plus des amorces.



Figure 6. Principe des sondes Scorpion.

Sondes MGB TaqMan Une sonde MGB (Minor Groove Binder) est une petite molécule en forme de

croissant qui s’insère parfaitement dans le petit sillon de l’ADN double brin (Kutyavin

et al., 2000). Dans les sondes TaqMan, le groupe MGB est attaché à l’extrémité 3’

avec le colorant d’extinction de fluorescence (Figure 7). Lorsque la sonde TaqMan

s’hybride, le MGB stabilise l’hybridation en se déployant dans le petit sillon de l’ADN

double brin créé entre la sonde et la séquence cible. La stabilisation est beaucoup

plus efficace lorsque les doubles brins sont parfaitement appariés (c’est-à-dire

lorsqu’il n’y a pas de mésappariement de séquence). Outre le pouvoir discriminant

accru, la plus grande stabilité signifie que les sondes TaqMan MGB sont très courtes

(généralement 13 à 20 mer) par rapport aux sondes TaqMan standard (généralement

18 à 40 mer), tout en satisfaisant aux exigences de conception. Les sondes TaqMan

MGB présentent plusieurs avantages en ce qui concerne la PCR quantitative,

notamment pour les essais multiplex. La performance spectrale améliorée permet

une précision et une cohérence accrues entre les essais individuels et la spécificité

d’hybridation accrue assure une plus grande discrimination des cibles. Par ailleurs, la



sonde plus petite peut faciliter la conception des essais en offrant plus de possibilités

dans des régions cibles plus courtes, telles que les « fenêtres » de consensus de

conservation ou de divergence de séquence. La taille des amplicons peut être

réduite au maximum en utilisant des sondes MGB plus courtes pouvant améliorer

davantage la cohérence inter-essais.

Figure 7. Principe des sondes MGB.

Principes de quantification par PCR en temps réel

Quantification relative La teneur en OGM d’un échantillon peut être exprimée comme étant la quantité de

matière génétiquement modifiée dans la quantité de matière totale. Pour déterminer

cette valeur dans un système PCR en temps réel, il faut évaluer le nombre de

séquences d’ADN d’un gène de référence endogène (en vue d’une utilisation en tant

que « normalisateur ») ainsi que le nombre de séquences d’ADN cible spécifique de

l’OGM. Le gène de référence doit être sélectionné de manière à ce qu’il soit

spécifique de l’espèce, présent en copie unique par génome haploïde, stable au sein

de différentes lignées de la même espèce et ayant les mêmes propriétés

d’amplification que les OGM analysés (bien que cela soit plutôt dû à une bonne

conception des sondes d’amorces). Un problème dans la quantification relative

résulte de l’interprétation du pourcentage de teneur en OGM non stipulé par la



législation ; par conséquent, la teneur en OGM (en pourcentage) peut être

considérée comme étant le poids de l’ingrédient modifié divisé par rapport au poids

total de l’ingrédient pur (par ex. poids du maïs GM divisé par le poids total de

l’ensemble du maïs contenu dans l’échantillon). Du point de vue analytique, il

convient de calculer le pourcentage d’OGM en termes de nombre de copies d’ADN

cible par rapport au nombre de copies spécifiques de taxon cible, mais cette

définition ne tient pas compte de certaines caractéristiques importantes des lignées

d’OGM ; par conséquent, les paramètres suivants doivent être soigneusement pris

en compte lors de l’interprétation des résultats :

a. la ploïdie de la lignée. Il est possible que la ploïdie de la lignée GM soit différente

de celle de la lignée wt (par ex. tétraploïde au lieu de diploïde) ;

b. la zygotie de la lignée. La caractéristique GM pourrait être homozygote ou

hétérozygote ;

c. le nombre d’insertions par génome haploïde d’une construction génique artificielle

unique. Une construction pourrait être insérée en une seule copie par génome

haploïde ou en plusieurs copies.

Le point c. peut être contourné en concevant le système de sonde-amorce à la limite

de l’insertion de la construction dans le génome. Étant donné que les séquences

flanquantes sont uniques, cela confère au système le double avantage d’être

spécifique à la lignée et d’exclure de la quantification les insertions multiples de la

même construction. On contourne les points a. et b. empiriquement en utilisant des

matériaux de référence homogènes avec l’échantillon (par ex. matériaux de

référence sous forme de farine de maïs pour quantifier la farine de maïs).

Alternativement, des étalons de référence différents des matériaux de référence

certifiés (par ex. séquences d’ADN clonées ou mélanges d’ADN génomiques)

peuvent être calibrés par rapport à ces matériaux de référence certifiés afin de

corriger les divergences moléculaires dans la quantification. Une solution courante

aux problèmes liés aux points a. et b. consiste à exprimer le pourcentage d’OGM en

termes de génomes haploïdes.

Dans tous les cas, cet aspect de la quantification doit être pris en compte lors de la

mise au point d’une méthode, étant donné que la limite de détection et la limite de

quantification sont influencées par le nombre effectif de copies à quantifier.



Conception d’une expérience de quantification d’OGM en temps réel La conception d’une analyse PCR en temps réel doit inclure les éléments suivants :

- Un système PCR capable de détecter une séquence d’ADN cible spécifique de

l’OGM.

- Un second système PCR capable de détecter une séquence de référence

endogène, préférentiellement spécifique de l’espèce, mais pouvant être utilisée en

tant que « normalisateur » dans les calculs des concentrations relatives d’OGM.

- Les courbes d’étalonnage pour la cible et la référence endogène. Pour chaque

échantillon expérimental, la quantité de cible et de référence endogène est

déterminée à partir de la courbe d’étalonnage correspondante. La quantité de cible

est normalisée avec la quantité de référence endogène pour obtenir la concentration

relative de la cible. Pour qu’elles répondent aux exigences statistiques, les courbes

d’étalonnages doivent comprendre au moins 4 points de concentration différents.

Chaque point de la courbe d’étalonnage, ainsi que l’échantillon, doivent être chargés

au moins en trois exemplaires.

En outre, un contrôle négatif (NTC – contrôle sans matrice) doit être ajouté tant pour

la quantification du gène de référence et que pour celle des OGM. D’autres contrôles

peuvent être utilisés (par ex. contrôle ADN cible négatif, contrôle ADN cible positif).

Enfin, la quantification du gène de référence et la quantification de la séquence

spécifique de l’OGM doivent être effectuées au cours de la même opération PCR

(co-amplification) et non en plusieurs opérations, afin d’éviter toute fluctuation

statistique entre différentes expériences.

PCR multiplexe en temps réel En fonction des propriétés chimiques et de l’appareillage utilisé pour la quantification,

il est possible de concevoir des PCR en temps réel pour effectuer la quantification

des séquences de référence et d’OGM séparément dans des tubes distincts ou dans

les mêmes tubes en tant que réaction « multiplexée ».

Les deux options présentent à la fois des avantages et des inconvénients : les

réactions multiplexées permettent d’économiser du temps et des réactifs (il est

possible d’analyser le double d’échantillons en une seule et même expérience),

d’éviter les erreurs de configuration entre la mesure de la référence et du gène cible

de l’OGM, étant donné qu’elles ont lieu dans le même tube, mais elles sont moins

sensibles (en termes de limite de quantification) en raison de l’interférence entre les

deux réactions et des différences de consommations de réactifs entre les deux



réactions. D’un autre côté, des réactions séparées pour mesurer le gène de

référence et le gène cible de l’OGM sont plus sensibles en termes de limite de

quantification, mais nécessitent deux fois la quantité de réactifs et de tubes

réactionnels sur l’appareillage de PCR en temps réel et sont plus exposées par ex.

aux risques d’erreur de pipetage lors de la mesure d’un échantillon. La disponibilité

de colorants rapporteurs multiples pour les sondes TaqMan permet de détecter

l’amplification de plusieurs cibles dans le même tube. Le colorant rapporteur (FAM)

se distingue de l’autre (VIC) car ils ont des longueurs d’onde d’émission maximale

différentes. Par exemple, la disponibilité de colorants multiples ayant des longueurs

d’onde d’émission distinctes (FAM, TET, VIC et JOE) permet d’effectuer des essais

TaqMan multiplex. Le colorant TAMRA est utilisé comme extincteur sur la sonde et le

colorant ROX comme référence passive dans le mélange réactionnel. Pour obtenir

les meilleurs résultats, la combinaison FAM (cible) et VIC (contrôle endogène) est

recommandée, étant donné qu’ils présentent la plus grande différence en termes

d’émission maximale. D’un autre côté, il convient de ne pas combiner JOE et VIC.

Les essais TaqMan multiplex peuvent être effectués sur les systèmes de détection

de séquence ABI PRISM 7700, 7900, 7500, 7300 et 7000 en raison de leur capacité

à détecter des colorants multiples ayant des longueurs d’ondes d’émission distinctes.

Analyse graphique des données de la PCR en temps réel Au cours d’une PCR en temps réel, les données de fluorescence (valeurs Rn)

recueillies permettent de tracer un graphique représentant la quantité de signal par

rapport au nombre de cycles (ou au temps). En général, le graphique est tracé sur

une échelle semi-logarithmique. Dans la PCR en temps réel, on peut distinguer trois

phases différentes : une première phase de « retard » avec de légères fluctuations

des courbes correspondant au signal de fond ; une seconde phase exponentielle

avec des courbes parallèles croissantes, et une troisième phase où les courbes ont

tendance à atteindre un palier (Figure 8).



Figure 8. Graphique de PCR en temps réel. Les phases typiques de PCR en temps réel sont mises en relief.

La force de la PCR en temps réel réside dans le fait que la quantification survient non

pas à la phase terminale de la PCR (palier), mais à l’étape où la croissance

exponentielle de la quantité d’ADN amplifié (valeur Rn) atteint un point

significativement plus élevé que le signal résiduel. Cette technique de mesure

augmente considérablement la précision de la quantification, étant donné qu’il y a

une corrélation directe entre la quantité de matrice initiale et la phase durant laquelle

l’amplification commence à devenir exponentielle. Dans la PCR en temps réel, un

cycle seuil (CT) est défini à titre expérimental comme le cycle auquel le signal de

fluorescence atteint la moyenne des signaux de fluorescence mesurés entre le

troisième et le quinzième cycle plus dix écarts types. Plus la quantité initiale d’ADN

génomique est élevée, plus le produit accumulé est détecté rapidement dans le

processus PCR, et plus la valeur CT est basse. En pratique, le choix de la ligne de

seuil dans la détermination de la valeur CT incombe souvent à l’opérateur,

représentant l’un des éléments subjectifs de la PCR en temps réel. La ligne de seuil

doit être placée au-dessus de toute activité de base et dans la phase d’augmentation

exponentielle, qui paraît linéaire dans la transformation logarithmique (toutes les

courbes sont parallèles). Dans tous les cas, la ligne de seuil doit être placée au

niveau auquel les courbes des répliquâts commencent à coïncider le plus. En fait, il

arrive parfois que les répliquâts présentent, dans la toute première partie de la phase

exponentielle, une légère divergence qui diminue ou disparaît totalement alors que la

réaction se poursuit.



Calcul de la teneur en OGM Le rendement de la PCR en temps réel est une valeur ∆Rn, qui correspond à la

différence entre Rn+ (le signal de fluorescence comprenant l’ensemble des éléments)

et Rn- (le signal de fond de la réaction – référence ou lecture d’un échantillon NTC).

La teneur en OGM d’un échantillon peut être déterminée de deux manières

différentes :

1. Tracé de deux courbes standard sur la base de différentes quantités d’ADN :

- la première courbe avec un système de quantification spécifique du gène de

référence ;

- la seconde courbe avec un système de quantification spécifique de la cible GM.

Pour chaque échantillon, les quantités de cible spécifique et de gène de référence

sont déterminées par interpolation avec la courbe standard. La teneur en ADN des

OGM (sous forme de pourcentage) est ensuite calculée comme étant le rapport entre

la quantité de séquence cible GM et la quantité de séquence du gène de référence

(GM/référence * 100).

Il convient de noter que les échantillons analysés doivent forcément se situer entre

les limites supérieure et inférieure des deux courbes standard. Les valeurs

aberrantes doivent être exclues, étant donné qu’elles sont sujettes à des erreurs de

quantification.

2. La méthode CT comparative (∆∆CT) : cette méthode n’utilise pas une quantité

connue de standards mais compare la quantité relative de la séquence cible d’OGM

à la séquence du gène de référence. La courbe standard est obtenue en chargeant

une série d’échantillons à différentes concentrations connues d’OGM (par ex.

matériaux de référence certifiés de l’IRMM). Le résultat est une courbe standard de

valeurs ∆∆CT (∆CT = CT gène de référence - CT OGM). La valeur de la teneur en OGM est

obtenue en calculant la valeur ∆CT de l’échantillon et en la comparant aux valeurs

obtenues avec les standards.

Pour que cette méthode soit fructueuse, les efficacités d’amplification des systèmes

PCR cible et de référence doivent être semblables. À cet effet, une méthode sensible

de contrôle consiste à examiner la manière dont ∆CT (la différence entre les deux

valeurs CT de deux PCR pour la même quantité de matrice initiale) varie en fonction

de la dilution de la matrice. Si les efficacités des deux amplicons sont

approximativement équivalentes, la représentation graphique logarithmique de la

quantité d’entrée par rapport à ∆CT serait une ligne presque horizontale (pente

<0,10). Cela signifie que les deux PCR ont la même efficacité dans la plage de

quantités de matrice initiales. Si le graphique montre une efficacité inégale, la

méthode de la courbe standard doit être utilisée pour la quantification des OGM. La



plage dynamique doit être déterminée à la fois pour (1) les concentrations minimale

et maximale des cibles pour lesquelles les résultats sont exacts et (2) les rapports

minimum et maximum de deux quantités de gènes pour lesquelles les résultats sont

exacts. Dans la PCR en temps réel compétitive classique, la plage dynamique est

limitée à un rapport cible/compétiteur d’environ 10:1 à 1:10 (la précision optimale est

obtenue pour un rapport de 1:1). La PCR en temps réel est capable de générer une

plage dynamique beaucoup plus importante.



Références

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septembre 2003 concernant les denrées alimentaires et les aliments pour

animaux génétiquement modifiés. JO L 268, 18.10.2003, pp. 1-23.

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septembre 2003 concernant la traçabilité et l’étiquetage des organismes

génétiquement modifiés et la traçabilité des produits destinés à l’alimentation

humaine ou animale produits à partir d’organismes génétiquement modifiés, et

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Module 11

Détection quantitative du soja Roundup Ready® par PCR en temps réel

N. Foti

Détection quantitative su soja Roundup Ready® par PCR en temps réel 2


Table des matières

Module 11

Détection quantitative du soja Roundup Ready® par PCR en temps réel

INTRODUCTION 3

PCR EN TEMPS REEL UTILISANT LE THERMOCYCLEUR ABI PRISM® 7700 3

PCR EN TEMPS REEL UTILISANT LE THERMOCYCLEUR LIGHTCYCLER® (ROCHE) 9

REFERENCES 15



Introduction

Les protocoles suivants sont des méthodes basées sur la PCR en temps réel pour la

quantification d’une lignée de soja GM spécifique (le soja Roundup Ready®) dans

les matières premières et les produits transformés. Les quantifications par PCR en

temps réel s’effectuent au moyen de deux thermocycleurs différents équipés pour

détecter une amplification en temps réel en mesurant la fluorescence : le

thermocycleur ABI PRISM® 7700 SDS (Applied Biosystèmes) et le thermocycleur

LightCycler® (Roche).

La PCR en temps réel est utilisée pour amplifier une séquence d’ADN cible de

référence endogène (spécifique du soja), plus une séquence cible d’ADN indiquant la

présence de soja génétiquement modifié (soja Roundup Ready®).

Les deux essais impliquent deux systèmes PCR indépendants, chacun ayant des

amorces d’ADN spécifiques et des sondes marquées par un fluorochrome. L’un des

systèmes PCR détecte une séquence d’ADN cible spécifique de l’OGM, l’autre est un

système de référence endogène conçu pour servir de référence quantitative

détectant le soja GM et non GM.

Remarque : les protocoles qui figurent dans ce manuel ont été sélectionnés à des

fins didactiques et doivent être considérés comme des exemples de base de

quantification d’OGM par la méthode de la PCR en temps réel. Nous recommandons

de consulter périodiquement les sources et la littérature pertinentes afin d’obtenir des

informations sur les derniers protocoles mis au point et validés. Veuillez noter

également que ces protocoles ont été sélectionnés en fonction de l’équipement

disponible dans notre laboratoire. Le CCR et l’OMS n’encouragent en aucun cas le

recours exclusif à une société ou à une marque spécifique.

PCR en temps réel utilisant le thermocycleur ABI PRISM® 7700

Protocole de PCR en temps réel spécifique du soja RR : méthode PCR multiplexe

Cette méthode consiste en une amplification/quantification du gène de référence de

la lectine et d’une partie du transgène inséré dans le soja RR au moyen d’une PCR

multiplexe (deux réactions PCR dans le même tube) (Foti et al., 2006). Les sondes



TaqMan de lectine et de RR sont marquées respectivement avec les fluorochromes

VIC et FAM, ce qui permet de détecter l’amplification de plusieurs cibles dans le

même tube. Le fluorochrome rapporteur (FAM) se distingue du fluorochrome VIC en

raison de leurs différentes longueurs d’ondes d’émission maximale. Le thermocycleur

ABI PRISM® 7700 SDS est capable de détecter des fluorochromes multiples avec

différentes longueurs d’ondes d’émission.

La quantité de fluorochrome (FAM) du soja RR est normalisée par rapport à la

quantité de fluorochrome végétal (VIC) détecté dans chaque échantillon. On obtient

ainsi une valeur ∆CT, dont la moyenne est établie pour les échantillons répétés. Ces

valeurs sont comparées à une courbe d’étalonnage générée par le ∆CT des

standards de concentration connue de soja RR (méthode comparative CT, ou ∆∆CT).

Cette procédure a été mise en œuvre avec succès pour diverses matières premières,

ingrédients et aliments contenant du soja (par ex. aliments pour animaux, boissons à

base de soja, yaourts, farine, lécithine, etc.).

La performance analytique de la méthode a été contrôlée avec succès dans le cadre

de plusieurs procédures d’essai d’aptitude (par ex. FAPAS®, GIPSA).

Équipement et réactifs

• Sequence Detector System ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems)

• Plaques de réaction MicroAmp Optical à 96 cupules (Cat. N° N801-0560)

• Couvercles MicroAmp Optical (Cat. N° N801-0935)

• TaqMan® Universal Mastermix (Cat. N° 4304437) 2X contenant : tampon TaqMan 2x

AmpliTaq Gold® ADN polymérase (5 U/µl), UNG AmpErase® (1 U/ml), dNTP 200

µM avec dUTP, référence passive 1


• Centrifugeuse réfrigérée pour tubes coniques de 15 ml

• Micropipettes




• Tubes centrifuges coniques de 15 ml en polypropylène


• Amorces (Le-F et Le-R) et sonde (sonde Le) spécifiques du gène de référence

• Amorces (RR-F et RR-R) et sonde (sonde RR) spécifiques du transgène



Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le gène de référence

Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le transgène

RR-F Séquence GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT Longueur (pb) 23 Poids moléculaire 7014

RR-R Séquence GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C Longueur (pb) 25 Poids moléculaire 7712

Sonde RR Séquence 5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC

AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3’ Longueur (pb) 33 Poids moléculaire 10137

Le-F Séquence TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Longueur (pb) 19 Poids moléculaire 5586,0

Le-R Séquence GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA Longueur (pb) 24 Poids moléculaire 7532

Sonde Le Séquence 5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT

CG-(TAMRA)-3’ Longueur (pb) 23 Poids moléculaire 7019,0




• Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la quantité de réactifs requise pour

la réaction. Conserver les réactifs décongelés dans la glace.

• Dans un tube de 15 ml conservé dans la glace, ajouter les éléments suivants dans

l’ordre indiqué ci-dessous (à l’exception de l’ADN) pour préparer les mastermix.

Chaque extrait d’ADN est analysé en « tripliquât » (3 répétitions). Veuillez noter que

quatre mélanges réactionnels supplémentaires sont préparés afin de faciliter le calcul

des erreurs de pipetage dues à la viscosité de la solution.

Tableau 1. Préparation du mastermix pour une plaque d’essai PCR multiplexe.

Concentration

PCR

Mastermix pour cuve

de réaction (µl)

Mastermix pour un

échantillon (3 répétitions)

Mastermix pour une plaque

(32+4 échantillons)

Eau déionisée stérile 18,3 54,9 1976,4 TaqMan Universal Mastermix 2X 1x 25 75 2700 Amorce Le-F (20 µM) 40 nM 0,1 0,3 10,8 Amorce Le-R (20 µM) 40 nM 0,1 0,3 10,8 Amorce RR-F (20 µM) 100 nM 0,25 0,75 27 Amorce RR-R (20 µM) 100 nM 0,25 0,75 27 Sonde Le (10 µM) 100 nM 0,5 1,5 54 Sonde RR (10 µM) 100 nM 0,5 1,5 54 ADN 50-250 ng 5 15 TOTAL 50 150

• Mélanger doucement et centrifuger brièvement.

• Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml pour chaque échantillon d’ADN à tester :

échantillons de courbe standard (soja RR CRM à 0,1, 0,5, 1,2, et 5 %) échantillons

inconnus et échantillons de contrôle (0 % soja RR, ADN de soja RR et contrôle sans

matrice).

• Ajouter à chaque tube microcentrifuge la quantité de mastermix requise pour 3

répétitions (135 µl de mastermix). Ajouter à chaque tube la quantité d’ADN requise

pour 3 répétitions (c’est-à-dire 15 µl d’ADN). Passer chaque tube au moins trois fois

pendant env. 10 secondes dans l’agitateur vortex. Cette étape est primordiale, car

elle contribue à réduire au maximum la variabilité entre les trois répliquâts de chaque

échantillon.



• Centrifuger brièvement. Placer la plaque de réaction à 96 puits dans une base et

aliquoter 50 µl dans chaque cupule horizontalement de gauche à droite. Après avoir

ajouté les mastermix à une rangée verticale de puits, les couvrir avec des bouchons

au moyen de l’outil prévu à cet effet.

NB : ne rien écrire sur la plaque optique et ne pas toucher les bouchons.

• Veiller à ce que les parties aliquotes de mastermix déposées se trouvent au fond des

puits, et à ce qu’il n’y ait aucune éclaboussure ou bulle sur le côté ou à l’intérieur des

bouchons.

• Placer la plaque dans le thermocycleur ABI PRISM® 7700 ; ouvrir une nouvelle

fenêtre de configuration de plaque afin d’assigner le type d’échantillon à chaque

puit : le type d’échantillon IPC est associé au fluorochrome VIC et l’échantillon UNKN

(inconnu) à la couche FAM.

• Soumettre les échantillons aux cycles décrits au Tableau 2.

Tableau 2. Programme de cycles pour l’essai multiplex du soja RR dans le thermocycleur ABI PRISM® 7700 SDS Configuration : mode PCR en temps réel

Volume de réaction : 50 µl

Étape Phase T °C Durée Acquisition Cycles 1 UNG 50 oC 120 s Non 1x 2 Dénaturation initiale 95 oC 600 s Non 1x 3 Amplification Dénaturation 95 oC 15 s Non 45x 4 Hybridation &

Élongation 60 oC 60 s Mesure

Analyse des données et interprétation des résultats

Une fois l’opération terminée, les données sont analysées à l’aide du logiciel ABI

PRISM® 7700 SDS pour déterminer les valeurs CT du fluorochrome rapporteur

respectif de chaque échantillon.

Il est essentiel de numéroter correctement les échantillons dans la fenêtre de

configuration des plaques du logiciel SDS. Chaque cupule doit se voir affecter un

numéro unique dans le champ « Replicate » ; les répliquâts d’un même échantillon

doivent se voir attribuer le même numéro.



Procéder à l’analyse en sélectionnant « analyse » dans le menu Analyse pour

accéder automatiquement aux courbes d’amplification ; régler la valeur de seuil pour

les couches FAM et VIC.

Après analyse, exporter les résultats dans un fichier Microsoft® Excel. A l’ouverture

du fichier, un tableau contenant deux séries de données correspondant aux couches

de fluorochromes FAM et VIC indique les valeurs CT correspondant à chaque puit.

Calculer les moyennes CT (FAM) et CT (VIC) de chaque groupe de répliquâts pour

déterminer les valeurs ∆CT (CT FAM – CT VIC).

Pour chaque échantillon, le pourcentage d’OGM est calculé en analysant le ∆CT de

l’échantillon, en le comparant à la série de valeurs log (% OGM) et aux valeurs ∆CT

obtenues pour les échantillons de la courbe standard.



PCR en temps réel en utilisant le thermocycleur LightCycler® (Roche)

Protocole de PCR en temps réel spécifique du soja RR

La méthode consiste en une amplification/quantification du gène de référence de la

lectine et d’une partie du transgène inséré dans le soja RR, réalisée en deux

réactions PCR indépendantes (BgVV, Rapport d’appel d’offres UE, 2000). Les deux

systèmes PCR utilisent des sondes marquées par le fluorochrome FAM.

Pour chaque échantillon, la quantité de séquences spécifiques du soja GM et la

séquence du gène de référence (gène de la lectine) sont déterminées à partir des

courbes standard appropriées, élaborées à la fois pour le transgène et le gène de

référence. La teneur en soja GM est divisée par la quantité de gène de référence afin

d’obtenir une valeur de soja GM normalisée.

Équipement et réactifs

• Système de thermocycleur LightCycler® Roche

• Capillaires pour échantillons LightCycler®. Roche, cat. N° 1909339

• Adaptateur de capillaires LightCycler®. Roche, cat. N° 1909312

• Sondes d’hybridation LightCycler® FastStart DNA Master. Roche, cat. N° 3003248,

contenant : ADN Polymérase Taq FastStart, mélange dNTP (avec dUTP au lieu de

dTTP) et tampon de réaction, conc. 10x ; eau stérile, classe PCR

• Sérumalbumine bovine (SAB), exempte de nucléase (exempte de DNase et de

RNase), par ex. Promega, cat. N° R9461 (1 µg/µl)

• ADN Polymérase Taq Platinum 5 U/µl (avec le tampon 10x original et 50 mM de

MgCl2). Invitrogen – Life Technologies cat. N° 10966026


• Micropipettes





• Amorces (GM1-F et GM1-R) et sonde (sonde GM1) spécifiques du gène de

référence

• Amorces (GM2–F, GM2-R) et sonde (sonde GM2) spécifiques du transgène



Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le gène de référence

GM1-F Séquence 5’-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3’

GM1-R Séquence 5’-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3’

Sonde GM1 Séquence 5’-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3’

Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le transgène

GM2-R Séquence 5’-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3’

Sonde GM2 Séquence 5’-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3’

Courbes standard

Pour chaque série, les deux courbes standard sont obtenues avec 5 dilutions

différentes d’ADN de référence (étalonnage). Une seule réaction est effectuée avec

chaque ADN standard d’étalonnage avec les deux mastermix.

Les courbes standard pour la quantification d’ADN de soja et de la séquence

spécifique de l’OGM sont obtenues avec des solutions d’ADN standard d’étalonnage

à des valeurs de concentration décroissantes partant de 2 % d’ADN de soja RR avec

un tampon TE (0,1 M, pH 8,0). Environ 100 ng d’ADN sont utilisés pour le premier

point des courbes standard. Les dilutions et les concentrations des courbes standard

sont indiquées au Tableau 3.

GM2-F Séquence 5’-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3’



Tableau 3. Quantité d’ADN et dilutions des courbes standard.

Quantité d’ADN (ng)/réaction

% d’ADN de soja

% d’ADN GM

Facteur de dilution

STD 1 100 100 2 STD 2 50 50 1 1:2 STD 3 25 25 0,5 1:4 STD 4 12,5 12,5 0,25 1:8 STD 5

6,25 6,25 0,125 1:16


• Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la quantité d’éléments requise.

Conserver les réactifs décongelés dans la glace.

• Pour chaque système, ajouter les éléments suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous

(à l’exception de l’ADN) à un tube microcentrifuge de 1,5 ml dans la glace afin de

préparer les mastermix. Veuillez noter que deux mélanges réactionnels comprennent

un excès de volume pour tenir compte des erreurs de pipetage dues à la viscosité de

la solution.

Tableau 4. Préparation du mastermix pour le système GM1.

Composant Concentration PCR µl/réaction Total µl (pour 18 réactions)

Pol.ase Taq Platinum Tampon 10x MgCl2 (50 mM) dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM) Amorce GM1-F (20 µM) Amorce GM1-R (20 µM) Sonde GM1 (10 µM) SAB exempte de nucléase (1 µg/µl)Pol.ase Taq Platinum (5 U/µl) Eau exempte de nucléase ADN

1x

4 mM 0,8 mM 500 mM 500 nM 200 nM

0,1 mg/ml 0,8 U

#

2

1,6 4

0,5 0,5 0,4 2

0,16 6,85

2

36

28,8 72 9 9

7,2 36 2,9

123,5

Volume total : 18 µl+2 µl ADN 324,2 µl (sans ADN)



Tableau 5. Préparation du mastermix pour le système GM2

Composant Concentration PCR µl/réaction Total µl (pour 18 réactions)

Pol.ase Taq Platinum Tampon 10x MgCl2 (50 mM) dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM) Amorce GM2-F (20 µM) Amorce GM2-R (20 µM) Sonde GM2 (10 µM) SAB exempte de nucléase (1 µg/µl) Pol.ase Taq Platinum (5 U/µl) Eau exempte de nucléase ADN

1x

4 mM 0,8 mM 500 mM 500 nM 200 nM

0,1 mg/ml 0,8 U

#

2

1,6 4

0,5 0,5 0,4 2

0,16 6,85

2

36

28,8 72 9 9

7,2 36 2,9

123,5

Volume total : 18 µl+2 µl ADN 324.2 µl (sans ADN)


• Préparer deux tubes de réaction de 0,5 ml (un pour le système GM1 et un pour le

système GM2) pour chaque échantillon d’ADN à tester (échantillons de courbe

d’étalonnage et échantillons inconnus)

• Ajouter à chaque tube de réaction la quantité de mastermix requise pour 2 répétitions

(36 µl de mastermix). Ajouter à chaque tube la quantité d’ADN requise pour 2

répétitions (c’est-à-dire 4 µl d’ADN). Passer chaque tube au moins trois fois pendant

env. 10 secondes dans l’agitateur vortex. Cette étape est primordiale, car elle

contribue à réduire au maximum la variabilité entre les répliquâts de chaque

échantillon.

• Placer les capillaires dans l’adaptateur centrifuge préalablement refroidi.

• Pipeter 20 µl du mastermix dans chaque capillaire conformément au procédé prévu à

cet effet (cf. le Tableau 6 « Configuration de la plaque – ordre de chargement » -

carrousel LightCycler® standard)

• Centrifuger à basse vitesse (env. 1150 tr/mn). Cette étape assure la concentration du

volume total du mélange réactionnel dans l’extrémité du capillaire

• Transférer les capillaires dans le carrousel LightCycler® (Roche)

• Soumettre les échantillons aux cycles décrits au Tableau 7



Tableau 6. Configuration de la plaque – ordre de chargement du carrousel LightCycler® : positions 1 à 16 = système GM1, positions 17 à 32 = système GM2. Chaque échantillon d’ADN en double pour les systèmes du gène de référence et du transgène (OGM)

Position Échantillon (%) Position Échantillon

(%) Position Échantillon (%)

1 STD (100) 13 U2 25 STD (0,125)

2 STD (100) 14 U2 26 STD (0,125)

3 STD (50) 15 NTC 27 U1

4 STD (50) 16 NTC 28 U1

5 STD (25) 17 STD (2) 29 U2

6 STD (25) 18 STD (2) 30 U2

7 STD (12,5) 19 STD (1) 31 NTC

8 STD (12,5) 20 STD (1) 32 NTC

9 STD (6,25) 21 STD (0,5)

10 STD (6,25) 22 STD (0,5)

11 U1 23 STD (0,25)

12 U1 24 STD (0,25)

Tableau 7. Programme de cycles pour le système LightCycler® Réglage : pente 20 °C/s à tous les paliers.

Mode d’affichage fluorescent : F1/1

Dénaturation :

Cycles: 1 Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number

Temp. Time Slope 2° Target Temp.

Step Size

Step Delay (Cycles)

Acquisition Mode

1 96 °C 120 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None

Cycles: Cycles: 45 Type: Quantification Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number


Step Size

Step Delay (Cycles)

Acquisition Mode

1 95 °C 5 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None 2 60 °C 15 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 Single 3 72 °C 15 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None

Refroidissement: Cycles: 1 Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number


Step Size

Step Delay (Cycles)

Acquisition Mode

1 40 °C 30 sec 20 °C/sec 0 °C 0 °C 0 None



Durant l’opération, cliquer sur le bouton EDIT SAMPLE et introduire les noms des

échantillons dans l’écran de chargement. Définir toutes les positions (y compris l’ADN

d’étalonnage) comme « Unknowns ».

Analyse des données et interprétation des résultats

• Pour l’analyse des données, sélectionner « Fluorescence » F1/F2 dans la fenêtre

avant d’analyse des données.

• Pour la quantification, cliquer sur le bouton quantification.

• Le logiciel LightCycler® propose deux méthodes de quantification différentes : la

méthode « Second Derivative Maximum » et la méthode « Fit Points ». Pour la

quantification avec le kit de détection d’ADN de soja RR, il est préférable d’appliquer

la méthode « Fit Points ». Opérer les réglages suivants : réglage de base =

« Proportionnal » ; nombre de points = 2.

• Sélectionner la courbe standard avec toutes les réactions d’échantillons inconnus

correspondantes.

• Ouvrir le dossier « Step 2: Noise Band ».

• Placer le seuil de bruit de fond à une de position 0,1. Le seuil de bruit de fond peut

être déplacé manuellement à l’aide de la souris ou en appuyant sur le bouton en

dessous du bouton « Chance Graph Settings ». Ce bouton ouvre la fenêtre « Manual

Cursor Adjustment » (réglage manuel du curseur) et la valeur du curseur peut être

réglée sur 0,1.

• Ouvrir le dossier « Step 3: Analysis ».

• A l’étape 3, les points d’intersection ainsi que les concentrations correspondantes de

solutions étalon et de matrices d’ADN inconnues sont calculés.

• Contrôler la valeur « r » de la courbe standard. Les valeurs r ≥ -0,98 sont

acceptables ; valeur « r » optimale = -1.



Références

EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as as well quantitative

detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize

products. Report of the EU tender n. XXIV/98/A3/001.

LightCycler® Operator’s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals).

User Bullettin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM® 7700

Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, 1997.

User Bullettin #5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes .ABI PRISM 7700 Sequence

Detection System. PE Applied Biosystems, 1998.

Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). Real-

Time PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in

raw material and processed food. European Food Research and Technology

Journal 222, 209-216.






Module 12

Détection quantitative du soja Roundup Ready® par ELISA

F. Eyquem

Détection quantitative du soja Roundup Ready® par ELISA 2


Table des matières

Session 12

Détection quantitative du soja Roundup Ready® par ELISA

INTRODUCTION 3

LA TECHNIQUE ELISA 8

EXPERIMENTATIONS 11

REFERENCES 22



Introduction La détection immunologique spécifique d’une nouvelle protéine synthétisée par un

gène introduit au cours d’une transformation constitue une approche alternative pour

l’identification de plantes génétiquement modifiées. Il est à noter, toutefois, qu’une

modification génétique n’est pas toujours spécifiquement axée sur la production

d’une nouvelle protéine et ne génère pas systématiquement des niveaux

d’expression protéinique suffisants pour être détectés. Par ailleurs, certaines

protéines peuvent être exprimées uniquement dans certaines parties de la plante

(des promoteurs à spécificité tissulaire sont déjà utilisés à des fins spécifiques) ou

exprimées à différents niveaux dans diverses parties ou au cours de différentes

phases du développement physiologique.

On a constaté que les niveaux d’expression des produits transgéniques se situent

dans une fourchette de 0 à 2 % de la protéine soluble totale, même lorsque de

puissants promoteurs constitutifs ont été utilisés pour activer l’expression (Longstaff,

1995). Dans la plupart des cas, cependant, les niveaux d’expression signalés (par

ex. pour les cultures GM approuvées) sont inférieurs à la limite supérieure de 2 %

(Hemmer, 1997).

Les immuno-essais sont des systèmes de mesure analytiques dans lesquels des

anticorps sont utilisés comme réactifs. Les anticorps sont des protéines spécifiques

isolées du sérum d'animaux qui ne se lient physiquement qu’à la substance ayant

déclenché leur production. Les anticorps sont générés en injectant la substance à

détecter (par ex. CP4 EPSPS, la protéine qui confère la résistance à l’herbicide

Roundup) à des animaux, tels que des lapins et des souris, dont les cellules

reconnaissent la substance comme étant « étrangère » et répondent en produisant

des anticorps. Les anticorps sont purifiés, liés à un marqueur détectable puis utilisés

en tant que réactifs pour détecter la substance d'intérêt.

Une condition requise pour l’élaboration de méthodes de détection immunologiques

est de disposer d‘anticorps extrêmement spécifiques dirigés contre la nouvelle

protéine à détecter. Par ailleurs, l’échantillon ou les protéines d'intérêt ne doivent pas

être dégradés de façon significative.

Les anticorps sont des outils puissants qui permettent aux biologistes de détecter et

de quantifier les antigènes dans des mélanges complexes. Tous les immuno-essais

sont basés sur la fixation spécifique d’un anticorps à un antigène.



Interactions anticorps/antigène

Lorsque les immunologistes décrivent les propriétés des anticorps en tant protéines,

la plupart incluent une description de la capacité de ces molécules à précipiter des

antigènes dans une solution, même si la précipitation d’anticorps n’est désormais

que rarement utilisée pour isoler ou détecter des antigènes expérimentalement et les

anticorps précipitent rarement les antigènes in vivo, excepté dans certaines maladies

auto-immunes. La valeur pédagogique de la réaction de précipitation des anticorps,

comme illustré à la Figure 1, est qu’elle reflète parfaitement un grand nombre de

propriétés fondamentales et universelles des anticorps. Cette technique démontre

entre autres que :

• les anticorps sériques (IgG) sont bivalents dans leurs réactions avec les

antigènes et ont la capacité de ponter ces derniers ;

• les antigènes sont souvent multivalents dans leurs interactions avec les

anticorps ;

• les anticorps sériques sont généralement polyclonaux ; et

• les anticorps sont extrêmement spécifiques en termes de structures qu’ils

reconnaissent au niveau des molécules antigéniques.

Figure 1. Courbe de précipitation d’un système comprenant un antigène et ses

anticorps



La représentation graphique de la quantité d’anticorps précipités par rapport à la

concentration croissante d’antigènes (pour un total d’anticorps constant) révèle trois

zones :

Une « zone d’excès d’anticorps » dans laquelle la précipitation est inhibée et

l’excès anticorps peut être détecté dans le surnageant.

Une « zone d’équivalence » de précipitation maximale dans laquelle les anticorps et

les antigènes constituent de grands complexes insolubles et ni les anticorps ni les

antigènes ne peuvent être détectés dans le surnageant.

Une « zone d’excès d’antigènes » dans laquelle la précipitation est inhibée et

l’excès d’antigènes peut être détecté dans le surnageant.

Bien que la réaction de précipitation soit particulièrement appropriée pour

caractériser les interactions entre les anticorps polyclonaux et les antigènes

multivalents, elle ne s’avère généralement pas très utile pour caractériser les

interactions entre les antigènes et les anticorps monoclonaux, à moins que les

antigènes ne présentent des épitopes identiques multiples (comme structures

glucidiques répétitives présentes dans les polysaccharides). Ce n’est que dans ces

conditions qu’un anticorps monoclonal monospécifique pourra ponter et précipiter un

antigène. Toutefois, les anticorps monoclonaux sont généralement caractérisés par

des types de mesures plus affinés fournissant des informations détaillées sur

l’interaction anticorps/antigène, comme la constante d’équilibre et les taux cinétiques.

L’utilité des anticorps dans la détection et l’isolation des antigènes est démontrée par

le large éventail d’applications extrêmement puissantes mises au point au fil des

années. L’utilité des anticorps est aussi considérablement améliorée par leur relative

stabilité dans diverses réactions de modification chimique qui modifient la structure

des anticorps sans détruire leur capacité à fixer les antigènes. On a utilisé des

anticorps marqués chimiquement par des composants fluorescents, magnétiques,

radioactifs et autres afin de faciliter la détection ou l'isolement d'antigènes dans

diverses conditions expérimentales.

Préparation d'anticorps monoclonaux

Les substances étrangères à l'organisme, comme les bactéries et virus d'autres

agents infectieux, appelés antigènes, sont identifiées par le système immunitaire du

corps comme étant indésirables. Nos défenses naturelles contre ces agents

infectieux sont les anticorps, des protéines qui recherchent les antigènes et

contribuent à leur destruction.

Les anticorps présentent deux caractéristiques très utiles. Premièrement, ils sont

extrêmement spécifiques ; plus précisément, chaque anticorps se fixe et s'attaque à



un antigène particulier. Deuxièmement, une fois activés par l’apparition d’une

maladie, certains anticorps continuent à conférer une résistance contre cette

maladie.

La seconde caractéristique des anticorps permet d’élaborer des vaccins. Un vaccin

est une préparation de bactéries ou de virus tués ou atténués qui, une fois introduits

dans l'organisme, stimulent la production d’anticorps contre les antigènes qu’ils

contiennent.

C’est dans la première propriété des anticorps, leur spécificité, que réside toute

l’importance de la technologie des anticorps monoclonaux. Non seulement les

anticorps peuvent être utilisés à des fins thérapeutiques pour protéger contre les

maladies, mais ils peuvent également contribuer à déceler toute une palette de

maladies ainsi que la présence de drogues, produits virologiques et bactériologiques

ainsi que d’autres substances inhabituelles ou anormales dans le sang.

Etant donné la diversité des utilisations de ces substances de lutte contre les

maladies, leur production en quantités pures est depuis longtemps le centre de mire

d’enquêtes scientifiques. La méthode conventionnelle consistait à injecter un

antigène à un animal de laboratoire puis, après la formation des anticorps, à recueillir

ces anticorps dans le sérum (un sérum contenant des anticorps est appelé

antisérum). Cette méthode présente deux inconvénients : elle génère de l’antisérum

contenant des substances indésirables et fournit une quantité très limitée d’anticorps

utilisables.

La technologie des anticorps monoclonaux permet de produire des quantités

importantes d’anticorps purs en utilisant des cellules qui produisent des anticorps

naturellement ainsi qu’une catégorie de cellules pouvant se développer sans

interruption en culture cellulaire. Si nous constituons un hybride combinant la

caractéristique d’« immortalité » et la capacité de produire la substance souhaitée,

nous disposons de fait d’un système capable de produire des anticorps en

permanence.

Dans la technologie des anticorps monoclonaux, des cellules tumorales pouvant se

reproduire continuellement sont fusionnées avec des cellules de mammifères

produisant des anticorps. Cette fusion cellulaire engendre un « hybridome », qui

produira continuellement des anticorps. Ces anticorps sont qualifiés de monoclonaux

parce qu'ils proviennent d’un seul type de cellule, la cellule hybridome ; en revanche,

les anticorps produits par les méthodes conventionnelles découlent de préparations

contenant de nombreux types de cellules ; c’est la raison pour laquelle on les qualifie

de polyclonaux. Un exemple d'obtention d’anticorps monoclonaux est décrit ci-

dessous.



Production d’anticorps monoclonaux

Un myélome est une tumeur de la moelle osseuse qui peut être adaptée de manière

à se développer continuellement en culture cellulaire. Lorsque des cellules

myélomateuses ont été fusionnées avec des cellules spléniques de mammifères

produisant des anticorps, on a constaté que les cellules hybrides résultantes (ou

hybridomes) produisent de grandes quantités d’anticorps monoclonaux. Ce produit

de fusion cellulaire allie les qualités souhaitées des deux différents types de cellules :

la capacité de se développer continuellement et la capacité de produire de grandes

quantités d’anticorps purs.

Etant donné que les cellules hybrides sélectionnées ne produisent qu’un anticorps

spécifique, les anticorps sont plus purs que les anticorps polyclonaux produits à

l'aide de techniques conventionnelles. Ils sont potentiellement plus efficaces que les

médicaments traditionnels utilisés pour lutter contre les maladies, étant donné que

ces derniers attaquent non seulement la substance étrangère, mais également les

propres cellules de l'organisme, ce qui entraîne parfois des effets secondaires

indésirables, comme par exemple des réactions allergiques. Les anticorps

monoclonaux attaquent uniquement la molécule cible et entraînent peu, voire aucun

effet secondaire.



La technique ELISA

Définition

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (essai d’immunoabsorption enzymatique) :

tout essai immunoenzymatique utilisant un immunoréactif enzymatique (antigène ou

anticorps) et un immunoadsorbant (antigène ou anticorps lié à un support solide). Il

existe toute une série de méthodes (par ex. liaison compétitive entre le réactif

marqué et l’inconnu non marqué) permettant de mesurer la concentration inconnue.

La technique ELISA (Clark & Adams, 1977) repose sur les interactions spécifiques

entre les anticorps et les antigènes. Les réactifs clés dans le cadre des tests ELISA

sont les anticorps, des protéines solubles produites par le système immunitaire en

réponse à une infection engendrée par une substance étrangère (appelée

« antigène »). Dans le cas de la détection des OGM, l’antigène peut être la protéine

récemment synthétisée.

La technique ELISA a souvent été mise en œuvre pour évaluer, à un stade

expérimental, le niveau d’expression des protéines synthétisées par le gène

récemment introduit. Des informations concernant la production et l’utilisation

d’anticorps spécifiques peuvent ainsi être trouvées dans de nombreux articles

décrivant les développements de plantes transgéniques (Mohapatra et al., 1999).

Seuls quelques anticorps spécifiques dirigés contre les protéines résultant des

transgènes utilisés dans les cultures génétiquement modifiées autorisées sont

disponibles dans le commerce: quelques exemples sont les anticorps contre le

produit du gène nptII, NPTII, ou APH(3')II et contre le produit du gène gus.



Il existe 3 manières différentes d’effectuer un Test ELISA :

Une méthode ELISA permettant la détection spécifique du soja Roundup Ready® a

été mise au point, testée et validée par Lipp et al. (2000).

Cette méthode repose sur l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre la

protéine CP4-EPSPS (5-énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, enzyme issue

de la souche CP4 de l’Agrobacterium sp.) (Padgette et al., 1995), la protéine qui

confère la tolérance à l’herbicide Roundup du soja Roundup Ready®. Les résultats

préliminaires indiquent que cette méthode (qui consiste à utiliser un kit ELISA

disponible dans le commerce) est capable de détecter la présence d’OGM dans le

soja brut à des concentrations comprises entre 0,3 % et 5 %.



Principe

La technique ELISA directe en sandwich permet de détecter la protéine CP4 EPSPS

comme illustré sur les figures ci-dessous :

La surface d’une plaque de microtitration est recouverte d’un anticorps de capture

monoclonal spécifique.

Lorsque l’échantillon considéré est ajouté, l’anticorps de capture fixe l’antigène. Les

composants libres de l’échantillon sont éliminés par lavage.

Après le lavage, un anticorps polyclonal lié par covalence à la peroxydase de raifort

(HRP) est ajouté, et est spécifique pour un second site antigénique sur la protéine

CP4 EPSPS liée.

Surface couverte Y Anticorps monoclonaux

Surface couverte

Antigène

Surface couverte

HRP

Anticorps détecteur



Après le lavage, un chromogène est ajouté, à savoir de la tétraméthylbenzidine pour

peroxydase de raifort. La peroxydase de raifort génère un signal de couleur qui est

proportionnel à la concentration d’antigènes dans une plage linéaire. Pour arrêter le

développement de la couleur, une solution d’arrêt est ajoutée. Le degré de couleur

généré est mesuré à une longueur d’onde de 450 nm.

Expérimentation

(Analyse des ingrédients alimentaires génétiquement modifiés, Manuel d’utilisation

du Kit Soja (1999). Strategic Diagnostics, Inc., Rév. 052099, Vers. 1.8.)1

Introduction

Le protocole suivant expose une méthode ELISA permettant de déterminer la

présence de la protéine CP4 EPSPS exprimée dans le soja Roundup Ready® dans

les produits agricoles bruts tels que les farines de soja et les isolats de protéine de

soja.

Cette méthode s’applique aux échantillons pour lesquels peu, voire aucun traitement

n’a été effectué et la protéine CP4 EPSPS n’est ainsi pas dénaturée. Par exemple, la

température à laquelle les ingrédients alimentaires sont transformés peut avoir un

impact sur la capacité de détection des protéines. Les données indiquent que des

1 Le kit décrit dans ce module était le seul protocole homologué disponible dans le commerce au moment où les formations étaient organisées et ce Manuel préparé. Le CCR et l’OMS ne promeuvent en aucun cas une marque spécifique de kits disponibles dans le commerce.

Surface couverte

TM TM



températures de traitement ne dépassant pas 65°C pendant au maximum 60 minutes

permettent une détection fiable des protéines.

Cette méthode a été validée pour la détection de la protéine CP4 EPSPS et peut être

mise en œuvre afin de déterminer la concentration de la protéine dans l’échantillon

dans une gamme allant de 0,3% à 5% (pds/pds) en utilisant des matériaux de

référence spécifiques. Le kit peut également être opéré à des niveaux de détection

plus bas de 0,05% à 0,3% en utilisant un protocole modifié.

Equipement

Tubes centrifuges coniques de 15 ml en polypropylène

Eprouvettes en verre de 12 X 75 mm

Film en plastique ou feuille d’aluminium

Bande de plastique ou nettoyeur de plaque manuel

Pissettes, par ex. 500 ml

Pipettes de précision capables de fournir de 20 µl à 500 µl

Agitateur vortex

Coupelles ou équivalents

Spatules

Balance capable d’effectuer des mesures de 0,01 g

Centrifugeuse avec une capacité de 5000 à 10000 tr/mn

Lecteur de plaque de microtitration capable de relever l’absorbance à 450 nm

Incubateur capable de maintenir une température de 37°C

Tamis avec ouverture de 450 µm, ou équivalent

Tamis avec ouverture de 150 µm (maille 100), ou équivalent

Pipette multicanaux, par ex. de 50 µl à 300 µl (en option)

Réservoirs à réactif pour distribution multicanaux (en option)

Nettoyeur de plaque automatique (en option)

Portoirs pour tubes centrifuges de 15 ml (en option)



Réactifs

Généralités

Sauf spécification contraire, utiliser exclusivement durant l’analyse des réactifs de

catégorie analytique convenable et de l’eau déionisée ou distillée.

Toute déviation par rapport aux critères de performance définis peut indiquer un

manque de stabilité des réactifs. Si les composants du substrat ont déjà changé de

couleur, passant de clair à bleu, ce réactif doit être éliminé. N’utiliser en aucun cas de

solution tampon trouble.

Tous les composants du kit doivent être stockés à une température comprise entre

2°C et 8°C. La durée de vie des composants du kit est indiquée (cf. la date limite). En

fonction des essais de stabilité dans des conditions de dégradation accélérée, la date

d’expiration du kit d’essai a été fixée à 9 mois à une température comprise entre 2°C

et 8°C.

La solution mère de conjugué d’anticorps « conjugué de soja » ainsi que la solution

de travail de conjugué d’anticorps doivent être conservées à une température

comprise entre 2°C et 8°C jusqu’à la date de péremption du kit. Le tampon de lavage

dilué doit être stocké à une température comprise entre 2°C et 8°C, au plus tard

jusqu’à la date d’expiration du kit.

Réactifs généralement fournis avec le kit d’essai

Tampon d’extraction de soja, tampon de borate de sodium, pH 7.5

Tampon d’essai de soja, solution saline tamponnée au phosphate, Tween 20, sérum

albumine bovine, pH 7.4

Cupules à bande enduite (12 bandes contenant chacune 8 cupules enduites avec les

anticorps de capture monoclonaux et 1 support de bande)

Conjugué de soja, protéine anti-CP4 EPSPS de lapin, sous forme lyophilisée

Support de conjugué de soja, 10% de sérum de souris inactivé thermiquement

Substrat chromogène, K-BlueTM, tétraméthylbenzidine (TMB), peroxyde d’hydrogène,

5% de diméthylformamide en tant que solvant de base

Solution d’arrêt, 0,5% d’acide sulfurique

Concentré de tampon de lavage 10x, solution saline tamponnée au phosphate,

Tween 20, pH 7.1

Etalons de référence négatifs et positifs



Procédure

Limitation de la procédure

Ce système d’essai ELISA se limite aux échantillons pour lesquels l’expression de la

protéine CP4 EPSPS peut être mise en corrélation avec le niveau de matière GM

présente dans les étalons de référence utilisés.

Le kit d’essai ELISA est conçu de manière à fournir des performances optimales à

des températures ambiantes comprises entre 15°C et 30°C. L’absorbance de l’étalon

de référence le plus élevé doit être supérieure à 0,8 et ne doit pas dépasser la plage

linéaire du spectromètre (la limite supérieure varie en fonction des différents

spectromètres). Il est important de tenir compte du fait que les valeurs OD

augmentent plus rapidement lorsque les températures sont supérieures à 30°C. Par

conséquent, si les températures sont élevées, un temps d’incubation réduit du

substrat s’avérera nécessaire. Lorsque les températures sont basses (moins de

15°C), le temps d’incubation du substrat doit être augmenté.

Mesures permettant d’éviter toute contamination durant la préparation des échantillons

Généralités. Le test OGM ELISA est une technique extrêmement sensible qui est

capable de détecter des quantités infimes de contamination GM. Il est donc impératif

de nettoyer minutieusement l’ensemble du matériel utilisé pour traiter les échantillons

de soja entre les différents lots d’échantillons. La procédure suivante implique une

première étape d’élimination physique d’un maximum de particules. La seconde

étape, un nettoyage à l’alcool, permet de dénaturer l’échantillon et de le rendre non

réactif dans le cadre de l’essai â toute protéine GM ayant pu demeurer sur

l’équipement.

Nettoyage du broyeur ou du mélangeur. Nettoyer de façon périodique à l’aide

d’une brosse souple et laisser tremper dans une solution alcoolisée. Sécher la

brosse avant toute utilisation ultérieure en l’essuyant à l’aide d’un chiffon doux ou

d’une serviette de laboratoire.

Rincer avec de l’alcool, qui peut être stocké et pulvérisé à l’aide d’un flacon de

pulvérisation ou d’injection. Deux rinçages ou pulvérisations sont recommandés.

Ensuite, rincer minutieusement à l’eau. Sécher à l’air ; en cas de réutilisation rapide,

sécher à l’aide d’un sèche-cheveux disponible dans le commerce.



Nettoyage du tamis. La poudre de soja a tendance à sécher et à se coller sur le

tamis. Tapoter énergiquement le tamis contre une surface dure afin d’éliminer toute

matière sèche collée dessus.

Brosser à l’aide d’une brosse souple et propre. Nettoyer la brosse de façon

périodique et laisser tremper dans une solution alcoolisée pendant au moins 1

minute. Sécher la brosse avant toute utilisation ultérieure en l’essuyant avec un

chiffon doux.

Laisser tremper dans de l’alcool pendant au moins 5 minutes et rincer

soigneusement à l’eau . Sécher à l’air ; en cas de réutilisation rapide, sécher à l’aide

d’un sèche-cheveux disponible dans le commerce.

Méthode alternative : utiliser un bain à ultrasons suivi par un séchage à l’air.

Propreté de la zone de travail. La propreté de la zone de travail est également

capitale. Etant donné que l’essai est extrêmement sensible, la moindre contamination

du tube par une faible quantité de poussière OGM pourrait entraîner un résultat

positif erroné. Eviter toute contamination à la poussière de soja dans la zone de

travail. Ne pas laisser de la poussière de soja contaminer l’équipement devant être

utilisé dans le cadre d’une opération ultérieure. Pour des performances optimales,

effectuer l’essai dans une salle séparée de l’installation de broyage et de préparation

de l’échantillon afin d’éviter toute contamination de poussière éventuelle.

Préparation de l’échantillon

Un sous-échantillon homogène représentatif doit être prélevé sur l’échantillon de

laboratoire.

Si l’échantillon est du soja brut, placer au moins 500 g dans un broyeur approprié et

broyer pendant environ 3 minutes ou jusqu’à ce qu’il soit suffisamment fin pour

traverser les tamis. Pour l’analyse quantitative, une dimension de particule inférieure

à 150 µm doit être obtenue et moins de 450 µm pour l’analyse qualitative. Afin

d’éviter toute contamination, procéder en faisant preuve de la plus grande vigilance

durant l’étape de tamisage. Veiller également à éviter tout chauffage excessif.

L’échantillon sera mélangé et broyé par le broyeur. Prélever de la matière broyée un

sous-échantillon d’environ 100 g et le passer à travers un tamis avec des pores de

450 µm (maille 40). Faire passer au moins 90% de ce sous-échantillon à travers le

tamis de 450 µm. Pour un essai qualitatif, cette matière peut être utilisée

immédiatement ; pour un essai quantitatif, la matière tamisée doit l’être davantage à

l’aide d’un tamis ayant des pores de 150 µm. Il a été démontré que la matière

traversant le tamis de 450 µm est homogène ; il est donc nécessaire de tamiser juste



assez de matière pour obtenir un échantillon final à travers le tamis de 150 µm. Il

suffit de passer la quantité de matière requise pour l’échantillon final.

D’autres types d’échantillons peuvent être traités de la même manière, bien que des

tailles d’échantillons plus petites puissent être utilisés.

Procédure d’essai

Laisser l’ensemble des réactifs atteindre la température ambiante avant toute

utilisation.

Oter les bandes enduites et retirer le support du sac en aluminium. Veiller

systématiquement à refermer hermétiquement le sac en aluminium après avoir retiré

le nombre de bandes approprié. Dix cupules sont nécessaires pour les étalons de

référence et les « blancs ». Chaque plaque aura ses propres étalons et contrôles.

En cas de nettoyage manuel, sceller à l’aide d’un ruban adhésif les bords de

l’ensemble des bandes requises pour une opération au support de bandes afin

d’éviter toute chute accidentelle des bandes hors du support pendant les étapes de

nettoyage.

Préparation du conjugué d’anticorps

Solution mère de conjugué d’anticorps. Pipeter 1 ml de diluant de conjugué de

soja de la bouteille dans le tube correspondant. Vortexer pendant environ 10

secondes.

Solution de travail de conjugué d’anticorps. Transférer à nouveau 240 µl de

conjugué de soja reconstitué dans le flacon de diluant de conjugué de soja. Etiqueter

le flacon en indiquant la date et mélanger en le retournant 20 fois.

Préparation du tampon de lavage

Laisser le concentré de tampon de lavage 10X atteindre la température ambiante.

Diluer le concentré de tampon de lavage 10X dans de l’eau déionisée pour préparer

le tampon de lavage de travail (par ex. 50 ml de concentré de tampon de lavage 10X

dans 450 ml d’eau déionisée).

Ajouter au nettoyeur de plaque automatique ou à la pissette.



Extraction d’échantillons et étalons de référence

Les échantillons et les étalons de référence négatifs et positifs sont extraits dans les

mêmes conditions en deux exemplaires, comme décrit ci-après.

Lors du pesage des échantillons, peser chaque étalon de référence par ordre

croissant de concentration, puis les échantillons.

Peser 0,5 g ± 0,01 g de chaque étalon de référence et l’échantillon dans des tubes

individuels de 15 ml en polypropylène. Afin d’éviter toute contamination, nettoyer la

spatule avant toute nouvelle pesée.

Ajouter 4,5 ml de tampon d’extraction de soja dans chaque tube contenant 0,5 g

d’échantillon et vortexer pendant 10 secondes.

Centrifuger les mélanges à environ 5000 tr/mn pendant 15 minutes.

A l’aide d’une pipette de transfert, retirer soigneusement le surnageant sans aspirer

les particules et placer le surnageant dans un tube propre de 15 ml étiqueté.

Avant de procéder à l’essai, diluer les extraits d’échantillon et d’étalon de référence

avec le tampon d’essai de soja conformément au Tableau 1.

Les extraits de protéine doivent être stockés à une température comprise entre 2°C

et 8°C, pendant une journée au maximum.

Tableau 1. Plages de dilution en fonction de la matrice

Matrice Dilution

Soja Farine de soja

Farine de soja dégraisséeIsolat de protéine

1:300 1:300 1:300 1:10

Dilution des extraits d’échantillon Pour le contrôle négatif extrait, pour chaque contrôle positif extrait et pour chaque

échantillon, deux tubes à essai de 12 X 75-mm sont nécessaires pour effectuer la

dilution.

Pipeter 280 µl du tampon d’essai de soja dans l’un des tubes à essai de 12 x 75-mm.

Pipeter 380 µl du tampon d’essai de soja dans l’autre tube à essai de 12 x 75-mm.

Etiqueter le tube de 280 µl tube « 1:15 » et celui de 380 µl « 1:300 ».

Pipeter 20 µl de chaque extrait d’échantillon dans le tube étiqueté « 1:15 » et

vortexer.

Transférer 20 µl du tube « 1:15 » mélangé vers celui étiqueté « 1:300 » et vortexer.



Répéter ces étapes pour le contrôle négatif, chaque référence positive et les extraits

d’échantillon.

Procédure d’immuno-essai ELISA

Généralités

Le kit d’essai ELISA peut être opéré dans différents formats en utilisant n’importe

quel numéro de bandes de 8 cupules. Il est recommandé de suivre un plan de

chargement aléatoire.

Deux exemplaires sont nécessaires pour l’ensemble des cupules de réaction et la

valeur d’absorbance moyenne de chaque cupule est calculée. Chaque opération

comprend le blanc (tampon d’essai), le contrôle négatif et les étalons de référence

positifs.

Lorsqu’un essai est entamé, toutes les étapes doivent être effectuées sans

interruption.

Ajout d’échantillon

Ajouter 100 µl d’extraits dilués ainsi que le blanc aux cupules appropriées.

Utiliser des pointes jetables séparées pour chaque étape de pipetage afin d’éviter

toute contamination croisée. Couvrir la plaque avec un film en plastique ou une

feuille d’aluminium afin d’éviter toute contamination ou évaporation.

Incubation de l’échantillon

Incuber la plaque de microtitration à 37°C pendant 1 heure.

Lavage

Laver 3 fois à l’aide de 300 µl de tampon de lavage.

Lavage manuel. Vider les cupules en les retournant au-dessus d’un évier ou d’un

récipient approprié. A l’aide d’une pissette de 500 ml contenant une solution de

lavage de travail, remplir chaque cupule à ras bord, laisser reposer pendant 60

secondes, puis vider la plaque comme décrit ci-dessus. Répéter l’étape de lavage 3

fois. Eliminer le liquide résiduel ainsi que les bulles en tapotant à l’envers sur

plusieurs couches de papier.

Eviter toute chute des bandes hors du cadre en utilisant du ruban adhésif.

Lavage automatique. A la fin de la période d’incubation, aspirer le contenu de

l’ensemble des cupules à l’aide d’un nettoyeur de microcupule, puis remplir les



cupules avec du tampon de lavage. Répéter l’étape d’aspiration/remplissage 3 fois.

Enfin, utiliser le nettoyeur de microcupule pour aspirer l’ensemble des cupules, puis

tapoter la plaque à l’envers sur une pile de serviettes en papier afin d’éliminer toute

goutte résiduelle ainsi que les bulles du tampon de lavage.

Ne pas laisser sécher la cupule, cela risquerait d’affecter les performances de l’essai.

Un lavage insuffisant entraînera des résultats erronés. Quel que soit le type de

nettoyeur utilisé (manuel ou automatique), veiller impérativement à ce que chaque

cupule d’essai soit nettoyée avec des volumes identiques à toutes les autres

cupules.

Ajout d’un conjugué d’anticorps

Ajouter 100 µl de solution de travail de conjugué d’anticorps à chaque cupule.

Couvrir la plaque afin d’éviter toute contamination ou évaporation.

Incubation

Incuber la plaque de microtitration à 37°C pendant 1 heure.

Lavage

A la fin de la période d’incubation, répéter les étapes de lavage comme décrit ci-

dessus.

Ajout de substrat

Ajouter 100 µl de la solution colorée à chaque cupule.

Mélanger doucement la plaque et incuber pendant 10 minutes à température

ambiante.

L’ajout de substrat chromogène doit être effectué sans interruption. Conserver la

même séquence et le même intervalle de temps à l’étape de pipetage. Protéger la

plaque de microtitration contre les rayons du soleil, sans quoi cela influerait sur

l’intensité de la couleur.

Ajout d’une solution d’arrêt

A la fin de la période d’incubation, ajouter 100 µl de solution d’arrêt à chaque cupule,

pipeter la solution d’arrêt dans la même séquence que l’ajout du réactif de couleur.

L’ajout d’une solution d’arrêt doit être effectué sans interruption. Protéger la plaque

de microtitration contre les rayons du soleil, sans quoi cela influerait sur l’intensité de

la couleur.



Lecture de l’absorbance

A l’aide d’un lecteur de plaque de microtitration équipé d’un filtre permettant

d’effectuer une lecture à 450 nm, mesurer l’absorbance de chaque cupule d’essai.

Tous les relevés doivent être effectués dans un délai de 30 minutes suivant l’ajout de

la solution d’arrêt.

Enregistrer les résultats obtenus et calculer les valeurs d’absorbance moyennes ou

utiliser un programme informatique à cet effet.

Evaluation

Les valeurs des étalons doivent être utilisées pour réaliser la courbe d’étalonnage. La

valeur du blanc doit être ôtée de l’ensemble des valeurs pour les échantillons et

étalons de référence. Les valeurs corrigées moyennes de chaque point de référence

en double doivent être utilisées pour réaliser la courbe d’étalonnage. Les données

moyennes de chaque échantillon en dupliquât doivent ensuite être utilisées pour

déterminer leur concentration sur la base de cette courbe.

Application des critères d’admissibilité/de rejet

Chaque opération devra respecter les critères d’admissibilité/de rejet dans le cadre

de la procédure pour être valable. L’opération comprend les éléments suivants : tare

d’essai (blanc), extraction de chaque étalon OGM de référence, contrôle négatif et

chaque échantillon inconnu. Tous les extraits de protéine ainsi que la tare d’essai

seront traités en deux exemplaires. Si une procédure n’observe pas les critères

d’admissibilité de l’essai, l’opération tout entière sera renouvelée.

Opération Critères

Tare de tampon d’essai A450nm < 0,30

0% norme GM A450nm < 0,30

2,5% Référence A450nm > 0,8

Toutes les normes positives CV des doubles < 15%

Echantillons inconnus CV des doubles < 20%



Schéma de fonctionnement

Etablissement d’un schéma de fonctionnement de l’extraction d’échantillon et de la référence standard

Procédure Volume/poids Description

Pesage 0,5 g Pesage des échantillons, tare d’essai, étalons de référence

Ajout 4,5 ml Ajout du tampon d’extraction

Mélange Mélange de l’échantillon avec le tampon d’extraction jusqu’à ce qu’il soit homogène

Centrifugation 5000 tr/mn Centrifuger l’échantillon à 5000 tr/mn pendant 15 minutes Eliminer le surnageant et le placer dans un tube propre

Dilution 1:300 ou 1:10 en fonction de la matière examinée

Diluer les échantillons et les étalons de référence

Etablissement d’un schéma de fonctionnement de la procédure d’immuno-essai ELISA

Procédure Volume Description

Ajout 100 µl Pipeter les extraits d’échantillons dilués, étalons de référence et tare d’essai dans une cupule d’essai appropriée

Incubation Incuber pendant 1 heure à 37°C

Lavage Laver 3 fois à l’aide du tampon de lavage

Ajout 100 µl Ajouter le conjugué d’anticorps dans chaque cupule d’essai

Incubation Incuber pendant 1 heure à 37°C

Lavage Laver 3 fois à l’aide du tampon de lavage

Ajout 100 µl Ajouter la solution de couleur dans chaque cupule

Incubation Incuber pendant 10 minutes à température ambiante

Ajout 100 µl Ajouter la solution d’arrêt dans chaque cupule d’essai

Mesure de l’absorbance

Mesurer la valeur de l’absorbance de chaque cupule d’essai dans le lecteur de plaque à 450 nm



Références

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immunoenzymatique avec microplaque en vue de la détection de phytovirus.

Journal of General Virology 34, 475–483.

Hemmer, W. (1997). Aliments dérivés d’organismes génétiquement modifiés et

méthodes de détection. Biosafety Research and Assessment of Technology

Impacts of the Swiss Priority Program Biotechnology – Rapport 2/97, 61 pages.

http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (Dernière

connection Janvier 2010).

Lipp, M., Anklam, E. & Stave, J.W. (2000). Validation d’un immuno-essai en vue de la

détection et de la quantification de soja génétiquement modifié dans des aliments

et fractions de denrées alimentaires à l’aide de matières de référence. Journal of

AOAC International 83, 919–927.

Longstaff, M., Edmonds, H.S. & Newell, C.A. (1995). Méthode améliorée pour la

détection et la quantification de protéine recombinante dans les plantes

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Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F., Vanderarend, A. & Davey,

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résistance à l’herbicide. Transgenic Research 8, 33–44.

Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,

Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eichholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,

Taylor, N.B. & Kishore, G.M. (1995). Mise au point, identification et caractérisation

d’une lignée de soja tolérante au glyphosate. Crop Science 35, 1451–1461.

Autres références

Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. & Morgan, M.R.A. (1999). Conception et mise

au point d’immuno-essais en vue de la détection de protéines. Food Control 10,

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directive 79/700/CEE de la Commission du 24 juillet 1979 fixant des méthodes

communautaires de prélèvement d’échantillons pour le contrôle officiel des

résidus de pesticides sur et dans les fruits et légumes. JO L 239, 22.9.1979, p. 24.

Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,

J.N., Sanders, P.R. & Fuchs, R.L. (1999). Méthodes immunodiagnostiques en vue

de la détection de la 5-énolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase dans le soja

Roundup Ready®. Food Control 10, 407–414.

Stave, J. W. (1999). Détection de protéines nouvelles ou modifiées dans les

nouveaux aliments issus d’OGM – besoins futurs. Food Control 10, 367–374.

Van der Hoeven, C., Dietz, A. & Landsmann, J. (1994). Variabilité de l’expression

génique spécifique aux organes des plantes de tabac transgéniques. Transgenic

Research 3, 159–165.






Annexe

Exemple de programme de travail (Base pour un cours d’une semaine)

M. Querci

Exemple de programme de travail 2

Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Annexe

1ER JOUR : LUNDI

9:00 Présentation du cours, des organisateurs et des participants

9:30 Théorie : Introduction consacrée aux procédures générales de détection

d’OGM et contenu du cours

PREPARATION D’ECHANTILLONS : EXTRACTION D’ADN 10:00 Pratique : Extraction d’ADN par la méthode CTAB (1e partie)

10:30 Pause café

11:00 Théorie : Electrophorèse sur gel pour l’analyse d’acides nucléiques

Pratique : Préparation des gels d’agarose

12:00 Pratique : Extraction d’ADN par la méthode CTAB (2e partie)

13:00 Déjeuner

14:00 Pratique : Extraction d’ADN par la méthode CTAB (3e partie)

15:15 Pratique : Chargement des échantillons sur gels d’agarose

16:00 Pause café

16:20 Théorie : Présentation générale de la configuration d’un laboratoire de PCR :

problèmes, etc. …

17:20 Pratique : Interprétation des gels d’agarose



2E JOUR : MARDI

PCR QUALITATIVE 9:00 Théorie : Introduction à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) et à

l’utilisation de la PCR pour l’analyse de maïs et de soja transgéniques

9:30 Pratique : Application de la PCR pour le maïs MON810 et le soja Roundup

Ready®

Tests spécifiques de l’espèce : détection des gènes de la zéine et de la

lectine

10:15 Pause café

10:40 Préparation des gels d’agarose

11:00 Présentation : Echantillonnage et validation : concepts de base

12:30 Déjeuner

14:00 Chargement des échantillons sur gels d’agarose

14:30 Théorie : Caractéristiques du soja Roundup Ready® et du maïs MON810 et

introduction à la PCR nichée spécifique aux OGM

15:15 Interprétation des gels d’agarose (PCR spécifique à la zéine et à la lectine)

16:00 Pause café

16:15 Pratique: PCR pour le maïs MON810 et le soja Roundup Ready®

Tests spécifiques aux OGM : détection du promoteur 35S et du

terminateur nos

17:00 Présentation : Introduction à la législation européenne sur les OGM



3E JOUR : MERCREDI

PCR QUALITATIVE 9:00 Pratique : PCR nichée pour l’analyse spécifique du maïs MON810 et du soja

Roundup Ready® (1e réaction PCR)

10:00 Préparation des gels d’agarose

10:30 Pause café

11:00 Présentation : Détection d’OGM et management de la qualité

12:00 Chargement des échantillons sur gels d’agarose (PCR du promoteur 35S et

du terminateur nos)

12:30 Déjeuner

13:30 Pratique : PCR nichée pour la détection spécifique de maïs MON810 et de

soja Roundup Ready® (2e réaction PCR)

14:00 Interprétation des gels d’agarose (PCR du promoteur 35S et du terminateur

nos)

15:00 Pratique : Préparation des gels d’agarose

15:30 Pause café

15:45 Pratique : Chargement des échantillons sur gels d’agarose (PCR nichée)

16:00 Théorie : Introduction à la PCR en temps réel (RT-PCR) pour la détection et

la quantification d’OGM

17:30 Pratique : Interprétation des gels d’agarose (PCR spécifique du maïs

MON810 et du soja Roundup Ready®)



4E JOUR : JEUDI

PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL (RT-PCR) 9:00 Pratique : Quantification de l’ADN et préparation d’échantillons pour la PCR

en temps réel (RT-PCR)

9:30 Pratique : PCR en temps réel (RT-PCR) pour l’analyse spécifique du soja

Roundup Ready® à l’aide

du LightCycler (Roche) (groupe 1) de l’ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) (groupe 2)

Pause café

13:00 Déjeuner

14:00 Pratique : PCR en temps réel (RT-PCR) pour l’analyse spécifique du soja

Roundup Ready® en utilisant

le LightCycler (Roche) (groupe 2) l’ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) (groupe 1)

15:30 Théorie : Analyse de données : Introduction à quelques outils statistiques

16:30 Pause café

17:00 Pratique : Poursuite de la PCR en temps réel (RT-PCR) pour l’analyse

spécifique du soja Roundup Ready®



5E JOUR : VENDREDI

ANALYSE QUANTITATIVE DU SOJA ROUNDUP READY® PAR LA METHODE ELISA

9:00 Théorie : Approche sérologique de la détection d’OGM

9:20 Pratique : ELISA 1e partie

10:00 Pause café

10:30 Présentation : Approche sérologique de la détection d’OGM


12:00 Déjeuner


14:00 Interprétation des résultats

15:00 Présentation : Domaines de discussions internationales concernant

l’utilisation en toute sécurité d’organismes génétiquement modifiés

16:00 Discussion générale et conclusions

Mission du CCR La mission du Centre Commun de Recherche est de fournir un soutien scientifique et technique à la conception, à l'élaboration, à la mise en œuvre et au suivi des politiques communautaires en répondant aux demandes de celles-ci. En tant que service de la Commission européenne, le Centre Commun de Recherche joue pour l'Union le rôle de centre de référence en matière de science et de technologie. Proche du processus d'élaboration des politiques, il sert l'intérêt commun des Etats membres tout en étant indépendant des intérêts particuliers, privés ou nationaux.

LB-X

1-06-033-FR-C

cours de formation sur - europagmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/manual...le...

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