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CRISTALIZAO DE MACROMOLCULAS

BIOLGICAS

Prof. Dr. Walter Filgueira de Azevedo Jr.

Laboratrio de Sistemas Biomoleculares.

Departamento de Fsica-Instituto de Biocincias, Letras e Cincias

Exatas-UNESP, So Jos do Rio Preto. SP.

www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br

2004

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ndice 1. Introduo....................................................................................................... 3

2. Princpios gerais para cristalizao de macromolculas biolgicas........ 5

2.1. Pureza da macromolcula biolgica......................................................... 6

2.2. Pureza da macromolcula biolgica......................................................... 7

2.3. Nucleao, crescimento e cessao de crescimento................................ 7

3. Conceitos sobre solubilidade....................................................................... 8

4. Solubilidade de macromolculas biolgicas............................................. 8

5. Salting-in e salting-out.................................................................................. 11

6. Diagramas de fase de macromolculas biolgicas.................................... 14

7. Tcnicas de cristalizao de macromolculas biolgicas.......................... 16

8. O Mtodo da matriz esparsa ( Fatorial)....................................................... 17

8.1. Aplicao do mtodo da matriz esparsa................................................... 19

9. O Mtodo da matriz esparsa passo a passo................................................ 21

9.1. Regras gerais para aplicao do mtodo da matriz esparsa................... 21

9.2. Experimento inicial de cristalizao usando-se o mtodo da matriz esparsa

.............................................................................................................................. 22

9.3. Melhoria das condies de cristalizao.................................................. 23

9.4. Protocolo para cristalizao da purina nucleosdeo fosforilase (PNP)

utilizando Hanging Drop (gota suspensa)................................................. 24

9.5. Protocolo para cristalizao da lisozima utilizando Hanging Drop (gota

suspensa)............................................................................................................. 25

10. Referncias bibliogrficas........................................................................... 27

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1. Introduo A vida a reao qumica mais complexa da natureza e neste cenrio as

protenas desempenham o papel principal. O estudo estrutural de protenas

forneceu a base para comearmos a entender a vida em termos moleculares. Desde

da resoluo da primeira estrutura de protena em 1959 at os dias de hoje, onde

quase trinta mil estruturas de macromolculas biolgicas tiveram sua estrutura

tridimensional determinada e suas coordenadas atmicas esto depositadas no

banco de dados de estruturas (Protein Data Bank)( www.rcsb.org/pdb/), um

grande desenvolvimento nos mtodos de resoluo de estruturas tem permitido

que o tempo de resoluo de estruturas fosse reduzido de anos para meses e em

alguns casos dias e at mesmo horas. A principal tcnica para resoluo da

estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas como um todo tem sido a

cristalografia por difrao de raios X, e at hoje a tcnica principal para

investigao da estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas (Blundell

and Johnson, 1976; Drenth, 1994). Os principais passos na resoluo de estruturas

por cristalografia de difrao de raios X esto descritos na figura 1.

Entre os principais passos da resoluo de protenas descreveremos a

cristalizao no presente texto. O principal objetivo da cristalizao de uma

macromolcula biolgica, tal como protena, cido nuclico ou vrus, o estudo

estrutural destas macromolculas, por mtodos de difrao de raios X. Tal estudo

estrutural fundamental para o entendimento molecular de vrios mecanismos

biolgicos.

Os cristais de macromolculas biolgicas so diferentes dos cristais de

pequenas molculas em vrios aspectos. Eles diferem em tamanho, cristais de

macromolculas so, normalmente bem menores, dificilmente excedem 1mm3 em

volume. Uma outra diferena que cristais de macromolculas biolgicas so bem

mais frgeis e possuem um alto contedo de solvente. A fragilidade dos cristais de

macromolculas biolgicas uma conseqncia das fracas interaes entre as

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macromolculas biolgicas dentro da rede cristalina e do alto contedo de solvente

nestes cristais (de 20% a mais de 75%). Cristais de protenas podem ter contedo de

solvente de at 75 % do volume em alguns cristais, como da Purina Nucleosdeo

Fosforila humana (De Azevedo et al., 2003). As ligaes fracas que mantm a

estrutura cristalina destas macromolculas biolgicas so do tipo hidrofbico e

ligao de hidrognio. Por esta razo, os cristais de macromolculas biolgicas

devem ser mantidos em um ambiente saturado de solvente, caso contrrio, a

desidratao conduzir quebra destas ligaes fracas e, conseqente, a destruio

dos cristais. O alto contedo de solvente, contudo, tem conseqncias teis, pois os

canais de solvente nos cristais de macromolculas biolgicas permitem a difuso

de pequenas molculas, uma propriedade usada na preparao de derivados

isomorfos e de complexos binrios de protenas e ligantes. Uma outra caracterstica

dos cristais de macromolculas biolgicas so as grandes dimenses de suas celas

unitrias, se comparadas com as dimenses das celas unitrias das pequenas

molculas. Cristais de macromolculas biolgicas podem ter parmetros de cela

unitria de at algumas dezenas de milhares de ngstrons (Ducruix and Gieg,

1992; Usha., et al, 1984).

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2. Princpios gerais para cristalizao de macromolculas biolgicas Uma das partes mais crticas na resoluo da estrutura de uma

macromolcula biolgica a cristalizao da mesma. Os principais passos

envolvidos na resoluo da estrutura a nvel atmico de uma macromolcula

biolgica esto mostrados na figura 1.

Figura 1. Principais passos na resoluo de uma estrutura por biocristalografia. 1.

Cristalizao. 2. Coleta de dados de difrao de raios X. 3. Resoluo da estrutura. 4.

Anlise da estrutura.

E entre todos estes passos a cristalizao o menos entendido.

Biocristalizao, como qualquer cristalizao, um processo de mltiplos

(4)

(3) (2)

(1)

6

parmetros, que envolve os trs passos clssicos da cristalizao, que so:

nucleao, crescimento e cessao de crescimento. O que faz com que o processo de

cristalizao de macromolculas biolgicas seja diferente que o mesmo envolve

um nmero de parmetros, muito maior do que aquele envolvido no crescimento

de cristais de pequenas molculas, e as propriedades fsico-qumicas peculiares

destes compostos. Por exemplo, a estabilidade tima das macromolculas

biolgicas em um meio aquoso est restrita a uma faixa estreita de pH. Mas a

principal diferena entre crescimento de cristais de pequenas molculas e cristais

de macromolculas biolgicas a flexibilidade conformacional e a versatilidade

qumica dessas macromolculas e, conseqentemente, sua maior sensibilidade s

condies externas. Para um planejamento racional das condies de cristalizao

necessrio o controle dos parmetros fsicos e biolgicos. A seguir descreveremos

trs dos principais parmetros a serem controlados num experimento de

cristalizao de uma macromolcula biolgica.

2.1. Pureza da macromolcula biolgica Devido ao fato que as macromolculas so extradas de complexas misturas

biolgicas, tais como as clulas, a purificao um passo importante para a

cristalognesis. Pureza, entretanto, no uma condio primordial para a

cristalizao, visto que, cristais de macromolculas biolgicas podem ser obtidos

de misturas de macromolculas, onde temos uma ou mais macromolculas

biolgicas como contaminante. Mas, tais cristais, so na maioria das vezes bem

pequenos, ou ento, crescem como massas policristalinas, que no so adequadas

para estudos cristalogrficos por difrao de raios X. Para o uso de tcnicas de

difrao de raios X necessrio o uso de cristais com a menor dimenso por volta

de 0,2mm, contudo com uso de fontes de raios X bem intensa, tais com sncrotrons,

tem sido possvel a resoluo de estruturas de macromolculas biolgicas cujos

cristais apresentavam dimenses menores que 0,1mm. Como regra geral, pode-se

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dizer que, a baixa pureza da macromolcula biolgica a causa mais comum da

falta de sucesso na cristalizao da mesma.

2.2. Solubilidade e supersaturao Para crescer cristais de qualquer composto, as molculas ou ons tm de ser

trazidos a um estado de supersaturao, um estado que termodinamicamente

instvel, no qual pode se desenvolver numa fase amorfa ou cristalina quando este

retornar ao equilbrio. Supersaturao pode ser alcanada pela evaporao lenta do

solvente ou pela variao de alguns dos parmetros como temperatura, pH e fora

inica. Disto segue que, o conhecimento das solubilidades macromoleculares um

pr-requisito para o controle das condies de cristalizao. Assim, como as bases

tericas da solubilidade so ainda controversas, especialmente no que tange efeitos

dos sais, os dados sobre a solubilidade quase sempre se originam de determinaes

experimentais. Nos ltimos anos, mtodos quantitativos permitiram tais

determinaes, usando pequenas quantidades de protena (Mikol & Gieg, 1989;

Ries-Kautt & Ducruix, 1989). O principal resultado destes mtodos foi a

demonstrao experimental da complexidade do comportamento da solubilidade,

enfatizando a importncia da determinao de diagramas de fase para o

planejamento racional de experimentos de crescimento de cristais de

macromolculas biolgicas.

2.3. Nucleao, crescimento e cessao de crescimento Devido ao fato que protenas e cidos nuclicos necessitam pH e fora inica

definidas para a sua estabilidade e funo, cristais de macromolculas biolgicas

tm de ser crescidos a partir de solues aquosas complexas. A cristalizao

comea com a fase de nucleao (i.e. a formao dos primeiros agregados

ordenados) que seguida pela fase de crescimento. As condies para se atingir a

nucleao so algumas vezes difceis de se repetir, e desta forma os procedimentos

de semeao com um material cristalino pr-formado se faz necessrio. Em muitos

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casos este o nico mtodo para se obter resultados reprodutveis. A nucleao

requer um estado de supersaturao maior do que aquele da fase de crescimento.

A velocidade da cristalizao aumenta com a supersaturao, desta forma

nucleao e crescimento deveriam ser desacoplados, o que quase nunca realizado

concientemente.

A cessao de crescimento de uma macromolcula biolgica pode ter

diversas causas, desconsiderando as triviais, como remoo da macromolcula do

meio de cristalizao, temos causas tais como, defeitos de crescimento,

envenenamento das faces, ou envelhecimento da macromolcula.

3. Conceitos sobre solubilidade Para se cristalizar uma macromolcula biolgica em um dado solvente,

necessrio levar a soluo a um estado de supersaturao. Uma macromolcula

biolgica segue as mesmas leis da termodinmica, como qualquer outro tipo de

molcula (inorgnica ou orgnicas) no que se refere supersaturao, nucleao, e

crescimento de cristais (Boistelle & Astier, 1988). Todavia, macromolculas

biolgicas apresentam peculiaridades, porque as interaes necessrias para

solubiliz-las num solvente so similares, e podem ser competitivas com as

interaes intermoleculares que so responsveis pela estrutura tridimensional da

macromolcula.

4. Solubilidade de macromolculas biolgicas Em geral, a solubilidade de um composto qumico em um solvente, a uma

dada temperatura, definida como a quantidade de composto dissolvida em uma

soluo em equilbrio com um excesso de composto no dissolvido; e.g. 25oC, o

sal sulfato de amnia se dissolve at que sua concentrao atinja 4,1 moles por litro

de gua, o excesso permanece no dissolvido. Mais sal pode ser dissolvido quando

se eleva a temperatura, e quando a temperatura trazida de volta a 25oC, a soluo

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atinge supersaturao. O excesso de sal cristalizar, at que a concentrao do sal

atinja seu valor de solubilidade 25oC (4,1 moles por litro de gua).

No caso de macromolculas biolgicas, a solubilidade definida tambm

pelas caractersticas do solvente. Como o solvente consiste usualmente de gua a

qual foram adicionadas diversas substncias qumicas para levar a soluo at um

dado pH (tampo), fora inica (sais), e eventualmente outros aditivos, estes

compostos podem afetar a solubilidade da macromolcula biolgica das seguintes

formas:

(a) diretamente, pela interao com diferentes grupos funcionais da

macromolcula e eventualmente modificando a conformao da

macromolcula. Trabalhar em diferentes condies de tampo e sais

como trabalhar como uma macromolcula diferente do ponto de vista

fsico-qumico.

(b) indiretamente, atravs da modificao das propriedades fsico-qumicas

do solvente; e.g. variao do pH modifica a carga lquida da protena e

desta forma a natureza do polieletrlito. Alm disso, se pontes salinas

esto envolvidas na estrutura tridimensional, estas podem se quebrar e a

macromolcula pode modificar sua conformao.

Uma macromolcula biolgica um polmero de aminocidos ou

nucleotdeos, os quais esto enovelados em uma estrutura tridimensional:

principalmente por interaes dipolo-dipolo, ligaes de hidrognio (e.g.

C=O+H-N), e por interaes de van der Waals;

por algumas ligaes covalentes ( pontes S-S);

eventualmente por pontes salinas ( e.g. -COO- +H3N-) entre resduos carregados.

Protenas apresentam as cadeias laterais hidrofbicas preferencialmente no

seu interior enquanto as cadeias laterais hidroflicas se localizam principalmente na

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sua superfcie. Desta forma as protenas podem sem consideradas como

polieletrlitos capazes de se dissolverem em gua.

A estabilidade das macromolculas biolgicas em soluo baseia-se na

competio das interaes solvente-soluto com interaes intramoleculares, as

quais so necessrias para manter a estrutura da macromolcula. O balano das

interaes que controlam a solubilidade e/ou a conformao de uma

macromolcula podem ser modificadas por (von Hippel & Schleich, 1969):

(a) Temperatura. Um aumento da temperatura aumenta a desordem das molculas

de solvente e permite tambm que conformaes da macromolcula de mais

alta energia livre total se formem.

(b) pH. Como a temperatura, variaes no pH afetam ambos soluto e solvente.

Todavia, alteraes das concentraes de H+ e OH- so minoritrias se

comparadas com a protonao e desprotonao de grupos da macromolcula.

(c) Sais. Sais podem agir de diferentes formas. (i) Eles so responsveis pela fora

inica, e desta forma afetam as interaes eletrostticas da macromolcula por

meio de blindagem de cargas. (ii) Eles podem formar interaes eletrostticas

diretas com resduos carregados na superfcie das macromolculas. (iii) Sais

podem agir atravs de interaes monopolo-dipolo com grupos dipolares da

macromolcula biolgica.

(d) Competidores de ligaes de hidrognio. Molculas que possuem um potencial

para formarem ligaes de hidrognio competem alta concentrao (>4M)

com ligaes de hidrognio da gua e ligaes de hidrognio intramoleculares

na protena.

(e) Aditivos hidrofbicos. Eles podem agir diretamente com partes hidrofbicas da

macromolcula e podem tambm alterar a estrutura do solvente. Detergentes

no-inicos agem desta forma (McPherson, et al., 1986).

(f) Solventes orgnicos. A adio de solventes orgnicos implica na modificao da

constante dieltrica e conseqentemente variaes em diversas interaes.

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5. Salting-in e salting-out A dependncia da solubilidade da protena com a concentrao salina foi

estudada em termos dos fenmenos de salting-in e salting-out (Green, 1932). O

aumento da solubilidade de uma macromolcula biolgica a baixa concentrao

salina (

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com a temperatura. KS KS so constantes de salting-out. So independentes da

temperatura e pH, mas dependem da natureza dos sais presentes na soluo. A

molaridade indicada por m. E a fora inica por , esta fora leva em conta a

valncia Zi de todos os ons presentes na soluo. A expresso da fora inica

dada por:

= ( mi Zi). (2)

Figura 2. Fenmeno de salting-in. a) Macromolcula biolgica sem a presena de ons

dissolvidos na soluo. A atrao eletrosttica entre os grupos carregados em duas os mais

macromolculas causa a aglomerao e precipitao. b) ons blindam a interao

eletrosttica entre as macromolculas, aumentando a solubilidade.

Um composto adicionado a um sistema macromolcula biolgica + gua

(soluto+solvente) pode se ligar macromolcula (ligao preferencial) ou ser

excludo (excluso preferencial). A interao lquida do salting-out excluso

preferencial, mesmo que molculas possam se ligar macromolcula biolgica.

A variao da solubilidade das macromolculas biolgicas (S), na faixa

completa de concentrao salina, reflete o efeito de ambas interaes, eletrosttica e

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hidrofbica a primeira sendo predominante baixa concentrao salina, e a

segunda a alta concentrao salina como mostrado na figura 3. Isto expresso pela

seguinte equao (Green, 1932):

log S = log So + ki C1/2 - ko C, (3)

onde ki e ko so as constantes de salting-in e salting-out respectivamente; So a

solubilidade da macromolcula biolgica em gua pura; e C a concentrao molar

salina.

Figura 3. Contribuio dos efeitos eletrosttico e hidrofbico sobre a solubilidade S,

normalizada em relao solubilidade em gua pura So.

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6. Diagramas de fase de macromolculas biolgicas Como a solubilidade de uma macromolcula biolgica depende de diversos

parmetros podemos avaliar a importncia de um dado parmetro a partir de um

diagrama bidimensional. Este diagrama uma representao da solubilidade

(mg/ml ou mM de macromolcula em soluo) como funo um parmetro, com

todos outros sendo mantidos constantes. Um diagrama deste tipo est

representado na figura 4, e compreende as seguintes zonas:

(a) A curva de solubilidade (S) separa as zonas supersaturadas e hiposaturadas.

Em um experimento onde as concentraes do agente de cristalizao e da

macromolcula biolgica correspondem s condies da curva S, a soluo

saturada da macromolcula est em equilbrio com a macromolcula

cristalizada. Isto corresponde situao ao final do processo de crescimento do

cristal a partir de uma soluo supersaturada, ou da dissoluo de cristais em

uma soluo hiposaturada.

(b) Abaixo da curva de solubilidade (S) a soluo est hiposaturada e a

macromolcula biolgica nunca ir cristalizar.

(c) Acima da curva de solubilidade (S), a concentrao da macromolcula biolgica

maior que a concentrao no equilbrio para uma dada concentrao salina.

Isto corresponde a uma zona de supersaturao. Dependendo da cintica para

se atingir o equilbrio e do nvel de supersaturao, esta regio pode ser

dividida em trs zonas: (i) A zona de precipitao onde o excesso de

macromolcula imediatamente se separa da soluo em um estado amorfo.(ii)

A zona de nucleao onde o excesso da macromolcula biolgica se separa

sob a forma cristalina. Prxima zona de precipitao, a cristalizao pode

ocorrer com um chuveiro (shower) (uma grande quantidade de cristais) que

podem ser confundidos com precipitado amorfo, pois os cristais apresentam

dimenses bem reduzidas assemelhando-se, muitas vezes, a um p.(iii) Na

zona metaestvel uma soluo supersaturada pode no nuclear, ou seja, pode

no gerar cristais, por um longo perodo de tempo, a menos que a soluo seja

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mecanicamente pertubada ou uma semente (um pequeno cristal) seja

introduzida, processo conhecido como semeadura (seeding). Classicamente este

processo se divide em macrossemeadura (macroseeding), onde um cristal de

dimenses macroscpicas introduzido uma soluo na zona metaestvel,

e microssemeadura (microseeding), onde normalmente vrios cristais bem

pequenos so inseridos numa soluo na zona metaestvel, contudo esta

diferenciao entre macro e micro um tanto arbitrria, sendo que o principal

que se tem uma ou mais sementes inseridas numa soluo com a

macromolcula biolgica na zona metaestvel. Esta zona corresponde,

idealmente, ao crescimento de cristais sem a nucleao de novos cristais.

Uma soluo saturada contm uma quantidade de soluto tal que no pode

haver crescimento ou dissoluo se cristais so adicionados soluo, ou seja,

qualquer ponto sobre a curva (S) no diagrama de fases esquemtico mostrado na

figura 4. Isto corresponde ao equilbrio termodinmico entre as duas fases (lquido

slido). O potencial qumico () de cada espcie qumica, i, a mesma em ambas

fases (cristal e soluo):

ic = is = io + RT ln ci (4)

onde io o potencial qumico padro, o coeficiente de atividade, e ci a

concentrao da espcie qumica i. Isto verdadeiro para qualquer espcie qumica

( macromolcula, gua etc). A supersaturao alcanada quando o potencial

qumico do soluto em soluo maior que o do cristal. Isto pode ser atingido

atravs da variao de alguns dos parmetros que afetam a solubilidade. A

supersaturao a fora motriz para a cristalizao; e definida como a diferena

do potencial qumico entre a soluo e o cristal. Entretanto, as aproximaes mais

comuns so as relaes c/cs e (c-cs)/cs onde c a concentrao da protena e cs a

concentrao do soluto em uma soluo saturada, ou seja, um ponto sobre a curva

de solubilidade(S) da figura 4. Estas quantidades tm a vantagem de serem

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adimensionais. Deve-se notar que o valor da supersaturao (definido como a

relao entre a concentrao de macromolcula biolgica c e a solubilidade cs )

realmente encontrada nos experimentos de cristalizao de macromolculas

biolgicas fica na faixa de 2 a 10. Esta faixa bem mais alta que aquela encontrada

para crescimento de cristais de pequenas molculas.

Figura 4. Descrio esquemtica de um diagrama bidimensional da solubilidade de uma

macromolcula biolgica.

7. Tcnicas de cristalizao de macromolculas biolgicas Existem muitas tcnicas para a cristalizao de macromolculas biolgicas,

todas tm como objetivo trazer a soluo da macromolcula biolgica a um estado

de supersaturao. As tcnicas mais utilizadas so difuso de vapor e dilise. Ns

descreveremos aqui a tcnica de difuso de vapor que atualmente a mais

utilizada. Esta tcnica foi utilizada pela primeira vez na cristalizao da tRNA

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(Hampel et al., 1968). Uma gota contendo a macromolcula biolgica a ser

cristalizada em tampo com o agente de cristalizao e aditivos equilibrada

contra um reservatrio contendo a soluo do agente de cristalizao a uma

concentrao mais alta do que na gota. O equilbrio prossegue por meio da difuso

das espcies volteis (gua e solventes orgnicos) at que a presso de vapor na

gota se iguale quela do reservatrio. Se o equilbrio ocorre por meio de troca da

gua (da gota para o reservatrio), isto leva a uma diminuio do volume da gota,

e conseqentemente a um aumento na concentrao de todos os constituintes da

gota de cristalizao. Para espcies qumicas com presso de vapor maior que a

presso de vapor da gua, a troca ocorre do reservatrio para a gota. Os mesmos

princpios se aplicam para gotas suspensas (hanging drops), gotas sentadas (sitting

drops) e gotas sanduches (sandwich drops).

Figura 5. Representao esquemtica da gota suspenda ( hanging drop), gota sentada (

sitting drop) e gota sanduche (sandwich drop).

8. O Mtodo da matriz esparsa ( fatorial) Com o aumento do nmero de macromolculas biolgicas cristalizadas com

sucesso, tornou-se bvio que muitas das condies de cristalizao se

assemelhavam, ou seja, havia uma concentrao de resultados positivos de

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cristalizao de macromolculas biolgicas usando-se nmero limitado de

precipitantes, tampes e aditivos. Isto levou proposio de diversos mtodos de

cristalizao (Carter & Carter, 1979), onde um nmero limitado de condies de

cristalizao eram tentados, usando-se pequenas quantidades da macromolcula

biolgica, geralmente por volta de poucos miligramas. A partir da observao dos

resultados preliminares destes experimentos era possvel determinar que tampo,

aditivo e agente precipitante seriam os mais favorveis e a partir da proceder-se a

sucessivos melhoramentos at se conseguir cristais adequados, ou ainda, em casos

favorveis, obter-se cristais adequados j na primeira tentativa com as condies

padres. Dentro deste raciocnio a Dra. Jaru Jancarick da UC Berkeleley props o

mtodo da matriz esparsa ( Jancarick & Kim, 1991) onde diversas condies

diferentes so tentadas para se cristalizar a macromolcula biolgica.

Visto que, o nmero de variveis que afetam a cristalizao, tais como,

concentrao, temperatura, pH, fora inica, aditivos especficos e precipitantes,

grande e combinatria, o nmero total de possveis condies de cristalizao a

serem testadas to grande que uma procura completa com todas as condies de

cristalizao em potencial seria invivel.

Tabela 1. Parmetros da matriz de cristalizao (Jancarik & Kim, 1991)

Agentes precipitantes No-Volteis Sais Volteis Mistura MPD Tartarato de Na,K 2-Propanol Sulfato de NH4 + PEG PEG 400 Fosfato de NH4 2-Propanol + PEG PEG 4000 Sulfato de NH4 PEG 8000 Acetato de Na Sulfato de Li Formiato de Na Fosfato de Na,K Citrato de Na Formiato de Mg Faixa de pH: 4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5 Aditivos: Cloreto de Ca, Citrato de Na, Cloreto de Mg, Acetato de NH4, Sulfato de NH4, Acetato de Mg, Acetato de Zn e Acetato de Ca.

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No mtodo da matriz esparsa foram escolhidas trs categorias de

parmetros que afetam a cristalizao como varveis principais, so estes: pH e

materiais tampes, aditivos e agentes precipitantes. Para a varivel pH e tampes

foram escolhidos cinco diferentes pHs: 4,6; 5,6; 6.5; 7,5 e 8.5, e para cada valor de

pH foi escolhido o tampo qumico que tinha provado ser o mais adequado para a

cristalizao de protenas no passado. A escolha de aditivos tambm foi baseada na

experincia passada de muitos laboratrios. Para os agentes precipitantes foram

escolhidos quatro tipos: 2-propanol como agente voltil, 2-metil-2,4-pentanediol

(MPD) e polietileno glicol (PEG) como agentes no-volteis e vrios agentes de

salting-out. Todos esto listados na tabela 1.

Por tentativa e erro a matriz multimensional foi simplificada eliminando-se

as condies que podem ser parcialmente representadas por resultados de outras

condies, a proposta original apresenta 58 condies. Comercialmente a empresa

Hampton Research, (USA) simplificou o mtodo original, e disponibiliza um kit

com 50 condies de cristalizao. Comercialmente h outros kits usando-se como

princpio a variao de pH, fora inica e agentes precipitantes.

8.1. Aplicao do mtodo da matriz esparsa Aps preparar as 58 diferentes solues, ns usamos o mtodo de hanging

drops, para testar as condies de cristalizao. Colocamos 0,7ml de cada uma

destas solues em cada um dos reservatrios de uma caixa plstica Linbro (Linbro

modelo 76-033-05). Estas caixas foram originalmente desenhadas para cultura de

clulas e possuem 24 reservatrios. necessrio o uso de trs caixas Linbro, sendo

que a terceira ter s 10 reservatrios so usados, o restante dos reservatrios da

terceira caixa podem ser usados em experimentos futuros. Teremos ento 58

reservatrios com 0,7 ml de cada uma das solues de cristalizao. O volume da

soluo do poo pode variar, ficando normalmente na faixa de 0,5 a 1,0 ml.

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Figura 6. Seqncia de eventos para a montagem de uma gota de cristalizao: a)

Coloca-se 1-2l da soluo da macromolcula biolgica sobre a lamnula de vidro. b)

Adiciona-se 1-2l da soluo do reservatrio gota com a soluo da macromolcula

biolgica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a soluo de macromolcula biolgica mais

a soluo do reservatrio.

Colocamos, em seguida, 1-2 l da soluo da macromolcula biolgica em

uma lamnula de vidro de 22 x 22 mm que foram siliniconizadas com 1% Prosil-28

( PCR Inc., Gainseville, Florida. U.S.A) e 1-2 l da soluo do reservatrio listada

no apndice 1 (figura. 6). Cobrimos cada um dos reservatrios das caixas Linbro

com as respectivas lamnulas de vidro onde temos 1-2l de soluo da

macromolcula biolgica mais 1-2l de soluo do reservatrio, usando uma graxa

de vcuo para vedar os reservatrios com as lamnulas de vidro. Este tipo de

composio o que convencionou chamar-se de gota (2+2). Nesta situao,

teremos uma concentrao menor de precipitante na gota, do que no reservatrio.

E a difuso de vapor dgua se proceder da gota para o reservatrio. No caso em

que as espcies qumicas do reservatrio possuam presso de vapor menor que a

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presso de vapor dgua, isto far com que a concentrao da soluo de

macromolcula biolgica bem como das outras espcies qumicas presentes na gota

aumente, o que em casos favorveis levar a macromolcula biolgica a uma

condio de supersaturao favorvel formao dos primeiros agregados

cristalinos (zona de nucleao). Tal composio (2l + 2l) pode ser mudada, bem

como o volume inicial da gota, contudo em um experimento de cristalizao deve-

se ter em mente o uso racional da macromolcula biolgica, principalmente nos

experimentos preliminares de cristalizao, de forma que, grandes volumes de

gotas de cristalizao devem ser evitados nos experimentos preliminares.

Na proposio original do mtodo recomenda-se que a macromolcula

biolgica a ser cristalizada seja dissolvida em gua ou no seu tampo original e

trazida a uma concentrao de aproximadamente 10 mg/ml. Um parmetro que

pode causar problemas a concentrao inicial de 10mg/ml, pois muitas

macromolculas biolgicas no conseguem atingir tal concentrao sem precipitar,

neste caso recomenda-se usar a mais alta concentrao possvel prxima a

10mg/ml.

9. O Mtodo da matriz esparsa passo a passo O uso constante do mtodo da matriz esparsa no Laboratrio de

Biocristalografia da UC Berkeley levou confeco de um conjunto de regras

bsicas utilizadas nos experimentos de cristalizao de uma nova macromolcula

biolgica. Tais regras e procedimentos foram desenvolvidos pela Dra. J. Jancarick,

as quais descreveremos a seguir, pois podem ser de grande utilidade em qualquer

projeto de cristalizao de uma nova macromolcula biolgica.

9.1. Regras gerais para aplicao do mtodo da matriz esparsa a) Nunca deixe qualquer gota de cristalizao clara, ou seja, sem precipitado

amorfo ou cristais, aps a aplicao do mtodo da matriz esparsa, pois tal

procedimento no lhe fornece qualquer tipo de informao. Assim, uma

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semana aps ter-se preparado o primeiro experimento de cristalizao usando-

se as condies descritas anteriormente (seo 8), aumente a concentrao do

precipitante no reservatrio de todas as gotas que no apresentaram cristais

nem precipitado. Isto deve ser feito em passos de 5% a cada trs dias, ou seja,

aumenta-se a concentrao do precipitante no reservatrio 5% acima da

concentrao anterior a cada trs dias, at que se consiga cristais ou precipitado

amorfo. O aumento da concentrao de precipitante no reservatrio causa uma

quebra do equilbrio termodinmico que foi provavelmente atingido aps uma

semana de feito o experimento de cristalizao. Tal procedimento pode levar a

macromolcula biolgica condio de supersaturao e nucleao.

b) O procedimento de Esperar e Ver funciona melhor que o procedimento Use

todo o material (macromolcula biolgica) agora, porque no primeiro

procedimento voc obtm um retorno do primeiro experimento de cristalizao

o que permite o uso de menores quantidades de material nos prximos

experimentos. Por esta razo sempre espere uma semana antes de fazer um

outro experimento de cristalizao com a mesma macromolcula biolgica.

9.2. Experimento inicial de cristalizao usando-se o mtodo da

matriz esparsa Passo 1) Se a macromolcula biolgica tiver de ser transportada mantenha-a em

gelo (sem congel-la) e adicione glicerol at 50% em volume e armazene-a em -

20oC. Use o necessrio para o experimento de cristalizao inicial, geralmente entre

1 e 2 mg o suficiente, e coloque o restante de volta a -20oC. A fim de eliminar o

glicerol da soluo estoque, toma-se o volume desejado da macromolcula

biolgica em glicerol e adiciona-se um volume igual do tampo, ento dialisa-se

contra o tampo.

Passo 2) concentre a protena no mesmo tampo e acrescente DTT, ou EDTA se

necessrio. Se existe NaCl no tampo melhor elimin-lo, desde que o NaCl no

seja necessrio para a solubilidade da macromolcula biolgica.

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Passo 3) Faa o fatorial 4oC e a temperatura ambiente, se houver material

suficiente.

Passo 4) Examine a gotas imediatamente aps montado o experimento de

cristalizao e anote: a) o nmero das gotas com precipitado.

b) h presena de sujeiras.

c) h presena de microcristais.

Passo 5) Confira as gotas diariamente por uma semana, fazendo as mesmas

anotaes do passo 4. E verifique tambm o surgimento de algum bom cristal.

importante verificar como a macromolcula biolgica se comporta com o tempo

em cada gota de cristalizao.

Passo 6) Supondo que pequenos cristais se formaram em uma ou mais gotas do

experimento inicial de cristalizao, deve-se concentrar esforos nos melhores

cristais e tentar a melhoria das condies de cristalizao dos mesmos. Os

procedimentos para a melhoria das condies de cristalizao sero mostrados a

seguir.

9.3. Melhoria das condies de cristalizao Consideremos o seguinte cenrio onde temos pequenos cristais obtidos nos

experimentos iniciais, com ou sem precipitado amorfo acompanhando-os. Para a

melhoria dos cristais e eliminao do precipitado amorfo seguimos os seguinte

passos:

Passo 1) Abaixe a concentrao da macromolcula e tente as mesmas condies em

que obteve os primeiros cristais. Tente varias concentraes, por exemplo, se os

primeiros cristais foram conseguidos com a concentrao de 10mg/ml tente 9, 8, 7,

6 e 5 mg/ml.

Espere por uma semana e se no houver melhora nos cristais,

Passo 2) Mantenha a concentrao da macromolcula biolgica constante e abaixe

a concentrao do agente precipitante.

Espere por uma semana e se no houver melhora nos cristais,

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Passo 3) Adicione 0,2M NaCl ao reservatrio. Se a gota de cristalizao ficar

completamente clara (sem precipitado ou cristais) aps uma semana, aumente a

concentrao do precipitante em incrementos de 5% a cada 3 dias. Se a gota

continuar sem cristais ou precipitado 0,2M de NaCl foi demasiado, tente

novamente com 20mM NaCl o mesmo procedimento.

A eliminao do precipitado, se presente, importante visto que o mesmo

age como stio de nucleao e complica a manipulao futura do cristal.

Se no houve melhoria nos cristais pode-se tentar microssemeadura

(microseeding) caso tal tentativa no funcione pode-se tentar variar a temperatura,

caso o experimento foi realizado a 4oC, deve-se tentar em temperatura ambiente e

vice-versa.

9.4. Protocolo para cristalizao da purina nucleosdeo fosforilase (PNP) utilizando hanging drop (gota suspensa) O protocolo descrito a seguir visa a cristalizao da PNP humana. Equipamentos e reagentes:

- Placa Linbro; - PNP (De Azevedo et al., 2003) a 12mg/mL em tampo fosfato de potssio a

10 mM, pH 7,1 (soluo A); - 40 % de sulfato de amnio em tampo citrato de sdio a 0,05 M, pH 5,3 (soluo

B); - Microfiltro de 0,22 m; - Graxa de vcuo; - Lamnula.

Mtodo:

1. Prepare a solues estoques de 40 % de sulfato de amnio em tampo citrato de sdio a 0,05 M, pH 5,3 e PNP a 12mg/mL em tampo fosfato de potssio a 10 mM, pH 7,1. Filtre a soluo com um microfiltro de 0,22 m;

2. Prepare uma placa Linbro; 3. Abastea os reservatrios da fileira A da placa Linbro com soluo B

variando de 15-40 % em passos de 5 %;

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4. Em uma lamnula, misture 1 L da soluo A com 1 L do reservatrio. Rpido e em srie engraxe a borda dos reservatrios e cubra com a lamnula;

5. Abastea os reservatrios da fileira B com soluo B variando de 19-29 % em passos de 2 %;

6. Abastea os reservatrios da fileira C com soluo B variando de 15-20 % em passo de 1 %;

7. Use a fileira D para duplicar ou testar parmetros particulares (por exemplo, volume da gota para observar se a influncia nos efeitos cinticos ou no crescimento);

8. Mantenha os experimentos a 18 C; 9. Observe os experimentos no dia seguinte;

Resultados. Os cristais da PNP humana apareceram aps 24 horas e apresentam dimenses aproximadas de 0,5 x 0,5 x 0,6 mm. A figura 7 mostra fotomicrografia dos cristais na gota de cristalizao.

Figura 7. Fotomicrografia dos cristais da PNP humana.

9.5. Protocolo para cristalizao da lisozima utilizando Hanging Drop (gota suspensa)

O protocolo descrito seguir visa a cristalizao da lisozima. Equipamentos e reagentes:

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- Placa Linbro; - lisozima 40mg/mL em acetato a 50 mM, pH 4,5; - NaCl 3 M ; - Microfiltro de 0,22 m; - Graxa de vcuo; - Lamnula. Mtodo:

1. Prepare as solues estoques de NaCl a 3 M e lisozima a 40 mg/mL (2,74 mM) em acetato a 50 mM, pH 4,5. Filtre todas as solues com um microfiltro de 0,22 m;

2. Prepare uma placa Linbro; 3. Abastea os reservatrios da fileira A com solues de NaCl variando de

0,5-1,5M em passos de 0,2 M; 4. Em uma lamnula, misture 4 L da soluo estoque com 4 L do

reservatrio. Rpido e em srie, engraxe a borda dos reservatrios e cubra com a lamnula;

5. Abastea os reservatrios da fileira B com soluo de NaCl variando de 0,8-1,8 M em passos de 0,2 M. Repita o experimento na fileira B depois de diluir a soluo estoque de protena metade para obter uma nova concentrao de 20 mg/mL (1,37 mM);

6. Abastea os reservatrios da fileira C com solues de NaCl variando de 1,5-2,5 M em passo de 0,2 M. Repita o experimento depois de diluir a soluo estoque de protena pela metade;

7. Use a fileira D para duplicar ou testar parmetros particulares (por exemplo, volume da gota para observar se h influncia nos efeitos cinticos ou no crescimento);

8. Mantenha os experimentos a 18 C; 9. Observe os experimentos durante 2 dias;

Resultados: Os cristais de lisozima apareceram aps 24 horas e apresentam dimenses aproximadas de 0,5x0,5x0,5mm.

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Figura 8. Fotomicrografia dos cristais da lisozima.

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