cromatografia gasosa de lipídios como ferramenta para estudos de ecologia microbiana
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Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana. Marcelo Ferreira Fernandes. Resumo. Parte I. Ecologia Microbiana Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa de Lipídios como de Lipídios como Ferramenta para Ferramenta para
Estudos de Ecologia Estudos de Ecologia MicrobianaMicrobiana
Marcelo Ferreira Fernandes
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ResumoResumo
• Parte I. Ecologia Microbiana
• Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos
• Parte III. Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana
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PARTE IPARTE I
Ecologia Microbiana Ecologia Microbiana
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Ecologia MicrobianaEcologia Microbiana
• Objetivos:
– Entender a biodiversidade de microrganismos na natureza e como diferentes guildas interagem em comunidades microbianas
– Medir a atividade dos microrganismos na natureza e monitorar seus efeitos sobre o ecossistema (componentes bióticos e abióticos)
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Interações entre Interações entre Microrganismos e Microrganismos e
Impactos Ambientais e Impactos Ambientais e Econômicos Derivados de Econômicos Derivados de
suas Atividadessuas Atividades
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O Exemplo do Ciclo do O Exemplo do Ciclo do NitrogênioNitrogênio
N2 (80% atmosfera)
N N
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Outros Exemplos de Outros Exemplos de Impactos Ambientais e Impactos Ambientais e
Econômicos Derivados da Econômicos Derivados da Atividade de Atividade de
MicrorganismosMicrorganismos
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• Controle da disponibilidade de nutrientes minerais para as plantas– Ciclagem de nutrientes, associações simbióticas (FBN, micorrizas), perdas de nutrientes
• Seqüestro de carbono e balanço de gases de efeito estufa
• Melhoria da qualidade física e química do solo– Formação de húmus, formação e estabilização de agregados de solo
• Controle biológico de pragas e doenças vegetais e animais
• Processos infecciosos (doenças) em plantas e animais
• Decomposição de alimentos e outros bens
• Biolixiviação de minerais de importância econômica (cobre, ouro, urânio...)
• Biorremediação de xenobióticos (pesticidas, petróleo, explosivos, nylon...)
• Tratamento de águas; eutroficação de águas e poluição de lençóis freáticos
• Corrosão de metais, entupimento de tubulações de água e óleo
• Produção de enzimas de importância industrial, fármacos, combustíveis, polímeros para plásticos biodegradáveis etc
• ...
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Fatores que Controlam Fatores que Controlam Estes Processos e ImpactosEstes Processos e Impactos
• Bióticos– Presença e atividade de uma guilda específica
– Interações entre guildas
• Abióticas
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A Atividade do “Fator Biótico” A Atividade do “Fator Biótico” Visa à SobrevivênciaVisa à Sobrevivência
• Obtenção de energia ou de compostos para síntese celular – Ciclos biogeoquímicos (C, N, P, S, Fe, Mn, Hg...) – Associações simbióticas com plantas e animais – Patógenos, predadores e parasitas
• Transformação de compostos tóxicos ao crescimento microbiano– Ciclos biogeoquímicos
• Proteção contra fatores ambientais adversos
• ...
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Diversidade Metabólica MicrobianaDiversidade Metabólica Microbiana
• Vasta diversidade de “modos de vida” ou de conseguir recursos para sobrevivência
– Entre espécies de microrganismos
– Dentro da mesma espécie
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Obtenção de Energia (Aerobiose)Obtenção de Energia (Aerobiose)– Corg → CO2 (Fungos, bactérias, protozoários...)
• Decomposição de restos animais e vegetais• Formação do solo (CO2 + H2O H2CO3), formação de humus, ciclagem de nutrientes
– NH4+ → N2O → NO → NO3
- (Nitrosomonas, Nitrobacter...)• Contaminação de águas com NO3
-
• Gases de efeito estufa
– Fe2+ → Fe3+ (Thiobacillus ferroxidans)• Biolixiviação de metais (cobre, ouro, urânio...)
– CH4 + 2 O2 → CO2 + 2 H2O• Importante dreno de metano
– So + H2O + 1 ½ O2 → SO42- + 2 H+ (Thiobacillus, Beggiatoa...)
• Solubilização de fosfatos de rocha pela acidificação do solo, corrosão de estruturas metálicas...
– 2 H2 + O2 → 2H2O (Alcaligenes, Ralstonia...)
– CO + ½ O2 → CO2 (carboxidotróficas: Pseudomonas carboxydovorans)• Principal dreno de monóxido de carbono da Terra
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Obtenção de Energia Obtenção de Energia (Anaerobiose: Aceptores de (Anaerobiose: Aceptores de
Elétrons)Elétrons)– CO2 → CH4 (Arqueas metanogênicas: Methanobacterium, Methanococcus)
• Gás de efeito estufa e combustível
– NO3- → NO → N2O → N2 (Alcaligenes, Pseudomonas...)
• Perda de fertilizantes• Gases de efeito estufa
– Fe3+ → Fe2+ (Geobacter, Shewanella, Geospirillum, Thiobacillus ferroxidans, Sulfolobus...)
• Degradação de compostos aromáticos (benzoato, toleno) utilizados como fonte de energia (doadores de elétrons)
• Biolixiviação de metais de sulfetos metálicos.
– SO42- + acetato ou H2 → H2S (Desulfovibrio, Desulfobacter...)
• Toxidez à vida aquática• Desclorinação redutiva de pesticidas clorados
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Obtenção de Compostos para Obtenção de Compostos para Síntese e Metabolismo CelularesSíntese e Metabolismo Celulares
• Fotoautotrofia (algas, cianobactérias, Euglena)– Fixação de CO2, via luz
• Quimoautotrofia (muitas bactérias e arqueas)– Fixação de CO2, via oxidação de compostos minerais
• Heterotrofia (fungos, protozoários, bactérias, arqueas)– C orgânico (saprofitismo, simbiose, parasitismo ou predação)
• Fixação Biológica do N2 (algumas bactérias)– N2 NH4
+
• ...
• ...Dinitrogenase
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InteraçõesInterações entre Guildas entre Guildas MicrobianasMicrobianas
• Rizóbios (fixadores simbióticos de N2) vs. actinomicetos (produtores de antibióticos) → controle do processo da FBN em soja
• Fermentadores (diversos mcgs) vs. metanogênicos (arqueas anaeróbicas) vs. metanotróficos (bactérias anaeróbicas): balanço de metano entre solo e atmosfera → controle do processo de efeito estufa
CO2 CH4
H2
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Fatores Abióticos de Controle Fatores Abióticos de Controle da Atividade, Biomassa e da Atividade, Biomassa e
Composição de Comunidades Composição de Comunidades MicrobianasMicrobianas
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Atividade, Biomassa e Atividade, Biomassa e Composição Microbianas são Composição Microbianas são
Afetadas por: Afetadas por: – Disponibilidade de oxigênio
• De modo geral, bactérias e arqueas mais versáteis que eucariotos
– Disponibilidade de água• Fungos e actinomicetos mais resistentes a seca• Holoarqueas = extremófilos
Temperatura • Extremófilos = poucas bactérias; ultra-extremófilos = muitas arqueas
– Disponibilidade de nutrientes• Oligotróficos vs. copiotróficos
– Disponibilidade de energia
– pH• Fungos = ácido; bactérias = neutro (Extremos em Arquea e Bacterias)
– Toxidez por produtos naturais e artificiais
– Interações biológicas...
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Impactos Antropogênicos sobre a Impactos Antropogênicos sobre a Microbiota e Processos Microbiota e Processos
Associados Associados • Preparo do solo:
– aeração, temperatura, umidade, pH
• Pesticidas e outros compostos químicos: – toxidez seletiva ou geral
• Culturas, sistemas de culturas, mudanças de uso da terra– quantidade e qualidade de substrato, relações hospedeiro e microrganismos, temperatura
e umidade
• Adubações e calagem: – disponibilidade de nutrientes, pH...
• Irrigação e drenagem: – disponibilidade de água, temperatura e oxigênio...
• Pecuária: – disponibilidade de nutrientes, oxigênio...
• Deposições atmosféricas industriais: – disponibilidade de nutrientes, pH...
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Exemplos de Impactos de Exemplos de Impactos de Atividades Humanas sobre Atividades Humanas sobre
a Atividade, Biomassa e a Atividade, Biomassa e Composição das Composição das
Comunidades MicrobianasComunidades Microbianas
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Mudança do Uso da TerraMudança do Uso da Terra• Substituição de florestas por pastagens:
– Pisoteio animal → compactação do solo → reduz fluxo de oxigênio para o solo
• Ambiente aeróbico → anaeróbico• Favorecimento de metanogênicos em detrimento de
metanotróficos• Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
– Remoção da cobertura vegetal → maior incidência solar → dessecamento da superfície do solo
• Limitação de água na superfície, mas não no subsolo• Menor atividade de metanotróficos• Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
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![Page 22: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/22.jpg)
Ecologia MicrobianaEcologia Microbiana
Atividades
Humanas
Atividades Microbianas
Meio Ambiente
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PARTEPARTE II II
Diversidade Genética, Diversidade Genética, Estrutural e da Estrutural e da
Composição Química Composição Química de Lipídios em de Lipídios em
MicrorganismosMicrorganismos
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De Onde Vem a Capacidade De Onde Vem a Capacidade dos Microrganismos de dos Microrganismos de
Realizar Tantas Funções e Realizar Tantas Funções e de se Adaptar a Tantos de se Adaptar a Tantos Ambientes Distintos?Ambientes Distintos?
![Page 25: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/25.jpg)
Diversidade GenéticaDiversidade Genética• “Alta diversidade de genes”
– Diversidade metabólica potencialpotencial determinada pelos genesgenes de cada espécie.
– Evolução cria novos genes a partir de outros existentes
– Acúmulo de genes diferentes do ancestral: nova sps.
• Taxonomia molecular baseada em similaridade nas seqüências de genes– Seqüências rRNA (Woese, 1990)– Três domínios muito distintos
• Bacteria• Archea• Eukarya
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Árvore da Vida (Woese, 1990)Árvore da Vida (Woese, 1990)
![Page 27: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/27.jpg)
Evolução, estruturas celulares Evolução, estruturas celulares e composições de e composições de macromoléculasmacromoléculas
• Além de gerar diversidade metabólica, a evolução genética resultou em diferenças marcantes em estruturas celularesestruturas celulares e composições de macromoléculascomposições de macromoléculas entre grupos taxonômicos de microganismos:
– Ex: parede celular e estrutura química dos lipídioslipídios
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Estruturas Celulares Estruturas Celulares Microbianas Ricas em LipídiosMicrobianas Ricas em Lipídios
MP*PC
(Peptidoglicano)
MP*PC
Peptidoglicano
Membrana Externa*
PC
(Fungos: Quitina)
(Algas: Celulose, glicoproteínas)
MP* MP*
Bactérias Gram +
Bactérias Gram -
Fungos e Algas
Protozoários
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Estruturas Celulares Estruturas Celulares Microbianas Ricas em Lipídios Microbianas Ricas em Lipídios
(cont.)(cont.)
MP*PC
(Pseudpeptidoglicano ou glicoproteínas ou proteínas ou
polissacarídeos)
Achaea
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BacteriaBacteriaLipídios
Principais nas Membranas
Ácidos Graxos
Bactérias G+
PL (MP)GL (MP)
PL: i15:0, a15:0, i16:0; i17:0, a17:0
Bactérias G- PL (MP, MExt) LPS (MExt.)
PL: 17:0cy, 19:0cy, 18:1ω7cLPS: 3-OH-FA
Actinomicetos
PL (MP) PL: 16:0 10Me, 17:0 10Me; 18:0 10Me
![Page 31: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/31.jpg)
BacteriaBacteriaLipídios
Principais nas Membranas
Ácidos Graxos
Bactérias G+
PL (MP)GL (MP)
PL: i15:0, a15:0, i16:0; i17:0, a17:0
Bactérias G- PL (MP, MExt) LPS (MExt.)
PL: 17:0cy, 19:0cy, 18:1ω7cLPS: 3-OH-FA
Actinomicetos
PL (MP) PL: 16:0 10Me, 17:0 10Me; 18:0 10Me
![Page 32: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/32.jpg)
ArchaeaArchaea
![Page 33: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/33.jpg)
EucaryaEucarya
Lipídios Principais nas Membranas
Ácidos graxos
Fungos PL (MP)Ergosterol (MP)
PL: 18:2ω6cNão se aplica
Eucariotos PL (MP)Esteróis (MP)
PL: 20:4ω6cNão se aplica
![Page 34: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/34.jpg)
PARTEPARTE III III
Lipídios como Lipídios como Ferramenta para Ferramenta para
Estudos de Ecologia Estudos de Ecologia MicrobianaMicrobiana
![Page 35: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/35.jpg)
Ecologia Microbiana Ecologia Microbiana Aspectos de InteresseAspectos de Interesse
• Biomassa microbiana
• Atividade microbiana
• Composição ou estrutura da comunidade
![Page 36: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/36.jpg)
Métodos para Investigação da Métodos para Investigação da Estrutura da Comunidade Estrutura da Comunidade
MicrobianaMicrobiana
• Dependentes de cultivo – Meios seletivos para organismos de
interesse– Plaqueamento da amostra em meio de
cultura sólido – Enumeração e identificação de
microrganismos
![Page 37: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/37.jpg)
Organismos CultiváveisOrganismos Cultiváveis
Bactéria
Fungos
Archaea
Actinomicetos
Protozoários,
Algas
![Page 38: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/38.jpg)
![Page 39: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/39.jpg)
Organismos Viáveis, Não-Organismos Viáveis, Não-CultiváveisCultiváveis
• Torsvik, V. et al. High Diversity in DNA of Soil Bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 56(3):782-787, 1990.
• Apenas 1 a 10% dos microrganismos na natureza são cultiváveis em laboratório;
• Embora não cultiváveis, esses organismos são ativos na natureza;
• Exemplos de impacto:
– Morris et al. (Nature, 2002): • SAR 11, ser vivo mais abundante do planeta, não-cultivável.
– Nitrificação:• Bactérias Nitrosomonas e Nitrobacter (Winogradsky, 1888)• Wuchter et al. (PNAS, 2006):
– Archaea (Crenarchaeota): 100-1000 x mais abundante que bactérias nos oceanos • Leininger et al. (Nature, 2006):
– Archaea (Crenarchaeota): ~3000x mais abundante que bactérias no solo
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Métodos de Investigação Métodos de Investigação da Comunidade da Comunidade
Microbiana Microbiana Independentes de Independentes de
CultivoCultivo
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Métodos Independentes de Métodos Independentes de CultivoCultivo
– DNA • taxons e funções mais específicos • Primers específicos para grupos taxonômicos microbianos
(rRNA) ou genes para enzimas relacionadas a uma determinada função (ex: bactérias nitrificantes = gene amo...)
– LipídiosLipídios • em geral, compara grandes grupos taxonômicos de
microrganismos • poucos marcadores para grupos funcionais específicos• em alguns casos, atividade de guilda com uma função
específica pode ser investigada em associação com técnicas isotópicas
• Marcador fenotípico
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Métodos Baseados em DNA Métodos Baseados em DNA (opcional)(opcional)
• Extração do DNA da amostra ambiental
• Amplificação de regiões específicas do DNA (PCR e primers específicos)– Taxonomia (rRNA) – Funções (genes específicos)
• Padrão de bandas em gel de eletroforese– DGGE– LH-PCR– T-RFLP ...
• Clonagem e seqüenciamento de fragmentos amplificados ou recuperados das bandas do gel
• Identificação microbiana utilizando-se ferramentas de comparação de similaridades entre seqüências obtidas com as disponíveis em bancos de dados de seqüências de DNA (NCBI)
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Métodos Baseados em LipídiosMétodos Baseados em Lipídios
• Princípio de avaliação da estrutura das comunidades microbianas:
– Diversidade Estrutural de Ácidos Graxos
– Associação entre estrutura e grupos microbianos (biomarcadores microbianos)
– Inferências sobre mudanças na estrutura da comunidade a partir de mudanças no perfil de ácidos graxos
![Page 44: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/44.jpg)
Diversidade Química de Ácidos Microbianos
Saturado (ex: 17:0)
Monoinsaturado (ex: 18:19c)
Poliinsaturado
Ramificado (iso, iX:0)
Ciclopropeno (ex: 19:0cy8c)
Ramificado (anteiso; aX:0)
ex: 18:26c
ex: 18:36c
![Page 45: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/45.jpg)
Nomenclatura dos Ácidos Nomenclatura dos Ácidos GraxosGraxos
• X:Y – X = no de carbonos da molécula– Y = no de insaturações (duplas ligações)Ex: 16:0 (ácido hexadecanóico)
– Se Y>0 (insaturados):• X:YZc, onde Z é a posição da primeira insaturação à partir do C
distal, e “c” indica a conformação “cis”, e t, a “trans”Ex: 16:15c; 18:17t; 18:26c
• iX:Y, aX:Y, X:Y 10-Me– Radical metil lateral na posição 2, 3 ou 10, a partir do C distalEx: i15:0; a15:0; i17:0; 18:0 10-Me
• X:Ycy Zc– cy representa presença de anel ciclopropenoEx: 19:0cy 8c
![Page 46: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/46.jpg)
Ácidos Graxos BiomarcadoresÁcidos Graxos Biomarcadores
• Grupos Taxonômicos
• Poucos de Grupos Funcionais Específicos
![Page 47: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/47.jpg)
BiomarcadoresBiomarcadoresTipo FAME Grupo Microbiano
Poliinsaturados 18:2ω6c Fungos
Poliinsaturado 20:5ω6c Fungos micorrízicos arbusculares
Poliinsaturado 20:4ω6c Protozoários, nematóides
Metil C ω10 16:0 10Me; 17:0 10Me; 18:0 10Me
Actinomicetos
Metil C ω10 16:0 10Me
Desulfobacter (redutoras do SO4
2-)Ciclopropil 17:0cy; 19:0cy
Bactéria Gram negativas
Iso/anteiso i15:0; a15:0; i16:0; i17:0, i17:0
Bactéria Gram positivas
Monoinsaturado 18:1ω7c Bactéria Gram negativas
Monoinsaturado 16:1ω5c (NLFA) Fungos micorrízicos arbusculares
Monoinsaturado 16:1ω5c (PLFA) FMA, Flavobacterium/Cytophaga
Monoinsaturado ω8c
16:1ω8c, 18:1ω8c Bactérias metanotróficas
Misto i17:1ω7c
Desulfovibrio (redutoras do SO4
2-)
![Page 48: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/48.jpg)
Ácidos Graxos em Diferentes Ácidos Graxos em Diferentes Classes de Lipídios ComplexosClasses de Lipídios Complexos• Ácidos graxos raramente ocorrem
livres em células
• Normalmente, eles integram lipídios estruturalmente mais complexos
• Diferentes tipos de ligações químicasligações químicas unem os ácidos graxos ao restante da molécula dos lipídios complexos
![Page 49: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/49.jpg)
Ligações Químicas dos Ácidos Ligações Químicas dos Ácidos GraxosGraxos
• Lipídios com ligações éster– ex: triacilgliceróis – R-COO•
• Lipídios com ligações éter– ex: plasmalógenos, Archaea
– R-CH2O•
• Lipídios com ligação amida – ex: esfingolipídios– R-CO • NH-R’
![Page 50: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/50.jpg)
Éster Metílico de Ácido Graxo Éster Metílico de Ácido Graxo ““Fatty Acid Methyl Fatty Acid Methyl
EsterEster””(FAME)(FAME)
COOH
COOCH3
Metanólise Alcalina Branda (PLFA e EL-FAME) ou
Saponificação – Metanólise Ácida (MIDI)
Ácido Graxo
FAME
Altamente volátil
R
![Page 51: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/51.jpg)
Saponificação/MetilaçãoSaponificação/Metilação• Duas etapas:
– Saponificação: Ácido graxo sabão– Metilação: substituição do Na por metil FAME
• Condições de reação:– Saponificação: altas temperaturas, 3,8 M NaOH em MeOH:H2O
(100oC, 30’)
– Metilação: presença de água, 6 M HCl:MeOH (85oC, 10’)
• Ligações-alvo: – Éster, éter, amina, ácidos graxos livres
• Altamente danosas à estrutura de alguns ácidos graxos:– ciclopropanos
![Page 52: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/52.jpg)
Metanólise Alcalina BrandaMetanólise Alcalina Branda
• Uma só etapa (transesterificação)– Separação de ácidos graxos das moléculas
complexas e esterificação com ·CH3
• Condições de reação: – 0,2M KOH em MeOH (37oC, 1h)– Ausência de água
• Ligações-alvo– Ésteres
![Page 53: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/53.jpg)
Principais Lipídios Principais Lipídios Complexos Contendo Complexos Contendo
Ácidos GraxosÁcidos Graxos
![Page 54: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/54.jpg)
FosfolipídiosFosfolipídios• Universal em membranas celulares,
proporções aproximadamente constantes por massa celular– Exceto em Archaea, ligações são principalmente ésteréster
• Rápida hidrólise do fosfato após morte Rápida hidrólise do fosfato após morte microbiana (Fosfolipídio -> Lipídio Neutro)microbiana (Fosfolipídio -> Lipídio Neutro)
• Microbiota viável
CH
CH2O
O C
H2C O C
O
O
P
O
O-
OR
![Page 55: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/55.jpg)
Lipídios NeutrosLipídios Neutros
CH
CH2HO
O C
H2C O C
O
O
• Presentes em:•Células mortas•Reserva em eucariotos
• Reservas de LN em procariotos são Reservas de LN em procariotos são rarasraras
![Page 56: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/56.jpg)
GlicolipídiosGlicolipídios
• EL-glicolipídios
CH
CH2O
O C
H2C O C
O
O
O
OH
H
H
HO
H
H
OHH
OH
![Page 57: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/57.jpg)
Reserva vs. Células Mortas em Reserva vs. Células Mortas em NLFANLFA
min14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
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FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230405.D)
13
.74
6
14
.54
5 1
4.6
23
15
.01
2
15
.17
5
15
.74
6 1
5.8
54
16
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0 16
.98
3
17
.21
3 1
7.3
06
17
.48
6
17
.69
7
18
.45
2 1
8.5
28
18
.67
3
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.89
8
19
.06
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62
19
.33
5
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.65
9
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.34
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.54
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min14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
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20
30
40
50
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FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230409.D)
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2
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0 1
7.0
88
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3
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.69
5
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.45
6
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.89
6
19
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7
19
.58
8
20
.57
5
20
.85
2 2
0.9
61
21
.05
6
21
.18
8
21
.40
8
22
.68
7
23
.14
5
15:0i 15:0a
16:0i
16:1ω7c 16:1ω
5c
16:0
16:0 10M
e 17:1i
17:0i17:0a
17:0 cy
16:1 2O
H
17:0 10M
e
18:0 10M
e
18:2ω6c
18:1ω9c 18:1ω
7c
18:0
19:0 cy
16:0ωO
H
16:0 D
CA
NLFA
PLFA
Pastagem (Corvallis, OR, EUA)
Agosto 2005
![Page 58: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/58.jpg)
Protocolos para Protocolos para Extração de FAMEs do Extração de FAMEs do
SoloSolo
![Page 59: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/59.jpg)
Principais Protocolos de Principais Protocolos de Extração de FAMEsExtração de FAMEs
• PLFA (Phospholipid Fatty Acids)– White e Ringelberg (1998)
• MIDI (Microbial Identification™)- Sasser (1990)
• EL-FAME (Ester-linked FAME)– Direto do solo (Schutter e Dick, 2000)– Extrato lipídico (Drjiber et al., 2000)
![Page 60: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/60.jpg)
Método: PLFA Método: PLFA
• Método mais utilizado (padrão)
• Mais caro e trabalhoso– Coluna de SPE-Si: ~R$ 10,00 (no Brasil) – 40-50 ml de clorofórmio, acetona e metanol
amostra-1
– 24 amostras em 2 dias
• Extrai apenas ácidos graxos esterificados em fosfolipídios
![Page 61: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/61.jpg)
Protocolo PLFAProtocolo PLFA
![Page 62: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/62.jpg)
• Bligh e Dyer (1959) modificado– Mistura monofásica metanol:clorofórmio:tampão
fosfato 50 mM (2:1:0,8)– Solo:clorofórmio (1:1, m/v)– Volumes de água e tampão fosfato 100 mM– Ex: 4 g solo úmido com 25% umidade (b.u.)
• 3 g solo seco + 1 g água• 6 ml de metanol, 3 ml de clorofórmio, 2,4 ml TF 50 mM• 2,4 ml TF 50 mM (combinação de água e TF 100 mM)• 1 ml água do solo + 0,2 ml água adicionada + 1,2 ml
TF 100 mM
Fase 1.Fase 1.Extração de Lipídios Totais do Extração de Lipídios Totais do
SoloSolo
![Page 63: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/63.jpg)
1.1. Solo e mistura de solventes em tubo de centrífuga com tampa com revestimento interno de teflon;
1.2. Agitar por 2 h, decantar “overnight”– Variações:
• sonicação (2 min)• tempo de agitação, omissão da decantação;
1.3. Ressuspender solo e centrifugar (10 min e 2000 x g);
1.4. Filtrar sobrenadante papel Whatman #1;
1.5. Adicionar metanol:clorofórmio ao solo remanescente no tubo e repetir passos 1.3 e 1.4 mais duas vezes;
![Page 64: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/64.jpg)
1.6. Partição do filtrado em duas fases: adicionar solução NaCl 2 M (solução:clorofórmio, 1:1);
1.7. Esperar até que a desaparecimento da turbidez na fase superior (aquosa);
1.8. Transferir a fase inferior (orgânica) para um tubo de ensaio e secá-la sob atmosfera de N2 ultra-puro, a 37oC. Armazenar a -20oC.
![Page 65: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/65.jpg)
![Page 66: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/66.jpg)
Fase 2. Fase 2. Fracionamento das Classes de Fracionamento das Classes de
Lipídios (Cromatografia de Lipídios (Cromatografia de Afinidade)Afinidade)
• Extração em fase sólida (ácido silícico)
• Partição de lipídios entre radicais silanóis ativos nos grânulos de ácido silícico e solventes de polaridade crescente (clorofórmio, acetona e metanol)
![Page 67: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/67.jpg)
![Page 68: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/68.jpg)
![Page 69: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/69.jpg)
2.1. Colocar coluna de ácido silícico (3 ml, 500 mg) em aparato de vácuo com tubo de ensaio diretamente abaixo da mesma;
2.2. Adicionar 2 ml de clorofórmio à coluna, sem deixar drenar;
2.3. Ressuspender extrato de lipídios em volume mínimo (100-200 μL) de clorofórmio e transferir para coluna de ácido silícico. Repetir 3 vezes para assegurar transferência quantitativa;
2.4. Acionar vácuo e adicionar 3 x 2 ml de clorofórmio, e coletar esses volumes no tubo de ensaio colocado abaixo;
2.5. Trocar tubo de ensaio por um novo, adicionar 3 x 2 ml de acetona, e coletar volumes no tubo de ensaio abaixo;
2.6. Trocar tubo de ensaio por um novo, adicionar 3 x 2 ml de metanol, e coletar volumes no tubo de ensaio abaixo;
2.7. Secar frações sob atmosfera de N2 ultrapuro , a 37oC, armazenar a -20oC.
![Page 70: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/70.jpg)
Clorofórmio Metanol
Acetona
Esquema do Fracionamento de Esquema do Fracionamento de LipídiosLipídios
Neutros
NLFA
Esteróis Glicolipídios
Poli-β-hidroxialcanoatos
Fosfolipídios
PLFAPLFA
![Page 71: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/71.jpg)
![Page 72: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/72.jpg)
Fase 3. Metanólise Alcalina Fase 3. Metanólise Alcalina para Produção dos FAMES de para Produção dos FAMES de
PL PL • Geração dos FAMEs a partir de fosfolipídios
esterificados;
• Remoção dos ácidos graxos do restante da molécula lipídica e substituição das ligações com glicerol por grupos metil > aumenta a volatilidade dos compostos
• Para PLFA, proceder reação apenas na fração contendo fosfolipídios;
• Nota:Nota: Dependendo do objetivo do estudo, a fração neutra e glicolipídica também poderão ser tratadas posteriormente para análise cromatográfica de compostos de interesse.
![Page 73: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/73.jpg)
3.1. Redissolver os lipídios fracionados secos em 1 ml de tolueno: metanol (1:1, v/v) e 1 ml de KOH metanólico (0,2 N);
3.2. Agitar tubo em vortex, rapidamente, e colocá-los em banho-maria a 37oC por 15 min.;
3.3. Após amostras esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 2 ml de hexano:clorofórmio (4:1, v/v), e misturar amostra;
3.4. Neutralize pH (6 a 7) da mistura com adição de 0,2 ml de ácido acético 1N. Verificar pH final em papel de tornassol;
3.5. Adicione 2 ml de água destilada para separar fases e misture amostra em vortex por 30 s. Esperar separação de fases se completar (~10-15 min.);
3.6. Transferir fase orgânica (superior) para um tubo de ensaio novo,
3.7. Reextrair fase inferior: adicionar 2 ml de clorofórmio:hexano (4:1 v/v), agitar em vortex 30 s., esperar separação de fases, transferir para tubo novo (repetir 2x)
3.8. Evaporar solvente sob N2 ultrapuro, a 37oC; armazenar a -20oC, sob N2.
![Page 74: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/74.jpg)
PLFA (Esquema Geral)PLFA (Esquema Geral)
3 g solo + CHCl3:CH3OH:tampão
(1:2:0,8)
transferir para coluna SPE-silica
FAMEs em hexano, em frasco GC
2 h, agitar 100 rpm
Filtrar (Whatman 1), repetir 2x após adicionar CHCl3 e CH3OH ao solo remanescente, vortex e
centrifugação
adição de NaCl 2M
Fase orgânica (inferior) contém lipídios totais
partição de fases
tranferir fase orgânica
extrato lipídico
secar sob N2
40oC
extrato lipídico seco
centrifugar 500 x g
Eluir c/ CHCl3, acetona e CH3OH
Lipídios Neutros
ClorofórmioAcetona
Metanol
Glicolipídios Fosfolipídios
secar sob N2, 40oC
Transesterificação (geração de FAMEs)
KOH (0,2 N) em metanol, 40oC
CG-FID
ressuspender em 3 x 200 ul CHCl3
Descartar Perfil de FAMEs
Partição com água, recuperar FAMEs (fase superior) em hexano, secar sob
N2, resuspender em hexano
![Page 75: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/75.jpg)
Fase 4. Preparo de Amostras, Fase 4. Preparo de Amostras, Separação em CG, Quantificação e Separação em CG, Quantificação e
Identificação de CompostosIdentificação de Compostos4.1. PLFA secos são ressuspensos em hexano, agitados em vortex, e transferidos
para frasco GC com “insert” de 200 μL;
4.2. Injeção em CG-FID, equipado com coluna não-polar (ex: 5% diphenyl, 95% methylpolysiloxane fase estacionária; ex: Ultra-2, DB-5, HP-5), com 25 m, 0,2 mm diam. int.; 0,33m espessura filme); rampa de temperatura: 170-280oC a 4oC min-1; mais 5 min. a 280oC para limpeza da coluna.
4.3. Curva-padrão: FAME 13:0 (“methyl tridecanoic acid”): relação entre área de pico cromatográfico e quantidades conhecidas do FAME.
Alternativamente: adição de padrão interno: usualmente FAME 19:0.Resultados em mol de FAMEs individuais por g de solo (pmol FAME g-1 solo seco).
4.4. Misturas padrões de FAMEs microbianos (BAME e FAME-37): comparar TR com amostras
4.5. ECL vs. TR (Biblioteca de ECLs. Ex: MIDI)- Relação linear entre TR e número de C de série homóloga de ácidos graxos saturados de cadeia linear
4.5. CG-EM (confirmação de compostos): importante, mas, em geral, não realizada.
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Curva Padrão Curva Padrão Tridecanoato de Metila (FAME Tridecanoato de Metila (FAME
13:0)13:0)
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FID1 A, (F:\PLFA-F~3\11210213.D)
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2.02
9
4.88
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9.41
5 12.41
1
0 pmol ml-1
60 pmol ml-1
151 pmol ml-1
605 pmol ml-1
302 pmol ml-1
1210 pmol ml-1
y = 0.5935x + 2.3384
R2 = 0.9996
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 500 1000 1500
FAME 13:0 (pmol ml-1)
Áre
a (C
G)
pmol FAME 13:0 ml-1 Área CG
0 0
60 35.9
151 87.6
302 187.6
605 368.5
1210 716
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BrancosBrancos- Verificar contaminações das amostras durante procedimento de extração- Todo o procedimento é realizado de modo idêntico às amostras, porém sem solo
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14.
545
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15.
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15.
175
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15.
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600
16.
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17.
213
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17.
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18.
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18.
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18.
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20.
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20.
630 20.
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FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230413.D)
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980 1
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FID1 A, (G:\PLFA20~1\MARCEL~1\11230416.D)
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PLFA Br
PLFA
NLFA Br
NLFA
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Efeito do Desmatamento sobre a Efeito do Desmatamento sobre a Estrutura da Comunidade Estrutura da Comunidade
MicrobianaMicrobiana
![Page 80: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/80.jpg)
Floresta Adulta (>150 a) vs. Floresta Recem-Cortada (10 a)
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0
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20.
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20.
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505
~ 10 anos
>150 anos
16:0
com
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![Page 81: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/81.jpg)
Método: MIDIMétodo: MIDI• Adaptado de método comercial para identificação de bactérias
em cultura pura, de acordo com perfil de lipídios celulares totais
• Mais rápido (?) e barato que PLFA
• Requer menor quantidades de solo (??)
• Mais perigoso (base e ácido concentrados, alta temperatura)
• Extração diretaExtração direta, sob condições extremas de pH e temperatura (saponificação/metilação ácida)
• Extrai FAMEs de potencialmente todos os lipídios celulares (éster, éter, amida...) e não-celulares (reserva, células mortas, fontes não-microbianas, matéria orgânica do solo...), incluindo ácidos graxos livres
• Forte potencial de alterar a estrutura química de muitos ácidos graxos, especialmente os com aneis ciclopropeno e os insaturados
![Page 82: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/82.jpg)
Protocolo MIDIProtocolo MIDI
![Page 83: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/83.jpg)
SaponificaçãoSaponificação
• Pesar 3 g de solo em tubo de de vidro (20 ml) com tampa de rosca revestida com Teflon;
• Adicionar 3 ml de solução de NaOH (3,8N) em água:metanol (1:1 v/v);
• Agitar em vortex e ferver por 30 min.
• Produto: sais de sódio de cadeia longa (sabão)
![Page 84: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/84.jpg)
Metilação ÁcidaMetilação Ácida
• Adicionar 6 ml de mistura HCl (6M):metanol (1:0,85 v/v);
• Aquecer em banho-maria 85oC, 10 min.
• Produto: FAMEs
![Page 85: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/85.jpg)
Recuperação dos FAMEsRecuperação dos FAMEs
• Adicionar 3 ml de hexano (partição de fases);
• Transferir todo conteúdo do frasco para para tubos de centrífuga de 35 ml, com rosca revestida por Teflon;
• Centrifugar a 480 x g por 10 min. para separar MOS da fase orgânica;
• Transferir fase orgânica (superior) para tubos de 13 x 100 mm com tampa revestida de Teflon;
![Page 86: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/86.jpg)
Lavagem da Fase OrgânicaLavagem da Fase Orgânica
• Adicionar 3 ml de base fraca (0,3 M NaOH) para lavar residual de reagentes ácidos
• Agitar tubo lentamente por 5 min
• Transferência da fase superior para tubos CG (2ml)
![Page 87: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/87.jpg)
Análise cromatográfica, Análise cromatográfica, quantificação e identificação quantificação e identificação
dos compostosdos compostos
• Idem PLFA
![Page 88: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/88.jpg)
Método: EL-FAMEMétodo: EL-FAME
• Mais rápido (!), fácil (!) e barato que PLFA
• Extrai ácidos graxos esterificadosesterificados em diversas classes de lipídios (neutros, glicolipídios e fosfolipídios)
• Contribuição de lípídios de reserva e de células mortas (LN), além de glicolipídios esterificados, para o perfil de FAMEs
• Duas variações de extração: – direta do solo (Schutter e Dick, 2000);– a partir do extrato de lipídios totais (Drijber et al., 2000).
![Page 89: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/89.jpg)
Protocolo EL-FAMEProtocolo EL-FAME
![Page 90: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/90.jpg)
Metanólise Alcalina BrandaMetanólise Alcalina Branda
• Pesar 3 g de solo em tubo centrífuga de 35 ml com tampa revestida de Teflon;
• Adicionar 15 ml de KOH (0,2 N) em metanol;
• Agitar em vortex e incubar a 37oC por 1 h (transesterificação, idêntica à do PLFA)
• Agitar tubos em vortex a cada 10 min. durante o tempo de incubação.
• Adicionar 3 ml de ácido acético 1,0 M para neutralizar pH do conteúdo do frasco
![Page 91: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/91.jpg)
Recuperação dos FAMEsRecuperação dos FAMEs
• Partir fases adicionando 10 ml de hexano;
• Centrifugar a 480 x g, 10 min.;
• Transferir fase orgânica para tubo de ensaio e secar sob N2 ultrapuro;
• Ressuspender extrato seco em 3 x ~70 µL de hexano, agitando em vortex após cada adição do solvente, e transferir para frasco CG, com insert de 200 µL.
![Page 92: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/92.jpg)
Análise cromatográfica, Análise cromatográfica, quantificação e identificação quantificação e identificação
dos compostosdos compostos
• Idem PLFA
![Page 93: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/93.jpg)
Comparação entre MétodosComparação entre Métodos
EL-EL-FAMEFAME PLFAPLFA
MIDIMIDI
AG Éster Fosfolipídios
AG Éster
AG Totais
![Page 94: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/94.jpg)
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19.
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19.
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037
20.
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20.
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345
21.
445
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21.
930
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19.
538
19.
606
19.
710
19.
828
19.
963
20.
034
20.
722
21.
000
21.
236
21.
341
21.
439
21.
681
21.
788
21.
888
22.
183
22.
247 22.
417
22.
591
22.
698
22.
813
22.
989
23.
140
23.
251
23.
345
PLFA
EL-FAME
MIDI
Impacto da Escolha do Método de Impacto da Escolha do Método de Extração sobre os Perfis de Ácidos Extração sobre os Perfis de Ácidos
GraxosGraxos
![Page 95: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/95.jpg)
Efeito da Escolha do Efeito da Escolha do Protocolo de Extração Protocolo de Extração
sobre a Interpretação de sobre a Interpretação de Resultados de Estrutura da Resultados de Estrutura da
Comunidade MicrobianaComunidade Microbiana
![Page 96: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/96.jpg)
Amostras de SoloAmostras de Solo • 29 amostras de solo através do Estado do
Oregon, EUA (0-10 cm depth)
• Ecossistemas diversos– Sem vegetação na data de amostragem– Herbáceas (culturas anuais, pastagens e pomares)– Florestas (gimnospermas com >150a; clareiras de
10 a; mistas)
• Ampla faixa de propriedades do solo– COT, MOP, MO-nP, pH, textura
• Amostras de solo peneiradas (< 2mm)
• Extração de FAMEs pelos 3 métodos
![Page 97: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/97.jpg)
Análise de FAMEsAnálise de FAMEs
• Cromatografia gasosa
• Identificação inicial por comparação dos TR entre amostras e padrões de FAMEs microbianos
• Confirmação de compostos abundantes por EMEM
• Dados de composição de AG analisados em mol%mol%
![Page 98: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/98.jpg)
Mol%
![Page 99: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/99.jpg)
MIDI versus PLFAMIDI versus PLFA
• Análise estatística: ordenação multivariada NMS– Distância de Sorensen
– PC-ORD 4, modo autopiloto “lento e abrangente”
– Correlações com variáveis de solo e caracterização da mudanças no perfil de FAMEs utilizando coeficiente de Pearson (“joint plots”)
![Page 100: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/100.jpg)
MIDI versus PLFA - ResultadosMIDI versus PLFA - Resultados
• CG-MS: alguns biomarcadores de substâncias vegetais (cutina, suberina, e ceras) presentes em grandes quantidades no extrato de MIDI, mas não em PLFA
![Page 101: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/101.jpg)
16:0 16OH
14:0 14OH
12:0 12OH
16:0 alcohol
16:0 DCA
CG-EM
CG = 19cy:0 10c
CG = 17:17c
suberina, cutina, ceras
cutina, ceras
cutina, ceras
suberina
suberina, cutina, ceras
Compostos Vegetais
![Page 102: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/102.jpg)
Compostos de Planta Compostos de Planta MIDI vs. PLFAMIDI vs. PLFA
mol% FAMEs MIDI PLFA
16:0 Alcohol 1.62 0.00 16:0 16OH 6.70 0.29 16:0 DCA 2.87 0.06 14:0 14OH 6.61 0.00 12:0 12OH 1.69 0.00
![Page 103: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/103.jpg)
FAMEs FAMEs MIDI vs. PLFAMIDI vs. PLFA
mol% FAMEs MIDI PLFA
17:0cy 0.75 3.51 19:0cy 0.41 5.40 18:1ω7c 2.14 9.80 17:0i 0.53 1.67 17:0a 0.67 1.90 16:0 10Me 1.14 4.66 17:0 10Me 0.34 1.05 18:0 10Me 0.53 2.03
![Page 104: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/104.jpg)
Non-metric Multidimensional Scaling
mol% of FAMEs PLFA
MIDI
Forest
Forest
Correlation Axis 1MIDI vs. Axis 1PLFA: r = 0.87
Correlation Axis 2MIDI vs. Axis 2PLFA: r = 0.28
MIDI
![Page 105: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/105.jpg)
EL-FAME versus PLFAEL-FAME versus PLFA
• Mesmo método de produção de FAMEs (metanólise alcalina branda)
• Diferentes reservatórios de lipídios alvos de produção de FAMEs
PLFA vs. PLFA + NLFA + GLFA
![Page 106: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/106.jpg)
EL-FAME versus PLFAEL-FAME versus PLFA
Objetivo:
Avaliar a interferência de NL e GL no que se refere à comparação da interpretação de dados de comunidade microbiana entre o EL-FAME e o PLFA (padrão)
Amostras de solo:
Idem estudo de comparação entre PLFA vs. MIDI
Análises estatísticas:
Modelos de regrassão múltipla (stepwise)
Ordenação das amostras com base na relação entre EL/PL com respeito às concentrações molares dos FAMEs (mol%) nos respectivos extratos
![Page 107: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/107.jpg)
Organic C Vegetation Interactions
FAMEs Intercept EL POM nPOM pH Herb Forest EL vs.
pH EL vs. Forest
EL vs. Herb
POM-C vs. Forest R2
FUNGI 534*** 10.0*** 11.6*** 6.6*** 0.45*** 0.14*** 0.92 GP 2335*** 4.1*** 14.5*** 1.09*** 3.4*** 0.07*** 0.92 GN 1806*** 2.5*** 19.3*** 1.10*** 4.0*** 0.07*** 0.91 ACT 1049*** 3.1*** 14.8*** 3.9*** 0.08*** 0.91 AMF 299*** 0.4ns* 19.8*** 1.0ns 1.6*s* 6.5*** 1.68** 0.44** 0.05*** 0.90 EUK 90*** 7.4*** 4.3*** 2.0*** 4.6*** 0.27*** 0.93 16:0 1817*** 7.9*** 12.5*** 4.1*** 0.10*** 0.95 18:0 353*** 7.1*** 11.4*** 3.9*** 0.10*** 0.94 16:1ω7c 932*** 5.5*** 20.0*** 1.2ns* 4.0*** 0.57** 0.63** 0.06*** 0.92 18:1ω9c 1208*** 8.2*** 18.1*** 3.7*** 0.07*** 0.94 Total 14485*** 4.8*** 17.2*** 4.0*** 0.07*** 0.93
Multiplicative changes (exp ß) on FAME amount (pmol g-1 soil)
Stepwise Multiple Regression (Backward Selection)
FAME ~ (method of extraction, vegetation, POM, nPOM, pH)
controls( PLFA , no veg )
TOTAL FAME (EL) = 14485 * 4.8(EL=1) * 17.2POM * 4.0Forest * 0.07(POM*Forest)
TOTAL FAME (PL) = 14485 * 4.8(EL=0) * 17.2POM * 4.0Forest * 0.07(POM*Forest)
4.8
1.0
TOTAL FAME (EL/PL) = 4.8
![Page 108: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/108.jpg)
Lipid
Source Interactions NL vs.
Lipid Source Interactions GL vs.
FAMEs NL Forest Herb Model R2 GL Forest Herb Model R2
Fungi 2.27*** 0.56* 0.83 0.28*** 0.84
GP 0.31*** 0.82 0.23*** 0.89
GN 0.19*** 0.86 0.09*** 0.94
Act 0.17*** 0.90 0.19*** 0.92
AMF 8.65*** 0.32** 0.71 0.31*** 0.46*** 0.81
Euk 1.95*** 0.80 0.00
16:0 1.52*** 0.65 0.65*** 0.84
18:0 0.78ns 0.76 0.69*** 0.81
16.1ω7c 2.95*** 0.45* 0.31** 0.59 0.19*** 0.63*** 0.90
18.1ω9c 2.19*** 0.75 0.34*** 0.86
Total 1.02 ns 0.70 0.32*** 0.89
Multiplicative changes (exp ß) on FAME amount (pmol g-1 soil) associated with lipid sources (neutral lipids vs. phospholipids; and glycolipids vs. phospholipids
Stepwise Multiple Regression (Backward Selection)
FAME ~ (lipid source, vegetation, POM, nPOM, pH)
Vegetation: non-vegetation at sampling (control), herbaceous, and forest
Lipid source: PLFA (control), NLFA or GLFA
![Page 109: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/109.jpg)
NMS with EL-FAME:PLFA mol% ratios
EL-FAME (mol%)
15:0i 18:26c
… 20:46c
CO 0.05 0.26 0.20
PMa 0.09 0.21 0.23
…
OGc 0.01 0.34 0.12
PLFA (mol%) 15:0i 18:26c
… 20:46c
CO 0.12 0.15 0.11
PMa 0.16 0.12 0.16
…
OGc 0.06 0.22 0.22
ELFA/PLFA 15:0i 18:26c
… 20:46c
CO 0.41 1.73 1.82
PMa 0.56 1.75 1.44
…
OGc 0.17 1.53 0.55
No vegetation
Herbaceous
Forest
![Page 110: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/110.jpg)
Outros Lipídios ImportantesOutros Lipídios Importantes
• Ergosterol (esterol): – exclusivo de fungos (biomassa de
fungos)– altamente correlacionado com PLFA
18:26c
• Poli-hidroxialcanoatos (PHAs)– reservas em bactérias– em SPE-Si é eluído com acetona
![Page 111: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/111.jpg)
Outros Usos dos Métodos Outros Usos dos Métodos Baseados em Lipídios na Baseados em Lipídios na
Investigação da MicrobiotaInvestigação da Microbiota
• Diversidade e estrutura da comunidade microbiana
• Biomassa microbiana – Total– Grupos microbianos específicos
• Estado nutricional de fungos do solo• Respostas de bactérias a estresses
ambientais
![Page 112: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/112.jpg)
Biomassa Microbiana ViávelBiomassa Microbiana ViávelMétodo 1. Soma dos PLFAs
BM total: soma de todos os PLFAs3,0 x 104 células/pmol PLFA (bactéria)1,2 x 104 células/pmol PLFA (algas)
BM grupo-específica: soma de PLFAs do grupoDados quantitativos obtidos na análise de PLFA
Método 2. Quantificação do P na fase orgânicaPrincípio: P na fase orgânica do extrato é derivado de fosfolipídios.Vantagem: simples, dispensa CG
![Page 113: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/113.jpg)
Efeito da Substituição de Floresta Efeito da Substituição de Floresta por Agricultura (Trigo ~26 anos) por Agricultura (Trigo ~26 anos)
sobre a BMsobre a BM
![Page 114: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/114.jpg)
Método BM 1 (Soma dos PLFAs) Método BM 1 (Soma dos PLFAs) Floresta vs. Agricultura (Trigo ~26 Floresta vs. Agricultura (Trigo ~26
anos)anos)
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10180305.D)
14.
820
14.
874
14.
946
15.
111
15.
345
15.
510
15.
625
16.
077
16.
187
16.
935
17.
325
17.
540
17.
654
17.
733
17.
833
18.
045
18.
134
18.
417
18.
486 1
8.80
3 1
8.87
3 1
8.94
2 1
9.02
2
19.
245
19.
409
19.
515
19.
686
19.
830
19.
934
20.
004
20.
122
20.
266
20.
693
20.
805
20.
916
20.
989
21.
098
21.
220
21.
324
21.
424
21.
532 21.
592
21.
761
21.
896
22.
172
22.
291
22.
345
22.
460
22.
521
22.
581
22.
861
23.
058
23.
136
23.
251
23.
321
23.
513
min15 16 17 18 19 20 21 22 23
pA
20
30
40
50
60
FID1 A, (F:\PLFA-F~3\10180306.D)
14.
952 1
5.34
3 1
5.51
1
16.
080
16.
188
16.
943 17.
325
17.
562 1
7.65
3
17.
832
18.
038
18.
134
18.
802
18.
875
18.
935
19.
020
19.
243
19.
410
19.
513
19.
686
19.
935
20.
006
20.
694
20.
808
20.
985 21.
210 21.
316
21.
415
21.
532
21.
593
21.
761
21.
896
22.
460
22.
523
23.
257
23.
318
23.
570
Floresta
Agricultura
![Page 115: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/115.jpg)
Método BM 2. Quantificação do Método BM 2. Quantificação do P na Fase Orgânica do Extrato P na Fase Orgânica do Extrato
de Solode Solo• Protocolo: White et al. (1979) (resumo)1. Extração de lipídios totais, por 2 h (Bligh e Dyer, 1959);2. Partição com NaCl 2 N;3. Recuperação da fase orgânica (inferior);4. Secagem sob N2 ultrapuro;
5. Digestão com ácido perclórico, 180oC (3-4h);6. Adicionar solução molibdênio (White et al., 1979);7. Após 10 min, adicionar solução de ANSA (1-amino-2-
naftol-4-ácido sulfônico);8. Ferver por 10 min. em banho-maria;9. Ler absorvância a 830 nm.
![Page 116: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/116.jpg)
Comparação com Outros Comparação com Outros Métodos de Deteminação da Métodos de Deteminação da
BMBM(Frostegard et al., 1991)
• P-lipídio vs. SIR (respiração induzida por substrato)
SIR (g CO2/g solo) = 17,6 + 0,13 P-lipídio (nmol P/g solo)
R2 = 0,86
• P-lipídio vs. conteúdo celular de ATP
ATP (g ATP/g solo) = 0,92 + 0,0046 P-lipídio (nmol P/g solo)R2 = 0,89
![Page 117: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/117.jpg)
• Bååth, 2003– Princípio: sob excesso de C e deficiência de N
ou P, a comunidade fúngica não cresce, mas acumula lipídios.
– Experimento e Resultados:
• Glucose apenas: NL aumenta e PL permanece constante
• Glucose + N + P: NL constante e PL aumenta
– Bååth, E. Microbial Ecology, 45:373-383, 2003
Estado Nutricional de Fungos Estado Nutricional de Fungos do Solodo Solo
![Page 118: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/118.jpg)
Protocolo:Protocolo: Estado Nutricional de Fungos Estado Nutricional de Fungos
do Solodo Solo• Bååth et al., 2003 • Idem procedimento para estrutura da
comunidade, exceto:– Não descartar a fração LN– Fração de LN e PL são transesterificada– Relação NL:PL do FAME 18:26c (fungo)– Quanto maior a relação NL:PL maior é a
deficiência nutricional (N ou P) da comunidade fúngica
![Page 119: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/119.jpg)
Respostas de Bactérias a Respostas de Bactérias a Estresses AmbientaisEstresses Ambientais
• Sob estresses (dessecamento do meio e restrição nutricional)
– Aumento da relação entre FAMEs cíclicos e precursores
• 19:0cy / 18:17c ou 17:0cy /16:17c – Kieft et al., 1994, AEM, 60:3292-3299, 1994
– Custo de manutenção para mitigar estresse: aumenta gasto de energia, menor eficiência de conversão de carbono em biomassa microbiana: impacto na conservação de MOS.
![Page 120: Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814634550346895db34283/html5/thumbnails/120.jpg)
Experimento (Fernandes, 2007) • Incubação por 425 d, microcosmos, solo de Tabuleiros Costeiros, SE
(Argissolo amarelo)
• 3 resíduos x 2 N x 7 datas, 4 repetições– Resíduos: controle, palha de milho, casca de coco– Doses N: equivalente 15 e 150 kg N ha-1
– Datas: 12, 33, 54, 112, 212, 350 e 425 dias– 130 aos 280 d sob seca (-1,5 MPa)
• Variável resposta: 19:0cy/18:17c
• Estatística: Regressão múltipla – stepwise, forward– Modelo inicial: grande média– Modelo cheio: todas as interações entre todos os fatores– F para incluir termos no modelo < 4,0
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Regressão Múltipla (stepwise forward)
• Call: lm(formula = ST ~ MILHO + TIME + UMIDO + TIME:MILHO, data = STRESS.19.INCUB, na.action = na.exclude)
• Residuals:• Min 1Q Median 3Q Max • -0.4682 -0.1053 -0.006328 0.111 0.6178
• Coefficients:• Value Std. Error t value Pr(>|t|) • (Intercept) 1.91311.9131 0.0448 42.7342 0.00000.0000• MILHO -0.6297-0.6297 0.0451 -13.9688 0.00000.0000• TIME 0.00230.0023 0.0001 20.2161 0.00000.0000• UMIDO -0.3261-0.3261 0.0404 -8.0648 0.00000.0000• TIME:MILHO -0.0011-0.0011 0.0002 -5.6939 0.00000.0000
• Residual standard error: 0.1823 on 163 degrees of freedom• Multiple R-Squared: 0.89080.8908 • F-statistic: 332.3 on 4 and 163 df, the p-value is 0
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19:0cy/18:7c = f(resíduo, t, umidade, N)
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
0 100 200 300 400 500
Dias de Incubação
19:0
cy
/ 18:
1w7c
SECA
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• FIM