cromatografía de líquidos de alto...
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Cromatografía de Líquidos de Alto y Ultra Alto Rendimiento
De los orígenes a la actualidad
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CROMATOFRAFIADELIQUIDOSDEULTRAALTORENDIMIENTO_9441.pdf
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Gas Líquido
Columna Plano
CLS CLL CFE CII CE
CPG CFG
CCF CP
Cromatografía
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Elución
• La muestra se aplica al principio de la
columna como una banda fina
• El eluyente tiene menor afinidad por la fase
estacionaria que los solutos
• Los solutos avanzan por el sistema a
velocidades diferentes, menores a la de la
fase móvil
• Los solutos se separan en bandas que eluyen
al final de la columna
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Requisitos de la muestra
• Soluble en la fase móvil
• “Limpia”
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HPLC ideal para muestras con:
• Presión de vapor baja
• Compuestos iónicos
• Compuestos de peso molecular elevado
• Compuestos Termolábiles
• SOBRE TODO: MEZCLAS DE COMPUESTOS
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Técnica Instrumental
La herramienta analíticade mayor importancia
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Componentes básicos
Control
de flujo
Fase
móvilIntroducción
de muestraColumna Detección
Registro
y proceso
Horno
C
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Instrumentación
Fase móvil Bomba de alta presión
Inyector
Columna
Detector
Muestra
Control de temperatura
Gradientede elución
Registro
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Columna
Van Deemter
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Efecto del diámetro de partícula
3
2 5
1
p
i t m
p
LH a d
N
Bp f D
d C
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Digestión de enolasa.Efecto del tamaño de partícula
en N y P
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COLUMNAS EN HPLC
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Columnas
• Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de sílice
fundida
• Dimensiones
–Longitud: 25 a 300 mm
–Diámetro: 75 mm a 1000 mm (0.075 a 4.6 mm)
–Tamaño de partícula: 1.2 a 10 mm
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Empaques de UHPLC
• Images of current 1.9um particles
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Tipos de fases estacionarias
• Cromatografía de intercambio iónico
• Cromatografía en fase normal
• Cromatografía en fase inversa
• Cromatografía de exclusión por tamaño
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¿¿¿ Ab o Ad ???
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Cromatografía
• Fase Normal
–FE polar
–FM No-polar
• Fase Inversa
–FE No-polar
–FM polar
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Cromatografía
de fase inversa
• FE
–Sílica químicamente modificada con
grupos no-polares: hidrocarburos
saturados: C18 octadecil, C8 octil,
C4 tetrametil, C2 dimetl
• FM
–Mezclas: agua/disolventes orgánicos
H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)
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Tipos de CL
• Cromatografía de intercambio iónico
• Adsorción: líquido-sólido
• Partición: líquido-líquido
–Cromatografia en fase normal
–Cromatografia en fase inversa
• Cromatografia de exclusión por tamaño
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Cromatografía de fase inversa
• Retención por solvofobicidad
• Habrá mayor retención conforme:
– Parte apolar de la molécula del soluto es mayor
– % C en la FE es mayor
– Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)
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Fase móvil
• Disolventes grado cromatográfico
• Agua de 18 m
• Baja viscosidad
• No vólatil
• Miscibilidad
• Filtrada
• Sin oxígeno disuelto (degasificada)
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Fuerza del eluyente
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Viscosidad del eluyente
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H = f (v)
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GRADIENTE DE ELUCIÓN
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Análisis Isocrático
Fase inversa, 10% CH3CN
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Análisis Isocrático
Fase inversa, 80% CH3CN
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Análisis Isocrático
Fase inversa, 50% CH3CN
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Análisis por gradiente
Gradiente de acetonitrilo
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T t
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Elución por gradiente
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Detectores
• Indice de refracción
• Ultravioleta-Visible
• Fluorescencia
• Electroquímico
• Dispersión de luz, viscosímetro
• Radioactividad
• Infrarrojo
• Espectrómetro de masas
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Proteínas por 2D nano UPLC
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Cromatogramas de digestión de E. Coli
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Fabricantes de Equipo HPLC
• Agilent Technologies • Beckman Coulter• Cecil Instruments • Dionex Corp• Hitachi • PerkinElmer, Inc. • Shimadzu Scientific Instruments • Thermo Fisher Scientific• Waters Corporation
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Columnas para HPLC
• Agilent Technologies • AkzoNobel• Beckman Coulter• Dionex Corp• Merck KGaA• Micro-Tech• Phenomenex• SGE Analytical Science• Shimadzu Scientific Instruments • Shodex• Sigma-Aldrich • Thermo Fisher Scientific• Tosoh Corporation• Waters Corporation• W. R. Grace and Company (Vydac)