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Criopreservación
– THeI. Diego H. Santamarina
Definición
• La criopreservación es el proceso por el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196 ºC para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluídas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.
Antecedentes.
• 1949. Glicerol como crioprotector. (Polge et al.).
• 1951. Células madre en sangre periférica en ratones (PBSC) (Brecher et al).
• 1964. PBSC en humanos (Freireich et al).
• 1977. Primer PBSCT en perros (Cavins et al).
• 1986. Primer PBSCT y criopreservación en humanos (Kessinger et al).
• 1993. Primer PBSCT humano con selección de células CD34+
(Shpall et al).
Daño
Deshidratación
Mecánica
Alta Velocidad
Baja Velocidad
Medio Isotónico
Medio
Hipertónico
Medio Hipotónico
Lesión por congelación.
• Daño mecánico por formación de hielo intra- y
extracelular.
• Daño mecánico por expansión térmica.
• Hiperosmolaridad extracelular y
deshidratación.
• Cambios en el pH.
• Desnaturalización de proteínas.
Causas de daño celular por congelación.
Formación de cristales de hielo
durante la congelación del agua• Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la
célula y son los cristales intracelulares los que
comportándose como cuchillas cortan las estructuras
internas de la célula, especialmente las membranas.
• El hielo es dinámico
• El hielo no es inerte, entre los 0 y los -30º el hielo cambia
continuamente de conformación lo que provoca que se
acentúe el efecto "cuchilla" del mismo.
• Debido a estos efectos durante la congelación se debe
evitar la formación de hielo intracelular .
Deshidratar la célula
• Hay que extraer el agua de la célula y
sustituirla por crioprotectores o
criopreservantes que mantengan el equilibrio
osmótico.
• Si la célula llega al 30% de deshidratación se
alcanza un punto de no retorno, a partir del
cual las condiciones biológicas son
irrecuperables (Merymann, 1968).
Teoría de la congelación
Propiedad coligativa de los solutos.
0ºC 0ºC
0ºC 0ºC
Centros de nucleación
de hielo.
Solución eutéctica con
más solutos segregados
(aún con menor punto
de congelación).
Solución eutéctica
(con menor punto de
congelación).
Solución superenfriada.
Lesión por congelaciónDaño mecánico
Célula
sanguínea.
Célula sanguínea
destruida.
Centros de nucleación
de hielo intracelulares.
Centros de nucleación
de hielo.
Lesión por congelación.Daño osmótico (deshidratación).
Espacio extracelular
normosmótico.
Espacio extracelular
hiperosmolal.
Centros de nucleación
de hielo.
Célula sanguínea
deshidratada.
Célula sanguínea
normosmolar.
Salida de agua
intracelular.
Tipos de crioprotectores
- Agentes penetrantes: Crioprotectores con bajo peso
molecular, permeables a través de la membrana.
Desplazan el agua intracelular evitando la formación de
cristales de hielo.
- Agentes no penetrantes: Son crioprotectores con un
alto peso molecular, y por lo tanto no permeables a
través de la membrana. Promueven la rápida
deshidratación celular. Un ejemplo de ellos son los
azúcares: sacarosa, glucosa, trealosa...
CrioprotecciónMecanismo coligativo.
Espacio extracelular
normosmótico.
Espacio extracelular
ligeramente hiperosmolal.
Centros de nucleación
de hielo.Célula sanguínea
con poco estrés
osmótico.
Célula
sanguínea.
Molécula de
DMSO.
CrioprotecciónMecanismo de la envoltura cristalina.
Espacio extracelular
normosmótico.
Espacio extracelular
hiperosmolal.
Centros de nucleación
de hielo.
Célula sanguínea con
ligera deshidratación.
Célula
sanguínea.
Molécula de
HES.
Envoltura cristalina
de HES.
Crioprotectores.
• No debe ser tóxico para las células a las
concentraciones requeridas para la
criopreservación.
• La concentración de los crioprotectores
dependerá de la tolerancia de la célula al
crioprotector.
• Debe de ser eliminable antes de la infusión o
inocuo para el paciente.