INTRODUCCIÓN:

La cromatografía en columna es un método utilizado para purificar compuestos químicos a partir de mezclas de compuestos. A menudo se utiliza para aplicaciones preparativas en las escalas de microgramos hasta kilogramos.

Dentro del sistema que se comúnmente se utiliza para la elaboración de esta técnica dentro del laboratorio tendremos una clásica columna de cromatografía preparativa, la cual es un tubo de vidrio con un diámetro de 50 mm y una altura de 50 cm a 1 m, con un toque en la parte inferior. Para la realización de nuestra cromatografía se prepara de la eluyente con la fase estacionaria polvo y cuidadosamente se vierte en la columna. Se debe tener cuidado para evitar burbujas de aire. Una solución de la materia orgánica es una pipeta en la parte superior de la fase estacionaria. Esta capa suele ser cubierto con una pequeña capa de arena o de algodón o lana de vidrio para proteger la forma de la capa orgánica de la velocidad de la que acaba de agregar eluyente. Eluyente pasa lentamente a través de la columna para avanzar en la materia orgánica. A menudo, un depósito de eluyente esférica o un eluyente lleno y cerrado embudo de decantación se coloca en la parte superior de la columna.

Los componentes individuales son retenidos por la fase estacionaria de manera diferente y separados unos de otros mientras se ejecutan a velocidades diferentes a través de la columna con el eluyente. Al final de la columna que eluyen de uno en uno. Durante el proceso de cromatografía de todo el eluyente se recoge en una serie de fracciones. La composición del flujo de eluyente puede ser controlado y cada fracción se analizan los compuestos disueltos, por ejemplo, por cromatografía en fase de análisis, UV de absorción, o fluorescencia. Compuestos de color (o de fluorescentes de compuestos con la ayuda de un UV la lámpara) puede ser visto a través de la pared de vidrio como el traslado de las bandas.

Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo.

Para la elección del eluyente y conocer algunas características de la sustancia a utilizar se presente a continuación el siguiente esquema:

El orden aproximado de elución de compuestos y de polaridad es aproximadamente el que se indica:

MATERIAL POR EQUIPO

Columna para cromatografía Pipeta de 5 ml*Matraz redondo fondo plano 125 ml Probeta de 25 ml *T de destilación Piseta de 125 ml c/eluyenteRefrigerante p/agua c/mangueras EspátulaColector Frasco p/cromatografia c/tapaTapón esmerilado PortaobjetosVaso de pp. de 100 ml Tubos capilaresVaso de pp. de 150 ml * Frascos "viales"Vidrio de reloj Embudo de vidrioAgitador de vidrio Pinza de tres dedos con nuez

Recipiente eléctrico para B.M.* Graduados

SUSTANCIAS Y REACTIVOS

Acido benzoico Acetato de etiloAzul de metileno HexanoSilicaqel para columna Sulfato de sodio anhidroSilicaqel para crom. en capa fina Yodo

EXPERIMENTO 1. PURIFICACIÓN DE ÁCIDO BENZOICO

Esquema del montaje final de la columna para cromatografía

Para la aplicación de la cromatografía en columna, se utilizo una mezcla sólida de ácido benzoico contaminado con azul de metileno.

1.- Primero, manteniendo la posición de cerrado de nuestra columna, se monto esta, de forma que su posición quedara lo mas vertical posible. Posteriormente se coloco un algodón en su fondo y una cantidad pequeña de acetato de etilo como eluyente.

2.- Una vez realizado el paso anterior se procedió a la preparación de una suspensión de 10g de gel de sílice para columna en 40 mL de eluyente. A través del embudo de vidrio se vertió la suspensión en la columna con un empacado uniforme, y posteriormente se elimino el exceso de disolvente (no se debe dejar la gel de sílice sin disolvente).

3.- Una vez realizado lo anterior se disolvió 0.4g de ácido benzoico con azul de metileno, en 4 mL de eluyente, distribuyendo esta mezcla sobre la superficie del gel de sílice en la columna. Una vez realizado esto se abrió la llave de nuestra columna para colectar el disolvente y permitir la absorción de la muestra, recolectando a partir de aquí cada una de las muestras obtenidas en los frascos viales.

4.- Con la ayuda de cromatoplacas se pudo verificar la separación exitosa de cada una de las fracciones, usando una cromatoplaca testigo como comparativo directo.

Cada una de estas cromatoplacas se eluyo en una mezcla de hexano-acetato de etilo (en proporción 2:1) verificando la presencia del compuesto separado (Figura 1). En cada cromatoplaca se busco observar algún cambio de la coloración de la mancha del producto principal (a menor concentración menor intensidad de color).

5.- Cuando ya no se observo en la cromatoplaca presencia alguna del producto separado reunieron las fracciones que contenían producto.

Para recuperar el acido benzoico se destilo el exceso de disolvente utilizando, esto mediante una destilación simple, utilizando el baño maría y dejando en el matraz un residuo de 5 mL aproximadamente, el cual fue vertido en un vidrio de reloj para pesarse.

6.- Por último se calculo el rendimiento.

Resultados:

Para la parte correspondiente a la elección del eluyente ideal se obtuvieron los siguientes resultados:

Eluyente: Acetato de etilo.(a) = Distancia del centro de la mancha

al punto de inicio = 5.5 cm(b) =Distancia del frente del eluyente al

punto de inicio = 6Rf = a / b = 5.5cm /6cm = 0.916

Eluyente: Hexano.(a) = Distancia del centro de la mancha

al punto de inicio = 4.2 cm(b) =Distancia del frente del eluyente al

punto de inicio = 5.6Rf = a / b = 4.2cm / 5.6cm = 0.750

Eluyente: Metanol.(a) = Distancia del centro de la mancha

al punto de inicio = 2.7 cm(b) =Distancia del frente del eluyente al

punto de inicio = 4.2Rf = a / b = 2.7cm / 4.2cm = 0.643

Para la recolección del disolvente con nuestras muestras en los frascos viales se observo un patrón en la coloración de las manchas (estas estaban presentes) en los primeros 4 viales, mientras que en los últimos dos ya no se observa mancha de producto.

4 primeros viales

Se observa la presencia de la muestra de acido benzoico durante los primeros 4 viales.

2 últimos viales

Puede observarse que ya no se encuentra presente en la muestra alguna fracción de acido.

Valor recuperado por destilación simpre de la muestra de acido benzoico:

Peso del matraz solo: 55.38g Peso del matraz con ácido: 56.66 g

Cantidad recuperada de acido: 0.28g Cantidad de acido en la muestra original: 0.4 g

Porcentaje de rendimiento = 0.28g / 0.4g = 70%

Análisis de resultados:

En esta práctica se empleo la técnica de cromatografía en columna con el fin de separar individualmente una muestra de ácido benzoico de una mezcla que contenía también azul de metileno, para esto se identifico al acido en la mezcla comparando su comportamiento cromatográfico con el de la sustancia patrón de ácido benzoico puro eluido en AcOet.

Con ayuda de 6 frascos viales se elaboraron 6 eluatos de aproximadamente de 10ml cada uno, con el fin de encontrar el eluato donde deja de haber presencia de ácido benzoico.

En este caso las muestras de estos se colocaron en 3 cromatoplacas distintas preparadas con gel de silica con el fin de realizar cromatografía en capa fina en cada placa. En cada una de las cromatoplacas se colocaron 2 muestras de frascos viales distintas (colocadas a los lados) y en medio se colocó el testigo de ácido benzoico observar la variación del comportamiento cromatográfico. Observando las imágenes recopiladas, puede notarse que la mayor cantidad de ácido en los eluatos está presente en los primeros 2 en una cantidad considerable, también puede observarse como para el tercer eluato la cantidad de ácido presente es muy poca y prácticamente nula para el eluato número 4. En los eluatos numero 5 y 6 ya no se observaba muestra, así que se mezclaron las muestras 1,2 y 3, para después separar el eluyente del ácido por destilación simple. La muestra obtenida por esta operación tiene una masa final de 0.28g de una muestra inicial de 0.4g de ácido con un rendimiento del 70%, donde posiblemente parte de esta muestra original se quedo en la columna al momento de realizar el proceso de destilación simple. En cuanto al azul de metileno, este quedo retenido por el adsorbente (fase estacionaria), esto permitió que este se separara del acido benzoico.

MANEJO DE RESIDUOS: Los residuos generados en este experimento son:

TRATAMIENTOS

D1, D2, D3, y D4: Guardar para recuperar por destilación al final del semestre

D5: Secar y redestilar

D6: Emoacar cuidadosamente para incineración

D7: Lavar y recuperar para su reutilización

CUESTIONARIO: 1. Si una mezcla de antraceno y naftaleno se separa por cromatografía sobre alúmina, ¿cuál de los dos hidrocarburos eluirá primero y cuál al último? ¿Cuál sería el más polar? Primero eluirá el antraceno, posteriormente lo hará el naftaleno. Esto ocurre debido a que el antraceno es mas polar que el naftaleno, a causa de la triple estructura cíclica-aromática sobre la doble estructura cíclica-aromática del segundo lo que implica mas polaridad (a causa de la deslocalización electrónica de los anillos).

2. Un colorante desconocido, se piensa que puede ser azul de metileno, ¿cómo se podría comprobar esta suposición usando un procedimiento basado en una técnica cromatográfica? Utilizando la técnica de cromatografía en capa fina, esto realizando una cromatoplaca patrón en que se podamos observar el comportamiento cromatográfico de del azul de metileno puro (realizando las pruebas correspondientes para la elección del el eluyente más adecuado para el azul de metileno) y comparando su comportamiento con el de la sustancia a analizar, si el colorante desconocido y el azul de metileno tienen el mismo comportamiento cromatográfico bajo las mismas condiciones, es muy probable que estemos trabajando con sustancias iguales.

3. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una cromatografía en columna? Usando como criterio principal a la polaridad de la muestra que estamos utilizando, ya que esto determina la polaridad del eluyente que debemos utilizar, así como determinar las demás fases que rodean la columna para evitar que la muestra no se desplace más de lo necesario. 4.- La recuperación cuantitativa del producto principal, ¿sería más completa si se recogieran fracciones mayores o menores de 10 mL? ¿Por qué? Esta seria más completa si pudiéramos obtener con frascos viales muestras d mayor tamaño a 10 ml para que mayor parte de la muestra pase por la columna y así se juntarían las fases para realizar la destilación y obtuviéramos mayor cantidad de muestra final

5. Indique alguna de las aplicaciones de la cromatografía de adsorción en columna y capa fina Capa fina : Puede utilizarse como método para la separación de aminoácidos Columna : Puede utilizarse como método para separación de colorantes, proteínas

6. Escriba la ficha bibliográfica completa de 5 libros de cromatografía en capa fina y columna (técnica y teoría) especializada:

°ABBOTT, David y ANDREWS, R. S. Introducción a la Cromatografía. 3ra. Edición. Colección Exedra. Editorial Alhambra. España. 1973.

°BAUER, Karin ; GROS, Leo and SAUER, Werner. Thin Layer Chromatography: An Introduction. Hüthig Verlag. Germany. 1991.

° DOMINGUEZ, Xorge Alejandro. Cromatografía en Papel y en Capa Delgada. Serie de Química. Organización de los Estados Americanos. Nº 16. U.S.A. 1975

° GÖTZ, Wolfgang; SACHS, Albert and WIMMER, Hans. Thin-Layer Chromatography. Gustav Fisher. Verlag. Germany. 1980. °JORK, H and WIMMER H. TLC Report: A Collection of Quantitative Papers. GIT Verlag. Germany. 1986. °Reactivos de Coloración para Cromatografía en Capa Fina y en Papel. Merck. Alemania. 1980.

7. Cuál es la diferencia entre cromatografía en capa fina y la cromatografía en papel. Igual que la realizada en papel, la cromatografía en capa fina se basa en la distribución en dos fases, la estacionaria, compuesta por una capa de hidratación y la móvil, que se trata de un solvente orgánico. La única novedad radica en el soporte, ya que no es una hoja de papel, sino una capa de 0,1 a 1 mm de óxido de silícico o celulosa, apoyada en un subsoporte de cristal. La capa se aplica manualmente mediante un aparato que deja una ranura regable por la que sale la pasta denominada Silicagen, este aparato la vamos deslizando por la placa a velocidad constante para conseguir la textura deseada, no hay que decir que a mayor velocidad menor grosor de la capa. Siempre se realiza de forma ascendente, principalmente por que el soporte es rígido. La cromatografía en capa fina aguanta tratamientos de visualización mucho más potentes debido al subsoporte y que es más rápida, pudiendo terminar la corrida en una media hora.

CONCLUSIONES: En esta práctica se realizó la separación por columna de una mezcla de azul de metileno con ácido benzóico para obtener distintas fracciones de la mezcla inicial, hasta el punto en el que pudimos separar al acido del azul de metileno, esta separación se pudo comprobar mediante cromatografía en capa fina al comparar las especies presentes en cada frasco vial con una muestra testigo de ácido puro, para poder identificar los eluatos que contenían ácido benzóico. Al final ya con toda la muestra de eluyente con acido se procedió a separar ambos por destilación simple obtener la muestra deseada que era de ácido benzóico.

En conclusión la cromatografía por columna se empleara cuando para la separación de mezclas o purificación de sustancias, necesitemos retener a esta en su fase estacionaria (en este caso el gel de silica) o bien a algunos compuestos de esta por su propiedad de adsorción, para esto haremos que pase por la columna y la fase estacionaria de esta columna una corriente de disolventes como fase móvil (nuestro eluyente que en este caso es el AcOEt) que arrastrará a los compuestos constituyentes de la mezcla, haciéndoles avanzar a través de la columna.

Este tipo de cromatografía nos resulta especialmente útil para poder identificar los recipientes en donde se encuentra un componente de una mezcla. Esto nos ayudara a determinar la cantidad de este cuantitativamente y de forma mas amplia que en el caso de una cromatografía en capa fina; además este método nos permite de forma muy eficiente la separación de cantidades mayores de mezclas de sustancias, donde la velocidad dependerá únicamente de la capacidad de nuestra columna cromatográfica para liberar al eluyente con la muestra deseada.