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Caderno de Farmácia , v. 17, n. 2, p. 117 - 120, 2001. 117

AAVVAALLIIAAÇÇÃÃOO CCRROOMMAATTOOGGRRÁÁFFIICCAA DDEE PPOOLLIIFFEENNÓÓIISS PPRREESSEENNTTEESS NNAASS PPAARRTTEESS MMOORRFFOOLLÓÓGGIICCAASS DDEE P P H H Y Y LLLLAAN N T T H H U U S S N N I I R R U U R R I I

* * LIONÇO, M.I.a; DE SOUZA, T.P.b; PETROVICK, P.R.

a Bolsista CNPq; b Doutoranda; Laboratório de Desenvolvimento Galênico; Programa de Pós-graduação em CiênciasFarmacêuticas, Faculdade de Farmácia - UFRGS

RESUMO: Foram realizadas análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia em camada

delgada (CCD) e cromatografia em papel (CP), para identificação e quantificação de compostos fenólicos em extratosaquosos obtidos por decocção dos diferentes órgãos vegetais de Phyllanthus niruri. Os resultados evidenciaram aadequação dos métodos cromatográficos na avaliação da qualidade da droga vegetal ou de seus órgãos vegetais.Constataram-se diferenças qualitativas e quantitativas na composição de polifenóis entre as partes morfológicas.

UNITERMOS: P HYLLANTHUS NIRURI , POLIFENÓIS, ANÁLISE CROMATOGRÁFICA, CONTROLE DE QUALIDADE EM

MATÉRIAS-PRIMAS VEGETAIS.

ABSTRACT: CHROMATOGRAPHIC EVALUATION OF POLYPHENOLS IN MORPHOLOGICAL ORGANS FROM

P HYLLANTHUS NIRURI The identification and assay of phenolic compounds in aqueous extractive solutions fromdifferent parts of Phyllanthus niruri have been accomplished through high performance liquid chromatography(HPLC), thin layer chromatography (TLC) and paper chromatography (PC). The results showed the adequacy of thechromatographic methods to estimate the quality of vegetal as well as its morphological parts, moreover, it has been

find out qualitative and quantitative differences in the polyphenolic composition of the tested solutions.KEYWORDS: MORPHOLOGICAL PARTS; P HYLLANTHUS NIRURI , CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS, POLYPHENOLS,

* Trabalho agraciado com o 1º lugar no Concurso Acadêmico de Pesquisa Científica, 22, In: SEMANA ACADÊMICA DE ESTUDOSFARMACÊUTICOS, 27, Porto Alegre, 2001. Programa e Resumos. Porto Alegre: UFRGS, Faculdade de Farmácia, Diretório

Acadêmico da Faculdade, 2001. p. 26.

INTRODUÇÃO

Phyllanthus niruri (quebra-pedra) tem sidoamplamente utilizada na medicina popular,principalmente sob a forma de extrato aquoso3. Odecocto aquoso da planta pode ser obtidoutilizando-se as partes aéreas ou a planta toda,incluindo raízes. Estudos clínicos comprovam suaatividade terapêutica em afecções do aparelhogeniturinário11. Diversos compostos, tais como,alcalóides, flavonóides, lignanas, fenóis e terpenosforam isolados das plantas do gêneroPhyllanthus

3. As diferenças funcionais dasdistintas partes da planta, tais como folhas, galhose raízes, acarretam em rotas metabólicas, além decomposição e quantidade de substâncias químicasdesiguais11. No sentido de garantir a eficácia doproduto fitoterápico, têm sido realizados estudos,objetivando estabelecer e validar métodos de

análise para controle de qualidade da drogavegetal e de soluções extrativas4. Para isto, aobservação de marcadores químicos é uma etapaimportante. Os polifenóis, tais como taninos eflavonóides, têm sido amplamente usados comeste objetivo. Relatos na literatura, bem comoanálises fitoquímicas prévias a este trabalho,realizados neste laboratório, levaram a escolha

deste grupo de substâncias como alvo de estudo.Flavonóides podem ser utilizados comomarcadores taxonômicos devido, sobretudo, à suaabundância relativa em quase todo o reinovegetal, especificidade para algumas espécies,relativa estabilidade e seu acúmulo com menorinfluência do meio ambiente11. Além desta classe,os taninos também são considerados bonsmarcadores químicos. Distinguem-se,classicamente, dois grupos de taninos:

cfdeaderno

armácia

ISSN 0102-6593




condensados e hidrolisáveis, que diferem pela suaestrutura e origem biogenética2. Metodologias deidentificação e quantificação de compostosquímicos presentes na solução extrativa de P.niruri permitem o acompanhamento daestabilidade da planta e dos produtos a partir dela

obtidos. Os métodos cromatográficos distinguem-se entre diversos métodos de análise de matrizescomplexas, pois permitem um número elevado devariações das condições técnicas e resultadosquantitativos e qualitativos.

MATERIAIS E MÉTODOS

A matéria-prima vegetal foi adquirida daempresa Quimer (SP). As folhas, os galhos e asraízes foram separados, secados e moídos. Forampreparadas soluções extrativas aquosas pordecocção das folhas, dos galhos, das raízes e damistura das partes aéreas, sendo utilizada a

relação droga:solvente (7,5:100 m/V). Em seguida,tendo em vista a determinação do perfilcromatográfico e a quantificação de polifenóispresentes nas partes morfológicas de Phyllanthusniruri , partiu-se para a análise das soluções.Diferentes sistemas para cromatografia emcamada delgada (CCD) e cromatografia em papel(CP) foram testados (tab. 1). Na cromatografialíquida de alta eficiência (CLAE), em fase reversa,estudou-se a adequação da utilização dossolventes orgânicos acetonitrila e metanol, comácido fosfórico, em sistema isocrático e gradiente,utilizando coluna Merck, RP – 18 (250 x 4 mm) e

detector UV em 275 nm. As análises foramdesenvolvidas em cromatógrafo Shimadzucomposto por bomba (LC-10 AD), controladorautomático de gradiente (FCV-10 AL), amostradorautomático (SIL-10 A ) e detector UV/VIS (SPD-10A), controlado por programa Class LC-10. Paraavaliação dos espectros dos picos foi utilizadocromatógrafo líquido de alta eficiência Waterscomposto por módulo de separação 2690, detectorcom arranjo de fotodiodos 996 e programa degerenciamento e avaliação Millennium

Para as CP e CCD foram empregados,como substâncias referência rutina, quercitrina e

isoquercitrina, na análise de flavonóides, e naavaliação dos taninos, ácido elágico, ácido tânico,(+)-catequina e (-)-epicatequina.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

A análise dos cromatogramas em papel,após revelação com Reagente Natural A6 evisualização sob luz ultravioleta, utilizada nadetecção de flavonóides, demonstrou diferençasentre os perfis apresentados pelas amostras dasdiferentes partes da planta, além disso, ospadrões testados não foram detectados nasamostras. O resultado da CCD para taninos, apósrevelação com FeCl3 leva à suposição dapresença de ácido gálico (Rf = 0,63) tanto nassoluções de folhas quanto de galhos e raízes.Pôde-se distinguir, também, a presença de umamancha (Rf = 0,66), com coloração azul escuro,após revelação com FeCl3, a qual se verificaapenas na amostra de raízes.

Previamente, em CLAE, foram injetadasamostras dos decoctos das folhas, galhos e raízes

de iguais concentrações (20 µg/ml). Isto resultouem cromatogramas não comparáveis, uma vezque, o perfil referente à solução extrativa dasfolhas mostrou picos muito maiores do queaqueles obtidos dos decoctos de galhos e raízes(fig. 1). Isto se deve às diferentes concentraçõesdas substâncias pesquisadas nas amostrasavaliadas. Para possibilitar a análise em conjuntodos três cromatogramas, foram injetadas amostrascom diferentes concentrações, sendo: folhas 4,8µg/ml, galhos 40 µg/ml e raízes 100 µg/ml. Daavaliação comparativa dos cromatogramas,observou-se a superposição de picos dos extratos

de folhas, galhos e raízes, além da presença depicos que aparecem unicamente no decocoto dasraízes. Os cromatogramas apresentaram quatropicos (P1, P2, P3 e P4), os três primeiros,presentes em todas as amostras, com boaresolução (RsP1-P2 = 1,61; RsP2-P1 = 1,61; RsP3-P2 =2,66). A análise do espectro de varredura destes(fig. 2) permitiu a identificação do pico 1, comtempo de retenção (TR) em torno de 6,8 min,como sendo o ácido gálico (AG) e a indicação deserem, os picos P2 (TR ≈ 20,9 min) e P3 (TR ≈ 22,0 min), respectivamente, uma flavanona e umderivado do ácido gálico.

A partir destas constatações, construiu-se acurva de calibração do ácido gálico, obtendo-separâmetros que atestam sua linearidade (tab. 2).

Tabela 1. Sistemas cromatográficos para cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia em papel (CP)Composição eluente (v/v)suporte

flavonóides taninosAcetato de etila: acetona: ácido acético: água

(60:20:10:10)Acetato de etila: ácido fórmico: isopropanol: água

(50:4:2:7) 14

CCDgel desílica F254 Butanol: ácido acético: água

(30:10:10)15

Acetato de etila: ácido fórmico: água(95:5:5)

Ácido acético: ácido clorídrico: água (30:3:10) 9 CP Ácido acético 15%10

Ácido acético 6% 9




Tabela 2. Parâmetros de regressão para a curva decalibração do ácido gálicoParâmetro Valor Limite de confiançaF 4960,33* -Desvio dalinearidade

0,5391 -

r2 0,9997 (0,09%) -a -1837,98 -4959 a 1283,88b 95638,38 92465 a 98811,42α significativo = 0,05

Como base para os cálculos dasconcentrações das substâncias referenciadaspelos P2 e P3 foram utilizadas as relações de

proporcionalidade entre as áreas destes e a áreado pico 1. Para o cálculo das concentrações deácido gálico (P1) utilizou-se a equação obtida pelacurva de calibração. Os resultados dequantificação de polifenóis (tab. 3) comprovam

que, nas soluções de folhas e galhos, asconcentrações das substâncias referentes a P2 eP3 foram maiores do que P1. Observou-se que, aamostra de folhas, apesar de estar emconcentração aproximadamente oito vezes menordo que a de galhos, apresentou maiorconcentração das substâncias estudadas. Não foipossível quantificar as os picos 2 e 3 em relaçãoao AG, na amostra de raízes, pois o pico 1 nãoapresentou resolução adequada para o cálculodas áreas. A relação entre as áreas de P3 para P2foi de 0,5, diferentemente das relações obtidaspara os mesmos picos nas amostras das folhas e

dos galhos, demonstrando que a substânciacontida em P3 distribui-se, majoritariamente nasfolhas.

Tabela 3. Quantificação do ácido gálico e das duassubstâncias majoritárias nos decoctosParte da planta Concentração (mg/ml))

Ácido gálico P2 P3Folhas 17,7 42,4 53,4Galhos 1,4 1,75 1,6

CONCLUSÕES

Os métodos cromatográficos utilizados paraverificar a constituição polifenólica das soluçõesextrativas dos diferentes órgãos vegetais semostraram viáveis e adequados. Foramevidenciadas diferenças quantitativas equalitativas na composição de polifenóis entrepartes morfológicas de Phyllanthus niruri . Aquantidade de ácido gálico e das substânciasanalisadas foi sensivelmente maior nas folhas doque nas outras partes vegetais. Nas raízes foiverificada a presença de uma substância que nãoocorre nas folhas e nos galhos.

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folhas

galhos

raízes

Figura 1. Cromatogramas dos extratos aquososdas diferentes estruturas morfológicas de P.

niruri de mesma concentração (20 µg/ml)

Figura 2. Varreduras dos picos 1, 2 e 3 por

detector de arran o de diodos




produto seco nebulizado dePhyllanthusnirur i L. – Euphorbiaceae (quebra-pedra).Porto Alegre: UFRGS, Faculdade de Farmácia,Programa de Pós-graduação em CiênciasFarmacêuticas, UFRGS, 2000. Dissertação demestrado.

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Endereço para correspondência:Prof. Dr. Pedro Ros PetrovickFaculdade de Farmácia da UFRGSAv. Ipiranga, 275290610-000 - Porto Alegre – RS[e-mail: [email protected]]

Recebido em: 10.10.2001Aceito em: 19.10.2001Revisão final: 25.11.2001

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