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Dedicatória
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU
ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES
BOTUCATU - SÃO PAULO 2002
Dedicatória
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU
ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES
Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Botucatu, para a obtenção do título de Doutor em Reprodução Animal.
Orientadora: Profª. Ass. Drª. Maria Denise Lopes
BOTUCATU - SÃO PAULO 2002
Dedicatória
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SULAMITA SELMA CLEMENTE COLNAGO Cunha, Isabel Candia Nunes da Criopreservação do sêmen de cães / Isabel Candia Nunes da Cunha. – 2002. Tese (doutoramento) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2002. Orientadora: Maria Denise Lopes 1. Cão – Sêmen - Criopreservação
CDD 636.708245 Palavras-chave: Sêmen; Cão; Criopreservação
Dedicatória
os meus pais Estevão e Maria e aos meus
irmãos André e Bruno, que me apoiaram e
incentivaram a cada passo da minha
caminhada, dedico.
A
Dedicatória
gradeço especialmente à Profª Ass. Drª.
Maria Denise Lopes pela amizade, apoio e
orientação, sem os quais este trabalho não se
realizaria.
A
Agradecimentos
Agradecimentos
realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou
indireta de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas elas e de forma
particular:
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Câmpus
de Botucatu e Departamento de Reprodução Animal e Radiologia
Veterinária, pelas oportunidades concedidas.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
pelo subsidio do projeto e pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Professor Frederico Ozanam Papa, pelas correções e sugestões, sempre
pertinentes.
À Professora Fernanda Landim Alvarenga, pela amizade e pela orientação
quanto à realização do teste de reação acrossômica.
À Professora Carmem Estefânia Serrra Neto Zúccari pelo apoio e auxilio
durante as sessões de fotografia e pelas longas horas de discussão, sempre
muito prazerosas.
A
Agradecimentos
Ao Professor Nereu Carlos Prestes pela sua disponibilidade e auxílio durante
as correções finais e por compartilhar inúmeras risadas nos últimos nove anos.
Ao Departamento de Clínica Veterinária, pelo empréstimo do microscópio de
fluorescência.
Ao Professor Adalberto José Crocci pela assessoria estatísca do Experimento I.
Ao Professor Paulo Roberto Curi pela assessoria estatística dos
Experimentos II, III e IV.
Às bibliotecárias Rosemary Cristina da Silva e Luciana Pizzani pela revisão
das referências bibliográficas e sugestões.
Aos Professores, Residentes e Funcionários do Departamento de
Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo afeto e apoio ao longo
destes anos.
À pós-graduanda Fabiana Ferreira de Souza pela ajuda incondicional
durante a realização de todas as fases deste trabalho.
A todos os integrantes do Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais
e Silvestres por trabalharem para que nossa especialidade seja reconhecida e
aprimorada.
A todos os colegas de Pós-graduação, pelo agradável convívio e sugestões
sempre pertinentes.
Agradecimentos
Às grandes amigas Denise, Elaine, Maria Célia, Érika e Juliana por serem,
acima de tudo, .
A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste trabalho
Amigas
Epígrafe
“O futuro não nos traz nem nos dá nada.
Nós é que, para construí-lo, devemos dar-lhe tudo.”
Simone Weil
Sumário
Sumário Lista de Figuras .................................................................................. 12
Lista de Tabelas .................................................................................. 13
1. Introdução e Revisão Geral _____________________________ 16
1. Introdução ................................................................................... 17
2. Revisão Geral ............................................................................. 20
2.1. Membranas Espermáticas .................................................. 20
2.2. Estrutura e Composição da Membrana Plasmática ........... 21
2.3. Respostas da Célula Espermática à Baixas Temperaturas 27
2.4. Interações dos Componentes dos Diluidores com a Célula
Espermática .......................................................................
31
2. Experimento I ________________________________________ 41
1. Revisão de Literatura .................................................................. 42
1.1. O ejaculado Canino ............................................................. 42
1.2. A centrifugação ................................................................... 44
2. Material e Método ....................................................................... 47
2.1. Animais ................................................................................ 47
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................ 47
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 48
2.4. Procedimentos experimentais ............................................. 49
2.5 Métodos Estatísticos Utilizados............................................. 51
3. Resultados .................................................................................. 52
4. Discussão ................................................................................... 55
3. Experimento II ________________________________________ 58
1. Revisão da Literatura .................................................................. 59
2. Material e Método ....................................................................... 64
2.1. Animais ................................................................................ 64
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 64
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 65
Sumário
2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 66
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 69
3. Resultados .................................................................................. 70
4. Discussão ................................................................................... 74
4. Experimento III _______________________________________ 77
1. Revisão da Literatura .................................................................. 78
2. Material e Método ..................................................................... 81
2.1. Animais ................................................................................ 81
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 81
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 82
2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 83
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 85
3. Resultados .................................................................................. 87
4. Discussão ................................................................................... 90
5. Experimento IV _______________________________________ 94
1. Revisão de Literatura .................................................................. 95
2. Material e Método ..................................................................... 102
2.1. Animais ................................................................................ 102
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 102
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 103
2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 106
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 109
3. Resultados .................................................................................. 110
4. Discussão ................................................................................... 114
6. Conclusões __________________________________________ 120
7. Referências Bibliográficas ______________________________ 122
8. Anexos ______________________________________________ 135
9. Resumo _____________________________________________ 143
10. Abstract ____________________________________________ 147
Lista de Figuras
Lista de Figuras Experimento I FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 50 Experimento II FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 68 Experimento III FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 84 Experimento IV FIGURA 1 - Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA
(emitindo fluorescência verde) e pelo PI (emitindo fluorescência vermelha). a – reação acrossomal verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c – espermatozóides lesados..............................................
105 FIGURA 2 - Esquema de formação dos grupos experimentais ....... 108
Lista de Tabelas
Lista de Tabelas
Experimento I TABELA 1 - Valores médios de motilidade espermática (%) do
sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002...............................................................................
52 TABELA 2 - Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5)
do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002...............................................................................
53 TABELA 3 - Valores medianos da aglutinação espermática do
sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002...............................................................................
53 TABELA 4 - Porcentagem média de células espermáticas íntegras
transformadas em arc sen √x (em rad) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). Botucatu, 2002.....................................................
54 Experimento II TABELA 1 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de
cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002...............................................................................
70 TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de
cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS Botucatu, 2002..............................................................
71 TABELA 3 - Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do
sêmen de cães avaliado antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002. ............................................................
72 TABELA 4 - Mediana da porcentagem de células íntegras no
sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................
73
Lista de Tabelas
Experimento III TABELA 1 - Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen
canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.........
87
TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do
sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................
88 TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas
espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002............................................
89 Experimento IV TABELA 1- Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen
canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................
110 TABELA 2- Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do
sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................
110 TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas
espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos.Botucatu, 2002..................................
110
Lista de Tabelas
TABELA 4 - Medianas da qualidade do movimento espermático
descrito por motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade média (VAP) e linearidade do movimento (LIN) avaliada após 30 minutos da descongelação. Botucatu, 2002..................
112 TABELA 5 - Mediana da porcentagem de células espermáticas de
cães lesadas (Ls) e com reação do acrossomo verdadeiras (Rv) após a descongelação.Botucatu, 2002...............................................................................
113
Introdução e Revisão Geral
17
1. INTRODUÇÃO
O interesse na reprodução dos cães, tanto com objetivo
de melhoramento e difusão de diferentes raças ou como modelo
experimental para a preservação de canídeos silvestres, desponta como
um vasto campo para os pesquisadores da atualidade.
Para que tais objetivos sejam atingidos com sucesso faz-
se necessário o aprimoramento de biotecnologias de avaliação,
manipulação e conservação do sêmen dos canídeos, assim como, o
conhecimento e controle do ciclo estral, com desenvolvimento de métodos
precisos para a detecção da ovulação e de técnicas acessíveis e menos
cruentas para o depósito do sêmen no trato genital da fêmea.
Os primeiros animais prenhes por inseminação artificial
(IA) foram cães, inseminados com sêmen a fresco, em estudos
conduzidos pelo abade Lazzaro Spallanzani no ano de 1780, na Itália,
provenientes desta experiência deu-se o nascimento de três produtos
vivos e normais (Mies Filho, 1987).
Elias Ivanov, após os trabalhos pioneiros de Spallanzani,
demonstrou que a fecundação era possível mesmo quando se
substituíam os líquidos produzidos pelas glândulas anexas masculinas por
um soro artificial. O mesmo autor, prosseguindo os estudos sobre
reprodução, esclareceu o papel do frio na conservação do sêmen extra-
organismo (Mies Filho, 1987).
A primeira gestação decorrente de IA com sêmen canino
preservado em leite pasteurizado e refrigerado por 7 dias, foi descrita por
Harrop (1954). A refrigeração é um processo de preservação do sêmen a
Introdução e Revisão Geral
18
uma temperatura de 5ºC por um período determinado indicado em alguns
casos como, quando o macho e a fêmea encontram-se em lugares
distintos de difícil acesso, ou nos casos de impedimento legal da entrada
de animais em outro estado ou país, antes de um determinado período de
observação (Cunha, 1997; Johnston et al., 2001).
O sucesso na congelação de sêmen canino foi descrito
por Rowson (1954). Coincidentemente, Seager (1969) anunciou a
primeira prenhez, resultante de uma inseminação artificial com sêmen
congelado em cães.
Estudos realizados com sêmen congelado de cães
demonstraram que, aparentemente, o espermatozóide descongelado não
apresenta a mesma motilidade e vigor do sêmen fresco ou refrigerado,
conseqüentemente, sua sobrevivência no trato genital feminino é reduzida
(Gill et al., 1970; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e
Bruce, 1989; Rota et al., 1995; England e Ponzio, 1996; Gabaldi e Lopes,
1998; Peña et al., 1998; Johnston et al., 2001).
Rotineiramente, o sêmen congelado é utilizado para a
inseminação artificial em outras espécies como a bovina, eqüina, ovina e
caprina, e, na maioria delas, o sêmen descongelado é depositado no
útero, evitando desse modo, a barreira cervical, o que não ocorre na
espécie canina, onde o sêmen é normalmente depositado no fundo da
vagina (Morton e Bruce, 1989; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989).
As técnicas de preservação de sêmen em baixas
temperaturas, causam diminuição da fertilidade, devido principalmente, as
lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides advindas do estresse
térmico (Morton e Bruce, 1989; Jasko, 1994).
O estudo da complexa estrutura e funcionamento da
membrana plasmática (MP) é um dos passos mais importantes para o
Introdução e Revisão Geral
19
entendimento das interações das células espermáticas com o meio que as
circunda e ainda para que se minimizem os efeitos deletérios causados
pelas alterações provocadas por diminuição ou aumento da temperatura,
alterações no pH e na osmolaridade (Watson, 1981; Gennis, 1989).
O caráter bioquímico dos componentes dos meios
diluidores, a maneira como interagem com os espermatozóides e a
possibilidade de sua metabolização ou até, os possíveis efeitos adversos
aos espermatozóides devem ser minuciosamente avaliados.
A técnica de preservação mais estudada no sêmen dos
canídeos é a congelação, porém, existem ainda algumas dificuldades
encontradas na padronização desta metodologia, devido principalmente,
às particularidades inerentes a esta espécie.
Em vista do exposto é que tivemos como objetivo deste
trabalho estudar e avaliar o efeito de diferentes etapas da criopreservação
do sêmen canino dando-se principal enfoque a:
Verificar o efeito do processo de centrifugação sobre
a qualidade do sêmen canino (experimento I).
Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e
momentos de glicerolização sobre o sêmen canino
(experimento II).
Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e
diluidores na congelação do sêmen canino
(experimento III).
Verificar o efeito de três diferentes diluidores sobre o
sêmen canino descongelado sob dois diferentes
protocolos (experimento IV).
Introdução e Revisão Geral
20
2. REVISÃO GERAL
2.1. MEMBRANAS ESPERMÁTICAS
O estudo detalhado da estrutura e função das membranas
espermáticas torna-se extremamente necessário quando objetivamos
empregar, com êxito, biotécnicas de preservação espermática.
Todas as células - procariontes ou eucariontes - são
circundadas por uma membrana plasmática (MP) que define a delimitação
da célula, separando seu conteúdo do meio que a circunda. Por servir de
barreira seletiva, a MP determina a composição do citoplasma celular
(Cooper, 1996), e, tem, papel fundamental na maioria dos fenômenos
celulares (Singer e Nicolson, 1972).
Segundo descrito por Singer e Nicolson (1972), o modelo
básico das membranas biológicas segue a organização estrutural de:
bicamada de fosfolipídios com proteínas associadas (Gennis, 1989;
Cooper, 1996). O mesmo modelo é também verificado nas membranas
espermáticas (Watson, 1981; Watson, 1995).
Nos espermatozóides, o duplo folheto não é,
simplesmente, uma bicamada passiva de membrana lipídica em que
receptores recebem seus sinais moleculares específicos, mas sim, uma
estrutura altamente especializada, assumindo um papel ativo na
capacidade fertilizante, recebendo sinais e modificando-se ao longo do
processo de espermatogênese, trânsito e armazenagem no epidídimo,
ejaculação, depósito no trato genital feminino e, finalmente, capacitação e
Introdução e Revisão Geral
21
penetração do oócito (Bayard, 1982; O´Rand, 1982; Holt, 1995; Watson,
1995; Lenzi et al., 1996).
O padrão definitivo de lipídeos dos espermatozóides de
um ejaculado só é estabelecido após sua maturação epididimária (Holt,
1984; Watson, 1995; Lenzi et al., 1996). Holt (1984) sugeriu que, além
das modificações da superfície celular, relatadas como de maior
importância neste processo, ocorrem ainda modificações no interior da
MP dos espermatozóides durante sua passagem pelo epidídimo como
modulação da fluidez, da permeabilidade e da mobilidade das proteínas
integrais das membranas.
Fatores externos às células espermáticas, tais como,
alterações na composição, pH, temperatura e osmolaridade do meio que
as circunda, podem provocar alterações irreversíveis em suas membranas
limitando a função fertilizante dos espermatozóides (Gennis, 1989;
Watson, 2000).
2.2. ESTRUTURA E COMPOSIÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA
Lipídeos
Uma grande variedade de lipídeos pode constituir a MP
de uma célula e a razão para a existência de tal diversidade parece estar
diretamente ligada à função específica que cada membrana exercerá. A
heterogeneidade em sua constituição, levando a uma especificidade de
função, é o fator mais intrigante quanto à composição das membranas
biológicas (Gennis, 1989).
Introdução e Revisão Geral
22
As principais classes lipídicas encontradas na MP dos
espermatozóides de mamíferos e de aves não são diferentes daquelas
encontradas em outras células animais, e incluem, primariamente,
fosfolipídios, glicolipídios e esteróis. Contudo, a maioria das espécies
moleculares dentro dessas classes lipídicas são também particulares dos
espermatozóides e apresentam proporções variando substancialmente
com o estágio de maturação e desenvolvimento desta célula e ainda com
as espécies animais (Parks e Graham, 1992; Watson, 1995).
Os fosfolipídios são constituintes de grande parte das
membranas espermáticas, sendo responsáveis por cerca de 60 a 70%
dos lipídeos totais de um ejaculado (Watson, 1981). São moléculas
anfipáticas constituídas por duas cadeias de ácidos graxos hidrofóbicos
ligados a um grupo fosfato que constitui a cabeça hidrofílica (Gennis,
1989; Cooper, 1996).
Devido ao fato das caudas dos ácidos graxos serem
dificilmente solúveis em água, os fosfolipídios, espontaneamente, formam
uma bicamada quando em solução aquosa, com suas caudas
hidrofóbicas voltadas para o interior da membrana, e seus grupos polares
da cabeça, expostos para os dois lados, em contato com a solução
aquosa (Cooper, 1996).
Em adição aos fosfolipídios, a MP das células animais
contém ainda glicolipídios e colesterol. Membranas diferentes podem
conter quantidades distintas destes constituintes, diferindo em seus
comprimentos e graus de saturação. Em combinação, estes parâmetros
são importantes na determinação das propriedades dinâmicas das
membranas (Widnell e Pfenninger, 1990).
Os glicolipídios são encontrados exclusivamente no
folheto externo da MP, com a porção glicosilada exposta na superfície
Introdução e Revisão Geral
23
celular. Estes são, relativamente, o menor componente, constituindo cerca
de 2% dos lipídeos totais da MP (Cooper, 1996).
O colesterol por outro lado, é o maior componente da MP
de células animais, estando presente nas mesmas quantidades molares
que os fosfolipídios (Cooper, 1996). A quantidade de colesterol
encontrada na membrana espermática varia entre suas diferentes partes
(e.x., a taxa de colesterol/fosfolipídio da membrana espermática é maior
do que a da membrana acrossomal), entre as espécies animais e ainda
varia entre indivíduos de uma mesma espécie (Gennis, 1989; Amann e
Graham, 1993; Holt, 1995; Cross, 1998).
Devido a sua estrutura de espiral rígido, o colesterol
exerce uma função distinta na estrutura da membrana. Este, sozinho, não
pode agrupar-se e formar uma bicamada, mas está inserido na bicamada
de fosfolipídios, com seu grupo polar hidroxil voltado para a cabeça do
grupo fosfolipídio (Cross, 1998; Cooper, 1996). O colesterol tem
importante papel na regulação da estabilidade e da permeabilidade da MP
(Yeagle, 1985), sendo que o efluxo de colesterol da MP dos
espermatozóides é o primeiro passo para o início do processo de
capacitação (Seki et al., 1992).
Cross (1998) relatou que a taxa colesterol/fosfolipídio
existente na membrana espermática exerce importante papel regulador do
processo de capacitação espermática, e que, trocas de colesterol por
fosfolipídios entre a MP e o meio externo, diminuindo o conteúdo de
colesterol, e aumentando, com isso sua fluidez, desencadeiam a reação
do acrossomo por: diminuir a microviscosidade da MP , diminuir a adesão
entre os fosfolipídios e, talvez, permitir um maior influxo de cálcio para a
célula espermática. Todos estes seriam passos inespecíficos que
intermediariam a fusão da membrana plasmática com a membrana
Introdução e Revisão Geral
24
acrossomal externa, processo fusogênico conhecido por reação do
acrossomo.
Cross (1998) considerou ainda que a MP de um
espermatozóide recém ejaculado é incapaz de sofrer a reação do
acrossomo por estar, de alguma maneira, “congelada” pela alta
quantidade de colesterol em sua estrutura.
Dependendo da temperatura, o colesterol exerce efeitos
distintos sobre a fluidez da membrana. Em altas temperaturas, o
colesterol interfere no movimento das cadeias de ácidos graxos dos
fosfolipídios, tornando a parte interna da membrana menos fluida,
reduzindo a permeabilidade à pequenas moléculas. Em baixas
temperaturas contudo, o colesterol exerce efeito contrário por interferir
nas interações entre as cadeias de ácidos graxos, prevenindo a
membrana dos efeitos da refrigeração e mantendo a sua fluidez (Cooper,
1996).
A organização estrutural em forma de bicamada é
essencial para que as funções primordiais da MP sejam cumpridas, esta
conformação, composta de duas dimensões fluidas, permite que
moléculas individuais, lipídeos ou proteínas encontrem-se livres para
movimentos de rotação ou ainda para a movimentação lateral através da
membrana (Gennis, 1989; Cooper, 1996).
Proteínas
Enquanto os lipídeos são os elementos estruturais
fundamentais das membranas, as proteínas são responsáveis por
intermediar e realizar suas funções específicas (Cooper, 1996).
Introdução e Revisão Geral
25
Quanto a sua massa, a MP é constituída de
aproximadamente 50% de lipídeos e 50% de proteínas, com as porções
de carboidrato dos glicolipídios e das glicoproteinas constituindo 5 a 10%
(Singer e Nicolson, 1972; Widnell e Pfenninger, 1990; Amann e Graham,
1993; Cooper, 1996). Por serem as proteínas muito maiores que os
lipídeos, esta porcentagem corresponde a aproximadamente uma
molécula de proteína para cada 50 a 100 moléculas de lipídeos (Cooper,
1996).
Segundo Amann e Graham (1993), embora uma grande
parte destas proteínas sejam histonas envolvidas no acondicionamento
de DNA, outras estão envolvidas com enzimas do acrossomo, receptores
da MP, elementos de funcionalidade da membrana (transporte de íons e
carboidratos) e estruturas do citoesqueleto (dando formato à cabeça ou
provendo os filamentos da cauda).
Singer e Nicolson (1972) distinguiram duas classes de
proteínas associadas à membrana, chamando-as de proteínas periféricas
e integrais à membrana. As proteínas periféricas não estão inseridas no
interior hidrofóbico da bicamada lipídica, em vez disso, encontram-se
indiretamente associadas com as membranas através de interações
protéicas, que, freqüentemente, envolvem ligações iônicas que se
desfazem por pH extremo ou frente a altas concentrações de sais. As
proteínas integrais à membrana só podem ser liberadas por tratamentos
que rompam a bicamada de fosfolipídios.
Muitas das proteínas integrais são chamadas
transmembrana, por apresentarem vários mergulhos na bicamada de
fosfolipídio, desta forma, apresentam porções expostas para os dois lados
da membrana. Assim como os fosfolipídios, as proteínas transmembrana
são moléculas anfipáticas, com suas porções hidrofílicas expostas para o
meio aquoso, dos dois lados da membrana. Algumas destas proteínas
Introdução e Revisão Geral
26
mergulham somente uma vez na membrana, outras realizam múltiplos
mergulhos (Cooper, 1996).
As proteínas e os fosfolipídios não são tão hábeis em se
movimentar de um folheto para o outro da bicamada, por estarem
inseridos em uma camada fluida, tanto os lipídeos como as proteínas são
capazes de se difundir, com muita facilidade lateralmente através da
membrana (Cooper, 1996).
Ainda assim nem todas as proteínas são capazes de
difundir-se livremente pela MP. Em alguns casos, a mobilidade das
proteínas da membrana é restrita por associações com o citoesqueleto.
Com intenção de manter funções distintas, algumas vezes a mobilidade
das proteínas da MP pode ser restrita a domínios apropriados da
superfície celular (Cooper, 1996).
Imediatamente após a espermiogênese, o
espermatozóide recém formado possui 3 áreas maiores de domínio em
sua MP: cauda posterior, cauda anterior e conjunto da cabeça (Bartles,
1995). Em uma divisão futura, o domínio do conjunto da cabeça da MP
dos espermatozóides divide-se em cabeça anterior e cabeça posterior,
após sua passagem pela rete testis e pelo epidídimo (Holt, 1984; Bartles,
1995).
Glicocálice
Como já descrito anteriormente, a porção extracelular das
proteínas da MP geralmente é glicosilada, com a porção carboidrato
exposta na face externa da MP, conseqüentemente, a superfície da célula
é coberta por uma camada de carboidratos, conhecida como glicocálice,
formada por oligossacarídeos de glicolipídios e glicoproteinas
transmembrana (Cooper, 1996).
Introdução e Revisão Geral
27
Uma parte da função dos glicocálices é de proteger a
superfície celular. Além disso, os oligossacarídeos dos glicocálices
servem de marcadores para uma grande variedade de interações
celulares (Cooper, 1996).
Amann e Graham (1993) citaram a presença do
glicocálice na superfície da membrana espermática. Afirmaram, ainda,
que muitas das proteínas da superfície externa da MP dos
espermatozóides contêm cadeias de carboidratos que tendem a formar
um campo de carga negativa e a atrair, e ligar-se, negligentemente, a
outras proteínas do meio que os circunda. Devido a este material
adsorvido, o aspecto externo da região do glicocálice dos
espermatozóides pode variar, dependendo da sua situação ou do meio
em que ele se encontra.
2.3. RESPOSTAS DA CÉLULA ESPERMÁTICA Á BAIXAS TEMPERATURAS
A congelação e a posterior descongelação, com a
manutenção de todas as funções vitais, é um desafio alcançado com
sucesso por alguns microorganismos da natureza (Mazur et al. 1972).
O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência,
reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos
energéticos e na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a
preservação celular. Da mesma maneira que a congelação pode diminuir
ou paralisar algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, também,
acelerar outras, levando a danos ou mesmo a morte celular (Mazur et al.
1972, Watson, 1981; Watson, 1995; Holt, 2000).
Introdução e Revisão Geral
28
Todos estes efeitos podem se apresentar de maneira
diferente entre as várias espécies animais, entre indivíduos de uma
mesma espécie e ainda entre os compartimentos do espermatozóide,
como o acrossômico ou o mitocondrial (Watson, 1995; Holt, 2000; Kirk,
2001).
De acordo com Jasko (1994), as técnicas de preservação
do sêmen em baixas temperaturas, como a refrigeração ou a congelação,
causam uma diminuição da fertilidade, devido às injúrias ocorridas nas
células espermáticas, advindas do choque térmico.
O termo Estresse Térmico ou Choque Térmico define
um conjunto de alterações ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos
quando resfriados rapidamente da temperatura corpórea até temperaturas
próximas a 50C, que tem como consequência um decréscimo irreversível
da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no funcionamento
das células espermáticas incluindo: diminuição da taxa da glicólise, da
respiração celular e da frutólise, aumento na degeneração do ácido
desoxirribonucléico e liberação de material intracelular (Amann e Graham,
1993; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Watson, 2000).
A maioria das alterações causada pelo estresse térmico
se inicia na membrana espermática (Jasko, 1994, Holt, 2000). A alteração
da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou pH
podem determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de
fosfolipídios (Gennis, 1989).
A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de
4-5ºC pode levar ao rearranjo de alguns fosfolipídios semelhantes dentro
da bicamada, que podem agrupar-se e assumir configuração hexagonal
do tipo II, na qual, as cabeças polares hidrofílicas dos fosfolipídios se
agrupam formando micelas, com suas caudas hidrofóbicas voltadas para
o lado externo. Com este rearranjo as propriedades básicas da membrana
Introdução e Revisão Geral
29
biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas,
não são mantidas alterando a funcionalidade da membrana em questão
(Watson, 1981; Gennis, 1989; Parks e Graham, 1992; Amann e Graham,
1993; Jasko, 1994; Watson, 1995; Holt, 2000; Watson, 2000).
Watson (2000) citou ainda que outros elementos da
bicamada de fosfolipídios podem ser extremamente afetados pela queda
da temperatura, um exemplo seria a mobilidade das proteínas integrais
que poderá ser restrita pelo efeito da fase transicional dos lipídios, o que
levará a uma alteração em suas atividades, especialmente aquelas
proteínas dependentes de sua modulação estrutural para a manutenção
de suas funções, como é o caso das proteínas formadoras dos canais
iônicos.
A regulação do influxo de cálcio é claramente afetada pelo
resfriamento, sendo indiscutivelmente, uma das mais graves alterações
em termos de função espermática, e, em alguns casos, esta alteração
pode ser incompatível com a viabilidade espermática. A entrada de cálcio
na célula durante o resfriamento, mimetizando o que ocorre
fisiológicamente durante a capacitação, contribui para o inicio das reações
fusogênicas entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal
externa. Watson (2000) relatou a existência de uma grande similaridade
entre os danos verificados na MP durante a congelação e as alterações
verificadas após a reação do acrossomo, este autor considerou uma a
versão desorganizada da outra.
Segundo a revisão de Watson (2000) existem ainda
alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis a alterações de
temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor
relatou que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias
para permitir a aproximação da MP e da membrana acrossomal externa,
promovendo a exocitose acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma
Introdução e Revisão Geral
30
das explicações para a fusão desorganizada das membranas após o
resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides.
Com o declínio constante da temperatura, as células
estarão expostas à temperatura de congelação (abaixo de 0ºC), e com
isto, as células espermáticas serão expostas a alterações de
osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio
extracelular encontra-se sob a forma de solução, com a congelação de
parte desta água, a saturação de solutos aumenta, tornando hipertônico o
meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio osmótico seja
atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio
externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode
levá-la a sofrer um efeito deletério devido a grande desidratação e a
exposição a um meio extremamente saturado. Este efeito é chamado de
Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos no processo
de congelação das células espermáticas (Mazur et al. 1972; Watson,
1981; Watson, 1995; Holt, 2000).
Quando se congela uma célula lentamente, existe tempo
hábil para que uma grande quantidade de água migre da célula
espermática para o meio extracelular, na tentativa de reverter os danos do
efeito de solução. Neste caso, é imprescindível que a descongelação se
faça também lentamente, para que os volumes de água sejam
reequilibrados antes da total descongelação, evitando que grandes
alterações do volume celular provoquem lesão da membrana
espermática, por outro lado, se a congelação se dá rapidamente não
ocorre uma grande alteração no volume de água no interior da célula e
microcristais de gelo serão ali formados. A descongelação neste caso
deve ser realizada também de maneira rápida, pois, se esta é realizada
de maneira lenta a água intracelular se descongela em um momento em
que existe ainda temperatura baixa o suficiente para haver uma
recristalização da água recém descongelada. Se isto acontecer, grandes
Introdução e Revisão Geral
31
cristais, advindos da recristalização se formarão, expondo a célula ao
risco de sofrer perfurações por estes grandes cristais de gelo (Mazur et al.
1972, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000).
Watson (1995) afirmou ainda que a habilidade em
suportar o choque térmico é adquirida pelos espermatozóides durante sua
passagem pelo epidídimo e que esta capacidade de suportar flutuações
de temperatura está diretamente relacionada com as mudanças nos
lipídios das membranas espermáticas que ocorrem neste momento. Este
mesmo autor sugeriu ainda que alterações tanto na freqüência das
ejaculações, como no tempo do trânsito epididimário e da exposição dos
espermatozóides aos fluidos epididimários, podem ser uma explicação em
potencial, para diferenças de congelabilidade entre ejaculados de um
mesmo indivíduo.
Um dos aspectos de maior questionamento dentro dos
estudos da criopreservação é saber quando as alterações ocorrem, se
durante o congelamento ou se no descongelamento. Existem evidências
sugestivas de que células congeladas podem ser danificadas pela
descongelação e este efeito tem sido atribuído, principalmente, à
recristalização dos microcristais durante uma descongelação inapropriada
(Watson, 1995).
2.4. INTERAÇÕES DOS COMPONENTES DOS DILUIDORES COM A CÉLULA ESPERMÁTICA
Um protocolo de preservação adequado deve manter o
potencial fertilizante das células espermáticas que deverão, ao final de
todo o processo, apresentar a vitalidade necessária para atingir o local da
fertilização e estarem aptas a concluir a capacitação e a reação
acrossômica, que constituem o estágio final de maturação espermática e
Introdução e Revisão Geral
32
possibilitam a fecundação de um oócito (Watson, 1995; Rota, 1998; Ström
Holst, 1999; Peña, 2000).
Tanto para a refrigeração como para a congelação do
sêmen, diluidores são utilizados com o intuito de proteger os
espermatozóides de todos os efeitos críticos do processo de congelação.
Para tanto, deverão ser adicionadas, aos diluidores, macromoléculas
como lipoproteínas e fosfolipídios que atuarão como estabilizadores da
MP e como crioprotetores. Deveremos ainda fornecer fonte de nutrientes
para o metabolismo espermático e meio tampão para a manutenção do
pH. O desenvolvimento de um meio diluidor está sempre voltado para a
obtenção de uma boa estabilização dos componentes da MP (Parks e
Graham, 1992; Jasko, 1994).
Holt (2000) em sua revisão afirmou existirem diferenças
na composição lipídica da MP entre espécies, raças e ainda entre
indivíduos da mesma espécie, sendo talvez, a explicação para que um
mesmo meio diluidor confira maior ou menor proteção aos
espermatozóides de um determinado indivíduo. Watson (2000) e Kirk
(2001) consideraram os indivíduos como “bons congeladores” e “maus
congeladores”, e estas duas classes se diferenciam pela capacidade dos
indivíduos em tolerar os efeitos deletérios da criopreservação.
Açúcares
Os açúcares têm sido incluídos nos diluidores para
conservação de sêmen a baixas temperaturas como substrato de energia
endógena, como componente osmótico e como agente crioprotetor
(Farstad, 1996; Peña, 1997; Holt, 2000; Johnston et al., 2001).
Introdução e Revisão Geral
33
O espermatozóide, como outras células, é capaz de metabolizar os hidratos de carbono mediante um mecanismo oxidativo ou aeróbico (do qual restam como resíduo CO2 e H2O), ou por mecanismo anaeróbico (de degradação incompleta), na qual a quebra dos carboidratos estaciona na fase do ácido lático, que se acumula (Pérez e Pérez, 1994).
Rigau et al. (2001), partindo do princípio de que os espermatozóides podem metabolizar tanto a glicose como a frutose, avaliaram os efeitos destas duas hexoses sobre o padrão de motilidade espermática em cães. Os autores concluíram que a frutose induz um padrão de motilidade mais rápido e mais linear que a glicose e especularam ainda que a incubação em presença de glicose resultou em padrão de motilidade semelhante àquele verificado em espermatozóides caninos hiperativados.
Os di e trissacarídeos, não metabolizáveis pelos espermatozóides, exercem ainda um efeito crioprotetor em função de seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico atuando como substitutos de eletrólito. Não possuem capacidade de penetrar a membrana quando a concentração de solutos é elevada e dão melhores resultados quando acrescidos à fração glicerolizada do extensor (Salisbury e Vandemark, 1978).
Além de suas propriedades coligativas, os açúcares exercem efeito crioprotetor interagindo diretamente com a membrana. Estas interações envolvem ligações de hidrogênio dos grupos hidroxil dos açúcares com o grupo fosfato localizados na cabeça dos fosfolipídios. Por restaurar o percentual de água ao redor dos grupos polares da cabeça dos fosfolipídios, os açúcares podem prevenir os danos causados pela desidratação extrema que pode ocorrer com a congelação (Holt, 2000). Geralmente, os dissacarídeos (sucrose, trealose) são mais efetivos em estabilizar a bicamada do que os monossacarídeos (De Leeuw, 1993).
Introdução e Revisão Geral
34
Gema de ovo
Desde que Phillips e Lardy (1940) descobriram os efeitos
benéficos da gema de ovo na conservação dos espermatozóides, muitos
estudos foram realizados para elucidar a origem da indiscutível “ação
benéfica” que este produto oferece aos espermatozóides na condução da
conservação “in vitro”.
O principal efeito protetor da gema do ovo parece ocorrer
pela diminuição dos efeitos negativos do choque frio estabilizando as
membranas espermáticas (Holt, 2000). Watson (1979) demonstrou que
uma lipoproteína de baixa densidade encontrada na gema de ovo é o
fator ativo que protege a célula espermática do choque frio, porém o
mecanismo pelo qual este efeito se dá permanece obscuro.
Watson (1981) demonstrou que a gema de ovo pode
conferir diversos graus de proteção aos espermatozóides de diferentes
espécies animais, sendo que a explicação para esta observação seja
devido, principalmente, à comprovação da existência de distintas
composições lipídicas das MP entre as espécies animais.
Devido às recentes necessidades de controle de doenças
e ainda, para se evitar o uso de meios diluidores compostos por
substância biológicas existe um crescente desejo dos pesquisadores em
encontrar um substituto bioquimicamente estável para a gema de ovo,
porém, até o presente, devido, principalmente, à falta de dados sobre o
mecanismo exato de como a gema do ovo interfere na estabilização das
membranas espermáticas, este substituto ainda não foi encontrado (Holt,
2000).
Introdução e Revisão Geral
35
Leite
O emprego do leite como meio diluente de sêmen foi
primeiramente demonstrado por Donne em 1837. Segundo Hoffman
(1905) o leite era um líquido orgânico com importante propriedade
biológica para a conservação dos espermatozóides por possuir certa
capacidade tampão, ação bactericida, viscosidade adequada para a
manutenção dos espermatozóides no meio líquido com abundância de
carboidratos que seriam utilizados pelos espermatozóides na produção de
energia.
Em 1950, Koelliker comprovou a eficácia do leite na
criopreservação de sêmen e afirmou que duas substâncias eram
responsáveis por esta característica: a lactose, que age como elemento
energético, e proteínas que são substâncias capazes de potencializar a
atividade cinética dos espermatozóides.
Cunha (1997) e Johnston et al. (2001) verificaram a
possibilidade da utilização de um diluidor a base de leite desnatado e
glicose, rotineiramente utilizado na espécie eqüina, para a refrigeração e
transporte do sêmen canino.
Glicerol
A adição de crioprotetores ao meio diluidor é essencial
para a sobrevivência das células espermáticas após os processos de
resfriamento, porém os crioprotetores podem acarretar danos às células
(Parks e Graham, 1992).
Muito são os compostos de ação crioprotetora que são
tradicionalmente classificados como tendo ação intra ou extracelular.
Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem o glicerol, o
Introdução e Revisão Geral
36
dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, metanol. A
ação protetora destes crioprotetores é atribuída a suas propriedades
coligativas e ligantes com água, diminuindo o ponto crioscópio
intracelular, e, portanto, aumentando a quantidade de água que
permanece no estado líquido sob baixas temperaturas, diminuindo a
concentração intracelular de solutos e reduzindo os danos do efeito de
solução (Peña, 1997; Holt, 2000).
Desde que Polge et al. (1949) demonstraram a eficácia do
glicerol, ele foi considerado o crioprotetor universal sendo a substância
mais amplamente empregada na congelação de sêmen, incluindo a
espécie canina (England, 1992).
Durante o processamento do sêmen ocorrem bruscos
movimentos de água e de crioprotetores em uma célula espermática,
sendo possível que movimentos similares ocorram também em cada
compartimento espermático. Este movimento de água através da
membrana é influenciado, principalmente, pela existência de defeitos na
membrana plasmática e pela composição e estrutura da bicamada lipídica
(Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997).
A primeira conseqüência da adição do glicerol em um
meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma rápida
saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento
retorno ao volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula
(Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997).
Hammersted e Graham, 1990, descobriram que a
exposição de células a um meio diluidor com concentração de 0,5 M de
glicerol pode criar uma concentração intramembrana de 1mM de glicerol,
logo, por alterar a composição da membrana espermática, o glicerol pode
ainda alterar as propriedades básicas da MP por induzir mudanças no
Introdução e Revisão Geral
37
acondicionamento de fosfolipídios e ainda alterar a estabilidade e a
permeabilidade a água.
A fusogenicidade da membrana e o padrão de respostas
induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas
mudanças causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática,
podendo este fato contribuir para a diminuição da sobrevivência
espermática posterior ao processo de congelação/descongelação e
acelerar a capacitação espermática (Watson, 1995).
Segundo England (1992) a concentração de glicerol
utilizada para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%, sendo
que, segundo Watson (1979), a concentração ótima de glicerol em um
meio diluente representa um equilíbrio perfeito entre o efeito protetor e o
efeito tóxico do glicerol.
O grupo dos agentes extracelulares inclui as proteínas,
açúcares de elevado peso molecular, polivinilpirrolidona, etc. Atuam
através de mecanismo osmótico promovendo a desidratação celular
durante a congelação e impedindo a formação de grandes cristais de gelo
no interior da célula (Peña, 1997; Holt, 2000).
Tampões
O contínuo metabolismo espermático, produzindo como
resultado grandes quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num
aumento do ácido lático no meio extracelular. Este acúmulo pode causar a
morte dos espermatozóides devido a drásticas alterações do pH no meio
extracelular. Daí a necessidade de adição de tampões ao meio diluidor
(Pérez e Pérez, 1994; Farstad, 1996; Holt, 2000).
Introdução e Revisão Geral
38
O fosfato foi primeiramente testado para este fim, porém o
citrato de sódio, introduzido por Salisbury em 1940, adaptou-se melhor a
esta finalidade. O citrato de sódio aumenta a capacidade de diluição da
gema de ovo ao meio líquido, fenômeno que favorece sobremaneira a
ação da gema sobre os espermatozóides. Este fenômeno é
particularmente notável no que diz respeito ao choque frio e, com o
emprego do citrato de sódio, se obtém um aumento no tempo de
sobrevivência dos espermatozóides (Pérez e Pérez, 1994).
Tampões devem ser utilizados para a manutenção do
balanço iônico e do pH no diluidor (Johnston et al., 2001). Substâncias de
poder tampão, incluindo citrato de sódio, TRIS
(trishidroximetilaminometano) ou TES, têm sido utilizados com sucesso na
preservação de gametas de canídeos (Farstad, 1996, Rota, 1998, Holt,
2000; Peña, 2000; Johnston et al., 2001).
Aditivos
Espécies reativas de oxigênio (H2O2; O2-,-OH, ROOH,...) e
os antioxidantes têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na
infertilidade. Algumas evidências diretas ou indiretas levam a crer que em
vários momentos da criopreservação do sêmen estas espécies são
formadas. O controle do nível das espécies reativas de oxigênio pela
inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições que reduzam a
oxidação durante a congelação tem sido descrito (Papa et al., 1993;
Bilodeau et al., 2001).
Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido
incluídos na preservação do sêmen (Papa et al., 1993; Ball, et al., 2001;
Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993) a ação da glicina
ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse
Introdução e Revisão Geral
39
aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation
Peroxidase), inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente,
protegendo a membrana celular da oxidação.
Segundo Bicudo (1993), a adição de glicina e OEP ao
meio citrato-gema melhorou o vigor espermático assim como aumentou a
retenção de acrossomo após a congelação do sêmen bovino.
A adição de diferentes compostos detergentes, como o
Equex STM paste ou o Orvus ES paste ambos tendo como fração ativa o
SDS (dodecil sulfato sódico) em diluentes de congelação parece ser
benéfica para várias espécies, incluindo a espécie canina (Rota et al.,
1997; Holt, 2000; Peña, 2000).
O SDS é um detergente aniônico do grupo alquil iônico,
solúvel em água, que age desnaturando proteínas de membrana, e que,
quando em altas concentrações, pode solubilizar completamente
membranas biológicas. A natureza da proteção exercida pelo SDS não é
completamente conhecida, sugere-se que o efeito do SDS possa ser
exercido diretamente no meio extracelular, solubilizando as lipoproteínas
da gema do ovo e aumentando, desta forma, seu potencial de proteção
(Holt, 2000; Peña, 2000).
Rota et al. (1997) incluíram o Equex STM paste ao seu
diluidor para o sêmen de cão e constataram sua ação benéfica aos
espermatozóides. Os mesmos autores, em acordo com o citado
anteriormente, sugeriram que a fração ativa do Equex, o SDS, deve estar
envolvida com a solubilização e a ativação de componentes da gema de
ovo.
Peña (2000) constatou que o Equex, quando utilizado em
diluidores para o sêmen canino, exerceu um efeito protetor sobre as
membranas espermáticas e sugeriu que o SDS possa ter reduzido a fase
Introdução e Revisão Geral
40
de transição lipídica e/ou protegido o funcionamento de bombas iônicas
dos espermatozóides.
Peña (2000) alertou para o fato de que a exposição
prolongada dos espermatozóides ao SDS ou às lipoproteínas da gema de
ovo tratadas pelo SDS, pode conferir um excesso de fluidez às
membranas espermáticas indicando que seu efeito benéfico é
dependente do tempo de exposição e da concentração deste no meio
diluidor.
Experimento I
42
EFEITO DO PROCESSO DE CENTRIFUGAÇÃO SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO
1. REVISÃO DE LITERATURA
Os ejaculados caninos apresentam oscilações
significativas de volume e concentração espermática devido,
principalmente, a grandes variações de tamanho entre animais e entre as
diferentes raças (Cunha, 1998).
Para que se determine um protocolo de congelação na
espécie canina, onde alguns fatores como: a concentração espermática
por palhetas e a concentração de crioprotetor por célula espermática
sejam constantes, faz-se necessário que esta variação de volume do
ejaculado canino seja minimizada.
A centrifugação é uma das formas propostas na literatura
para se padronizarem essas variações e manter constantes o volume e a
concentração espermática sem que se verifique influencia negativa sobre
as células espermáticas (Papa, 1987; Lopes e Papa, 1998; Kirk, 2001).
1.1. O ejaculado canino
Segundo Heidrich (1977), foi Freiberg em 1935 o pioneiro
a identificar o fracionamento no ejaculado do cão. Chamou a primeira
fração de uretral ou pré-espermática, a segunda, de fração rica em
espermatozóides, e a terceira, de fração prostática ou pós-espermática.
A primeira fração ou pré-espermática apresenta um
aspecto aquoso, cujo pH varia de 6,2 a 6,5 e um volume entre 2,4 ± 1,8ml
Experimento I
43
(Johnston, 1991; Silva et al., 1996, Peña, 1997). England e Allen (1992)
sugeriram que as frações pré-espermática e pós-espermática são
originadas na próstata.
A segunda fração ou espermática apresenta um aspecto
de cremoso a aquoso e sua coloração fisiológica varia de branco
opalescente ao marfim, o pH situa-se entre 6,3 a 6,6 e o volume médio
varia de 0,5 a 3,5 ml (Gunzel-Apel, 1994).
A última fração do ejaculado é de origem prostática e
apresenta um aspecto aquoso e seu pH oscila entre 6,5 e 7,0. O volume é
diretamente proporcional à atividade secretória da glândula prostática e
sua média é de 6,48 ± 4,32ml (Morton e Bruce, 1989; Aguiar et al., 1994).
O fluido prostático é produzido continuamente nos machos
caninos não castrados e reflui retrógradamente para a bexiga ou é
eliminado pelo orifício externo da uretra em quantidades variando de
pequenas gotas até muitos mililitros, dependendo do tamanho prostático
(Johnston et al., 2000)
A próstata é a única glândula acessória em cães, e seu
tamanho e seu peso são dependentes da idade, raça e peso corpóreo (Di
Santis et al., 2001).
O volume de um ejaculado canino está diretamente ligado
à quantidade de líquido prostático. A próstata canina, assim como a
humana, tende a aumentar com o avanço da idade, como resultado de
uma Hiperplasia Prostática Benigna. A maioria dos animais não castrados
e com mais de cinco anos apresentam a próstata aumentada de volume e
posicionada na região abdominal (Johnston, 2000; Di Santis, 2001).
Rota et al. (1995) descreveram os efeitos prejudiciais do
plasma seminal sobre a membrana plasmática dos espermatozóides
bovinos e em seu estudo com sêmen canino, concluíram que a adição de
Experimento I
44
extensores aumentaria o número de células espermáticas com membrana
plasmática íntegra.
A freqüência de coletas apresentada por Feldman e
Nelson (1996) é de uma coleta a cada 48 horas, ou de uma coleta ao dia
durante 3 dias consecutivos e um repouso de 2 dias, ou, ainda, duas
coletas ao dia e repouso de 2 dias, podendo ocorrer um aumento na
concentração total de espermatozóides após alguns dias de repouso
sexual.
Alguns experimentos de congelação do sêmen canino,
sem a eliminação da primeira e da terceira fração, têm sido propostos.
Porém os dados obtidos até o presente sugerem que a utilização
unicamente da fração espermática gera melhores resultados (Peña,
1997). A utilização da centrifugação como forma de eliminar a primeira e a
terceira fração tem sido realizada em alguns protocolos de preservação
do sêmen canino (Lopes e Papa, 1998; Held, 1997).
1.2. A centrifugação
England e Allen (1992) citaram um efeito deletério da
primeira e da terceira fração do ejaculado canino sobre as características
espermáticas. Explicaram ainda que, na cobertura natural, o tempo de
contato do espermatozóide com estas frações é reduzido, diminuindo este
efeito. Os mesmos autores pesquisaram o efeito da incubação dos
espermatozóides caninos diluídos na primeira e terceira frações do
ejaculado e afirmaram existir um declínio no número de espermatozóides
morfologicamente normais, decorrentes dos efeitos deletérios dessas
frações.
Papa et al. (1981) demonstraram que a centrifugação é
um método adequado para o nivelamento da grande variação de
Experimento I
45
qualidade e quantidade de ejaculados eqüinos, e que diversas forças e
tempos de centrifugação não apresentaram efeito negativo sobre a
motilidade espermática, nem sobre a sobrevivência dos espermatozóides,
avaliada por meio de coloração supra vital. Estes autores observaram
efeito positivo da centrifugação sobre a motilidade espermática, além de
que sua intensificação não depreciou a qualidade do sêmen “in vitro”
durante o teste de termorresistência a 5ºC e a 37ºC.
Vários autores têm sugerido com êxito a centrifugação de
sêmen canino antes da criopreservação (Held, 1997; Rota, 1998; Strom
Holst, 1999; Peña, 2000). Lopes e Papa (1998) verificaram uma melhora
da qualidade espermática do sêmen de cão descongelado no grupo onde
foi realizada a centrifugação prévia ao processo de congelação.
Jasko (1994) sugere ainda que vários diluidores podem
ser utilizados para pré-diluir o sêmen durante a centrifugação e que este
passo garante uma boa proteção à célula espermática durante este
processo. O mesmo autor sugere a utilização de um meio diluidor à base
de leite desnatado para a realização de tal procedimento.
O leite pasteurizado foi o primeiro diluidor descrito para a
refrigeração do sêmen em cães (Harrop, 1954). Devido a sua composição
e capacidade tampão, diluidores à base de leite, assim como aqueles à
base de gema de ovo têm sido amplamente difundidos para conservação
do sêmen em todas as espécies animais (Cunha, 1997).
A lavagem dos espermatozóides remove fatores inibidores
da capacitação e prostaglandinas, sendo a técnica mais comumente
utilizada no preparo dos espermatozóides humanos para inseminação
artificial. Técnicas avançadas de preparo dos espermatozóides, incluindo
o swin-up, swin-down, diferentes gradientes de centrifugação com Percoll,
colunas de Sephadex e de Ficoll têm sido utilizados para eliminar
espermatozóides imóveis, células brancas ou debrís dos ejaculados
Experimento I
46
humanos, e têm sido relacionadas ao aumento da porcentagem de
espermatozóides móveis no sêmen (Carrell, 1998).
Lopes e Papa (1998) afirmaram que a centrifugação do
sêmen canino em Ficoll-Paque melhora significativamente os resultados
de congelação e de descongelação em meio à base de glicina-gema para
a espécie.
O Percoll é uma suspensão coloidal de polivinilpirrolidina
(PVP) ligada a sílica e esta coligação alivia as propriedades tóxicas do gel
de sílica. A maior vantagem do Percoll é não penetrar em membranas
biológicas, além disso, suas soluções possuem baixas viscosidade e
osmolaridade. Devido ao grande tamanho de suas partículas, a
centrifugação em velocidades moderadas pode gerar um gradiente de
densidade próprio, sendo desta forma a separação desejada realizada
rapidamente (Gennis, 1989).
Amann e Graham (1993) citaram que o processo de
centrifugação do sêmen pode aumentar a peroxidação lipídica das
membranas espermáticas, porém, segundo Prakash (1998), a exposição
ao Percoll protege os espermatozóides da produção excessiva de radicais
livres, que podem causar alterações nas funções da membrana induzindo
a peroxidação lipídica.
Tendo-se em vista o exposto, o objetivo do presente
trabalho foi testar os efeitos do processo de centrifugação no sêmen
canino e comparar a pré-diluição do sêmen em meio à base de leite
desnatado e glicose, Percoll ou plasma seminal autólogo na realização
deste procedimento.
Experimento I
47
2. MATERIAL E MÉTODO
2.1. Animais
Após realização de exame clínico detalhado, coleta de
sangue para hemograma, pesquisa de Brucelose e Leptospirose, e de
sêmen para o exame andrológico foram selecionados cinco (5) cães
adultos, SRD, pesando entre 10 e 20 kg, provenientes do Biotério Central
da Unesp de Botucatu, e cinco (5) cães adultos, da raça Cocker Spaniel,
pesando entre 15 e 20 kg, provenientes de criatórios particulares da
cidade de Botucatu-SP.
Os animais provenientes do Biotério foram mantidos em
canis com solário durante a fase de coleta do sêmen, os cães de
criatórios particulares permaneceram em seus respectivos canis, com
boas condições de higiene e alimentação durante a fase experimental.
O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da
Pós Graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área
de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP- Botucatu, para análise e
manipulação.
2.2. Coleta do Sêmen
O ejaculado completo foi coletado por meio de massagem
peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta
graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira
dentro de uma garrafa de isopor.
Experimento I
48
2.3. Exame do Sêmen
ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva.
ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN
Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram
realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de
sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por
lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de
fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a
motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (Colégio
Brasileiro de Reprodução Animal -CBRA, 1996) para o vigor.
Aglutinação espermática: Foi descrita como aglutinação a
observação visual e subjetiva, sob microscopia de contraste de fase, de
grupos de células espermáticas aderidas cabeça-cabeça. O resultado foi
descrito através de um escore variando de zero a três, onde:
0- não se observa aglutinação.
1- aglutinações esparsas, visualizadas em campos
isolados.
2- aglutinações esparsas, observadas em todos os
campos.
3- aglutinações muito freqüentes, em todos os campos.
Experimento I
49
Concentração espermática: Foi determinada através de
contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em
água e o número de espermatozóides expresso por ml..
Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de
animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10
minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et
al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e
os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A
classificação da patologia espermática foi feita segundo Oetllé (1988).
Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade
das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se iodeto
de propídio e carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por
Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO
I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de
epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence
Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 200 células classificadas
como: células íntegras - células emitindo fluorescência verde, células
lesadas - possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha.
2.4. Procedimentos experimentais
Foram utilizados dez (10) ejaculados completos de dez
(10) cães diferentes (n=10). Após a avaliação inicial dos parâmetros
espermáticos, o ejaculado foi dividido em três partes iguais e transferido
para tubos plásticos de centrífuga graduados e centrifugados a 800g por
15 minutos, formando os seguintes grupos (figura 1): G1 (n=10): 1\3 do
sêmen não foi centrifugado. O sêmen foi mantido em banho Maria a 37ºC,
durante a centrifugação dos outros grupos; G2 (n=10): 1\3 do sêmen foi
centrifugado em plasma seminal autólogo (PSA); G3 (n=10): 1\6 do
Experimento I
50
sêmen foi diluido 1:1 em meio à base de leite desnatado e glicose (LG)
(Kenney et al., 1975) (ANEXO II); G4 (n=10): 1\6 do sêmen foi
centrifugado sobre diferentes gradientes de Percoll® (Sigma) (ANEXO III)
(figura 1).
Diluidor
Protocolo
Plasma seminal autólogo (PSA)
Leite desnatado e glicose (LG) Percoll
Não centrifugado
G1 (1/3 do sêmen)
Centrifugado G2 (1/3 do sêmen)
G3 (1/6 do sêmen)
G4 (1/6 do sêmen)
FIGURA 1 – Esquema de formação dos grupos experimentais.
Após a centrifugação, foi descartado o sobrenadante de
todos os grupos centrifugados. Foram retirados 10µl do “pellet” para
avaliação da integridade das membranas espermáticas, através do teste
fluorescente, descrito por Cunha et al. (1996) onde os espermatozóides
foram incubados junto aos corantes fluorescentes e avaliados sob
iluminação epifluorescente (400x).
Os “pellets” foram então ressuspendidos em 2ml de LG. A
mesma quantidade do mesmo diluidor foi acrescida ao G1. Todos os
grupos foram avaliados quanto a motilidade e vigor espermático (M1).
As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC.
Decorridos 30 minutos de incubação (M2), as amostras foram novamente
avaliadas quanto à motilidade e o vigor espermático.
Experimento I
51
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados
Para as variáveis motilidade e vigor, foi utilizada a análise
de perfil, visando comparar os 4 grupos caracterizados por: G1- grupo
controle da centrifugação, G2- grupo controle dos diluidores, G3- grupo
Kenney, G4 - grupo Percoll, em cada um dos dois momentos: M1- logo
após a centrifugação, M2- após imersão das amostras centrifugadas em
banho Maria a 37ºC por 30 minutos. Também pela análise de perfil pôde-
se comparar cada grupo, os momentos através dos valores médios
observados nas amostras.
Para a variável aglutinação a comparação entre os grupos
foi feita pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em cada momento,
e pelo teste de Friedman, utilizando os valores medianos amostrais,
compararam-se para cada grupo os momentos.
Para a variável porcentagem de células íntegras, foi
utilizada a análise de variância de um delineamento inteiramente
casualizado com 4 tratamentos (grupos) e 10 repetições. Nesta análise,
utilizou-se a transformação arc sen√% visando a normalização da
distribuição dos dados amostrais.
Experimento I
52
3. RESULTADOS
Imediatamente após a centrifugação não houve diferença
estatística significativa quanto à motilidade espermática entre os grupos.
Porém, após 30 minutos de incubação em banho Maria a 37ºC os grupos
centrifugados apresentaram-se significativamente superiores ao grupo
onde não houve centrifugação (G2=G3=G4>G1) quanto à motilidade
espermática (tabela 1).
TABELA 1- Valores médios de motilidade espermática (%) do sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002.
M1 M2
G1 71aA 47aB
G2 79aA 61bB
G3 79aA 67bB
G4 74aA 63bB
para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)
para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)
Em todos os grupos estudados, verificou-se diminuição
significativa da motilidade espermática após a incubação (M2< M1)
(tabela 1).
Experimento I
53
TABELA 2- Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002.
M1 M2 G1 3,2aA 2,aB G2 3,7aA 2,7abB G3 3,8aA 3,1bB G4 3,5aA 3bA
para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem
estatisticamente (p>0,05) para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem
estatisticamente (p>0,05)
O vigor espermático imediatamente após a centrifugação
(M1) não diferiu significativamente entre os grupos (G1=G2=G3=G4).
Porém, quando se comparou o vigor espermático dos grupos decorridos
30 minutos de incubação, verificou-se superioridade dos grupos
centrifugados em diluidor LG (G3) e em diferentes gradientes de Percoll
(G4) (tabela 2).
Decorridos os 30 minutos de incubação não foi observada
diminuição significativa do vigor espermático no grupo centrifugado em
diferentes gradientes de Percoll (M1=M2) (tabela 2).
TABELA 3- Valores medianos da aglutinação espermática do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002.
M1 M2
G1 0A 0A G2 0A 1,5B G3 0A 0A G4 0A 1,5B
em cada grupo, mediana de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)
Experimento I
54
Verificou-se aumento significativo de aglutinação
espermática após a incubação em banho Maria a 37ºC nos grupos
centrifugados em PSA (G2) e naqueles centrifugados em diferentes
gradientes de Percoll (G4). Não houve diferença estatística significativa
entre os grupos em nenhum dos momentos (tabela 3)
TABELA 4- Porcentagem média de células espermáticas íntegras transformadas em arc sen √x (em rad) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). Botucatu, 2002.
média desvio padrão
médias originais
G1 1,38a 0,155 98,2 G2 1,43a 0,141 99,0 G3 1,41a 0,190 98,7 G4 1,38a 0,151 98,2
médias de grupos seguidos de letras iguais, não diferem estatisticamente (p>0,05).
Não se verificou diferença estatística significativa quanto à
integridade das membranas espermáticas entre os grupos estudados
imediatamente após as centrifugações (tabela 4).
Experimento I
55
4. DISCUSSÃO
Os ejaculados caninos apresentam grande variação em
seu volume devido, principalmente, à diferenças individuais. Entre
animais, esta variação deve-se à diferença de tamanho entre raças ou
mesmo devido a características individuais, como a idade ou tamanho da
próstata. Individualmente pode-se verificar diferenças de volume entre
dois ejaculados devido à atividade sexual no período da coleta ou mesmo
em conseqüência do envelhecimento deste animal. Todas as diferenças
de volume acima descritas devem-se, exclusivamente, a alterações
fisiológicas comuns e inerentes à espécie canina (Cunha, 1998).
Para que um protocolo de congelamento de sêmen seja
estabelecido, estas diferenças de volume que, conseqüentemente,
levarão a uma diferença de concentração espermática por mililitro de
ejaculado, devem ser eliminadas, possibilitando desta forma um
tratamento semelhante a cada célula espermática, no que diz respeito à
diluição, à concentração de crioprotetor no meio que a circunda, ao
envase e ao volume da dose inseminante (Papa, 1987; Lopes e Papa,
1998; Dell’aqua Junior, 2000).
Vários autores (Held, 1997; Lopes e Papa, 1998; Rota,
1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) têm descrito metodologias de
criopreservação do sêmen canino utilizando a centrifugação como forma
de eliminar plasma seminal e padronizar o volume do ejaculado. Os dados
encontrados neste experimento concordam com estes autores, já que
verificamos que a centrifugação não alterou a qualidade espermática no
que diz respeito à motilidade e vigor espermático e à integridade das
membranas espermáticas.
Experimento I
56
A associação da retirada do plasma seminal através da
centrifugação com a adição de uma solução de centrifugação, com
propriedades protetoras e ação de tampão, pode ser uma alternativa
viável para a eliminação do plasma seminal, sabidamente deletério ao
espermatozóide canino, prolongando a sobrevida dos espermatozóides.
Após a cobertura natural o metabolismo espermático no trato genital
feminino é intenso, este acontecimento fisiológico pode ser mimetizado
em condições laboratoriais incubando-se o sêmen a uma temperatura de
37ºC por um determinado período, este aumento de metabolismo é
responsável pelo aumento da produção de catabólitos tóxicos que, em
contato com a célula espermática, induzirem danos à integridade
funcional e morfológica da célula espermática (Amann e Graham, 1993).
Verificamos que o sêmen centrifugado em Percoll ou em
LG, após incubado em LG por 30 minutos, apresentou melhor vigor
espermático que o sêmen incubado em mesmas condições e previamente
centrifugado sem solução de centrifugação ou não centrifugado.
Provavelmente, substâncias presentes nos diluidores de centrifugação
proporcionaram maior atividade tampão, antioxidante e substrato para
metabolismo (G3) ou uma melhor “lavagem” das substâncias nocivas
presentes no plasma seminal (G4) fazendo que o vigor fosse mantido por
um período mais longo.
Verificamos, porém, que, após a centrifugação em
diferentes gradientes de Percoll e a completa eliminação do plasma
seminal houve também um aumento a aglutinação cabeça-cabeça das
células espermáticas, mesmo tendo sido estes espermatozóides
acrescidos de um diluidor durante a incubação a 37ºC.
Sabendo-se que o potencial de membrana, que se reflete
como uma característica de carga elétrica positiva ou negativa à
membrana externa do espermatozóide, pode ser alterado pelos radicais
Experimento I
57
de hidrato de carbono ligados a lipídios e proteínas constituintes da
membrana (Amann e Graham, 1993) e, lembrando-se ainda, que estas
ligações podem se desfazer com certa facilidade (Gennis, 1989),
sugerimos que o Percoll possa ter realizado uma lavagem de radicais
glicosilados ligados à membrana espermática promovendo alterações de
cargas elétricas de algumas células espermáticas. Como conseqüência
deste desequilíbrio elétrico, as células espermáticas podem ter se
agregado umas as outras na dependência da característica de repulsão
ou de atração de cargas elétricas presentes em sua superfície externa.
Após a avaliação dos nossos dados verificamos que a
centrifugação do sêmen canino não afetou a qualidade do movimento
espermático e a integridade das membranas e ainda que a centrifugação
em meio à base de leite desnatado e glicose conferiu maior manutenção
da qualidade do movimento espermático durante a incubação em banho
Maria a 37°C.
Experimento II
59
EFEITO DE DIFERENTES PERÍODOS DE EQUILÍBRIO E MOMENTOS DE GLICEROLIZAÇÃO SOBRE
O SÊMEN CANINO
1. REVISÃO DE LITERATURA
A principal função de uma célula espermática é a
fertilização de um óvulo, e para que isso ocorra, o espermatozóide
necessita das habilidades adquiridas a cada passo da maturação
espermática. Pode-se dizer que a maturação de um espermatozóide se
inicia nos túbulos seminíferos dos testículos, e só é finalizada, quando se
dá o encontro e a união do gameta masculino com o gameta feminino
(Watson, 1995).
Para que a preservação de uma célula espermática seja
realizada com sucesso, cada passo desta maturação celular deve ser
respeitado e viabilizado e, ainda, é necessário que cada etapa seja
realizada exatamente em seu devido momento (Kirk, 2001).
O resfriamento da célula espermática (39~25ºC até ~0ºC)
é o primeiro momento crítico dentro do processo de preservação pelo frio.
Dentro deste procedimento alterações na membrana espermática,
ocasionando danos à sua estrutura e função, podem ocorrer. Estas
modificações são conhecidas como efeito de fase transicional (Gennis,
1989; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Kirk, 2001).
Os espermatozóides caninos, assim como todas as outras
células são circundadas por uma membrana plasmática, que define a
delimitação da célula, separando seu conteúdo do meio externo. Da
Experimento II
60
mesma forma, como as membranas biológicas de outras células, as
membranas dos espermatozóides são extremamente especializadas às
funções a elas atribuídas (Watson, 1995).
Quando em temperatura ambiente (∼25ºC) ou próxima à
temperatura corpóre da espécie em questão, a membrana espermática,
assim como qualquer membrana biológica encontra-se em conformação
de bicamada fluida de fosfolipídios e proteínas, como descrito por Singer
e Nicolson em 1972.
Dentre os fosfolipídios integrantes da membrana existem
aqueles aos quais a conformação de monocamada seria mais adequada,
devido, principalmente, à conformação da sua cabeça polar (Gennis,
1989). Estes fosfolipídios encontram-se geralmente próximos às proteínas
integrantes das membranas. Com a diminuição da temperatura os
fosfolipídios se agrupam formando micelas dentro da membrana
espermática e, em alguns casos, quando se reaquece a membrana, os
fosfolipídios não se misturam completamente aos outros elementos,
mudando desta forma a conformação da membrana (Amann e Graham,
1993).
Para evitar ou minimizar as alterações que podem ocorrer
durante a refrigeração celular este processo deve ser realizado de
maneira controlada e agentes crioprotetores devem ser adicionados ao
meio diluidor de sêmen (Aman e Graham, 1993; Zúccari, 1998; Kirk,
2001).
A inclusão de um crioprotetor ao meio diluidor é de vital
importância para o sucesso da preservação pelo frio. O crioprotetor mais
utilizado, quando se deseja congelar sêmen canino, é o glicerol, porém o
mesmo agente de crucial importância no processo de congelação exerce
um efeito tóxico sobre a célula espermática (England, 1992, Farstad,
1996; Peña et al., 1998).
Experimento II
61
A eficácia e praticidade de um grande número de
crioprotetores permeáveis ou não às células que diminuem a formação e
o tamanho dos cristais de gelo intracelulares, têm sido testados quanto a
sua utilização no resfriamento de células espermáticas (De Leeuw et al.,
1993).
O glicerol é um crioprotetor intracelular e sabe-se que sua
principal função como crioprotetor se dá na regulação do fluxo de água
para a célula espermática controlando, desta forma, a desidratação,
minimizando o efeito de solução, que é um dos pontos críticos do
processo de congelamento celular (Peña, 1997).
Além da regulação osmótica do glicerol existem ainda
evidências de que ele se liga aos grupos hidrofílicos da cabeça dos
fosfolipídios regulando a fluidez das membranas e às proteínas integrais e
glicoproteinas causando um agrupamento das partículas
intramembranosas (Parks e Graham, 1992).
Os agentes crioprotetores intracelulares, particularmente
o glicerol, exercem seu maior papel de crioproteção durante a
cristalização (-10 ~ -15ºC), onde os efeitos de solução e de recristalização
podem afetar negativamente a morfofisiologia da célula espermática
(Zúccari, 1998; Holt, 2000), portanto, sua inclusão em um meio diluidor
pode ser realizada a temperaturas mais baixas sem que isso atrapalhe
seus efeitos benéficos.
Polge (1957) indicou que a sobrevivência espermática
pós-descongelação era superior quando o glicerol era acrescido a 5ºC.
Miller e Vandertmark (1962) demonstraram que a porcentagem de
espermatozóides móveis era maior quando o glicerol era acrescido a
temperatura de 4,5ºC ao invés de 10ºC.
Experimento II
62
O momento ideal para a adição do glicerol durante o
processo de congelação/descongelação do sêmen canino também tem
sido estudado.
Rohloff (1978) não encontrou diferença entre a adição de
um diluente glicerolizado ao sêmen canino a 25 ou a 5ºC. Fontbonne e
Badinand (1993) concluíram que o glicerol pode ser adicionado ao sêmen
canino à temperatura ambiente durante a primeira fase de diluição.
Em sua revisão, Salisbury e vandemark (1978) afirmaram
que os danos espermáticos são superiores quando a temperatura de
exposição ao glicerol é maior que 5ºC. Os mesmos autores verificaram
ainda que a motilidade e a capacidade fecundante dos espermatozóides
bovinos pós-descogelação aumentam quando existe um intervalo entre a
adição do glicerol e o início da congelação, e que esta etapa pode ser
chamada de período de equilíbrio.
England (1992) sugeriu que o sêmen de várias espécies
animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação
para que desenvolva uma máxima resistência aos efeitos do congelação
e concluiu ainda que o tempo de equilíbrio pode ser extremamente
variável de acordo com o protocolo de congelação/descongelação e ainda
de acordo com a espécie em questão.
Watson (1979) sugeriu que este tempo não é só
importante para permitir a entrada do glicerol como se acreditava
anteriormente, mas também permite que as membranas espermáticas se
acomodem ou que influxos iônicos ocorram.
England (1992) comprovou que uma curva de
resfriamento (39ºC até 4ºC) em nove minutos e um tempo de equilíbrio de
4 horas e posterior congelação/descongelação conferiu maior viabilidade
ao sêmen canino.
Experimento II
63
Rota (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen
canino a 4ºC durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era
atingida após 45 minutos de resfriamento. Olar et al. (1989) concluíram
que a curva de refrigeração de 1 hora com um período de equilíbrio a 5ºC
de 1 hora era favorável na preservação do sêmen canino. Porém, estes
autores só conseguiram chegar a tal conclusão sobre a superioridade
desta curva após congelarem e descongelaram as amostras de sêmen.
Em vista da diversidade entre os protocolos para a
congelação do sêmen canino, que apresentam grandes diferenças entre
os tempos de equilíbrio e ainda no momento ideal para a adição do
glicerol, é que tivemos como objetivo do presente estudo: testar um
período de equilíbrio ideal para o sêmen canino congelado em um meio
diluidor á base de glicina e gema de ovo e em um outro diluidor á base de
TRIS, ácido cítrico e glicose. E ainda, verificar os efeitos da adição do
glicerol à temperatura ambiente ou a 5ºC sobre a viabilidade espermática
e sobre a integridade de suas membranas.
Experimento II
64
2. MATERIAL E MÉTODO
2.1. Animais
Foram utilizados dez cães: dois (2) SRD, um (1) Pointer,
quatro (4) Cocker Spaniel, um (1) Pastor Alemão, um (1) Dog Alemão, um
(1) Fox Terrier, sendo um SRD proveniente do Biotério Central da Unesp
de Botucatu e todos os outros cães provenientes de criatórios particulares
da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em
perfeitas condições para participação neste projeto.
O cão proveniente do biotério foi mantido em canil com
solário pertencente à pós-graduação durante a fase de coleta do sêmen.
Os cães de criatórios particulares permaneceram em seus respectivos
canis. Todos os animais foram mantidos sob ótimas condições de higiene
e conforto durante a fase experimental.
O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da
pós-graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de
Reprodução Animal da FMVZ- UNESP- Botucatu, para análise e
manipulação.
2.2. Coleta do Sêmen
Foram realizadas trinta (30) coletas de sêmen de dez (10)
cães. Cada ejaculado completo foi coletado por meio de massagem
peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta
graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira
dentro de uma garrafa de isopor.
Experimento II
65
2.3. Exame do Sêmen
ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva.
ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN
Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram
realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de
sêmen é colocada sobre lamina aquecida (38-40ºC) e recoberta por
lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de
fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a
motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA,
1996) para o vigor.
Concentração espermática: Foi determinada através de
contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em
água e o número de espermatozóides expressos por ml.
Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de
animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10
minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et
al, 1986), foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e
os resultados expressos em porcentagem, e registrados individualmente.
A classificação das patologia foi feita segundo Oetllé (1988).
Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade
das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto
Experimento II
66
de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por
Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO
I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de
epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence
Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 200 células classificadas
como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células
lesadas- possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha.
2.4. Procedimentos Experimentais
Foram utilizados dez (10) cães sendo que cada cão doou
três (3) ejaculados completos em dias diferentes (n=30).
Após a avaliação inicial dos parâmetros espermáticos,
cada ejaculado foi dividido em duas partes iguais contendo cada qual 200
milhões de espermatozóides (sptz) em média. As metades foram
centrifugadas em 800g por 5 minutos diluídos 1:1 em meio à base de leite
desnatado e glicose (pH- 6,91; 330mosm).
Descartado o sobrenadante, um pellet foi ressuspendido
em 2,14 ml de diluidor Glicina-Gema (GG) sem glicerol (pH-7,0;
318mosm) (ANEXO II). Do total desta amostra, 1,07 ml foi acrescido de
0,93 ml de diluidor GG com 12,8% de glicerol, segundo Lopes e Papa
(1998) e envasados em 4 palhetas de 0,5 ml contendo em média 25
milhões de sptz cada. A outra metade da amostra (1,07 ml) foi mantida
em um tubo de centrifuga (20ml) plástico fechado.
O outro pellet foi ressuspendido em 2ml de diluidor TRIS
(ANEXO II) com 3% de glicerol (pH-6,39; 685mosm). Do total desta
mostra, 1ml foi acrescido de 1ml de diluidor TRIS com 7% de glicerol
(Rota, 1997) e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo em média 25
Experimento II
67
milhões de sptz cada. A outra metade da amostra (1ml) foi mantida em
tubo de centrifuga (20ml) plástico fechado.
Neste momento foram avaliadas amostras de cada
tratamento quanto à motilidade e ao vigor espermático (M1) segundo
protocolo descrito anteriormente.
As amostras foram levadas ao refrigerador 5°C e ali
mantidas durante o período de equilíbrio designado. Foram testados
períodos de equilíbrio de 40 (n=10), 60 (n=10) ou 90 (n=10) minutos. Foi
utilizado um ejaculado diferente de um mesmo cão para o teste de cada
tempo de equilíbrio.
Desta forma foram formados 12 grupos experimentais,
sendo eles (figura 1) : G1- sêmen diluído em meio GG com glicerolização
antes dos 40 minutos de equilíbrio; G2- sêmen diluído em meio GG com
glicerolização antes dos 60 minutos de equilíbrio; G3- sêmen diluído em
meio GG com glicerolização antes dos 90 minutos de equilíbrio; G4-
sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior aos 40 minutos
de equilíbrio; G5- sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior
aos 60 minutos de equilíbrio; G6- sêmen diluído em meio GG com
glicerolização posterior aos 90 minutos de equilíbrio; G7- sêmen diluído
em meio TRIS com glicerolização total antes dos 40 minutos de equilíbrio;
G8- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total antes dos 60
minutos de equilíbrio; G9- sêmen diluído em meio TRIS com
glicerolização total antes dos 90 minutos de equilíbrio; G10- sêmen diluído
em meio TRIS com glicerolização total posterior aos 40 minutos de
equilíbrio; G11- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total
posterior aos 60 minutos de equilíbrio; G12- sêmen diluído em meio TRIS
com glicerolização total posterior aos 90 minutos de equilíbrio.
Experimento II
68
Diluidor Glicina (GG) TRIS
Período de equilíbrio 40’ 60’ 90’ 40’ 60’ 90’
Glicerolização antes do equilíbrio G1 G2 G3 G7 G8 G9
Glicerolização após o equilíbrio G4 G5 G6 G10 G11 G12
FIGURA 1 – Esquema de formação dos grupos experimentais.
Para cada ejaculado coletado de cada cão, lembrando-se
que cada cão doou 3 ejaculados, foram realizados os procedimentos dos
grupos: G1, G4, G7 e G10 para um ejaculado; G2, G5, G8 e G11 para
outro ejaculado e G3, G6, G9 e G12 para um terceiro ejaculado. A
escolha do período de equilíbrio utilizado em cada ejaculado diferente de
cada cão foi estabelecida de maneira completamente aleatória.
Decorrido o período de equilíbrio designado, o grupo
diluído em GG e glicerolizado após o equilíbrio (G4, G5 ou G6) foi
acrescido de 0,93 ml do mesmo diluidor com 12,8%, de glicerol e
envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo 25 milhões de sptz em média
cada, ficando cada amostra com concentração final de 5% de glicerol.
O grupo diluído em TRIS com glicerolização parcial após
do equilíbrio (G10, G11 ou G12) foi acrescido de 1 ml do mesmo diluidor
com 7% de glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo 25
milhões de sptz em média cada, ficando cada amostra com concentração
final de 5% de glicerol.
Todas as amostras foram então aquecidas por 10 minutos
a 37°C e avaliadas (M2) quanto à motilidade e ao vigor espermático
através de microscopia de contraste de fase e quanto à integridade das
membranas espermáticas sob microscopia epifluorescente, com o uso de
sondas fluorescentes como já descrito anteriormente.
Experimento II
69
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados
Para a comparação entre dois momentos no mesmo
tratamento: prova não paramétrica de Wilcoxon para pequenas amostras
pareadas, com o cálculo da estatística p.
Para a comparação entre tratamentos em cada momento:
prova não paramétrica de Friedmam com o cálculo das estatísticas χ2 e p.
As estatísticas calculadas foram consideradas
significativas quando p<0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida
tendência à significância, já que p é a probabilidade de erroneamente
concluir pela significância.
Experimento II
70
3. RESULTADOS
Logo após as primeiras diluições do sêmen com os
diluidores não se verificou diferença estatística significativa de motilidade
espermática entre os períodos de equilíbrio de 40, 60 ou 90 minutos entre
os tratamentos (p>0,05). Quando verificado o efeito de tratamento em
cada período de equilíbrio distinto, nos grupos tratados com diluidor TRIS,
quando a glicerolização total seria efetivada após o equilíbrio de 40 e de
90 minutos (G10 e G12), houve, no entanto, tendência à superioridade
(p<0,10) (tabela 1).
TABELA 1- Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002.
GG TRIS Glicerolização
antes do equilíbrio
Glicerolização após o equilíbrio
Glicerolização antes do equilíbrio
Glicerolização após o equilíbrio
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
M1 80 80 70 80 80a 80a 80 80 80a 85* 80a 80a*
M2 70 75 70 75 70b 75b 80* 80 70b 80* 80b 70b
Para cada grupo, momentos seguidos de letras diferentes diferem estatisticamente (p<0,05). *indica tendência à superioridade entre dados em uma mesma linha (p<0,10)
Experimento II
71
Quando a motilidade espermática foi avaliada após os
períodos de equilíbrio e após a realização de todas as glicerolizações
(M2), os grupos propostos não apresentaram diferença estatística
significativa (p>0,05), porém podemos verificar que os grupos tratados
com diluidor TRIS, tendo sido estes glicerolizados totalmente antes ou
após o equilíbrio de 40 minutos (G7 e G10), apresentaram tendência à
superioridade para esta variável (p<0,10) (tabela 1).
Quando o diluidor GG foi avaliado no M2 (após o período
de equilíbrio), a motilidade espermática dos períodos de 40, 60 ou 90
minutos de equilíbrio não diferiu estatisticamente (p>0,05), tanto nos
grupos onde a glicerolização foi efetuada antes como após o período de
equilíbrio.
TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS Botucatu, 2002.
G7 G8 G9 G10 G11 G12
M1 80 80 80 85 80 80 M2 80* 80* 70 80* 80* 70
*indica superioridade entre dados em uma mesma linha (p<0,05)
Quando contrastados os grupos onde o diluidor TRIS foi
utilizado, após a glicerolização total de todos os grupos (M2), tendo sido a
glicerolização realizada antes ou após o equilíbrio, os períodos de 40 e 60
minutos de equilíbrio se apresentaram estatisticamente superiores ao
equilíbrio de 90 minutos (tabela 2).
Experimento II
72
TABELA 3- Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães avaliado antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002.
GG TRIS
Glicerolização
antes do equilíbrio
Glicerolização após o equilíbrio
Glicerolização antes do equilíbrio
Glicerolização após o equilíbrio
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
M1 3 3 3 4Aa 4Aa 3Aa 3 3 2 4Aa 4Aa 3Aa
M2 3A* 3A* 2A 3Ab* 2,5Ab* 2Ab 3B* 3B* 2B 3Bb* 3Bb* 2,5Bb
Para cada grupo, valores seguidos de letras minúsculas diferentes diferem estatisticamente
(p<0,05). Para um momento. valores seguidos de letras maiúsculas diferentes diferem estatisticamente
(p<0,05) * indica diferença estatística significante entre os períodos de 40, 60 e 90 minutos de equilíbrio
(p<0,05)
Verificamos diferença estatística significante entre os
valores de vigor avaliados antes e após a glicerolização para os grupos
onde esta foi realizada após o equilíbrio (G4, G5, G6, G10, G11 e G12)
(tabela 3).
Para o vigor espermático, após as primeiras diluições do
sêmen com os diluidores (M1), verificou-se uma superioridade significante
nos grupos onde a glicerolização seria realizada após o período de
equilíbrio (G4, G5, G6, G10, G11 e G12) sobre os grupos onde a
glicerolização foi efetivada antes do período de equilíbrio (G1, G2, G3,
G7, G8 e G9) (tabela 3).
Quanto ao vigor espermático avaliado após o período de
equilíbrio (M2), verificamos que os grupos tratados com o meio diluidor
TRIS apresentaram resultados significativamente superiores (p<0,05) aos
resultados apresentados pelos grupos tratados com meio GG (tabela3).
Experimento II
73
Verificamos ainda que, de maneira geral, não houve
diferença estatística significante entre os grupos que receberam a
glicerolização antes ou após o período de equilíbrio.
Houve um efeito significativo de duração do período de
equilíbrio sendo, no geral, os tempos de 40 e 60 minutos equivalentes e
significativamente superiores ao equilíbrio de 90 minutos quanto ao vigor
espermático.
TABELA 4- Mediana da porcentagem de células íntegras no sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002.
GG TRIS
Glicerolização
antes do equilíbrio
Glicerolização após o
equilíbrio
Glicerolização antes do equilíbrio
Glicerolização após o equilíbrio
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
M2 95a 93a 82b 96a 92a 83b 96a 94,5a 90,5b 97,5a 94a 89b
Valores seguidos de letras diferentes diferem estatisticamente (p<0,05)
A porcentagem de células espermáticas íntegras sofreu
efeito de tempo, sendo que, naqueles grupos onde o período de equilíbrio
foi de 90 minutos os valores foram significativamente inferiores (p<0,05).
Quando os dados foram contrastados para verificar se
houve efeito de tratamento verificamos que aos 40 e 60 minutos de
equilíbrio os meios GG (com glicerolização antes ou após) e os meios
TRIS (com glicerolização total antes ou após) obtiveram porcentagem de
células espermáticas íntegras estatisticamente equivalentes (p>0,05).
Experimento II
74
4. DISCUSSÃO
Para que os resultados de congelação de sêmen dos
cães resultem em melhores resultados de fertilidade in vivo, vários passos
do protocolo de congelação do sêmen canino vêem sendo testados e
aprimorados (Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000).
A glicerolização é um passo necessário na congelação do
sêmen, porém é sabido que o glicerol exerce também um efeito tóxico
sobre a célula espermática. Quando a glicerolização é realizada a 5 ºC
este efeito tóxico pode ser minimizado devido, principalmente, à
diminuição da taxa de entrada de glicerol nas células espermáticas,
levando a uma desidratação mais lenta destas células (Parks e Graham,
1992).
Em nosso experimento buscamos contrastar os efeitos da
glicerolização a 37ºC e a 5ºC e verificamos que, de uma maneira geral, a
glicerolização antes ou após o equilíbrio não apresentou diferenças
significantes para as variáveis avaliadas, concordando tanto com as
afirmativas de Fontbonne e Badinand et al.(1993), que concluíram que o
glicerol pode ser adicionado ao sêmen canino à temperatura ambiente
durante a primeira fase de diluição como com as de Rota (1998) que
indica a glicerolização a 5ºC. Devemos ressaltar, entretanto, que, em
nosso experimento, as últimas avaliações foram realizadas antes do
congelamento e descongelamento das células espermáticas.
Sabemos que as maiores injúrias celulares são causadas
no momento da congelação e descongelação das células. Segundo Holt
(2000), os efeitos deletérios da desidratação (durante a congelação) e
posterior hidratação das células espermáticas (durante a descongelação)
são as etapas críticas do processamento do sêmen podendo traduzir as
Experimento II
75
maiores alterações morfofuncionais às células espermáticas. Podemos
aqui especular que alguma diferença entre os grupos quanto ao momento
de glicerolização poderia ter sido verificada após a finalização do
processo, ou seja, após a congelação e descongelação das amostras,
como verificado por Olar (1984).
Verifica-se, na literatura atual que o tempo necessário
para que a célula espermática se estabilize em um meio diluidor é
extremamente variável entre os protocolos existentes (Olar, 1984;
England, 1992; Lopes e Papa, 1998; Rota, 1998). Este tempo depende,
principalmente, dos constituintes do diluidor e do protocolo adotado para
um determinado diluidor, porém depende ainda de características dos
espermatozóides de uma determinada espécie e do indivíduo (Rota,
1997; Holt, 2000).
Para que a congelação se torne um processo rápido e ágil
busca-se o menor tempo de equilíbrio, porém todos os benefícios
advindos deste procedimento devem ser garantidos às células
espermáticas em questão.
Em nosso experimento testamos três diferentes tempos
de equilíbrio, 40, 60 e 90 minutos. Notamos que, para a variável
motilidade espermática, quando as amostras foram equilibradas por 40
minutos (G1, G4, G7, G10), não houve diferença estatística significante
entre os valores verificados antes (M1) e após (M2) o equilíbrio (tabela 1).
Nos grupos onde a glicerolização foi realizada após o
equilíbrio, sendo ele de 60 ou de 90 minutos, verificamos um decréscimo
da motilidade durante o equilíbrio, sendo os valores de M1
significativamente maiores que os de M2. Lembramos aqui que o glicerol
exerce um efeito tóxico à célula espermática e, imediatamente após a
inclusão do glicerol, podemos claramente verificar uma alteração no
Experimento II
76
padrão de movimentação espermática advinda desta toxicidade (Watson,
1981; England, 1992).
O vigor espermático em todos os períodos de equilíbrio foi
significativamente menor quando a glicerolização foi realizada após o
equilíbrio. Provavelmente, nos protocolos aqui propostos, as células
espermáticas precisem de um tempo maior para que o influxo de glicerol
seja equilibrado e para que a célula recobre sua movimentação normal,
como recomendado por Watson (1981). Salientamos mais uma vez que a
última avaliação foi realizada imediatamente após o equilíbrio e que a
congelação e descongelação das amostras não foi realizada.
O número de células espermáticas íntegras foi maior nos
grupos onde foram realizados 40 e 60 minutos de equilíbrio sendo que,
nestes mesmos períodos de equilíbrio, não verificamos também influência
do meio diluidor sobre a integridade das células espermáticas.
Olar et al. (1989) verificaram que os efeitos de diferentes
períodos de equilíbrio sobre a motilidade espermática só foram
observados após a congelação e a descongelação do sêmen canino.
Estes autores só puderam constatar a superioridade de uma curva de
refrigeração de 1 hora com equilíbrio de 1 h sobre a de 1h com equilíbrio
de 2 horas após a descongelação das amostras.
Quando buscamos um protocolo de congelação
procuramos o mais rápido, ágil e eficiente. Tendo-se em vista estas
premissas podemos concluir que os períodos de 40 e 60 minutos foram
superiores aos de 90 minutos e que a glicerolização anterior ao equilíbrio,
em nossas condições, apresentou-se vantajosa frente a glicerolização
pós-equilíbrio, tanto pela praticidade como pela tendência dos resultados
aqui verificados, porém, como discutido acima, a avaliação da viabilidade
espermática após a congelação e descongelação das amostras fazem-se
necessárias para que os dados aqui encontrados sejam confirmados.
Experimento III
78
EFEITO DE DIFERENTES PERÍODOS DE EQUILÍBRIO E DE DIFERENTES DILUIDORES NA CONGELAÇÃO
DO SÊMEN CANINO
1. REVISÃO DE LITERATURA
A globalização, processo que provocou drásticas
mudanças no cenário mundial, contribuiu para que proprietários de cães
se interessassem pelas mais diversas raças. Exemplares de muitas delas
não estão disponíveis no mercado nacional, a mesma realidade é
enfrentada em outros países.
A congelação e o transporte de gametas podem servir
para transpor barreiras de distância e tempo, viabilizando o trânsito de
sêmen de machos melhoradores ou mesmo de raças exóticas, com
menores despesas e riscos para proprietários e animais. Soma-se a este
fato, a possibilidade da utilização do cão como modelo experimental para
aperfeiçoamento de biotecnologias para a conservação de gametas de
canídeos selvagens.
Desde que Seager em 1969 relatou a 1° gestação e parto
proveniente de uma inseminação artificial (IA) com sêmen canino
congelado, várias etapas deste processo vêm sendo testadas e
aperfeiçoadas na tentativa de obtenção de melhores resultados de
fertilidade in vivo.
Estudos realizados com sêmen congelado de cães
mostraram que o espermatozóide descongelado não demonstra a mesma
vitalidade do sêmen fresco ou refrigerado, conseqüentemente, sua
Experimento III
79
sobrevivência no trato genital feminino é reduzida ( Gill et al., 1970; Olar,
1984; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e Bruce,
1989; Brown, 1992; Linde-Forsberg, 1995; Rota et al., 1995; England e
Ponzio, 1996).
Apesar das dificuldades encontradas no processo de
congelação do sêmen canino, Linde-Forsberg et al. (1999) analisaram
dados de 327 inseminações artificiais realizadas de 1983 a 1995
utilizando sêmen congelado pelo método CLONE (Cryogenetic
Laboratories) e constataram taxas de nascimento maiores de 70% quando
o sêmen descongelado apresentava mais de 40% de motilidade
espermática no momento da inseminação.
O meio diluidor utilizado para a congelação do sêmen
deve fornecer energia metabolizável para que os espermatozóides
mantenham-se viáveis após o processo de descongelação, apresentar um
pH e osmolaridade compatíveis com os espermatozóides de cada
espécie, levando-se em consideração que a habilidade dos
espermatozóides em resistir a refrigeração e ao congelamento difere entre
as espécies animais (Farstad, 1996).
Para a congelação do sêmen, o diluidor deve ainda conter
um crioprotetor. O glicerol é largamente utilizado para a congelação do
sêmen dos animais domésticos, entretanto, apresenta um efeito tóxico
sobre os espermatozóides, envolvendo todas as zonas da membrana
espermática. A concentração final de glicerol usada para a congelação do
sêmen canino varia, geralmente, de 2 a 10% (Olar, 1984; Farstad, 1996,
Peña et al., 1998).
O meio diluidor à base de TRIS, Ácido Cítrico e Glicose
vem se mostrando bastante viável na refrigeração e no congelamento do
sêmen canino (Olar, 1984; Rota, 1998; Santos et al.; 1999; Strom Holst,
1999; Peña, 2000).
Experimento III
80
O meio diluidor à base de glicina - gema de ovo apresenta
excelentes resultados quando utilizado na congelação do sêmen nas
espécies bovina (Bicudo et al., 1993), equina (Papa et al., 1993), ovina
(Gonzales, 1996) e na refrigeração e congelação do sêmen canino (Lopes
e Papa, 1996; Cunha, 1997; Santos et al., 1999).
A utilização de um diluidor denominado M9, composto de
33% de meio Merck-gema (Martin et al., 1979), 33% de meio à base de
leite desnatado e glicose (Kenney et al., 1975) e 33% de DME (Sigma)
acrescido de glicerol até a concentração final de 5%, melhorou os
resultados de congelação do sêmen eqüino (Neves Neto, et al. 1999;
Dell’Aqua Junior, 2000).
De acordo com Watson (1979) e Jasko (1994), antes da
congelação, os espermatozóides devem permanecer um determinado
período de tempo a uma temperatura de equilíbrio, para que ocorra
diminuição do metabolismo espermático e para que iniciem as interações
com os componentes do meio diluidor antes do estresse do
congelamento, diminuindo, dessa forma, os riscos de um choque térmico.
O período de equilíbrio ideal pode variar para cada espécie animal e para
cada diluidor utilizado (Chacur, 1996).
Tendo em vista a diversidade de protocolos para a
congelação do sêmen canino tivemos como objetivo no presente
experimento: verificar os efeitos de dois diferentes períodos de equilíbrio
com uma mesma curva de resfriamento e três diferentes diluidores sobre
a motilidade e o vigor espermáticos e sobre a integridade das membranas
do sêmen canino congelado e descongelado a 370C por 30 segundos.
Experimento III
81
2. MATERIAL E MÉTODO
2.1. Animais
Foram utilizados cinco (5) cães sendo: três (3) SRD, um
(1) Weimaraner e um (1) Pointer. Os cães SRD foram provenientes do
Biotério Central da Unesp de Botucatu e os outros cães provenientes de
criatórios particulares da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados
apresentaram-se em boas condições para participação neste projeto.
Os cães provenientes do biotério foram mantidos em canil
com solário pertencente a pós-graduação durante a fase de coleta do
sêmen. Os cães de criatórios particulares permaneceram em seus
respectivos canis. Todos os animais foram mantidos sob ótimas
condições de higiene e alimentação durante o experimento.
O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da
pós-graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de
Reprodução Animal da FMVZ UNESP-Botucatu, para análise e
manipulação.
2.2. Coleta do Sêmen
Foram realizadas duas coletas de sêmen de cada cão,
sendo as coletas de um mesmo cão realizadas em dias diferentes (n=10).
Cada ejaculado completo foi coletado por meio de massagem peniana e
recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta graduado.
Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira dentro de
uma garrafa de isopor.
Experimento III
82
2.3. Exame do Sêmen
ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva.
ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN
Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram
realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de
sêmen é colocada sobre lamina aquecida (38-40ºC) e recoberta por
lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de
fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a
motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA,
1996) para o vigor.
Concentração espermática: Foi determinada através de
contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em
água e o número de espermatozóides expressos por ml.
Espermiograma: Foi realizada na fase de seleção de
animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10
minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et
al, 1986), foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e
os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A
classificação das patologia foi feita segundo Oettlé (1988).
Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade
das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto
de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por
Experimento III
83
Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO
I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de
epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence
Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 100 células classificadas
como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células
lesadas- possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha.
2.4. Procedimentos experimentais
Foram coletados dez ejaculados e avaliados segundo os
parâmetros acima descritos, cada amostra de sêmen foi dividida em 3
amostras idênticas. Cada amostra foi acrescida na proporção de 1:1 de
meio à base de leite desnatado e glicose (Kenney, 1975) (pH 7,26; 355
mOSM) e centrifugada por 5 minutos a 800g. Após a eliminação do
sobrenadante, os grupos foram acrescidos dos meios diluidores sob os
seguintes protocolos:
Glicina Gema –Um “pellet” foi ressuspendido em 2,4ml
de meio Glicina-Gema de ovo (GG) sem glicerol (pH 7; 285 mOSM) e
decorridos 5 minutos acrescido de 1,6 ml de GG com 12,8% de glicerol e
envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta amostra com 5% de
glicerol em sua concentração final (Lopes e Papa, 1998).
Tris - O segundo “pellet” foi ressuspendido em 2ml de
meio TRIS, Ac.Cítrico e Glicose (TRIS) com 3% de glicerol (pH 6,10; 788
mOSM) e decorridos 5 minutos acrescido de 2ml de TRIS com 7% de
glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta amostra com 5%
de glicerol em sua concentração final (Rota,1997).
Experimento III
84
M9 - Um terceiro “pellet” foi ressuspendido em 4 ml de M9
(33% Merck-gema, 33% Kenney, 33% DME, 5% glicerol na solução final)
(Dell’Aqua Junior, 2000) (ANEXO II) e envasado em 4 palhetas de 0,5ml,
ficando esta com 5% de glicerol em sua concentração final.
Amostras tratadas sob cada protocolo foram avaliadas
quanto à motilidade e vigor espermático através de microscopia de
contraste de fase e, imediatamente após, levadas ao refrigerador
computadorizado MINITUB programado para a temperatura de 5ºC. A
temperatura de 5ºC foi atingida em média após 20 minutos de
refrigeração, sendo este período nomeado Curva de Refrigeração (CR).
Para cada grupo, um ejaculado de cada cão foi
manipulado como descrito e posteriormente mantido a 5ºC por 40 (n=5)
ou 60 minutos (n=5), sendo este período denominado Período de
Equilíbrio (PE).
Desta forma, foram formados 6 grupos quanto ao
tratamento das amostras de sêmen (figura 1), sendo eles: G1 – congelado
em GG após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos; G2 - congelado em
GG após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos; G3 - congelado em TRIS
após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos; G4 - congelado em TRIS
após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos; G5 - congelado em M9 após
CR de 20 minutos e PE de 40 minutos;G6 - congelado em M9 após CR de
20 minutos e PE de 60 minutos.
Diluidores
Protocolos
GG Tris M9
CR de 20’ PE de 40’ G1 G3 G5
CR de 20’ PE de 60’ G2 G4 G6
FIGURA 1 – Esquema da formação dos grupos experimentais
Experimento III
85
Após o PE (40 ou 60 minutos), 2 palhetas de cada grupo
foram levadas a um isopor contendo 5 cm de nitrogênio líquido (N2) e
mantidas a 4 cm deste durante 20 minutos. Decorrido este tempo, as
palhetas foram mergulhadas no N2 raquiadas e armazenadas em botijões
apropriados.
O conteúdo das 2 outras palhetas de cada grupo foi
levado diretamente do PE ao banho Maria 37ºC por 10 minutos e avaliado
(M1) quanto à motilidade e vigor espermáticos.
As palhetas armazenadas foram posteriormente (> 24
horas) descongeladas a 37ºC por 30 segundos e avaliadas (M2) quanto à
motilidade e vigor espermáticos e integridade das membranas
espermáticas.
As amostras descongeladas foram ainda mantidas em
banho Maria a 37ºC durante 1 hora para teste de longevidade
espermática e após este período reavaliadas (M3) quanto à motilidade e
vigor espermáticos e integridade das membranas espermáticas.
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados
Para a comparação entre dois momentos no mesmo
tratamento: prova não paramétrica de Wilcoxon para pequenas amostras
pareadas, com o cálculo da estatística p.
Para a comparação entre 3 momentos no mesmo
tratamento: prova não paramétrica de Friedman para amostras
dependentes, com o cálculo das estatíticas χ2 e p.
Para a comparação entre tratamentos em cada momento:
prova não paramétrica de Friedmam com o cálculo das estatísticas χ2 e p.
Experimento III
86
As estatísticas calculadas foram consideradas
significativas quando p< 0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida
tendência à significância, já que p é a probabilidade de erroneamente
concluir pela significância.
Experimento III
87
3. RESULTADOS
TABELA 1 – Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.
G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 80Aa 80Aa 70Ba 80Ba 70Ba 80Ba M2 50ab 40ab 40ab 30ab 50ab 40ab M3 30b 20b 20b 10b 20b 40b
Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05) não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05)
Verificamos que houve decréscimo da motilidade
espermática após o processo de descongelação para todos os grupos,
sendo que, ao final do teste de longevidade (M3) todas as amostras
apresentaram motilidade espermática significativamente diminuída frente
aos valores iniciais (p<0,05) (tabela 1).
Quando comparados os dados obtidos em cada
momento, verificamos que não houve diferença significante na motilidade
espermática após a descongelação e após o teste de longevidade, porém,
imediatamente após o período de equilíbrio, a motilidade espermática dos
grupos diluídos em GG apresentaram valores significativamente mais
elevados (p<0,05) (tabela 1).
Experimento III
88
TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.
Grupos G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 3Aa 2Aa 2Ba* 2Ba 3Aa 3Aa* M2 2ABab 2ABab 2Ba* 1Bab 2Aab 3Aa*
M3 1b 1b 0a* 1b 0b 2a*
Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas seguidas do símbolo * representam tendência estatística (p<0,10). não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05)
Na tabela 2, observa-se que as amostras congeladas com
TRIS (G3 e G4) apresentaram resultados significativamente inferiores
após a descongelação, porém, após o teste de longevidade (M3), não se
observou diferença estatística significativa entre os grupos (p>0,05).
Observa-se ainda que, verificando-se o vigor dentro de um mesmo grupo,
houve tendência à manutenção do vigor espermático após o período de
equilíbrio, descongelação e após teste de longevidade (M1 = M2 = M3)
(p<0,10) nos grupos onde o sêmen foi congelado com TRIS com PE de
40 minutos (G3) e com M9 com PE de 60 minutos (G6).
Experimento III
89
TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.
Grupos G1 G2 G3 G4 G5 G6
M2 46Aa 35Aa 37Aa 43Aa 60Ba 50Ba M3 36Ab 25Aa 32Aa 40Ab 62Ba 50Ba
Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05). não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05)
Na tabela 3, verificou-se que os dois grupos congelados
com meio o M9 (G5 e G6) apresentaram-se significativamente superiores
(p<0,05) após a descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3).
Observa-se ainda que os grupos G2, G3, G5 e G6
mantiveram, significativamente equivalentes, as porcentagens de células
espermáticas íntegras entre os momentos M2 e M3 (p<0,05).
Experimento III
90
4. DISCUSSÃO
A utilização do sêmen congelado de canídeos será um
grande passo na criação nacional, possibilitando a difusão do sêmen de
machos melhoradores de raças, e ainda, servindo de seguro biológico na
preservação de espécies ameaçadas de extinção.
O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência,
diminuindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição dos gastos
energéticos e diminuição na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo
para a preservação celular (Mazur, 1970, Watson, 1981, Watson, 1995,
Holt, 2000).
As técnicas de preservação do sêmen em baixas
temperaturas podem provocar a diminuição da fertilidade devido,
principalmente, às injúrias ocorridas aos espermatozóides durante o
processo de resfriamento (fase de transição), congelação e
descongelação (efeito de solução e recristalização) (Jasko, 1994, Zúccari,
1998; Holt, 2000; Kirk, 2001). A alteração da temperatura, assim como
alterações de osmolaridade, pressão ou pH podem determinar mudanças
irreversíveis na estrutura e organização das membranas espermáticas
(Gennis, 1989).
A avaliação seqüencial da motilidade espermática obtida
após o período de equilíbrio (M1), descongelação (M2) e após o teste de
longevidade (M3) corroboram com estas afirmações, sendo verificado um
decréscimo significativo destes valores no decorrer destes processos em
todos os grupos.
Experimento III
91
O vigor espermático das amostras congeladas com TRIS
com PE de 40 minutos e congeladas com M9 com PE de 60 minutos não
apresentaram decréscimo significativo após o descongelamento e o teste
de longevidade. O G3 apresentou resultados significativamente inferiores
quando comparado aos outros grupos em M1 e em M2, logo, esta
manutenção do vigor espermático é menos significativa para este grupo.
Ao contrário deste fato, em G6, onde se utilizou o M9 como diluidor com
60 minutos de PE, verificou-se uma superioridade sobre os outros grupos,
tanto no M1 como em M2, além de ter havido a manutenção dos valores
durante o processo de equilíbrio, descongelação e longevidade.
Podemos afirmar que houve uma maior manutenção da
viabilidade espermática no G6. O M9 é um diluidor rico em aminoácidos e
tampões que funcionam tanto como crioprotetores como antioxidantes e
são, provavelmente, estes componentes que conferem a ele maior poder
de proteção quanto aos efeitos adversos das alterações de temperatura.
Os dados aqui encontrados são concordantes com os obtidos por Neves
Neto (1999) e Dell’Aqua Junior (2000) que obtiveram melhores resultados
de congelação para o sêmen eqüino congelado neste diluidor.
Os efeitos deletérios da refrigeração da célula podem se
apresentar de maneira diferente entre as diferentes espécies animais,
entre indivíduos e ainda entre os compartimentos de um espermatozóide,
como o acrossômico ou o mitocondrial (Garner et al., 1999, Holt, 2000).
O sêmen de várias espécies animais necessita de uma
pausa de algumas horas antes da congelação para que desenvolva uma
máxima resistência aos efeitos adversos da criopreservação. Watson
(1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a
entrada do glicerol como se acreditava anteriormente, mas este tempo
permite que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos
iônicos ocorram.
Experimento III
92
Na literatura atual existem vários protocolos para a
congelação do sêmen canino, dentre eles, vários são os períodos de
equilíbrio propostos (Olar, 1984; England, 1992; Rota, 1998; Santos,
1999).
Após a avaliação estatística de nossos dados,
observamos que os dois períodos de equilíbrio propostos (40 ou 60
minutos) não influenciaram estatisticamente os dados avaliados. No
Experimento II, observamos a superioridade dos períodos de equilíbrio de
40 e 60 minutos frente ao de 90 minutos. Somando-se a curva de
refrigeração de 20 minutos ao período de 60 minutos, observamos que os
mesmos têm uma duração total bastante próxima. Provavelmente aqui, a
curva de refrigeração mais rápida (20 minutos) em contraste com uma
curva de refrigeração mais longa (~45 minutos) pode ter sido benéfica à
célula espermática canina, evitando maiores danos que poderiam ter sido
causados devido aos efeitos da fase de transição, que ocorre em
temperaturas entre 20 e 5ºC.
Após o término do processo de preservação, os
espermatozóides devem apresentar uma boa motilidade para que possam
atingir o local da fertilização e penetrar o óvulo. Precisam, também,
manter a integridade de suas membranas espermáticas, para sua
posterior ligação com a zona pelúcida e membrana vitelínica, resultando
na formação do zigoto (Holt, 1995; Zúccari, 1998).
Nos grupos congelados com M9, a integridade das
membranas espermáticas foi significativamente superior após
descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3). Acrescenta-se,
ainda, que os G5 e G6 mantiveram significativamente estáveis a
porcentagem de membranas íntegras durante o teste de longevidade
sendo que, ao final deste, M2=M3 (p>0,05). Os aminoácidos presentes
neste diluidor podem ter interagido positivamente na manutenção das
Experimento III
93
membranas espermáticas e ainda, a presença do EDTA, um quelante do
cálcio, pode ter protegido a célula espermática de alterações de
permeabilidade que podem levar à lesão da membrana plasmática.
Podemos concluir que o M9 resultou em melhores
resultados de preservação espermática quando utilizada uma curva de
refrigeração de 20 minutos com período de equilíbrio de 40 ou 60 minutos
e descongelação em 37ºC por 30 segundos.
Experimento IV
95
EFEITO DE TRÊS DIFERENTES DILUIDORES SOBRE O SÊMEN CANINO DESCONGELADO SOB
DOIS DIFERENTES PROTOCOLOS
1. REVISÃO DE LITERATURA
A criopreservação e suas conseqüências sobre a célula
espermática são os assuntos mais descritos e estudados pelos
pesquisadores da área de biotecnologia do sêmen. Sabemos que tanto a
refrigeração como a congelação e descongelação são eventos que
podem culminar em alterações irreversíveis da célula espermática. São
necessários ainda muitos estudos para que possamos compreender a
origem destas alterações para que, num futuro, estes efeitos deletérios
possam ser minimizados ou eliminados (Watson, 1995; Peña, 2000).
Watson (1995) afirmou que as mudanças pós-
ejaculatórias do espermatozóide no trato feminino em sua preparação
para a fusão com o oócito devem ser vistas como a continuidade no
desenvolvimento e maturação espermática, processo este que teve inicio
no epidídimo. A criopreservação implica em uma pausa neste processo
natural durante a qual o espermatozóide é “inativado”, porém, ao invés de
ser “reativado” no estágio de onde tinha parado, sua maturação é afetada
pelo processo.
Watson (1995) concluiu ainda que o processo de
criopreservação faz com que os espermatozóides se tornem mais reativos
pelo fato de suas membranas sofrerem mudanças na fluidez e tornarem-
se mais permeáveis ao cálcio. Estes fenômenos podem promover a
capacitação e reação do acrossomo, diminuindo o tempo de vida útil do
Experimento IV
96
espermatozóide, impossibilitando a futura fecundação do óvulo no local e
momento apropriado.
O meio diluidor deve proteger as células espermáticas
dos efeitos adversos de todo o processo de criopreservação. As
propriedades protetoras de um meio diluidor são atribuídas aos diferentes
componentes deste meio e da sua interação com as células espermáticas
de uma determinada espécie, e ainda, de um determinado indivíduo
(Watson, 1995; Rota, 1998; Holt, 2000).
Watson (1995) sugeriu ainda que um mesmo indivíduo
pode apresentar sua característica de congelabilidade seminal irregular, e
que esta irregularidade pode ser conseqüente de diferenças no tempo de
exposição das células espermáticas de diferentes ejaculados ao ambiente
epidídimário, que é o local onde os espermatozóides adquirem a maioria
de suas “habilidades” para suportarem as flutuações de temperatura.
Lopes e Papa (1998) compararam efeitos da
centrifugação e da congelação nos diluidores glicina e TRIS sobre a
motilidade e vigor do sêmen canino. Estes autores verificaram que houve
uma interação positiva entre a centrifugação e o congelação e concluíram
que o grupo centrifugado e congelado em meio glicina apresentou
melhores resultados.
Santos et al.(1999) avaliaram o efeito de cinco diferentes
diluidores na congelação do sêmen canino, sendo eles, TRIS-frutose-
ac.cítrico, glicina, lactose, leite desnatado e TRIS-frutose-citrato, com a
adição do glicerol em todos os casos realizada a 5ºC. Estes autores
concluíram que os diluidores TRIS-frutose-ac.cítrico e glicina
proporcionaram melhora na motilidade retilínia progressiva e vigor
espermáticos. Os autores comentaram que todos os diluidores
aumentaram a taxa de patologia espermática.
Experimento IV
97
Barnabé e Barnabé (1995) avaliaram a qualidade do
movimento e o estado acrossomal do sêmen de búfalo congelado nos
diluidores TRIS, TRIS-TES e glicina e, posteriormente, incubados em
heparina ou cafeina. Estes autores verificaram que o meio glicina
melhorou a qualidade do movimento espermático imediatamente após o
descongelamento e que o diluidor TRIS após incubação tanto em cafeína
como em heparina apresentou maiores quantidades de lesão acrossomal.
Neto Neves et al. (1999) em seus estudos sobre
congelação do sêmen eqüino concluiram que o meio M9 conferiu melhor
motilidade e vigor espermáticos frente ao diluidor Merck-Gema,
imediatamente após a descongelação e aos 60 minutos do teste de
termorresistência.
O processo de descongelamento parece ser tão deletério
aos espermatozóides quanto à congelação e os principais efeitos
adversos são atribuídos à recristalização de microcristais de gelo
intracelular, quando o descongelamento é realizado lentamente ou devido
a alterações bruscas do volume celular, quando o descongelamento se
procede muito rapidamente, além de alterações de estrutura e função da
MP ( Watson, 1981; Watson, 1995; Zúccari, 1998; Holt, 2000).
A temperatura sob a qual se descongela uma amostra de
sêmen influencia na viabilidade pós-descongelação deste sêmen, sendo,
principalmente, descritas alterações no movimento espermático e na
integridade das membranas (Ivanova-Kicheva et al., 1995; Watson, 1995;
Holt, 2000; Peña, 2000).
Um protocolo de congelação e descongelação de sêmen
deve incluir a temperatura e o período de exposição ideal, considerando-
se, para tanto, as características particulares daquele protocolo. Várias
temperaturas e tempos de exposição têm sido descritos para a
descongelação do sêmen canino, assim como inúmeros protocolos de
Experimento IV
98
congelação e descongelação (Olar, 1984; England, 1992; Rota, 1998;
Peña 2000).
Penã (2000) afirmou que a temperatura de 70ºC, por 8
segundos, melhorou os resultados de fertilidade para o sêmen canino. Em
seu experimento a autora sugeriu que o descongelamento a 37ºC, por 15
segundos, pode expor as membranas espermáticas a variações de
temperatura que induzem à reorganização de lipídeos ou à movimentação
de proteínas mais severamente que as alterações ocorridas a 70ºC por 8
segundos.
A descongelação, sob altas temperaturas com um tempo
de exposição bastante curto, tem sido preconizado para a descongelação
do sêmen canino (Olar, 1984; England, 1992; Ivanova-Kicheva et al.,
1995; Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) conferindo longa
viabilidade às amostras de sêmen tanto in vitro como in vivo.
Em contrapartida, os protocolos mais utilizados para
outras espécies animais, incluindo aquele preconizado pelo Ministério da
Agricultura (CBRA, 1996), indicam a descongelação de palhetas de 0,5ml
à 37ºC durante 30 segundos.
Após o processo de congelação e descongelação das
células espermáticas, testes de alta correlação com a fertilidade devem
ser realizados, para que se verifique a viabilidade dos diluidores e\ou dos
métodos de congelação utilizados (Penã, 2000; Kirk, 2001).
A avaliação da motilidade espermática, definida como o
percentual de espermatozóides móveis de um ejaculado e da intensidade
do movimento, constitui-se num parâmetro importante de avaliação da
qualidade e viabilidade do sêmen (Linde-Forsberg, 1995), porém, Blach et
al. (1989) afirmaram que alguns espermatozóides que estão móveis in
vitro podem tornar-se imóveis in vivo ou vice versa.
Experimento IV
99
O movimento retilíneo progressivo é considerado normal
em cães, e reflete uma completa habilidade e viabilidade para fertilizar o
óvulo (Mies Filho, 1987; Christiansen, 1988; Feldman e Nelson, 1996;
Rota et al., 1997).
A avaliação subjetiva do movimento espermático é muito
importante e deve ser rotineiramente realizada, no entanto, pelo fato de
ser realizada por um técnico, pode estar sujeita a um grande número de
variações, principalmente, no que diz respeito ao grau de habilidade e
experiência do avaliador (Iguer-Ouada e Verstegen, 2001).
Para que estas variações sejam minimizadas uma
avaliação computadorizada do movimento espermático pode ser
realizada. Muitas têm sido as tentativas de padronização desta avaliação
na espécie canina. Recentemente, Iguer-Ouada e Verstegen (2001)
propuseram a padronização de um avaliador computadorizado de
movimento espermático (HTR-IVOS10 analyzer, Hamilton Thorn
Research, Beverly, Mass, USA) que apresentou ótimos resultados na
avaliação de espermatozóides da espécie canina.
Utilizando-se este sistema podemos avaliar a motilidade
espermática total, motilidade total progressiva, padrão médio de
velocidade espermática (VAP), velocidade de deslocamento em linha reta
(VSL), velocidade de deslocamento curvilíneo (VCL), sobreposição do
deslocamento retilíneo e a do deslocamento curvilíneo VSL/VCL (STR) e
ainda a linearidade do movimento, ou seja a proximidade da linha de
deslocamento com uma linha linear (LIN) dos espermatozóides (Iguer-
Ouada e Verstegen, 2001).
Métodos identificadores da integridade das membranas
espermáticas têm sido utilizados na avaliação de diferentes técnicas de
conservação do sêmen (Blach et al., 1989; Harrison e Vickers, 1990;
Kumi- Diaka, 1993; Peña, 2000; Kirk, 2001).
Experimento IV
100
Segundo Cunha (1997), um dos métodos que pode ser
utilizado na verificação da integridade das membranas espermáticas de
cães é o emprego de sondas fluorescentes, sendo elas o diacetato de
carboxifluoresceína (FDA) e o iodeto de propídeo (PI). Quanto ao
mecanismo de ação, o FDA, um éster não polar e não fluorescente
atravessa a membrana plasmática e, uma vez no interior da célula, é
hidrolisado por esterases não específicas, resultando na formação de 6-
carboxifluoresceína, composto impermeável à membrana plasmática, que
emite fluorescência verde nos compartimento celulares onde há
integridade de membranas. Ao contrário, o PI, com forte afinidade aos
ácidos nucléicos, é impermeável à membrana plasmática, e, portanto, as
células com a membrana plasmática lesada, tornando possível a ligação
do PI com o DNA presente no núcleo, emite fluorescência vermelha.
O isotiocianato fluorescinado (Fitc) é uma sonda
fluorescente comum e largamente utilizada para verificação do estado
acrossomal (Penã, 2000; Kirk, 2001; LANDIM-ALVARENGA1). O Fitc deve
estar ligado a uma lecitina, que é uma proteína ou uma glicoproteina
isolada de sementes de várias plantas. Estas lecitinas se ligam
especificamente a resíduos de açúcares. As duas lecitinas mais utilizadas
na verificação de estado acrossomal são o PSA - aglutinina Pisum
sativum oriunda da ervilha e o PNA - aglutinina Arachis hypogea originária
do amendoim (Cross e Watson, 1994; Kirk, 2001).
O PSA e o PNA exibem padrões diferentes de afinidades
a açúcares, sendo que o PSA se liga manose e ao metil α - D -
glicosideos enquanto o PNA se liga a galactose. PNA liga-se
preferencialmente à membrana acrossomal externa enquanto que o PSA
se liga à matriz acrossomal (Cross, 1998, Peña, 2000; Kirk, 2001).
1. LANDIM- ALVARENGA, F. Docente do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP Botucatu
Experimento IV
101
A alteração da fluidez das membranas espermáticas
durante a capacitação propicia a fusão da membrana acrossomal externa
com a membrana plasmática, este fenômeno fusogênico é conhecido
como reação do acrossomo (Cross, 1998; Kirk, 2001).
Cross e Watson (1994) e Kirk2 utilizaram o Fitc-PNA para
verificar o estado acrossomal de espermatozóides bovinos e eqüinos,
respectivamente, e sugeriram que tal sonda fluorescente se liga a
membrana acrossomal externa quando esta exibe uma alteração de
permeabilidade. Para que se pudessem diferenciar os espermatozóides
com a total perda do acrossomo dos acrossomos intactos utiliza-se o PI
em conjunto com o Fitc PNA (Kirk2, 2001, LANDIM-ALVARENGA3).
O Fitc-PNA liga-se a resíduos de açúcares, logo, ligar-se-
á aos resíduos de açúcares presentes no meio, e ainda, a maioria das
lecitinas liga-se ao leite, gema de ovo e a outras partículas presentes no
plasma seminal (Kirk, 2001).
Com vista no exposto tivemos como objetivo deste
experimento avaliar o efeito de dois diferentes protocolos de
descongelação do sêmen canino congelado com três diferentes diluidores
sobre a qualidade do movimento espermático, integridade das
membranas espermáticas e a condição acrossomal.
2. KIRK, E Colorado State University – 2001. 3. c.f. nota 1, pág ----
Experimento IV
102
2. MATERIAL E MÉTODO
2.1. Animais
Foram coletados e processados ejaculados de nove cães,
sendo eles: um (1) SRD, três (3) Cocker Spaniel, dois (2) Weimaraner e
três (3) Rottweiller, todos eles provenientes de criatórios particulares da
cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em
boas condições de saúde.
Os cães permaneceram em seus respectivos canis
durante a fase experimental do projeto. Todos os animais foram mantidos
sob boas condições alimentares e de higiene durante a fase experimental.
O sêmen foi coletado no próprio criatório e transportado
imediatamente até o laboratório da Área de Reprodução Animal da FMVZ
UNESP- Botucatu, para análise e manipulação.
2.2. Coleta do Sêmen
Foi realizada uma coleta sêmen de cada cão (n=9). O
sêmen foi coletado por meio de massagem peniana e o ejaculado
completo recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta
graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira
dentro de uma garrafa de isopor.
Experimento IV
103
2.3. Exame do Sêmen
ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN
Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN
Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram
realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de
sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por
lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de
fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a
motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA,
1996) para o vigor.
Concentração espermática: Foi determinada através de
contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em
água e o número de espermatozóides expressos por ml.
Espermiograma: Foi realizada na fase de seleção de
animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10
minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et
al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e
os resultados expressos em porcentagem, e, registrados individualmente.
A classificação das patologia foi feita segundo Oetllé (1988).
Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade
das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto
de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por
Experimento IV
104
Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996)(ANEXO
I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de
epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence
Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 100 células classificadas
como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células
lesadas- possuem o núcleo emitindo fluoresncência vermelha.
Avaliação do estado acrossomal: Para avaliação do
estado acrossomal recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se
Iodeto de Propídio e Fitc-PNA, de acordo com a técnica descrita por Kirk
(2001) modificada por LANDIM-ALVARENGA4. Para a realização desta,
misturou-se 10µl da amostra a 40µl da solução de trabalho (ANEXO IV). A
avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de
epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence
Attchment “EFA” HalogenLamp Set. Foi realizada a contagem das células
espermáticas de um campo claro e, imediatamente após, este mesmo
campo foi verificado sob epifluorescência. Foram anotadas as células que
emitiam qualquer fluorescência a cada campo. No total era realizada a
contagem de 200 células em campo claro.
A classificação das células era realizada segundo descrito
por LANDIM-ALVARENGA3: reação acrossomal verdadeira – emitindo
apenas fluorescência verde (Fitc-PNA); falsa reação do acrossomo –
emitindo fluorescência verde na região acrossomal (Fitc-PNA) e vermelha
(PI); espermatozóides lesados – emitindo apenas fluorescência
vermelha (PI); espermatozóides intactos - células não coradas.
4. c.f. nota 1 pág ----
Experimento IV
105
FIGURA 1 – Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA (emitindo
fluorescência verde) e pelo PI (emitindo fluorescência vermelha). a – reação acrossomal verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c – espermatozóides lesados.
a
c
b
c
Experimento IV
106
2.4. Procedimentos experimentais
Foram coletados e processados ejaculados de nove cães,
sendo que cada cão doou 1 ejaculado. Depois de coletado, avaliado e
verificada a concentração espermática, cada ejaculado foi dividido em 3
amostras idênticas. Cada amostra foi acrescida, na proporção de 1:1, de
meio à base de leite desnatado e glicose (Kenney, 1975) (pH-7,26; 355
mOSM) e centrifugada por 5 minutos a 800g.
O sobrenadante de cada amostra foi eliminado e foram
confeccionadas 84 palhetas de 0,5ml segundo os seguintes protocolos:
Glicina Gema – Um “pellet” foi ressuspendido em diluidor
à base de glicina gema de ovo (GG) sem glicerol (pH 7; 285 mOSM) e
decorridos 5 minutos acrescido de GG com 12,8% de glicerol e envasado
em palhetas de 0,5ml, ficando este protocolo com 5% de glicerol em sua
concentração final (Lopes e Papa, 1998).
Tris - O segundo “pellet” foi ressuspendido em diluidor à
base de TRIS, acido cítrico e glicose (TRIS) com 3% de glicerol (pH 6,10;
788 mOSM) e decorridos 5 minutos acrescido de TRIS com 7% glicerol e
envasado em palhetas de 0,5ml, ficando este protocolo com 5% de
glicerol em sua concentração final (Rota, 1997).
M9 - Um terceiro “pellet” foi ressuspendido em M9 (33%
Merck-gema, 33% Kenney, 33% DME (Sigma), 5% glicerol na solução
final) (Dell’Aqua Junior, 2000) e envasado em palhetas de 0,5ml, ficando
este protocolo com 5% de glicerol em sua concentração final.
Foram envasadas 28 palhetas segundo cada protocolo,
ficando as palhetas com concentração espermática média de 33,73
milhões de sptz/ palheta.
Experimento IV
107
Amostras tratadas sob cada protocolo foram avaliadas
(M1) quanto à motilidade e vigor espermático através de microscopia de
contraste de fase e integridade das membranas espermáticas através de
sondas fluorescentes e imediatamente após, levadas ao refrigerador
computadorizado MINITUB programado para a temperatura de 5ºC. Tal
temperatura foi atingida em média após 20 minutos de refrigeração, sendo
este período nomeado Curva de Refrigeração (CR) e mantido por 40
minutos após atingirem a temperatura de 5ºC, sendo este período
denominado Período de Equilíbrio (PE).
Após o PE as palhetas foram levadas a uma caixa de
isopor contendo 5 cm de nitrogênio líquido (N2) e mantidas a 4 cm deste
durante 20 minutos. Logo após, as palhetas foram mergulhadas no N2,
raquiadas e armazenadas em botijões apropriados.
Uma amostra de cada grupo foi levada diretamente do PE
ao banho Maria 37ºC por 10 minutos e avaliada (M2) quanto à motilidade
e vigor espermáticos e integridade das membranas espermáticas, como já
descrito anteriormente.
Um total de cinqüenta e quatro (54) palhetas foram
descongeladas. As palhetas congeladas sob cada protocolo eram
descongeladas aos pares, sendo sempre descongeladas seis palhetas de
um mesmo animal. Uma das palhetas era descongelada a 37ºC por 30
segundos e outra palheta descongelada a 72ºC por 8 segundos. Foram
formados os seguintes grupos (figura 2) : G1 - congelado em GG e
descongelado a 37ºC por 30 segundos; G2 - congelado em GG e
descongelado a 72ºC por 8 segundos; G3 - congelado em M9 e
descongelado a 37ºC por 30 segundos; G4 - congelado em M9 e
descongelado a 72ºC por 8 segundos; G5 - congelado em TRIS e
descongelado a 37ºC por 30 segundos; G6 - congelado em TRIS e
descongelado a 72ºC por 8 segundos.
Experimento IV
108
Meio GG M9 Tris 30 segundos a 370C G1 G3 G5 8 segundos a 720C G2 G4 G6
FIGURA 2 – Esquema da formação dos grupos experimentais
Uma palheta de cada grupo foi avaliada quanto à motilidade e vigor espermático e integridade das membranas espermáticas entre 5 a 10 minutos após o descongelamento (M3).
As amostras foram mantidas em banho Maria 37ºC e, decorridos 30 minutos, em média, do descongelamento, foi realizada a avaliação da qualidade do movimento espermático através de avaliação computadorizada (Hamilton Thorn Research – IVOS 10) sendo verificados os parâmetros: motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), padrão médio de velocidade(VAP) e linearidade(LIN).
As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC por 1 hora após o descongelamento para o teste de longevidade espermática e, após este período, reavaliadas (M4) quanto à motilidade e vigor espermáticos, integridade das membranas espermáticas.
Posteriormente foram descongeladas 30 palhetas. Estas palhetas foram descongeladas de modo a formar cinco amostras de cada grupo acima descrito (figura 2) e realizada a avaliação do estado acrossomal.
Para avaliação do estado acrossomal utilizou-se o Fitc-PNA em conjunto com PI. O Fitc-PNA fluoresce em verde a membrana acrossomal externa dos espermatozóides onde existe alteração de permeabilidade e o PI fluoresce em vermelho as células espermáticas com a membrana plasmática lesada. As células foram avaliadas e contadas como descrito inicialmente.
Experimento IV
109
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados
Para a comparação entre dois momentos no mesmo
tratamento: prova não paramétrica de Wilcoxon para pequenas amostras
pareadas, com o cálculo da estatística p.
Para a comparação entre 3 momentos no mesmo
tratamento: prova não paramétrica de Friedman para amostras
dependentes, com o cálculo das estatíticas χ2 e p.
Para a comparação entre tratamentos em cada momento:
prova não paramétrica de Friedmam com o cálculo das estatísticas χ2 e p.
As estatísticas calculadas foram consideradas
significantes quando p<0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida
tendência à significância, já que p é a probabilidade de erroneamente
concluir pela significância.
Experimento IV
110
3. RESULTADOS
TABELA 1 – Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.
G1 G2 G3 G4 G5 G6
M1 70 70 80 80 80 80 M2 70 70 60 60 70 70 M3 40 50 40 50 50 40 M4 20 10 10 30 10 10
Avaliando-se a análise estatística das medianas da
motilidade espermática verificamos que não houve diferença estatística
significante entre os grupos em nenhum dos momentos avaliados
(p<0,05). Existe, no entanto, um decréscimo da motilidade após o
processo de descongelação e o teste de longevidade (tabela 1).
TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.
G1 G2 G3 G4 G5 G6
M1 3A 3A 3A 3A 2B 2B M2 3B 3B 3A 3A 2C 2C M3 1 2* 2 2 1 2* M4 1A 1A 0A 1A 0AB 1AB
Letras maiúsculas diferentes entre os grupos em uma mesma linha indicam diferença
estatística entre diluidores para cada temperatura (p<0,05) *indica tendência superioridade entre as duas temperaturas de descongelação para um
diluidor (0,05<p<0,10).
Experimento IV
111
A análise estatística dos dados apontou que não houve
diferença estatística para o vigor espermático entre os grupos (p>0,05),
porém, foram verificadas tendências estatísticas (tabela 2).
Quando foi verificado o efeito do diluidor em cada
momento isolado, descongelados em uma mesma temperatura, ou seja,
G1xG3xG5 e G2xG4xG6, verificamos que G1=G5≤G3, logo, verificou-se
tendência à superioridade do M9 logo após o descongelamento a 37ºC.
Quando foram contrastados os grupos descongelados a 72ºC, verificamos
que G2=G4=G6. Podemos ainda dizer que existe tendência dos grupos
G2, G4 e G6, ou seja, descongelados à temperatura de 72ºC, a
apresentarem os valores mais altos do vigor logo após o
descongelamento (tabela 2).
O vigor espermático após o teste de longevidade também
não diferiu estatisticamente entre os grupos, porém, houve tendência
(0,05<p<0,10) dos diluidores glicina gema e M9 a apresentar os maiores
valores após o teste de longevidade, sendo que dentre estes dois grupos,
o G4 (M9 descongelado a 72ºC) foi o que apresentou maiores valores
(tabela 2).
TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.
G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 86 86 87 87 91 91 M2 82 82 86 86 81 81 M3 53 57 53 62 59 62 M4 34B 37B 28Ba 39ABb 46A 44A
Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística entre diluidores para cada temperatura (G1 x G3 x G5) e (G2 x G4 x G6) (p<0,05).
Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística entre temperaturas para cada diluidor (G1xG2), (G3xG4) e (G5xG6) (p<0,05).
Experimento IV
112
Não houve diferença estatística significante entre os
grupos após a diluição (M1), período de equilíbrio (M2) após a
descongelação (M3) quanto à porcentagem de células com membrana
espermática integra (p>0,05) (tabela 3).
Após o teste de longevidade espermática (M4) verificou-
se superioridade dos grupos congelados em TRIS, tanto quando
comparados os grupos descongelados a 37ºC (G1 = G3 < G5) como
quando comparados os grupos descongelados a 72ºC (G2 < G6) (G4 é
intermediário). Quando comparadas as descongelações a 37ºC e a 72ºC,
ou seja, G1 x G2, G3 x G4 e G5 x G6, verificou-se menor porcentagem de
células integras quando o grupo congelado em M9 foi descongelado a
37ºC (G3 < G4), sendo as outras comparações estatisticamente
equivalentes (tabela 3).
TABELA 4 – Mediana da qualidade do movimento espermático descrito por motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade média (VAP) e linearidade do movimento (LIN) avaliada após 30 minutos da descongelação. Botucatu, 2002.
G1 G2 G3 G4 G5 G6
MT 20A 24A 16B 17B 11B 23B MP 10A 22A* 10B 9B 3B 11B* VAP 83,4 89,6AB* 72 78,4B 73,7 79,2B* LIN 62A 71A* 68A 64B 57B 61C*
Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística entre diluidores para cada temperatura (G1 x G3 x G5) e (G2 x G4 x G6) (p<0,05).
* em uma mesma linha indicam superioridade estatística entre temperaturas de descongelação para cada diluidor (G1xG2), (G3xG4) e (G5xG6) (p<0,05).
Experimento IV
113
Quanto à análise estatística da qualidade do movimento espermático, decorrida em média 30 minutos após a descongelação, verificamos que os grupos congelados em GG foram superiores aos outros estudados quanto à motilidade total e à motilidade progressiva e à linearidade e ainda apresentaram tendência à superioridade para a velocidade média (VAP). Quando comparamos a temperatura de descongelamento entre o mesmo diluidor, podemos verificar que para os grupos congelados em GG (G1 e G2) a descongelação a 72ºC apresentou resultados superiores para motilidade progressiva e linearidade do movimento, e ainda, quanto a motilidade total e a velocidade média houve tendência à superioridade do grupo G2, apresentando este sempre os mais altos resultados comparados a todos os outros grupos (tabela 4).
TABELA 5 – Mediana da porcentagem de células lesadas (Ls) e com reação do acrossomo verdadeiras (Rv) após a descongelação do sêmen canino. Botucatu, 2002.
G1 G2 G3 G4 G5 G6 Rv 8 8 0 1 10* 22,5* Ls 7,5 16 0 0,5 1 1
• *indica significa diferença estatística significativa
Quando avaliamos estatisticamente o estado do acrossomo verificamos que não houve diferença estatística significante quanto à quantidade de células lesadas após a descongelação entre os grupos estudados (tabela 5).
Os grupos congelados com TRIS tanto descongelado a 37ºC por 30 segundos como a 72ºC por 8 segundos (G5 e G6) apresentaram uma quantidade significativamente maior de células com reação verdadeira de acrossomo (tabela 5).
Experimento IV
114
4. DISCUSSÃO
O resfriamento, congelação e descongelação preservam a
célula espermática, porém inúmeros danos são verificados após a
descongelação (Mazur, 1970, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000).
Comprovamos que houve uma diminuição de viabilidade espermática
após a congelação e descongelação (C/D), com diminuição de motilidade
e vigor espermático e da integridade das membranas espermáticas em
todos os grupos estudados após a C/D, a despeito do meio diluidor
utilizado ou da temperatura em que se realizou a descongelação.
Para que a congelação de um ejaculado se realize com
sucesso é necessária a adição de um diluidor que ajude a estabilizar o
metabolismo celular e que ainda preserve a célula de sofrer,
precocemente, a capacitação ou uma forma desorganizada da reação do
acrossomo. O meio diluidor deve também permitir um ambiente favorável
para a conservação da integridade e função de todos os compartimentos
espermáticos e ainda, da MP dos espermatozóides (Watson, 1995;
Watson, 2000).
Quando avaliamos os meios diluidores descongelados em
cada temperatura distintamente, verificamos que não houve diferença
estatística entre os grupos quanto à motilidade e que, quanto ao vigor
espermático houve tendência estatística de superioridade do M9
descongelado a 37ºC frente aos outros grupos descongelados nesta
mesma temperatura, concordando com os achados do Experimento III.
A formação de espécies reativas de oxigênio é um dos
fatores que age negativamente sobre a célula espermática durante o
processo de refrigeração e congelação do sêmen (Cunha, 1997; Bilodeau,
2001).Cunha (1997) concordou com Papa et al. (1993) que concluiram
Experimento IV
115
que a glicina exerce função de antioxidante quando presente no meio
diluidor. Este aminoácido está presente no diluidores GG e M9.
O diluidor M9 além da glicina possui uma gama de outros
aminoácidos em sua composição, entre eles a cisteina que, como descrito
por Bilodeau et al. (2001), é um precursor intracelular da glutationa, que,
por sua vez, é um antioxidante capaz de reagir e anular diretamente
espécies reativas do oxigênio. Esta maior proteção exercida pelo meio M9
pode ser responsável por esta melhora no vigor espermático no grupo G3
frente ao G1 e G5.
Podemos dizer que estes achados concordaram com os
de Santos et al. (1999) que afirmaram que o GG e o TRIS resultaram em
resultados estatisticamente equivalentes de motilidade e vigor
espermático para o sêmen canino descongelados a 37ºC por 30
segundos.
Verificamos, no entanto, superioridade estatística quanto
à porcentagem de membranas íntegras nos grupos congelados com TRIS
após o teste de longevidade (M4), tanto nos grupos descongelados a
37ºC (G1=G3≤G5) como nos grupos descongelados a 72ºC (G2≤G4≤G6).
Entretanto, nos grupos congelados com meio TRIS,
verificou-se, também, uma diminuição significativa da linearidade do
movimento espermático após a descongelação, tanto no grupo
descongelado com 37ºC como no descongelado com 72ºC. Observamos
ainda uma quantidade significativamente maior de células exibindo reação
do acrossomo verdadeira nestes mesmos grupos após a descongelação
(G5 e G6).
Rigau et al. (2001) avaliaram o efeito da glicose e o da
frutose sobre o padrão de motilidade do sêmen canino. Estes autores
concluíram que a frutose produz um movimento espermático mais rápido
Experimento IV
116
e linear enquanto a incubação em glicose induz a movimentos oscilatórios
semelhantes aos verificados após a hiperativação espermática. O meio
TRIS contém apenas glicose em sua constituição enquanto o GG possui
frutose e glicose. O que pode justificar a diferença de padrão de
motilidade entre estes dois meios.
O EDTA, que está presente no M9, é um quelante de
cálcio (Graham, 1996), sendo assim, a concentração do cálcio em
presença desta substância no meio é diminuída. A entrada de cálcio na
célula espermática leva à capacitação espermática que, por conseguinte,
induzirá movimentos oscilatórios assim como desencadeará uma série de
alterações que culminará na reação do acrossomo (Cross, 1998). O meio
M9 provavelmente exerceu uma maior proteção às células espermáticas,
diminuindo os risco do inicio do processo de capacitação.
Podemos aqui especular que o diluidor TRIS, nas
condições utilizadas neste experimento, não foi tão eficaz quanto o GG e
o M9 em proteger o metabolismo espermático e as membranas
espermáticas, permitindo o inicio do processo de capacitação, uma vez
que, algumas das características observadas com o desencadeamento
deste processo são: o aumento do influxo de cálcio com alteração do
padrão de movimento espermático (alteração linearidade do movimento) e
ainda um aumento da fluidez da membrana acrossomal externa sem que
tenha havido a ruptura da membrana plasmática externa (reação
acrossomal verdadeira), explicando ainda, a maior quantidade de células
espermáticas íntegras presentes nos grupo G5 e G6 quando comparado
aos demais (Cross, 1988; Holt, 2000).
Podemos comparar os resultados aqui encontrados com
aqueles encontrados por Barnabé e Barnabé (1995), que verificaram
maior grau de lesão acrossomal ao sêmen bubalino congelado em TRIS
após incubação tanto em heparina como em cafeína.
Experimento IV
117
O teste de verificação do estado acrossomal utilizando-se Fitc-PNA e PI sob microscopia de epifluorescência não tinha sido ainda descrita para a espécie canina. O Fitc-PNA liga-se a radicais glicosilados que são expostos na membrana acrossomal externa com alteração de permeabilidade, que pode ser considerado um dos eventos precursores da reação do acrossomo (Cross, 1998; Kirk5), permitindo assim, a avaliação qualitativa do estado do acrossomal de uma amostra de sêmen.
Entretanto, o Fitc-PNA liga-se também a resíduos de açúcares presentes nos meios diluidores, e ainda, a maioria das lecitinas liga-se ao leite, gema de ovo e a outras partículas presentes no plasma seminal dificultando a avaliação (Kirk, 2001). Considerando-se este fato, a realização de centrifugação e lavagem das amostras de sêmen antes da realização desta avaliação, que não foi realizada neste experimento e que poderia evitar a coloração de resíduos de diluidores como no caso da figura 1, deveria ser ponderada.
Devemos ainda ressaltar que a avaliação do estado acrossomal em nosso experimento foi realizada apenas em parte dos animais estudados (30 palhetas, tendo sido estas provenientes de 5 dos 9 doadores). Conhecendo-se a existência de uma diversidade de resposta individual frente a um protocolo ou diluidor, e de acordo com a classificação dos animais em “bons congeladores” ou “maus congeladores”, segundo a capacidade de diferentes animais em suportar melhor as adversidades decorrentes do processo de criopreservação, descrita por Watson (1995) e por Kirk (2001), a reavaliação de todos os grupos com um número maior de animais deve ser considerada.
Os grupos congelados em GG conservaram melhor MT, MP, VAP e LIN após a descongelação, estes achados concordam com os de Lopes e Papa (1998) e com os de Barnabé e Barnabé (1995) e ainda com as conclusões de Rigau (2001), já que este é o meio diluidor GG é o único que leva frutose em sua composição. Verificamos ainda que o grupo
5. c.f. nota 2 pag. ----
Experimento IV
118
congelado com GG e descongelado a 72ºC apresentou sempre a melhor qualidade de movimento espermático.
O protocolo de um diluidor deve observar todas as necessidades espermáticas e corroborar para que a finalização de sua maturação se dê em momento e local adequados, garantindo que a qualidade fecundante de uma amostra de sêmen seja preservada (Watson, 1995).
Faz-se necessário, portanto, o estudo detalhado das diferentes etapas do processo de congelação e descongelação frente a cada diluidor, espécie e em alguns, casos indivíduos (Watson, 1995; Rota, 1998; Holt, 2000).Um dos passos a ser avaliado neste processo é a temperatura de descongelação.
Vários autores vêm sugerindo que a descongelação do sêmen canino a altas temperaturas com curto período de exposição proporciona melhores resultados de viabilidade e fertilidade; este fato deve-se, provavelmente, a diminuição dos riscos de recristalização de microcristais intracelulares que podem ocorrer durante uma descongelação lenta (Olar, 1984; England, 1992; Ivanova-Kicheva et al., 1995 Penã, 2000). Após a avaliação estatística dos dados do vigor espermático, observamos a tendência a superioridade (0,05<p<,10) das amostras onde a descongelação foi realizada a 72ºC por 8 segundos nos grupos congelados em GG e em TRIS. Após o teste de longevidade não se verificou diferença entre os grupos quando avaliadas as temperaturas de descongelação em cada diluidor (G1=G2) (G3=G4) (G5=G6).
Quanto à integridade das membranas avaliada entre as diferentes temperaturas de descongelação em um mesmo meio verificamos que não houve diferença estatística significativa entre as temperaturas ou entre os meios diluidores após a diluição das amostras, PE e descongelação. Verificamos que, após o teste de longevidade, as amostras congeladas em meio M9 e descongeladas a 72ºC eram
Experimento IV
119
superiores aquelas descongeladas a 37ºC. Como já discutido anteriormente, o meio M9 é rico em aminoácidos que exercem um poder antioxidante, além da presença do EDTA, que é um quelante de cálcio e inibe, desta forma alterações da membrana decorrentes do influxo de cálcio. Estas propriedades, provavelmente, propiciaram uma maior proteção às células espermáticas integras por um período maior.
Foi observada grande diferença quanto aos valores verificados pela avaliação da motilidade subjetiva e a avaliação computadorizada das amostras de sêmen. Provavelmente tal fato ocorreu devido ao tempo decorrido entre a avaliação subjetiva da motilidade (primeiro item a ser avaliado imediatamente após as descongelações) e a avaliação computadorizada do movimento espermático (último item a ser observado, geralmente 30 minutos após as descongelações). Um decréscimo de ~45% na motilidade espermática após 60 minutos de incubação do sêmen canino banho Maria a 37ºC foi também descrito por Rigau et al. (2001).
A avaliação computadorizada da qualidade do movimento espermático corroborou com os resultados até agora verificados. Verificamos que a motilidade progressiva (MP) a velocidade média (VAP) e a linearidade do movimento (LIN) foram maiores com a descongelação a 72ºC, nos grupos onde o diluidor GG ou TRIS foram utilizados.
De uma maneira geral, o movimento espermático apresentou-se superior para o grupo congelado em meio Glicina Gema e descongelado a 72ºC por 8 segundos (G2), porém, testes in vivo de fertilidade deverão ser realizados para que os resultados destas avaliações in vitro sejam comprovadas.
A partir dos resultados obtidos neste experimento, concluímos que as células espermáticas caninas descongeladas a 72ºC por 8 segundos apresentaram um maior somatório de bons resultados quanto aos testes de viabilidade espermática in vitro aqui empregados.
Conclusões
121
Baseando-se nos achados encontrados nos quatro
experimentos realizados podemos concluir que:
O processo de centrifugação não alterou a qualidade
do sêmen canino.
Os períodos de equilíbrio de 40 e 60 minutos foram
superiores quanto a qualidade espermática, quando
as avaliações foram realizadas antes da congelação
das amostras.
A glicerolização anterior ao equilíbrio, em nossas
condições, apresentou-se vantajosa frente à
glicerolização pós-equilíbrio.
O diluidor M9 foi favorável quando se realizou a
descongelação a 37ºC por 30 segundos.
A descongelação a 72ºC por 8 segundos foi, de uma
maneira geral, favorável ao sêmen canino congelado
segundo os protocolos propostos e as variáveis
testadas.
As células espermáticas congeladas em meio glicina
gema e descongeladas a 72ºC por 8 segundos
apresentaram um maior somatório de bons
resultados.
Os meios diluidores utilizados comportaram-se de
maneira diferente em dependência do protocolo de
criopreservação empregado.
Referências Bibliográficas
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Universidade Estadual Paulista.
Anexos
136
ANEXO I – Descrição da Técnica Fluorescente para Verificação da Integridade de Membranas
Misturou-se 10µl da amostra de sêmen a 40µl da solução
de trabalho. A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em
microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic
Fluorescence Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 100 células
classificadas como:
∗ Células Integras- células emitindo apenas
fluorescência verde.
∗ Células Lesadas- células espermático com o núcleo
emitindo fluorescência vermelha.
• PREPARO DAS SOLUÇÕES ESTOQUE DOS CORANTES UTILIZADOS:
a- Solução Estoque de Fluoresceína:
6-carboxifluoresceína diacetato 9,2mg
DMSO 20ml
b- Solução Estoque de Iodeto de Propídio:
iodeto de propídio 10mg
solução fisiológica 20ml
Anexos
137
c- Solução de Formaldeído:
Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica.
A solução de trabalho foi sempre preparada no momento
da avaliação microscópica, e constituía- se de: .
Sol. Est. Fluoresceína 20µl
Sol. Est. Iodeto de Propídeo 10µl
Sol. Formaldeído 10µl
Citrato de Sódio 3% 0,96ml
Anexos
138
ANEXO II - Preparo dos meios diluidores
Meio à base de leite desnatado (Kenney et al., 1975): Leite desnatado (Molico) 2,4g
Glicose (PÁ) 4,9g
Bicarbonato de sódio 0,75ml
Gentamicina 20mg
H2O bidestilada q.s.p. 1000 ml
pH 6,8 - 7,2
osmolaridade 350-375 mosm
Meio à base de glicina - gema (Bicudo et al., 1993). solução A Glicose 0,6g
Frutose 0,6g
H2O bidestilada q.s.p. 40ml
solução B Citrato de sódio 1,0g
Glicina 0,47g
H2O bidestilada q.s.p. 40ml
As soluções A e B eram aquecidas separadamente até
94ºC, durante 15 minutos. Em seguida aguardava-se o resfriamento até
aproximadamente 40ºC.
Anexos
139
Solução final glicina (Meio I)
solução A 40ml
solução B 40ml
Penicilina G sódica 0,033g
Estreptomicina 100mg
OEP 0,4ml
Gema de Ovo 20ml
pH 6,95
osmolaridade 300 mosm
Meio M9 (Dell’Aqua Junior, 2000)
Para cada 300ml de meio:
Solução I – Merck Gema (Martin et al., 1979)
Fração A glicose anidra 6g
citrato de sódio 0,375g
EDTA 0,370 g
Bicarbonato de Sódio 0,120g
Penicilina G Potássica 100.000UI
Sulfato de Estreptomicina 0,1g
Água bidestilada (q.s.p.) 25 ml
Fração B Lactose 11g
Água bidestilada (q.s.p.) 50ml
Anexos
140
Fração C gema de ovo 20ml
Orvus est Paste (OEP) 0,8ml
Total A+B+C = 95ml
Prepara-se a fração A e a fração B separadamente, junta-
se as duas e acrescenta-se a gema de ovo e o OEP.
Solução II (Kenney et al., 1975)
Total - 95ml
Solução III Dulbeecco’s Modified Eagle’s Médium
(DME) (Sigma n°D-1152) 1,74g
Bicarbonato de sódio10% 2,5ml
Glicose anidra 1,8g
Água bidestilada (q.s.p.) 95ml
Mistura-se as soluções I, II e II, homogeniza-se bem e
acrescenta-se 15 ml de Glicerol a solução final.
Meio diluidor TRIS (Rota, 1997) TRIS 2,4g
Acido cítrico 1,4 g
Glicose 0,8g
Benzilpenicilina sódica 0,06g
Sulfato de estreptomicina 0,1g
Gema de ovo 20ml
Equex STM Paste 1ml
Água destilada (q.s.p.) 100ml
Anexos
141
ANEXO III - Preparo dos Diferentes Gradientes de Percoll®
Nove partes de Percoll® (Sigma) foram diluídas em uma
parte de solução NaCl 1,5N. Esta solução foi chamada de Solução de
Trabalho (ST).
Foram realizadas duas outras diluições: a primeira
contendo 45% de ST e 55% de solução de HanK´s (Hank´s H1387 +
HEPES H0763 + água destilida q.s.p.) e uma segunda, contendo 90% de
ST e 10% de solução de Hank´s.
Os tubos cônicos de centrífuga foram montados na
seguinte ordenação: ½ parte da solução de Percoll® a 90% ao fundo, ½
parte da solução de Percoll® a 45% ao meio e 1 parte de sêmen na
superfície.
Anexos
142
ANEXO IV- Preparo das soluções estoque dos corantes utilizados para a
coloração de Fitc-PNA e PI:
a- Solução Estoque de Fitc PNA:
FITC labelled (L 7381, SIGMA) 1mg
PBS 1ml
b- Solução Estoque de Iodeto de Propídio:
iodeto de propídio 10mg
solução fisiológica 20ml
c- Solução de Formaldeído:
Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica.
A solução de trabalho foi sempre preparada no momento
da avaliação microscópica, e constituía-se de:
Sol. Est. Fitc PNA 20µl
Sol. Est. Iodeto de Propídeo 10µl
Sol. Formaldeído 10µl
Citrato de Sódio 3% 0,96ml
Fotos: MICROSCÓPIO AXIOSKOP da Carl Zeiss - para
campo claro, contraste de fase e epi-fluorescência, com campo visual de
20 mm. Conjunto de filtros de fluorescência 09 para excitação azul 450-
490 nm e conjunto de filtros 15 para excitação verde H 546. Equipamento
de microfotografia MC 80 para filmes de 35 mm.
Resumo
144
Criopreservação do sêmen de cães
Para verificar o efeito de algumas etapas do processo de criopreservação
sobre a qualidade do sêmen canino foram realizados quatro
experimentos: Experimento I - com objetivo de testar os efeitos do
processo de centrifugação no sêmen canino e comparar a pré-diluição do
sêmen em meio à base de leite desnatado e glicose, Percoll ou plasma
seminal autólogo na realização deste procedimento. Foram utilizados 10
ejaculados caninos, que, após análise inicial, foram divididos em quatro
amostras e centrifugados durante 15 minutos a 800g, sendo: G1- sêmen
não foi centrifugado, G2: centrifugado em plasma seminal autologo; G3:
centrifugado diluido em meio à base de leite desnatado e glicose (LG);
G4: centrifugado sobre diferentes gradientes de Percoll®. Após a
centrifugação e ressuspensão dos grupos em meio LG, foram avaliados a
motilidade, vigor e aglutinação espermática através de microscopia de
contraste de fase, e a integridade das membranas espermáticas sob
microscopia de epifluorescência. O processo de centrifugação não causou
danos aos espermatozóides caninos. Os grupos foram então mantidos em
banho-maria a 37ºC por 30 minutos e novamente avaliada a motilidade,
vigor e aglutinação espermática; o grupo centrifugado em meio à base de
leite desnatado e glicose mostrou-se o mais viável após este
procedimento. Experimento II: com o objetivo de testar um período de
equilíbrio ideal para dois diluidores do sêmen canino e de verificar os
efeitos da adição do glicerol a temperatura ambiente ou a 5ºC foram
coletados 30 ejaculados de 3 cães, e, após análise e processamento
inicial, um dos “pellets” foi tratado com o diluidor TRIS (TRIS, glicose,
ac.cítrico) com 3% de glicerol e o outro em um diluidor GG (glicina –
gema). A metade do volume estendido em TRIS com 3% de glicerol foi
acrescida de TRIS com 7% de glicerol e envasado em 4 palhetas de
0,5ml. A outra metade do volume estendido em TRIS com 3% de glicerol
e mantida em um tubo plástico. A metade do volume estendida em GG foi
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acrescida do mesmo diluidor glicerolizado de modo a ficar com 5% de
glicerol em concentração final e envasado em 4 palhetas de 0,5ml. A
outra metade do volume estendido em GG foi mantida em um tubo
plástico. Amostras de cada grupo foram avaliadas quanto motilidade e
vigor espermático através de microscopia de contraste de fase e levadas
ao refrigerador a 5°C. Foram testados períodos de equilíbrio de 40, 60 ou
90 minutos. Foi utilizado um ejaculado diferente de um mesmo cão para o
testar cada tempo de equilíbrio. Após o equilíbrio, o grupo não
glicerolizado ou o que não foi completamente glicerolizado antes do
equilíbrio foram tratados segundo a mesma metodologia descrita para os
grupos já glicerolizados. As amostras foram avaliadas quanto a motilidade
e o vigor espermático e a integridade das membranas. Concluimos que o
equilíbrio 90 minutos proporcionou os piores resultados, quando as
avaliações foram realizadas antes da congelação das amostras e, que a
glicerolização anterior ao equilíbrio, em nossas condições, apresentou-se
vantajosa frente a glicerolização pós-equilíbrio. Experimento III: com
objetivo de verificar os efeitos de dois diferentes períodos de equilíbrio
com uma mesma curva de resfriamento e três diferentes diluidores na
congelação do sêmen canino descongelado a 37ºC por 30 segundos
foram coletados dez ejaculados de cinco cães, sendo estes,
seqüencialmente, processados sob seis diferentes protocolos. Uma
amostra de cada grupo foi levada ao banho Maria 37ºC por 10 minutos
imediatamente após o período de equilíbrio (PE) e avaliada quanto a
motilidade e vigor espermáticos. Após o PE as palhetas foram congeladas
horizontalmente, 4cm acima do nitrogênio líquido, em caixa de isopor.
Palhetas de cada grupo foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e
avaliadas quanto a motilidade e vigor espermáticos, integridade das
membranas espermáticas. Foi realizado teste de longevidade espermática
mantendo as amostras em banho Maria a 37ºC, por 60 minutos e após
verificada a motilidade e vigor espermáticos, integridade das membranas
espermáticas. Após avaliação estatística dos dados observou-se que os
Resumo
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diferentes períodos de equilíbrio não influenciaram os dados avaliados.
Os grupos congelados com M9 apresentaram maior porcentagem de
membranas integras pós-descongelação e pós-teste de longevidade.
Experimento IV: Com objetivo avaliar o efeito de dois diferentes
protocolos de descongelação do sêmen canino congelado com três
diferentes diluidores foram coletados e processados ejaculados de nove
cães e processados sob três diferentes protocolos. Uma amostra de cada
grupo foi levada ao banho Maria 37ºC por 10 minutos imediatamente após
o período de equilíbrio e avaliada quanto à motilidade e vigor
espermáticos. Após o PE as palhetas foram congeladas horizontalmente,
4cm acima do nitrogênio líquido, em caixa de isopor. Duas palhetas
processados sob cada um dos três protocolos foram descongeladas,
sendo uma a 37ºC, por 60 minutos e outra a 72ºC por 8 segundos
formando 6 grupos. Neste momento foram avaliados a motilidade e o
vigor espermático, a avaliada a qualidade do movimento espermático
através de avaliação computadorizada, a integridade das membranas
espermáticas e a verificação do estado acrossomal através de teste
fluorescente com as sondas FDA e PI, e Fitc-PNA e PI. A longevidade
espermática foi verificada mantendo-se amostras dos grupos em banho
Maria a 37ºC e após verificada a motilidade e vigor espermáticos,
integridade das membranas espermáticas. Concluímos que a
descongelação a 72ºC foi favorável e que células espermáticas
congeladas em meio glicina gema e descongeladas a 72ºC apresentaram
um maior somatório de bons resultados quanto aos testes de viabilidade
espermática in vitro aqui empregados.
Abstract
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Canine semen cryopreservation
To evaluate several steps of dog semen criopreservation we held four different studies. Study 1: The aim of this was evaluate a canine semen centrifugation and to compare utilization of milk plus glucose extender (MG), Percoll or autologous seminal fluid during the centrifugation. Ten adult male dogs were used in this study. After an initial evaluation, each canine ejaculate was divided in four samples, each one sample centrifuged for 15 minutes 800g. The four groups were: G1- not centrifuged, G2- centrifuged without extender, G3- centrifuged in MG extender 1:1 and G4- centrifuged in two different Percoll gradient concentration. After centrifugation, all groups were diluted in MG. At this time, all groups were evaluated for motility and agglutination by phase-contrast microscopy. The samples were also evaluated for spermatic membrane integrity by fluorescence microscopy. The centrifugation procedures did not induce damage to canine spermatozoa. After centrifugation, all samples were kept in 37ºC water for 30 minutes and reevaluated for motility and agglutination using same methods. G2 group was more viable them the three other groups evaluated in this research. Study 2: In this study we evaluate different equilibration periods and the best moment for glycerol addition in two extenders used in different protocols to freeze canine semen. Three ejaculates from each of ten dogs were collected, analyzed, divided in two equal parts, and centrifuged. One pellet was suspended in 2.14 ml glycine-egg yolk extender (GG) without glycerol, half of this semen sample (1.07 ml) was mixed with 0.93ml of GG containing 12.8% glycerol. The identical procedure was used in the other half of semen sample (1.07 ml) after equilibration period. The other pellet was suspended in 2 ml TRIS-glucose-citric acid extender (TRIS) containing 3% glycerol; half of this semen sample (1 ml) was mixed with 1ml of TRIS containing 7% glycerol. The identical procedure was used in the other half of semen sample (1 ml) after equilibration period. Semen samples treated differently were held at 5°C to equilibrate for 40, 60 or 90
Abstract
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minutes. For all samples, progressive motility and vigour of movement were evaluated subjectively before and after equilibration period and plasmatic membrane integrity was evaluated after equilibration period using fluorescent dyes. The conclusion was that, for tested extenders and without freeze-thaw step, the 90 minutes period of equilibration was inferior to freeze dog semen. Study 3: Ten dogs ejaculate were taken. Each ejaculate was divided and mixed in three different extenders and processed under six protocols. After that, one sample of each group was warmed in 37ºC water bath during 10 min. At this time, the spermatic motility, vigour and plasma membrane integrity were evaluated (M1). The samples were frozen in a Styrofoam box 4 cm above liquid nitrogen. The straws were thawed at 37ºC for 30 sec and the spermatic motility; vigour and plasmatic membrane integrity were evaluated (M2). Plasmatic membrane, spermatic motility and vigour were evaluated after 1-hour incubation at 37ºC (M3). Statistics data showed that different equilibrations time did not have effect on froze-thawed canine semen. The best plasmatic membrane integrity was obtained after thawing canine semen with M9 extender. Study 4: Nine dogs ejaculate were taken. Each ejaculate was divided and mixed in three different extenders. A sample under each protocol was analyzed (M1) and held at 5°C to equilibrate for 60 minutes. After that, samples of each protocol were warmed in 37ºC water bath during 10 min and analyzed (M2) to spermatic motility, vigour and plasma membrane integrity. The samples were frozen in a Styrofoam box 4 cm above liquid nitrogen. A straw under each protocol were thawed at 37ºC for 30 sec and another at 72ºC for 8 sec and the spermatic motility; vigour and plasmatic membrane integrity were evaluated (M3). At this time, acrossomal status was verified using Fitc-PNA stain. Plasmatic membrane, spermatic motility and vigour were evaluated after 1-hour incubation at 37ºC (M4). Statistics data showed that different higher temperature have positive effect on froze-thawed canine semen. The best results were taken when canine semen was frozen in GG diluent and thawed 72ºC for 8 sec.