cromatografía de líquidos
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Reporte de una práctica utilizando un Cromatografo de liquidos.TRANSCRIPT
QUÍMICA FORENSE PRÁCTICA 7.
“ANÁLISIS DE METOMILO EN PLANTAS DE JITOMATE.”
06 DE NOVIEMBRE DE 2015
EQUIPO 5:
De la Cruz Cortés Alondra
Flores Fernández Jani Ytzú
Fossati Del Ángel Vanessa
Hernández Navarro Luis Alberto
Salazar Padilla Maribell
PROFESORES:
Sheila Sánchez Lazo Pérez
Luz Alejandra Castillo Alanís
Isidro Hinojosa López
Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Medicina
Licenciatura Ciencia Forense
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PRÁCTICA 7. ANÁLISIS DE METOMILO EN PLANTAS DE JITOMATE.
OBJETIVOS
Determinar la presencia de pesticidas en matrices biológicas
Realizar la cuantificación de los analitos de interés
Comprender la importancia de la técnica de cromatografía de líquidos en la
química forense
Aprender el funcionamiento de un equipo cromatográfico de líquidos
Interpretar los resultados obtenidos en el cromatograma
INTRODUCCIÓN
La cromatografía de líquidos es una técnica analítica de separación ampliamente
utilizada. Las razones de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla, su
capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles, pero sobre todo, su
amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria, muchos campos
de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales son
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos,
terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una
variedad de sustancias inorgánicas.
La cromatografía líquida de alta eficiencia se encuadra dentro de la cromatografía
de elución. En esta, un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido u
otro líquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de substancias
(analitos) en la corriente de fase móvil, cada analito avanzará a lo largo del sistema
con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases.
Esto supone que después de terminado el recorrido de la muestra por columna, cada
una de las substancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es
decir, estarán separadas.
Componentes de un equipo de cromatografía de líquidos.
Sistema de almacenamiento y dispensadores de la fase móvil (disolventes): su
función es garantizar la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones
apropiadas de modo que se evite la contaminación o degradación de los
disolventes empleados con estos fines.
Sistemas de impulsión de la fase móvil: bombas capaces de proporcionar
presiones hasta de 400 atm. Se encargan de mantener un flujo constante del
disolvente.
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Sistemas de inyección de la muestra: permiten la inserción de un volumen fijo o
variable de muestra en el sistema sin romper o perturbar significativamente las
condiciones de presión del mismo. La mayor parte de los cromatógrafos actuales
se venden con autoinyectores. Dichas unidades tienen la capacidad de inyectar
muestras en el cromatógrafo de líquidos a partir de frascos que están en un
carrusel o desde placas microtituladoras. Por lo regular, contienen rizos de
muestreo y una bomba de jeringa para inyectar volúmenes desde menos de 1 μL
hasta más de 1 mL.
Dispositivo de pre-tratamiento de las muestras: Su objetivo es efectuar
tratamientos u operaciones en la muestra, previas a la propia separación.
Columna: es el elemento fundamental de un cromatógrafo de líquidos, puesto
que en ella es donde tiene lugar la separación. Normalmente son de acero,
aunque existen de vidrio, material polimérico y en caso de microcolumnas, sílice
fundida.
Detectores: Proporciona información sobre la presencia de las especies separadas
en la columna cromatográfica. Debe elegirse de acuerdo a las características del
analito. El detector más usual es el de absorción UV-Vis.
Importancia del sistema de inyección.
El método de introducción de la muestra en HPLC, es de suma importancia pues un
mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda
cromatográfica que disminuyan la eficacia del sistema cromatográfico.
Imagen 1. Esquema de los componentes de un equipo de cromatografía de líquidos
(HPLC).
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Un inyector ideal debe tener las siguientes características:
Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible.
Ser de fácil manejo.
Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada
como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatográfica.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de
válvula:
Inyectores de jeringa: En este tipo de inyectores, la introducción de la muestra en
la columna se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema
cromatográfico a través de una membrana ("septum"), lo que permite depositar
la muestra en la cabeza de la columna (imagen 2).
Inyectores de válvula: Este sistema de inyección consiste en una válvula de seis
vías, dos de las cuales están conectadas entre sí por medio de una espira o
carrusel ("loop"). Esta espira es un tubo de volumen conocido, cuya misión es la de
contener la muestra antes de efectuarse la inyección.
La introducción de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la
primera se realiza a presión atmosférica, y consiste en cargar la muestra en la
espira con ayuda de una jeringa; en la segunda, mediante un giro de la válvula,
se hace pasar el eluyente a través de la espira hacia la columna (imagen 3). La
inyección mediante válvulas es con mucho la más utilizada, ya que reúne
prácticamente todas las características exigibles a un inyector.
Imagen 2. Inyectores de jeringa.
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El cromatograma
Un cromatograma nos dice la complejidad de la muestra en base al número de picos
observados. Identifica los componentes de la muestra en base a la precisa posición
de los picos (tiempo de retención) y determina cuantitativamente la concentración
de las sustancias en base al área de cada pico. Para obtener este cromatograma a
la salida de la columna se coloca un sistema de detección y registro, que permite
responder a una propiedad de la solución que contiene al analito o del propio analito
en función del tiempo.
Tiempo de retención (tR): Es el tiempo que transcurre después de la inyección de
la muestra para que el pico del analito alcance el detector se denomina tiempo
de retención.
Tiempo muerto (tM): Es el tiempo para que la especie no retenida alcance el
detector.
El factor de respuesta
En la cromatografía, el factor de respuesta (f) es la inversa del coeficiente a y
corresponde a la cantidad de sustancia por unidad de área; en el caso más general,
cada componente tendrá un factor de respuesta característico. Estos factores de
Imagen 3. Inyección mediante válvulas de 6 vías.
Imagen 4. Ejemplo de un cromatograma de
dos componentes.
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respuesta se determinan experimentalmente midiendo el área de la señal producida
por una cantidad conocida (Mi) de cada componente.
Metomilo.
El metomilo es un insecticida carbamato con acción de contacto, estomacal y
translaminar. Controla insectos chupadores y masticadores en hortalizas, cereales,
maíz, forrajeras, frutales y vides.
Cuando se utiliza no se debe reingresar al área tratada sino hasta pasadas 48 horas
de la aplicación. Los animales deben permanecer afuera hasta por 8 días. Este
insecticida es altamente tóxico por lo que si en algún momento se llega a encontrar
en plantas de consumo humano puede provocar diversos síntomas por intoxicación.
Propiedades fisicoquímicas:
Sólido cristalino de color blanco, con olor ligeramente sulfuroso.
Su punto de fusión se encuentra entre los 78 y 79 °C.
Su densidad relativa es de 1.2946 kg/m3 a 24 °C.
Su solubilidad en agua es de 58,000 mg/L (5.8 % peso/peso) a 25 °C.
Es soluble en algunos disolventes orgánicos. Su solubilidad (expresada en %
peso/peso) en diferentes compuestos a 25°C es la siguiente: en etanol de 42, en
metanol de 100, en isopropanol de 22 y en acetona de 73.
Se descompone al calentarse o al arder, produciendo gases tóxicos e irritantes
que incluyen a los óxidos de nitrógeno, óxidos de azufre, cianuro de hidrógeno y
metilisocianato.
Normas Oficiales Mexicanas que regulan el uso de plaguicidas.
En la NOM-232-SSA1-2009 sobre plaguicidas, se establecen los requisitos del envase,
embalaje y etiquetado de productos grado técnico y para uso agrícola, forestal,
pecuario, jardinería, urbano, industrial y doméstico.
Los plaguicidas son sustancias o mezclas de éstas que se usan con la intención de
mitigar, reducir o eliminar el impacto de las plagas en la producción agropecuaria, en
Imagen 5. Molécula de metomilo.
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la salud de los seres humanos, entre otros. Dada su naturaleza tóxica, estos productos
tienen el potencial de ejercer efectos adversos a la salud humana y al medio
ambiente. Lo anterior hace de los plaguicidas un grupo de sustancias en cuyo manejo
se debe enfatizar la protección del usuario y personal ocupacionalmente expuesto.
El mal uso de los plaguicidas puede ocasionar la intoxicación de los trabajadores, la
contaminación de los alimentos y el medio ambiente, todos éstos con efectos dañinos
para la salud humana. Esta norma se genera con el propósito de fomentar el manejo
seguro y comunicar los principales riesgos al momento de su uso.
HIPÓTESIS
Después del análisis de la muestra, se cuantificará una concentración elevada de
metomilo.
La cantidad del carbamato (metomilo) utilizado para el cultivo de hortalizas, será
superior a las cantidades permitidas en la norma.
La cantidad del carbamato (metomilo) utilizado para el cultivo de hortalizas se
encontrará dentro del parámetro permitido en la norma.
MATERIALES
2 matraces aforados de 10 mL
1 matraz aforados de 25 mL
1 matraz aforados de 50 mL
1 matraz aforado de 100 mL
Pipetas volumétricas de 1, 2 y 5 mL
3 pipetas beral
2 vasos de precipitados de 50 mL
2 vasos de precipitados de 100 mL
Propipeta/jeringa
Mortero con pistilo
1 nave para pesar
Espátula
REACTIVOS
Planta de jitomate, recolectada de los valles altos del Estado de México.
Alcohol metílico (metanol grado HPLC)
Acetonitrilo grado HPLC
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Estándar de metomilo
Cartucho de SPE
Sonicador
DESARROLLO
1. ¿Cuáles son los pasos críticos en la cuantificación de metomilo por cromatografía
de líquidos? Expliquen.
Elegir el disolvente adecuado como fase móvil y la columna apropiada como fase
estacionaria. Además la preparación de la muestra también tiene importancia ya
que debe utilizarse un disolvente capaz de solubilizar al metomilo, en este caso se
utilizó metanol.
2. ¿Qué tipo de técnica de cuantificación realizarán? Expliquen.
Se utilizará el método de estándar externo, para lo cual primero se inyecta una
masa conocida del componente a cuantificar, se mide el área de la señal y se
calcula el factor de respuesta. Posteriormente, se inyecta la muestra problema y
se mide la señal del componente que se quiere cuantificar. Finalmente, utilizando
el factor de respuesta se calcula la concentración del metomilo.
3. Realicen los cálculos necesarios para preparar 100Ml de una solución estándar de
metomilo de 10 ppm.
metomilodemgLL
mgppm 11.0
1
1010
4. ¿Cómo deberán realizar la extracción del o los pesticidas que estarían presentes
en una muestra?
En primer lugar se debe identificar y elegir la parte comestible de la muestra la cual
tiene mayor importancia ya que se trata de la principal fuente de intoxicación con
plaguicidas para las personas. De acuerdo con las características de la parte
comestible pueden llevarse ciertos procedimientos, los más comunes son triturarla
y con algún solvente extraer el analito (maceración) en algunas ocasiones es
necesario filtrar para evitar la presencia de residuos sólidos en la solución a analizar
por cromatografía, en esta práctica se determinó triturar el jitomate cherry con
todo y cascara y se añadieron 5 mL de metanol, posteriormente se hizo una
filtración. Y para evitar todo tipo de impurezas en la muestra, se pasó el filtrado por
un cartucho para SPE, el cual contenía gel de sílice, obteniendo asi, una fase
líquida totalmente libre de sólidos que puedan contaminar la muestra y afectar la
lectura del cromatógrafo de líquidos.
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Con lo anterior, se realizó el siguiente diagrama de trabajo para la elaboración de
la muestra y la lectura en el HPLC, previo a la inyección de la muestra, se debe
agregar el estándar de metomilo antes preparado.
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RESULTADOS
Debido a la imposibilidad de pesar 1mg de metomilo en la balanza, se tomaron 0.013g
de esta sustancia y se llevaron a 100mL, obteniendo una disolución de 130 ppm. Se
tomó 1mL de dicha disolución y se aforó a 10mL con agua calidad HPLC, obteniendo
como concentración del estándar final, 13 ppm.
En cuanto al peso de la matriz biológica jitomate, se trabajó con 11.99 g.
Una vez seguido el procedimiento indicado, se llevaron la muestra y el estándar al
cromatógrafo de líquidos. Se introdujeron, por separado, 250µL de cada preparación
en el sistema de inyección y se obtuvieron los siguientes cromatogramas:
Imagen 6. Cromatograma del estándar de metomilo.
Tiempo de retención del metomilo
11
h
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Comparando el tiempo de retención del metomilo obtenido a partir del estándar,
podemos identificar a la sustancia en la muestra obtenida de la matriz biológica
(jitomate).
El tercer pico en el cromatograma de la muestra, presenta un tiempo de retención de
0.900, similar a 0.933 que es el TR del estándar de metomilo. Así que trabajaremos con
los valores de este pico para calcular la concentración de metomilo en el fruto de la
planta.
Imagen 7. Cromatograma de la muestra que presuntamente contiene metomilo.
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Tabla 1. Relación de los resultados de la cromatografía de gases del estándar y la muestra.
Tiempo de
retención Área
Concentración de
metomilo (ppm)
Estándar 0.933 2.934 13
Muestra 0.900 42.99 x
Para poder calcular la concentración del metomilo se necesita conocer el factor de
respuesta (Fr) del metomilo, el cual se obtiene de la siguiente formula, con los datos
del estándar:
.
CFrÁrea
Fórmula
Fr
C
Área
Despeje
2256.013
934.2
ppm
doSustituyen
Fr=0.2256
De la fórmula anterior, se calcula ahora la concentración de la muestra problema,
utilizando el área obtenida en el cromatograma.
.
CFrÁrea
Fórmula
C
Fr
Área
Despeje
ppm
doSustituyen
55.1902256.0
99.42
La muestra contiene 190.55 ppm de metomilo.
gxmgmLmL
mgppm 41052.99527.05
1000
55.19055.190
Hay 0.9527mg de metomilo en 11.99g de matriz biológica, por lo tanto:
g
x
g
mg
199.11
9527.0 mg
g
gmgx 0794.0
99.11
19527.0
Cada gramo de matriz bilógica (jitomate) posee 0.0794mg de metomilo.
CONCLUSIONES
Es importante conocer la concentración de metomilo en la planta, ya que su nivel de
toxicidad es muy alto y es utilizado como plaguicida en diversos alimentos de
consumo diario, por lo que un exceso en el uso del mismo puede causar daños severos
en la salud de aquellas personas que lo consumen.
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La muestra presenta una concentración de 0.0794 mg de metomilo por cada gramo
del fruto, es decir, sí hay presencia de metomilo. Don Juan no está cumpliendo con la
Normatividad mexicana, por lo que se le puede aplicar una sanción administrativa
como la clausura de su negocio y la pérdida total de su cosecha; en los casos en los
que alguien haya resultado afectado en su salud por la ingesta de los frutos de la
cosecha puede levantar una denuncia y se tendría que comprobar la comisión del
delito.
El límite de residuos de metomilo en jitomate es de 1mg/kg1 y en nuestra muestra hay
79.4 mg/kg del plaguicida; es más que obvio que la ingesta del fruto puede provocar
intoxicación, incluso la muerte.
Este tipo de cuantificación la podemos hacer en nuestro ámbito laboral, cuando
tengamos una mezcla, y sospechemos que contiene alguna sustancia no volátil de
nuestro interés, por ejemplo algún veneno en una muestra de alimento o bebida,
algún agente contaminante en el agua para consumo humano, o en la tierra, entre
otras cosas.
BIBLIOGRAFÍA
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analítica. Editorial Sintesis. España.
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http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/cr
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http://www.arystalifescience.cl/pdf.asp?ficha=METOMIL%2090%AB%20PS
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http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/
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http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5139018&fecha=13/04/2010
Skoog, D., Holler, J., Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental, 6ª ed.
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Skoog, D., West, D., Holler, J., Crouch, S. (2005). Fundamentos de Química analítica,
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