cromatografia liquida de alta presion

5/28/2018 Cromatografia Liquida de Alta Presion

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CROMATOGRAFIA

LIQUIDA DE ALTA

PRESION

Harold McNair - Benjamn Esquivel


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CROMATOGRAFA LQUIDADE ALTA PRESIN

Por

HaroldM.McNairyBenjamn EsquivelH.

DepartmentofChemistry

VirginiaPolytechnic InstituteandStateUniversity

Blackburg,Virginia

ESTADOSUNIDOS

ProgramaNacionaldeDesarrolloCientficoyTecnolgico

DepartamentodeAsuntosCientficos

SecretaraGeneraldela

OrganizacindelosEstadosAmericanos

Washinton, D.C.-1973


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C op y r ig h t 1 973b y

TheGeneral Secretariato f theOrganizat ionof AmericanStates

Washington, D.C.

Derechos Reservados, 1973

SecretaraGeneralde la

Organizacinde losEstadosAmericanos

Washington, D.C.

Esta m onog raf aha sido preparada parasu publicacin enel

Dep artamentodeA suntos C ien t fico sde la Secretara General

de laOrganizacinde los EstadosAme ricanos.

Ed itora: Eva V. Chesneau

AsesorTcn ic o : Dr. FranciscoCasas

DepartamentodeQumica

Facultad de Ciencias Fsicasy

Matemticas

Universidad deCh ile

Santiago,Chile


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A IbhSimEl programa de monograf as cientficas es ana accta de la vasta labor

de la Organizacin de Los Estados Americanos, a cargo del Departamento de Asuntos Cientficos de la Secretara General de dicha Organizacin,a cuyo financiamiento contribuye en forma importante el Programa Re-gional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico.

Concebido por los Jefes de Estado Americanos en su Reunin cele-brada en Punta del Este, Uruguay, en 19&7, y cristal izado en las del i-beraciones y mandatos de la Quinta Reunin deL Consejo InterarnericanoCultural, llevada a cabo en \laracay, Venezuela, en 1968, el ProgramaRegional de Desar ro llo Cientfico y Tecnolgico es La expresin de lasaspiraciones preconizadas por los Jefes de Estado Americanos en elsentido de poner la cienca y la tecnologa al servicio de los puebloslatinoamericanos.

Demostrando gran visin, dichos dignatarios reconocieron que laciencia y la tecnologa estn transformando la estructura econmica ysocial de muchas naciones y que, en esta hora, por ser instrumentoindispensable de progreso en America .Latina, necesitan un impulso sinprecedentes.

El Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico es un

complemento de los esfue rzos nacionales de los pases latinoamericanosy se orienta hacia La adopcin de medidas que permitan el fomento de lainvestigacin, la enseanza y la difusin de La ciencia y la tecnologala formacin y perfeccionamiento de personal cientfico; el intercambio de informaciones, y la transferencia y adaptacin a los pases latino-americanos del conocimiento y las tecnologas generadas en otras re -giones .

En e,l cumplimiento de estas premisas fundamentales, el programade monograf as representa una contribucin directa a la enseanza de lasciencias en niveles educativos que abarcan importantsimos sectores de

la pobiaciny, al mismo tiempo, propugna la difusin deJ saber cientfico.

La coleccin de monografas cientficas consta de cuatro seri es, enespaol y portugus, sobre temas de fsica, qumica, biologa y mate-mtica. Desde sus comienzos, estas obras se destinaron a profesoresy alumnos de ciencias de enseanza secundaria y de los primeros aosde la universitaria; de stos se tiene ya testimonio de su buena acogida.

Este prefacio brinda aj programa Regional de Desarrollo Cientficoy Tecnolgico de la Secretara General de la Organizacin de los EstadosAmericanos la ocasin de agradecer a los doctores Haro ld M. McNair

y Benjamn E squivel H. , autor es de esta monograf a, y a quienes tenganel inters y buena voluntad de contribuir a su divulgacin.

septiembre de 1973


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NDICE

Pgina

A los Lectores .......................... .............................................. iii

CAPIT ULO PRIMERO. IN TRODUCCIO N................................ 1

Desarrollo Histrico ...................................................... .. 2Cromatografa Lquida "C ls ica" y Cromatografa L -

quida de Alta Presin ........................................................ 2Cromatografa {le Gases y Cromatografa Lquida de

Alta Presin .................................................................... 1Mecanismos de Separacin de Diferentes Form as de

Cromatogra fa Lquida ................................................ 6

CAPIT ULO SEGUNDO. INSTRUM ENTAL ................ ........... 9

Fase Mvil..................................................................... .. , . 10Registradores........................................................................ 1KControles de Temperatura . ..................................... ........ 1Recolectores de Fracciones ............ . ............ .. 19Medicin de Flujos . . . . . . ................................................ 10

CA PT UL O TERCERO. COLUMNAS Y FASES ESTACIO-

NARIAS..................................................................................... 21

Caracter sticas Generales.................................................. 21Fases Estacionarias ............................................................ 22Lista de Proveedores y Fabricantes de Relleno para

Columna...................... .......................................................... 29

CAP TULO CUARTO. DETECTORES .................................... 31

Detector de ndice de Refraccin ...................................... 32Detector de Luz Ultravioleta.............................. ............... 34

CAP TUL O QUINTO. ANALISIS CUAL ITAT IVO Y C UAN -T IT A T IV O .............................................................................. 3 7

Anli sis Cual itat ivo .............................................................. 37Anlisis Cuantitat ivo............................................................ 40

CAPTULO SEXTO. APL ICACION ES ................ ...................... 47

AP NDICE. PROVEEDORES COMERCIALES DE EQUIPOY ACCESORIOS PARA CROM ATOGRA FA LQUIDA . .. 54

Bibliografa Recomendada 55


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1INTRODUCCIN

La cromatografa es una tcnica quepermite separar , ais lar c iden-tificar los componentes de una mezcla de compuestos qumicos. Lamuestra es distribuida entre dos fases, una estacionaria y otra mvil, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es select iva-mente retenido por la fase estacionaria

La separacin se lleva a efecto en una columna tubular rellena de unslido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase es ta-

cionaria propiamente dicha o como soporte de una fase estacionaria li-quida. Tambin se puede efectuar utilizando como fase estacionariapapel de filtro o un slido finamente dividido colocado en forma de capafina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromatografa sebasan en ios mismos principios fundamentales, y se conocen respecti-vamente como cromatografa en columna, en papel y de capa fina. Enesta monografa slo se. considerar la cromatografa en columna.

En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquidoo un gas, y segn el caso se denominan respectivamente" cromatografa lquida" y 'cromatog raf a de g a s e s 1. Esta fase mvtl fluye a travs delrelleno de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, queson selectivamente retenidos por la fase estacionaria. E l flujo de lafase mvi l se mantiene constante a travs de todo el proceso y de estamanera se logra que cada componente de la mezcla sea luido de la co-lumna como un compuesto puro, disuelto en la fase mvil, A esta tc-nica se le llama 1cromatografa de elucin '. De la combinacin de losdistintos tipos de fases estacionarias y mviles, se pueden obtener va -rios tipos de cromatograf a, segn se indica en la Tabla I.

Tabla I. Diversos Tipos de Cromatografa

Fase Mvil Fase Estacionaria Tipos de Cromatografa

LquidoSlido Cromatografa LquidoSlido

Lquido Cromatografa LquidoI.quido

GasSlido Cromatografa GasSlido

Lquido Cromatografa GasLquido

Otra forma de clas ifica r las diversas tcnicas cromatogrficas esde acuerdo con su mecanismo de separacin, y sta se ver ms ad e-lante.


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DESARROLLO HISTRICO

En 1905, Ramscy utiliz por primera vez tcnicas cromatogrficas para sepa rar mezclas de gases y vapores . Al ano siguiente, el botn i-co ruso Tswett emple la cromatograf a de elucin en un experimento que tena por objeto la separacin de la clo rof ila de extractos vegetales .En una columna de vidrio, rellena de carbonato de calcio , Introdujo elextracto vegetal disuelto en ter de petrleo; a continuacin agreg ms ter de petrleo y observ que. a medida que el ter pasaba a travs de la columna, se separaban bandas de diversos colores que correspondana los carotenos, las clorofilas y las xantofilas . De aqu el origen de lapalabra cromatografa que, literalmente, significa "color escrito"; hoy este mtodo se llama cromatografa lquidoslido.

La cromatografa permaneci ignorada durante machos anos hasta que, en 1930, el investigador sueco Tise'lius y sus colaboradores intro -

dujeron dos tcnicas di ferentes a la tcnica de elucin, que son el "an -lisi s frontal" y el "an lisi s por desplazamiento"; tcnicas que hoy enda han cado en desuso.

En I94J, Mart in y Syngc, en busca de una solucin a l problema dedeterminar cantidades muy pequeas de aminocidos, introdujeron la' cromatografa de re par to" , lo que les vali el premio Nobe l de Qumicaen 1952. Esta tcnica evolucion con rapidez, llegando a ser lo queahora se conoce como cromatografa en papel y una versin limitada decromatografa lquidolquido en columna.

En ! 95, Martin y James introdujeron la cromatograf a de gases ,la cual se ha convertido en unade las tcnicas analticas ms tiles parael anlis is de gases y compuestos orgnicos voltiles. Se calcula queactualmente hay unos 100 000 cromatgrafos de gases en todo el mundo.

A pesar de que el primer experimento sobre cromatografa fue unaforma de cromatografa lquida, no fue sino hasta 19&8 que se produjoun avance considerable en esta tcnica que por tantos aos haba per-manecido olvidada; este avance fue gradual y se debi a la introduccin de altas presiones de operacin y de sistemas de deteccin continua.

Actualmente, la cromatografa lquida es objeto de nuevas mejoras y cabe prever que en un futuro prximo su uso ser muy amplio.

CROMATOGRA FA LQUIDA "CLSIC A" V CROMATO GRAFA LQUI-DA DE ALTA PRESIN

. Durante muchos afros se practic la cromatografa lquida en unaforma que llamaremos "clsica1y que consiste bsicamente en lo si-guiente (F ig. 1}: en una columna de vidrio , cuyo dimet ro va ra entre

2 y JO cm, rellena de algn materi al, como slice , alumina, azcar, etc ., cuyas part culas son por lo genera l de un tamao cercano a los200 nm, se introduce la muestra disuelta en la fase mvil o disolvente, por medio de un cuentagotas o de una pipeta, y luego se ag rega el d isol-vente, con el cual se eluye la muestra a travs de la columna. Los ta -maos de la muest ra varan entre 0, 1 y I g o ms. El disolvente o fase


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Fi g. 1. Cr omat ogr af a l i qui da " cl si ca" .

3mvi l fluye a travs de la columna po r efecto de la graved ad, producin-

dose apenas una dbil presi n eje rcid a por el volumen de la fase mvilque se agr ega a la columna. E l disolvente se recole cta en la base de lacolumna en. fracc ion es de determinado volumen. Uno de los inconven ien-tes de esta tcnica es el la rgo tiempo de an lisi s req uer ido , que muchasveces puede se r de horas e incluso das; otra des ventaja es que el ma-ter ial de relleno se utiliza por lo gen era l una sola vez debido a queparte de la muestra usualmente se adsorbe en forma irreversible.

El problema principal de este tipo de cromatograffa liquida "clsi-ca" es la identificacin y cuantificacin de los componentes que eluyende la columna disueltos en la fase mvil. En genera l se usa alguna tc-

nica auxiliar, como, por ejemplo, espectrofotometrfa, anlisis qum i-co, o simplemente un reg istr o gravimtri co, para evaluar el contenido decada uno de los componentes de la mezc la en las fracciones reco lectadas.

JLa crom atogra ffa liquida de alta presin utiliza instru menta l muydistinto con ventajas signif icati vas (F ig . 2). En este mtodo se usancolumnas de dimetro muy reducido, por ejemplo 2 mm, rellenas dema teria les esp ecia les pulverulentos, cuyas partculas tienen vin tamaliode 3040 iim y, en ocasiones, hasta de 10 Um. Es te tipo de columna esmuy eficaz, pero ofrece una gran res istencia al flujo de la fase mvil,

o sea una gran cada de presin. Po r esta razn es necesar io emplea rsis tem as de bombeo de alta presin (hasta 400 atm* ) que hagan fluir lafase m vil a una velocidad razonable a travs de la columna. Lac an

* 1 atm = 14, 7 lbs/pu lg3.


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Fi fr. 2. Cr omat ogr af a l qui da de al t a pr esi n.

tidad de fase estacionaria dentro de la columna es pequea, por lo quese requiere que la muestra tambin sea pequea, entre 1 y 10 mg.

Si La presin de entrada a la columna no es muy elevada (100 atmo trenos), la muest ra se introduce en la cm ara de inyeccin medianteuna jer inga de alta presin; a presiones ms elevadas, se utilizan lasvlvulas de inyeccin.

Un detector, colocado a la sal ida de la columna, proporciona unreg istro continuo de la composicin del liquido que sale , lo que perm i-

te obtener un cromatograma similar a los obtenidos en cromatografa de gases y que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de )a muestra.

Otra ventaja de este mtodo es el escaso deter ioro de la columna apesar de su repetido uso, si bien en algunos casos es nec esa rio r ege -nerarla.

Las ventajas de la cromatograf a lquida de alta presi n hacen queactualmente esta tcnica est ganando popularidad. La figura 3 il us -tra la reso lucin de un gran nmero de compuestos, obtenida con un

instrumento de buena calidad.

CRO MAT OGRA FA DE CASES Y CROM ATOGR AFIA LQUIDA DE AL TA PRESIN

Hoy da la cromatograf a de gases es una tcnica ampliamente di -fundida y ms utilizada que la c romatogra fa lquida. Teniendo en cuenta


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M i TI U t O B

Fi g. 3. Separ aci n de un ext r acto de cl ul as de h gado de r atn medi an-

te cr omat ogr af a de i nt er cambi o i ni co y det ect or de l uz ul t r avi ol et a.( Procedenci a: C. G. Hor vath, B. A. Pr ei ss y S. R. Li psky, Anal . Chem., 39,12, 1U22, 1967. Der echos r eservados Anal yt i cal Chemi st r y. )

el nmero de personas familiarizadas con ella, creemos que es conve-niente compararla con la cromatografa lquida de alta presin.

Las caractersticas salientes de ambas tcnicas se hallan resumi-das en la Tab la II* En la cromatogra fa de gases es necesario que lamuestra se volatilice sin descomposicin a fin de que pueda ser arras-trada por el gas transportador. Se puede aumentar la volatil idad de la

muestra, incrementando la temperatura de trabajo; sin embargo, elmximo posible de temperatura es de aproximadamente 400 C. Por este motivo, slo los gases, y aproximadamente el 15%de los compues-tos orgnicos conocidos, pueden ser analizados por cromatografa dega s e s .

En contraste, la cromatogra fa liquida requiere que la muestra seasoluble en la fase mvil, y esto hace posible el anl isis de compuestosde muy alto peso molecular: orgnicos e inorgnicos , inicos o covaIcntes. Claro est que es necesario encontrar la fase estacionaria ade-

cuada que separe selectivamente los componentes de lamuest ra j lo cualen teora siempre es posible, pero en la prctica puede result ar difcil.

Los mtodos utilizados en cromatografa de gases son ms rpidosv sens ibles, el instrumental ms sencillo y en general menos costoso.La cromatografa lquida ni es tan sensible ni tan rpida, pero su es-pectro de aplicacin es ms amplio si bien el instrumental es conside


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Tabla II, Ca rac ter st ica s de la Cro mato gra fa de Gases y de laCromatografa Lquida de Alta Presin

Muestras Cromatografa Cromatografa

de Gases Lquida de Alta Pres in

Requerimientos de la muestra

Voltil Soluble

Tipos de muestra Gases y 15% de loscompuestos orgni-cos; hasta un pesomolecular de 500

Molculas orgnicas e ino r-gnicas de peso molecular intermedio y alto

Cantidad Mnima

detectable

HT 10"ls g 1O6 1O*9 g

Tiempo deanlisis

Minutos Minutos horas

Resolucin 1000 platos teri-cos por metro deco lumna

5000 platos terico s por m e-tro de columna

Costo S$ 500 8000 US$ 2000 25 000

rablemente ms costoso. No obstante, es posib le pre ve r que, con for-me aumente el volumen de las ventas, se reduci rn los costos. Cabeahora hace rse la siguiente pregunta: Existe realmente competenciaentre la cromatografa de gases y la cromatografa lquida de alta pre-sin? La respuesta es no, puesto que ambas tcnicas se complementan.

MECANISMOS DE SEPAR ACION DE DIFEREN TES FORMAS DE CR O-MATOGRAFIA L QUIDA

Hay cuatro mtodos o form as de rea liza r crom atografa lquida, c a-da uno basado en diferentes mecanismos de separacin de los compo-nentes de la muestra . Mediante un cambio de columnas es pos ible utilizar cada uno de ellos.

Cromatografa LquidoLquido

El mecan ismo de separacin en crom atogra fa lquidolquido, omecanismo de distribucin Como tambin se llama, se ba sa en la di s-tinta solubi lidad que presenta una mol cula de la muest ra en la fase m-vil y en la fase estacionar ia. De ah que los compuestos ms solublesen la fase es taciona ria sean selectivamente retenidos por ella en tanto

que los menos solubles son transportados ms rpidamente por la fase mvil.

La cromatografa lquidolquido se utiliza para compuestos mode-radamente polar es, cuyo peso mo lecula r es infe rior a 1500. La s colum-nas comnmente utilizadas son de I a 2 m de longitud y de 2 a 3 rara de


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dimetro interno; la cada ce pres in es de aproximadamente 41 atmpor metro de columna a ] ml/min de flujo.

El mayor inconveniente de esta tcnica os la solubilidad de la faseestacionaria en la fase mvil y el deterioro de la columna. Una fo rma dere so lver lo es saturando la fase mvil con la fase estacionaria por mediode unapreoolomaa que contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. Otra forma es utilizando materiales que contengan la fase estacionaria qumicamente unida a un soporte, a modo de mater ial de relleno de lacolumna; esto evita la prd ida de fase estacionar ia y hace innecesario el uso de precolumnas para saturar la fase mvil.

Po r otra parte, la cromatografa lquidolquido requiere un controlcuidadoso del flujo y de la temperatura para poder identificar un co m-puesto determinado en funcin del tiempo de elucin* que es caracters-tico, en las condiciones de flujo y temperatura utilizadas, det comp ues-

to determinado.

Cromatografa LquidoSlido

El mecanismo de separacin de la crom atografa lqu idosl ido, ode adsorcin , se ba sa en la competencia que existe entre las molcu las de la muestra y las de la fase mvil o disolvente por ocupar los sitios ac -tivos en la superf ici e de un slido . Algunos de los slidos utilizadoscon ms frecuencia son almina y gel de slice.

Este tipo de cromato gra fa es el m s til y se aplica a molculas depola ridad baja o alta, cuyo peso mo lecu lar sea inferi or a 1000, Las co-lumnas utilizadas varan entre 0 em y 2 m de longitud y entre 2 y 3 mm de dimetro interno; la cada de pres in es de aproximadamente 41 atmpor metro de columna a I ml/min de flujo.

En muchas ocas iones , debido a una fuerte adsorcin o retencin delos componentes de la muest ra en el slido activo, es necesario aumen-tar la polar idad de la fase mv il en forma constante y uniforme, con locual se log ra un incremento de solubil idad en los componentes de lamu estra en la fase mv il. A esta var iante se le denomina elucin porgradiente o pro gram aci n de la fase mvil. Am enos que se utilicen re -llenos de columna que contengan la fase estacionaria qumicamente uni-da a un soporte slido es muy dif cil en cromatogra fa lquidolquido efectuar una program acin de la fase mvil debido al prob lema de lasolubilidad de la fase estacionaria en la fase mvil.

Cromatografa Lquida por Exclusin

Este tipo de croma tog raf a, conocido tambin como crom atogra fa de permeacin o croma tog raf a de filtracin , efecta la separacin de

acuerdo con el tamafio de las molculas.

La columna se re llena de un gel, cuyos poros son de tamaio simila ral tamalio de las molcu las de la muestra. Las molculas pequeftas

* Lla ma do tambin tiempo de retencin.


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pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las gran-des no. El intervalo de peso s molecula res en que se puede traba jar porcromatogra fa de exclusin vara desde 2000 hasta var ios millones.Las columnas utilizadas pueden tener hasta 4 m de longitud y la cadade pres in es por lo genera l de 10 atm por metro de columna a ! ml/minde flujo.

Esta tcnica es muy aplicada al caso de polme ros yo tros compues-tos do alto peso molecular, pero su resolucin no es buena y el tiempode anli sis puede resul tar largo. Po r otra parte conviene mencionarque el tiempo de elucin es proporcional al peso molecular.

Cromatografa por Intercambio Inico

La separacin por intercambio inico seb as a en la competencia en-tre la fase mvil y la muestra inica por los sitios o grupos activos de

una resina intercambiadora de iones.

Este tipo de separacin se aplica a compuestos de un intervalo depesos moleculares muy amplio, y ejemplos caractersticos de stos sonlos pptldos y los aminocidos.

Las columnas varan entre 1 y m de largo y 2 y 3 mm de dimetro interno, que producen cadas de presin de 55 a 135 atm, dependien-do de la velocidad de flujo de la fase mvil. En la fase mv il se puedeva riar la fuerza inica o el pH para obtener la elucin de los componen-tes de la mezcla en un tiempo razonable. Esta fo rma de cromatog raf a

es la nica que se puede aplicar a especies inicas.


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2INSTRUMENTAL

El instrumental propio de la cromatograf a de alta presin an no haalcanzado el grado de perfeccionamiento del usado en cromatografa degases, sin embargo es posible obtener instrumentos que se pueden con-side ra r bastante refinados. En efecto, hay disponible una amplia gama de ellos en cuanto a costo, versati lidad y comple jidad. En el apndicede esta monografa se da una lista de los principales fabricantes de

instrumentos y accesorios de cromatografa lquida.

En todo tipo de instrumental y no slo respecto a los cromatgrafos de fase lquida, hay ciertas caractersticas de ndole general que deben evaluarse al considerar un dado instrumento ya sea con fines de adqui-sicin o de fo rm arse una idea sobre la utilidad que puede pre sta r. D i-chas caractersticas son:

a) Versat ilidad. El instrumento debe se r apto para reso lver y tra -baj ar con muest ras de diferente tipo, debe pre sta rse a las distintastcnicas cromatogrficas y rea liza r el mximo de operaciones, tales 9como, programacin de fase mvil, recoleccin de fracciones a la s a -

lida de la columna, etc. Para ello el instrumento debe estar equipadocon los siguientes aditamentos:

Sistema de operacin de alta presin Div ersos detectores Sistema para recolectar fracciones a la salida de la columna Pr og ramad ores de fase mvil o disolvente i tambin llamados ge -

neradores de gradiente) Controles de temperatura para la columna y el detector Controles de flujo.

b> Rapidez. Par a obtener rapidez en el anlisis es necesario con-tar con mate ria les de relleno de columna de alta eficiencia y que el ins-trumento posea sistemas de bombeo de alta presin para la fase mvil. Durante mucho tiempo los anlisis efectuados por medio de la croma-tograf a lquida fueron en exceso lentos; hoy, sin embargo, se hacen an -lis is tan rpidos como los que se llevan a efecto por cromato gra fa degases.

c) Reproducib ilidad y Estabilidad. Son caracte rst icas esenciales si se quiere obtener del instrumento un funcionamiento efectivo a largo plazo. E l instrumento debe proveer un control adecuado sobre los pa -rm etros de operacin, tales como el flujo de la fase mvil, la tempe-ratura, pres in, composicin de la fase mvil, etc. , y para ello debeestar provisto de controles de temperatura y flujo, sistema de bombeo de alta presin , prog ramadores de fase mvil, detectores, etc.


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d) Sensibilidad. [In buen instrumento, a ms de trabajar con pe-

queas cantidades de mue stra, de be gene ra r seales de intensidad ap re ciables. La sensibil idad de todo cromatgrao de lquidos depende sobre todo del sist ema de deteccin que utiliza. Con los adelantos re gi st ra -dos en el diseo de detectores, ahora es posible detectar componentesde la muestra en el intervalo de los nanogramos.

Un estudio detallado de las caractersticas citadas permitir elegir el instrumento que mejor se adapte al tipo de trabajo que se quiereefectuar.

FASE MVIL

Aunque la fase mvil no es parte del instrumental propiamente di-cho, el control de la pres in, el flujo y la composicin de la mis ma, son muy importantes; de ah que en este captulo se traten los aspectos generales y las caractersticas de la fase mvil.

En lo que atae a las caractersticas que debe presentar toda fase mvi l para ser til en cromato gra fa lquida, cabe citar:

Diso lver la muestra No deg rada r o disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad Ser compatible con el tipo de detector utilizado.

Es esencial que la muest ra sea soluble en la fase mvil para que

pueda se r transportada a travs de la columna. Cuando se introducenmuestras en disolucin, puede oc ur rir precipitacin de la mue stra den-tro de la cmara de inyeccin o en la columna si el disolvente d


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Fift. U. Efecto de la temperatura sobre laviscosidad de la fase mvil y resolucin.

clones de la fase mvil, puesto que el cambio de compos icin de stapuede afectar el funcionamiento del detector.

I_.a figura 5 muest ra los componentes bs icos de un cro matcgra fo delquidos.

Son componente deseables en el instrumento, si bien no esenciales ,los siguientes:

Controles de temperatura para la columna y el detector Recolectores de fracciones

Programadores de fase mvil Medidores de flujo.

Con excepcin de columnas y detectores, se tratarn brevemente en

este capitulo cada una de las partes esenciales y accesorias.

Recipientes de Almacenamiento de la Fase Mvil

Se pueden utilizar recipientes de vidrio, acero inoxidable o plsti-cos ine rtes , de una capacidad entre I y 3 lit ro s, que en la mayora de loscasos es suficiente volumen para todo un da de operacin.


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Cmara

Fi g. 5. Repr esent aci n bsi ca de un cr omatgr af o de l qui dos deal t a presi n.

Muchas veces, en especial con fases mviles polares, hay una m ar -cada tendencia del oxgeno y otros gases a disolv erse en el lquido. Siestos gases se desgasifican dentro del instrumento y forman burbujas

pueden afectar seriamente el funcionamiento del detector y la eficaciade la columna. Por este motivo, es necesario remove r de la fase m-vil los gases disueltos. Actualmente, en muchos instrumentos, el re ci -piente mismo est condicionado para efectuar dicha remocin. Unaforma es aplicar vaco sobre el recipiente que contiene la fase mvil, mientras se agita el lquido con un agitador magntico. Si esto no essuficiente, se procede adems a calentar ligeramente el lquido en tan-to que el espacio l bre del recipiente se purga con nitrgeno o con algnotro gas inerte menos soluble.

Sistemas de Bombeo

Las columnas utilizadas en cromatografa lquida moderna estnrellenas de mater iales especiales de partculas muy pequeas, lo cualhace que la resistencia al flujo de la fase mvil sea muy elevada. Po r esta razn, se requiere un sistema de bombeo que haga fluir la fase mvil a un flujo razonable, pues de lo contrario los anlisis ser an excesivamente lentos.

Los aspectos ms importantes de todo sistema de bombeo son:

Pre sin mxima de operacin Intervalo de volmenes obtenibles Reproducibil idad y constancia del flujo Caracte rsticas del flujo

Tambin son importantes la resistencia a lquidos corrosivos, la fa -

cilidad para efectuar el cambio de fases mviles y la limpieza del sistema.


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De acuerdo con las caractersticas de funcionamiento y de diselio,se pueden considerar bsicamente dos tipos de bombas:

Bombas mec nicas, y Bom bas neumticas.

En Lo que atafie a las p rim era s, las hay de dos tipos distintos:

1. Bom bas recp roc as (pistn o diafragma !2. Bombas de desplazamiento continuo.

La figura 6 muestra en forma esquemtica cada uno de estos tipos de bombas.

Fig. 6. Diferentes tipos de bombas, a ) Bomba reciproca; b ) bomba tipo jeringa o de desplazamiento continuo, y e ) bomba neumtica. (Reproduci-da de "Basic Liquid Chromatography" por Nina Hadden y F. Bauman, f i g . 22D g . 21, 1972. Cortesa de Varian Associates, Palo Alto, California.)

Bombas rec procas . Son bombas que desplazan flujos de volumen

constante en fo rm a no continua, sino ms bien pulsante. La mxima presin que se puede obtener var a segn el diseo, pero en genera l esde aproximadamente 00 atm,

La form a como operan e stasb ombas es la siguiente: Mediante el m o-vimiento de un pistn o diafragma, y a travs de un sistema de vlvulas que alternadamente se abren y se cier ran, se llena y se vaca, de modoalternat ivo, una pequera cmara. El volumen que enva la bomba encada pulso se ajusta var iando la distancia a que se desplaza el pistn odiafragma.

Una de las desventajas de este tipo de bomba es que el flujo se ob-tiene en forma de pulsos y no en forma continua y uniforme. Lo ante-rior puede causar prdida en la eficacia de la columna e inestabilidad del detector y por lo tanto es necesa rio elim ina r dichas pulsaciones m e -diante algn sistema amort iguador . Una forma sencilla y convenientede log ra rlo es colocando una seccin la rga de tubo cap ilar (6 m de largo


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x i mm de dimetro) entre la bomba y la cmara de inyeccin; este tu-bo capilar s e deja flotar libremente y as f abs orb e las pulsaciones p ro -ducidas por la bomba.

E l flujo de volumen constante, a pesa r de las var iac ion es en la cafdade presin a travs de la columna, constituyela ventaja princip al de e s -tas bombas . Po r lo general, se utilizan manm etro s del tipo Bourdonpara medir la pres in a la cual est trabajando la bomba; estos man -me tros tambin ayudan a amo rtigu ar, en parte, las pulsaciones . Unaventaja ms de estas bombas es la capacidad de alimentar de modo con-tinuo el sistema.

Bombas de desplazamiento continuo. Lla mad as tambin bombas dembo lo o bombas de tipo jeringa, son aquella s en que un mbolo o pistnes desplazado en forma continua y uniforme por un motor de precisin,com prim iendo e l liquido contenido en una cmar a de un cierto volumen;

el Ifquido fluye luego a travs de una abe rtu ra en la mism a c m ar a y seobtiene asf un flujo de volumen constante que puede variar segn sedes place el mbolo a mayor o menor velocidad.

El flujo desplazado por estas bombas es uniforme y continuo, o sealibre de pulsaciones, pero la capacidad de la bomba es limitada y pararellena r la cm ara es necesar io suspender momentneamente su ope-racin.

Este sistema de bombeo es el preferido cuando se realizan progra-

maciones de fase mv il, ya que, regalando el volumen desplazado pordos bombas que contengan lquidos diferentes, es posible gen erar p ro -gramaciones de fase mvil de cualquier tipo.

Po r ltimo, cabe menc ionar que los flujos desplazado s po r estasbombas varan entre 0, 5 y 200 mi/h a pres ione s de hasta 340 atm.Su costo relativo es elevado y siempre existe cierta dificultad al relle-nar la bomba con una nueva fase mvil.

Bom bas neumticas. (Vese la Fig. 6). En este sistema de bo m -beo el lquido es desplazado mediante la pres in eje rc ida por un gasinerte a alta presin , ya sea en form a direc ta so bre ei Ifquido o biensobre el recipiente comprimible que lo contiene.

La presin mxima obtenible est limitada por la presi n del gasmismo y por el ma ter ial de fabrica cin del sistema. Los flujos obte-nidos estn lib re s de pulsaciones y son de pres in constante, lo cual si gn i-fica que 8i la cada de pres in de la columna cam bia , el flujo tambincambiar.

La s desventajas de estas bombas son la capacidad limitada en el

volumen total que pueden bom bea r (al igual que las bomb as de de sp la-zamiento continuo) y la difusin que presenta el gas en el lquido. Esteultimo pro blem a se puede resol ve r utilizando algn tipo de inte ra seentre el ifquido y el gas , evitando el contacto dire cto entre ell os , obien ,ms fc il an, desechando las ltimas porc ione s de lquido que han sidosaturadas por el gas.


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En este tipo de bombas existen algunas de diseo espec ial que em -

plean sistemas amplificadores de presin, lo que permite obtener pre-siones do hasta 400 atm utilizando bajas presiones de gas.

Sea cual sea el tipo de bomba empleado, conviene coloc ar un filt ro entre la bomba y la cmara de inyeccin para evitar que partculas ex-traas bloqueen el sistema; este filtro debe tener la capacidad de rete-ner partculas extraas sin producir una cada de presin excesiva.

Cuando se utilizan bombas que desplazan flujos de volumen constan-te, es recomendab le emp lea r una vlvula o sello de seguridad que libere la presin del s istem a cuando haalcanzado un limite super ior alno rm al. Esto podr a suceder si por alguna razn el sistem a se bloquea y la bo m -ba contina desplazando cL mi sm o volumen e incrementando continua-mente la presin.

Advie rta el lector que algunos instrumentos utilizan sistemas debombeo ms complejos que ios aqu descr itos en muchos casos, p ro -gramadores de fase mvil.

Cmaras de Inyeccin

Es ta parte del instrumento exige cuidadoso d iseo puesto que debere sis tir altas presiones, tener un volumen pequeo y sus cavidades de-ben se r bien ba rr idas por la fase mvil. Es en estas cma ras donde seintroduce la muestra que luego es a rr as tr ad a a la columna. Hay tres

modalidades distintas de introducir la muestra:

por medio de je ring as de alta presin; por medio de vlvulas inyectoras, y suspendiendo el flujo momentneamente.

Cuando se hace por medio de jer ingas (Fig . 71, se requie re que lapresin sea menor de J00 atm. En este caso, la mues tra se in-troduce perforando , con la aguja de la jeringa , un disco o sello, que seacapaz de re si st ir altas p resiones y la accin disolvente de la fase mvil.

Existen sellos perfo rables fabricados de diversos ma teriale s, como' vitn", ' sil ic n', "b un a" , etc. , resistentes a la mayor a de ios di so l-ventes.

Cuando se opera a presion es mayores de 100 atm, se utilizanvlvulas inyectoras cuyo funcionamiento se muest ra en la figu ra 8. En cas ode ca re ce r de este tipo de vlvu las, se puede re cu rr ir a la tcnica desuspensin del flujo, que consiste en int er rumpir la presin, deteniendola bomba; se es pera a que el flujo cese antes de rem over el sello pe rfo rab ie y se deposita la muest ra en la cmara de inyeccin o en la partesuper ior de la columna, se reinstala el sello pe rfo ra bl e y a continuacinse restab lece e flujo. Mediante esta tcnica no hay prdida de eficien -cia en la separacin, ya que las ve locidades de difusin en lquidos sonmuy ba ja s .

Las ventajas y desventajas de las distintas tcnicas de introduccinde la mue st ra se hallan re sumidas en la Tab la 111.


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Fi g. 7. I nyecci n ut i l i zando una i er i nga. ( Pr o-cedenci a: . ! . Cazes, J. Chem. Edua., 43 567 , 1966.Repr oduci da con permi so. )

Fase Mvi l

Fi g. 8. I nyecci n ut i l i zando una vl vul a i nyectora. a) Tomando l amuest r a; b) i nyect ando.


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Tabl a III. Tcnicas de Introduccin de la Muestra

Variables Jeringas V lvulas Interrupcin de Flujo

Presin mxima 100 atm 300 atm R eproducibilidad Buena Excelente Buena

Va r i acin en el ta-mao de la muestra Fcil Difcil Fcil

Introduccin de vo -lmenes pequeos Fcil Muy difci l Fcil

Tiempo requerido Segundos Segundos Minutos

Automa ti za ci n Difcil Fcil

Programadores de Fase Mvil

Esta tcnica, que equivale a la programacin de temperatura encromatogra fa de gases , consiste en cambiar la composicin de la fasemvil conforme transcurre el anlisis . Po r lo general, se utilizan dosdisol ventos de diferente polaridad y se var ia el porcentaje del disolventems polar en la mezcla binaria.

JLas ventajas que ofrece esta tcnica son:

Anl isis ms rpidos Me jore s separaciones Mayor sim etr a en los picos Me jor detectabilidad.

Po r otra parte, sus desventajas son:

Difcil de efectuar en cromatogra fa liquidoliquido Necesidad de regenerar la columna Incompatibilidad con el detector en ciertos casos .

JLa programacin de la fase mvil puede hacerse de diversas for-mas, dependiendo de cmo se efecte el mezclado de los diso lventes. l_afigura 9 muestra algunas de estas form as. En general, la forma expo-nencial es la ms fcil.

Desde el punto de vista de i instrumental, el programador de fase m-vil es un disposit ivo muy complejo que puede re sultar tan costoso comoel instrumento mismo. Bsicamente hay prog ramadores de dos clases:

1) Prog ramad ores que efectan el mezclado en una cmara, des -

pus de lo cual el lquido pasa a la bomba, la que enva la mezcla a lacolumna. Este tipo de program ador es muy sencillo y barato y no requie -re equipo espec ial alguno, si bien presenta ciertas limitaciones pues conl slo son fciles de efectuar programaciones exponenciales.

2) Prog ram adores de mezclado en corriente. Requiere dos bombas ,que por lo comn son del tipo de desplazamiento continuo y desplazan


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Composiclon

de

la

Fase

Mvil

o

Polarid

ad

a) Progr amaci n por etapas

t i empo

b) Programaci n exponenci al

c) Progr amaci n l i neal

Fi g. 9. Di f erent es f ormas


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REGISTRADORES

Su funcin es representar en un reg istro grf ico la seal dada porel detector. Generalmente se utilizan regi stradores potenciomtricosde 1 10 mV. Otras caracter sticas deseables de los regi stradores son respuesta rpida de la pluma y velocidad variable del papel.

CONTROLES DE TEMPERATURA

En muchos casos el control de temperatura que requiere la colum-na no necesita ser superior a 2" C; sin embargo, para traba jos dems precisin o cuando se realiza cromatografa lquidolquido es necesa-rio un control ms refinado. Po r otra parte, muchos anlisis se llevana cabo a temperatura ambiente, y es por esto que muchos instrumentoscarecen de dispositivos de control de temperatura.

Pa ra trabaja r a temperaturas superiores a la del ambiente, se uti-lizan baos de agua o de otro lquido, con regulacin de temperatura, obien hornos de tipo elctrico. Las caractersticas de estos tipos


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des, y detectores que no degraden o destruyan los componentes ya se-parados.

Hay disponibles reco lectores automticos y manuales bien comoaccesor ios o como componentes del instrumento. Cuando el objeto seala separacin de cantidades pequeas demue st ra , la recoleccin manuales la ms conveniente.

MEDICIN DE FLUJOS

En cromatografa liquida existen diversas tcnicas por medio de lascuales es posible medir el flujo a travs de la columna.

En primer lugar, cabe mencionar los mtodos gravimtrico y vo lu-mtrico, que consisten respectivamente en pesar o medir el volumen dela fase mvil recolectada durante un cierto lapso de tiempo. Estos mtodos son sencillos y exactos, pero no son muy rpidos y adems nodan una lectura continua.

Otros mtodos utilizan disposit ivos mecn icos con este propsito.Existen, por ejemplo, los medidores de flujo, que consisten en un pe-queo tubo de vid rio de seccin cnica, en cuyo inte rio r una pequelaesfera metlica flota dentro del lquido por efecto de la friccin que produce el paso de ste dentro de dicho tubo. La altura a la que semantiene la es fe ra da una indicacindel flujo obtenido. Es te disposit i-vo no es muy popular, pues no es muy exacto y adems requierecalibracin.

Otro tipo de disposit ivo es el llamado medidor de burbuja, que cons-ta de un tubo de vid rio de volumen conocido a travs del cual fluye lafase mvil . La forma cmo se mide el flujo es introduciendo una bu r-buja y midiendo el tiempo de su recorrido a travs del tubo. Este m -todo es muy rpido, exacto y preciso, y no requ iere calibracin.

Como se dijo ya, todo lo refe rente a columnas y detectores ser tratado en los captulos que siguen.


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3COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS

En todo sistema cromatogrfico, ya sea en fase liquida a gaseosa, la columna es el "c ora zn1 del sistema puesto que en ella se lleva aefecto la separacin de los componentes de la mezcla en estudio. Sehar por tanto una descripcin sucinta de algunas de sus caractersti-cas general es, tales como el mater ia l de que estn hechas, su longitud,dimetro, ctc. , y luego, con ms detalle, de los materia les de relleno, campo ste en que se han logrado avances que han revolucionado la tec-nologa de las columnas.

Conviene aclarar sin embargo que todava quedan muchos aspectosque no han sido suficientemente estudiados. Con frecuencia aparecen publicaciones que no son lo bastante explcitas y enocasiones son hastacontradictorias. La cromatografa lquida de alta pres inatraviesa poruna etapa de cambios continuos y lo que hoy parece ser cierto, puedemuy bien no parecerlo maana.

CARACTERSTICAS GENERALES

Bsicamente la columna consiste en un segmento de tubo de algnmaterial inerte, de dimetro uniforme y capaz de resis tir altas p resio -nes. De entre todos los mater iale s, el acero inoxidable es e) ms usa-do. En algunos casos tambin se ha empleado vidrio de paredes g rue-sas, pero tiene el inconveniente de no permitir conexiones metal vidrio hermticas a altas presiones.

Se ha observado que la superf icie de las paredes internas del tuboeje rce cierta influencia sobre la eficacia de la columna, este efecto em -pero no es muy importante si se utilizan rellenos de columna de alta

eficiencia. El mate ria l preferido por muchos investigadores es el tubode acero inoxidable de dimetro muy preciso y de paredes internas fi-namente pulidas f'trubore stainless steel").

La longitud de la columna vara entre 15 cm y varios metros y eldimetro, en la mayora de los casos, entre y 3 mm, aunque puede serde basta 9 mm.

La capacidad de la columna depende de su longitud, dimetro y m a-teria l de relleno. En genera l las columnas muy eficaces son de dim e-tro pequeo ( Z -3 mm) y efectan anlisis muy rpidos; su capacidad encambio es muy limitada y la muestra debe ser entonces de tamao muy reducido, lo que exige un detector muy sensible .

Si se desean rea lizar trabajos de tipo preparativo , o sea separar yrecuperar los componentes de una muestra en cantidad suficiente parapoder utilizarlos posteriormente, se debe recurrir a columnas con ma


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ter iales de mayor capacidad. Dichas columnas efectuarn la separac inen forma ms lenta y con una efic iencia menor que una columna de di -metro pequeo.

Respecto a la forma o geometra de la columna, por regla general, se pref iere n las rectas a las de cualquier otra forma, sobre todo po r-

que hay cierta prd ida de eficiencia cuando se doblan las columnas. Pe se a esto, cuando sea nec esar io usar columnas muy l arg as , se puedenutilizar columnas rectas conectadas entre s, o bien columnas enrolladas o de forma en: " U " , " L " , ' 'Sl; u "8 ", estas ltimas configuraciones fac ili-tan el control de la temperatura. En tod ocaso , recur des e que cualquierestrangulamiento de la columna pro vocar una gran prdida en su eficaciay ^ue, n el caso de columnas enroll adas , sta se r mayor conformedisminuya el dimetro de la columna y aumente el dimetro del rollo.

Aunque no forman parte de la columna como tal, las conexiones en-

tre columnas, a s como entre la columna y el detector o el inyector, de-ben a ms de ser hermticas, tener un volumen muy pequeo. En losextremos de la columna se coloca un disco de tefln o metal poroso para evitar que el relleno de la columna se afloje o pierda. Es necesario queeste disco o tapn retenga las partcu las del relleno sin p rodu cir unacada de presin muy grande.

FASES ESTACIONARIAS

Los m ateria les que se utilizan en crom atograf a lquida " clsica" ta les como gel de sli ce, almina, zeolit as, celu losa , etc., se utilizan po -co en cromato gra fa lquida de alta pre sin porque sus partculas suelense r muy grandes, de forma ir reg ula r, y en muchas ocasiones sus pr o-piedades son difciles de reproducir.

En cromatografa lquida de alta pres in, las dimensiones de laspartculas de los materiales empleados son muy pequeas, y muchas ve -ces estas partculas tienen form a regu lar . A algunos de estos materiale s se les llama 'pel icu lares" , y otros contienen fases lquidas qum icamen-te unidas a la superfic ie del mater ial . En una palabra, el materi al idealser a aquel que, en el menor tiempo posible, diera la me jor resolucin

para la separacin de la mezcla; tuviera la mxima capacidad de muestra, fuera fcil de introducir en la columna, produjera cadas de pres in pe-queas yque, adems, fuera de costo reducido. Est dems decir queeste mate rial de relleno ideal no existe en la actualidad, y en de te rm i-nadas circunstancias sejustifica sacrificar algunas ventajas para obte-ner otras.

La s partculas de los prim ero s mate riales de relleno porosos (gel deslice y almina, principalmente) eran ms o menos gran de s, sim ila re s alas de los utilizados en cromatogra fa lquida ' 'c l si ca ". E l tamao departcula es importante porque controla el proceso de difusin de las molculas de la mues tra hacia adentro y hacia afuera de los poros de lapartcula , A medida que el tamao de la part cula aumenta, el proceso de difusin se hace ms lento, es decir , la transfe ren cia de masa entrela fase mvi l y la fase estacionaria es lenta. Al mismo tiempo hay quecons idera r que si se aumenta el flujo de la fase mvil p ara obtener


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anlisis rpidos, el proceso de difusin, que es lento, hace que la co-lumna pie rda eficacia y, por lo tanto, resolucin. Conforme disminu-ye el tamafio de la partcula , la profundidad de los poros tambin d is -minuye y el proceso de tran sfe rencia de masa se hace ms rpido,permitiendo obtener anli sis rpidos sin prdidas en la resolucin Las razones indicadas explican porqu slo se utilizan materiales po-

rosos cuyas partculas sean de tamafio menor a 50 um.

Otros tipos de mate ria l utilizados son los llamados adsorbentes p e l i -cularen, tambin conocidos con el nombre de "adso rbentes de capapo ro sa ', de "po ros idad superficial1 o de' centro slido'1. Una re pr e-sentacin esquemtica de stos se muest ra en la figura 10. Consisten en partculas e sf rica s, generalmente v itr ea s, no porosas, recubiertas de una capa, muy fina de un adsorbente poroso, co mog elde si lc eo a l -mina. El espesor de esta capa es 1/40 del dimetro total de la pa rt -cula (alreded or de 1 um).

Fij. 10. Adsorbente peli cular. (Reproducida con permiso de"Columns for Modern Analytical Liquid Chromatography" por J.J. Kirkland, Anal. Chem., W , 36A48A, 1971.)

Los dos tipos de materiales adsorbentes mencionados, peliculares y porosos, aunque difieren en algunas de sus propiedades, tienen mu-chas en comn. En efecto, ambos pueden introducirse en la columnacon cierta facilidad y dar lugar a columnas muy eficaces; pueden utili-zarse en cromatografa lquidoslido, dependiendo de la actividad de su superfic ie, o bien pueden re cu br ir se de alguna fase lquida y utili-za rse en crom atog rafa lquidolquido. As imism o, se pueden unir

qumicamente en su superficie a alguna fase lquida y crear un nuevotipo de cromatografa, ya que el proceso efectuado con estos rellenos de columna no es exactamente crom atografa lquidol quido o lquidoslido. Hay, adems , materiales de relleno del tipo pelicular y porosopara cromatografa de intercambio inico.

Por otra parte, los m ater iales porosos, cuyas partculas pueden ser de for ma regula r o irr eg ul ar , tienen una gran superficie especfica,entre 50 y 500 m3/g, Ypor tanto pueden aceptar muestras de tamaoconsiderable, del orden de milig ram os por gramo de relleno, sin que

la columna pierda mucha eficacia. En contraste, los mate riales pe li-culares so n de superficies especficas menores, entre 1 y 12 mz/giaceptan menor tamao de muest ra, de 10 a 20 veces menos que los m a-teria les poro sos, y su costo es considerablemente ms elevado. Enlas fi guras 11 y 12 se pueden aprec ia r las d iferencias entre ambos ti-pos de rellenos.


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sil-x 40 u m

Fi g. 11. Fot ogr af a de par t cul asde Si l X, adsorbent e por oso. ( Re-produci da con permi so de "Hi ghPer f or mance Li qui d Chr omat ogr aphyPacki ng Mater i al s" por Ronal d E.Maj or s, Am. L a b . , mayo 1972, pg.28; der echos r eser vados 1972 porI nt er nat i onal Sci ent i f i c Communi -cat i ons, I nc. )

Z4PAX "CSP1

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Fi g. 12. Fot ogr af a de par t cul asde 7 i pax "CSP", adsor bente pel i cu-l ar . ( Reproduci da con permi so de"Hi gh Per f ormance Li qui d Chr omat og-r aphy Packi ng Mater i al s" por Ronal dE. Maj or s, Am. Tab., mayo 1972, pg.28; der echos r eser vados 1972 por

I nt er nat i onal Sci ent i f i c Communi -cat i ons, I nc. )

Fases Estacionarias para Cromatografa Lquidolquido y Lquidoslido

A continuacin se descri birn algunos de los materia les ms usadosen cromatografa lquidoslido, lquidolquido y de intercambio inico.Los materiales utilizados en cromatografa de exclusin o de pe rm ea cin se tratarn posteriormente por tener caractersticas diferentes.

En la Tab la V so encuentran resumidas las caracterst icas de losmateria les porosos ms utilizados en cromatografa lquidolquido ylquidoslid o. Por as il y Spherosi! son equivalentes y consisten en pe-queas es feras de silicagel porosa: pueden conseguirse en una gran va-riedad de tamaos de partculas y de reas especficas. Para c roma-tografa lquidoslido, se recomienda P o ra si lA ySpher osilXOA400, y para cromatografa lquidolquido, Po ra si lC y Spherosil XOB075.

SilX es un gel de slice de forma irregular cuya superficie ha sido parcialmente desactivada; se utiliza principalmente en cromatograf a lquidoslido.

Merckosorb, tambin conocido con eln om bre de L ichr oso rb, es un gelde slice del tipo empleado en cromatograf a de capa fina, pero de pa r-tculas muy pequeas. A las columnas re llenas con este material seles llama columnas " micro pak1' .


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Tabla V. Materiales Poroso s para Cromatografa Lquidolquido yLqu ido 8 li do

Adsorbente Nombre F orma Tamao dePartcula


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Tabla VI. Adsorbentes Pelicu lares p ara Crom atogra fa Lquidolquidoy Lquido6olido

AdsorbentePelicular

Nombre Tamao dePartcula

lllml

Superficie Provee Especfica dor*

ImVg )

Corasi l 1 37 7 1

Corasil II 50 14

Capa de slicePe los il NN

Pellosil NK

37

44

4

8

7

Vydac 3044 12 1012

Zipax 2537 1 8

Capa de almina Pellumina DN Pellumina DK

37443744

48

7

Permaphase ODS 2537 1 8

Permaphase ETH 2537 1 8

Capa de slice Durapak/Corasi l(Carbowax 400.1

3750 7 l

Corasil ODS 3750 7 1

* V ase la lista de fabricantes y pro veedores en la pgina 29.

Se mencion anteriormente que hay materia les que tienen la fa se lquida qumicamente unida. Un tipode estos mate ria les son los ll am a-dos esteres silicatos, como el Dura pak/Coras il y los Durapak, m en-cionados en la Tabl a V, que se ca racte rizan po r tener la unin Si O C , no muy resistente a la hidrlisis y a la temperatura; el Durapak/Corasil, que contiene Carb ow ax 400, es ms eficaz que los Durapak, pero es demenor capacidad de adsorcin . Otro tipo de fases lquidas utilizadasson las siliconas, que contienen la unin Si O S i, muy estable y r e s i s -

tente a la hidrl isis y a la tempera tura. Algunos de estos adsorben tes son Ferm apha se ODS, Perm apha se ETI1 y Co ras il ODS. La term ina-cin ODS signif ica que la fase liquida qumicamente unida es la octade cilsilicona; el ETH es una silicona de tipo ter. En el caso del Du ra pak/Coras il, la fase liquida est qumicamente unida a la superf icie departculas de Co ras il, y en el caso de Pe rmaph ase a la superf icie departculas de Z.ipax.

Materiales para Cromatografa de Intercambio Inico

Los mate riales utilizados para cromatografa de intercambio catinico y aninico difieren un poco de los materi ales desc ritos ms arr iba.

En pri mer lugar, cabe citar los ma teriale s o resinas porosas, queconsisten en partculas rgidas del copol mero estirenodiv inilbencen o en cuya supe rfici e y poros se encuentran los grupos nter cambiadores de iones, estos materiales son de capacidad elevada, generalmente del


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orden de microequivalentes por gramo de material . Otro tipo de m a-terial es el nter cambiador de iones pelicular o resina pelicular, queconsiste de una partcula vitrea deforma esfrica recubierta de una ca -pa muy fina del copolmero estirenodivinilbenceno, la cual contiene losgrupos activos; estos materiales son de capacidad reducida, menor quelos anteriores, y muy eficaces. Un tercer tipo de material consiste en

partculas de Zipax, en cuya superf icie se han incorporado grupos inter-cambiadores de iones; a este tipo de material se le conoce como resi-nas superf icialmente porosas. En la figura 13 se esquematizan estostres tipos de materiales.

Fi g. 13. Di f er ent es t i pos de r esi nas de i nt er cambi o i ni co, a) Resi napor osa; b) Resi na super f i ci al ment e porosa; c) Resi na pel i cul ar . ( Repr o-duci da de "Basi c Li qui d Chr omat ography por (l i na Hadden y F. Bauman,f i g. 2 7, pSg. 5 51, 1972. Cor t es a de Var i an Associ at es, Pal o Al t o,Cal i f orni a. )

Los grupos presentes en todo tipo de resinas de intercambio inico suelen ser NR< y NHS, en el caso de resinas de intercambio animco,que se obtienen comercialmente en forma de cloruros, y S03H en elcaso de resinas de intercambio catinico, que se adquieren en forma desales de sodio.

En las Tablas VII y VIII se sealan las caractersticas ms signifi-cativas de algunas resinas de ambos tipos. La mayora de las resinaspeliculares y superficialmente porosas pueden utilizarse condisolventesorgnicos . Adems, conviene ac la ra r que las capacidades que se indi-

can en las Tab las VII y VIII son aprox imadas, ya que el valor verdade -ro depende de la muestra y del mtodo de separacin.

Pellionex AT79 y AP 21 8 son materiales de caractersticas idn-ticas, en los que la nica diferencia es la naturaleza del pol mero querecubre la partcula vitrea. De modo simila r, Pellionex C P 109 yC P 128 dif ieren slo en capacidad, que es de 60 y 810 peq/g, resp ec -tivamente. Las resinas Aminex de intercambio aninico y catinicopueden ser adquiridas en diversos tamaos de partcula (1020 limi ypor otra parte, las resinas Du rrum de tipo DAX8 y DA X4 slo difi e-

ren en su capacidad adsorbente y rigidez.

Materiales para Cromatografa de Exclusin o Permeacin

En la actualidad hay disponible un gran nmero de mater iales paraesta tcnica cromatogrfica, que varan de acuerdo con su rigidez y conel intervalo de pesos moleculares dentro del cual son tiles; en otras


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Tabla VII. Resinas de Intercambio Inico Pe liculare s ySuperficialmente Porosas

Nombre Tamao dePartcula

(um>

Carcter Grupofuncional

Capacidad(Meq/g)

Provee-dor*

Pellicular Anion 40 Base fuerte - n r ; 10 4

Pellionex AT 7 9AF218

4453 Base fuerte NRj 10 7

Zipax SAX 2537 Base fuerte - n k 12 8

Zipax WAX 2537 Base dbil NHs 12 8

Pell icular Cation 40 Acido fuerte SQjH 10 4

Pellionex CP 109

C P 128

4453 cido fuerte SCfeH 60

8 J0

7

Zipax SCX 2537 cido fuerte SQ,H 3 8

* Vase la lista de fabricantes y proveedores en la pgina 29.

Tabla VIL Resinas de Intercambio Inico Po rosas

Nombre Tamafto dePelcula


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acuosos. E l intervalo de pesos mo lecular es en que son tiles oscila

entre 250 y 300 millones para el Styragel y de 750 a un milln pa ra elMerckogel OR.

Po r ltimo estn los llamados rellenos "r g id o s" , que se utilizan acualquier presi n, y entre ellos se cuenta el M.erckogeUSi (E Merck!

constituido por partculas ir re gu la re s de gel de slice; el intervalo do pe-sos moleculares en que es til es de 10 000 a 1milln. Spherosil y Po ra si l,descr itos ya al hablar de cromatografa lquidolquido y lquidoslido,tienen un lmite comprendido entre 60000 y 2 millones, y finalmente lasesf era s de vidrio poroso (electro nueleoniest se encuentran en diversa sformas y son tiles para trabajar con pesos moleculares desde 28 000hasta 1 200 000.

Se ha tratado de ab ar ca r brevemente lo referente a las columnas ya los materiales de relleno, sin embargo hay que aclarar que no se ha

intentado en cada caso hacer una descripc in detallada porque se consi-dera que estar a fuera del propsito de esta monografa. El lector in-teresado encontrar en la bibliografa las fuentes de informacin nece-sarias para profundizar en el tema.

Lista de Proveedores y Fabricantes de Materiales de Rellenopara Columnas

1. Wat er s Ass oci at es

2. Perkin Elm er3. E. Merck (Alemania !

4. Va ran Aerograp h5. Pechiney , Saint Gobain (Francia )6. BioR ad Laboratories7. Reeve Angel8. E .I . Du Pont de Nemours9. Dur rum Chemical Company10. Separation Group.11. Pharmac ia (Suecia).12. Applied Science Labo rator ies .


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4DETECTORES

Durante mucho tiempo el de sar ro llo de la crom atog rafa en aselquida se vio obstaculizado por la falta dedet ectore s adecuados El de -tector ideal se ra ^.quelque satisf icier a los siguientes requ isitos: al ta -

mente sens ible , esta ble, de lectura continua y de resp ues ta universal.Aun hoy da no existe un detector ideal y los que hay disponibles slo

son adecuados par a ciertas aplicaciones en partic ular. El pro blem a dedise ar y de con struir detectores para crom atog rafa lquida no ha sidotarea fcil y ha requerido de una tecnologa avanzada.

El problema de deteccin en cromatografa lquida se entiende me-jor si se piensa en el proceso que se debe llevar a efecto. Hace fal taun ciertodispositivo que mida en forma continua alguna propiedad fisi-coqum ica de los componentes de la mue stra de la solucin que loscontiene y que gen ere una seal proporcional a la concentracin de lamu estra, a medida que sta sale de la columna. Po r desg rac ia, la m a -yo ra de las propi edade s de la mu estr a que pudieran med irse son muysim ila re s en magnitud y car act erst icas a las del disolvente (fase m vil), J|y esto dificulta el pro ces o de deteccin. P a ra re so lver este prob lem a

se sugieren dos caminos que consis ten: uno, en elim ina r el disolvente conanterio ridad al pro ces o de deteccin, y el otro, en medir alguna p ro -piedad de la solucin que contiene la muestra y de alguna forma co m -pe ns ar o sust raer de la propiedad medida aquella fracc in que slocor res pon de al disolvente. Po r supuesto que esto no es fcil do hacer porque para lo gr ar una alta sensibilidad se deben controlar adem s los

par m etro s de operacin susceptibles de influenciar dichas propiedadesde la solucin y del disolvente. Por lo gene ral, este segundo mtodo r e -

qui ere un control cuidadoso del flujo y de la tempe ratura. A l con sider ar un detector en tr minos de su aplicacin a un cierto probl ema , o al ev a-

lu ar la s cualidades de un cierto diseo, debenten erse en cuenta c ie r-tas propiedades generales, tales como:

Resp uesta . Puede se r universal o selectiv a, segn la capacidadque tenga el detecto r de tr abaj ar con todo tipo de mues tras o slo con

uno especfico. En gene ral, los detectores universales son ms de se a-bles, si bien los selectivos, que suelen ser ms sens ibles , efectanme jor el anlis is de mue stras com plejas porque detectan ciertos co m -ponentes a muy bajas concentraciones.

Sensibilidad. Defnese la sensibilidad de un detector como la razn entre la seal generada y la cantidad de muestra que produce dichaseal. Este es un trmino relativo puesto que a pa rtir de un mismo d e -tector, la seal obtenida puede ser muy diferente para div ers as m ues -tras. Po r otra parte, la sensibilidad no da un ai de ac la ra ace rca de lacantidad m nima detectable, puesto que sta puede estar severamente limitada por el nivel de ruido del instrumento.


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Ruido. Es la var iacin en la seal del instrumento que no es a t r i -buida a la muestra y que puede ser producida por fallas electrnicas, variaciones de flujo o temperatura, fluctuaciones en el voltaje, burbujas de aire atrapadas en el detector, etc. Se llama cantidad mnima detec table a la cantidad de muestra que produce una seal igual al doble delnivel de ruido del instrumento. Dlo anterior se deduce porqu un de-

tector muy sensible y muy ruidoso puedenoser tan til como uno me-nos sensible, pero con un nivel de ruido ms bajo.

Linearidad. Pa ra utilizar la seal generada por el detector comouna medida cuantitativa, dicha seal debe guardar una relac in linealcon la concentracin de la muestra; esta propiedad se conoce como l i -near idad.

El intervalo l ineal de un detector se puede definir como la razn en-tre las concentraciones mximas y mnimas respecto a las cuales la

respuesta del detector es lineal. Conforme se aumenta la cantidad demuestra, se ll eg aa un nivel a partir del cual todo detector se vuelve nolineal. Pa ra obtener resultados cuantitativos se recur re a los grf icos de calibracin que representan la seal en funcin de la concentracin en el intervalo de concentraciones en que la respuesta del detector es lineal.

Estabilidad, Un buen detector debe ser insensible a los cambios detemperatura y a la variacin de flujo a la vez que ser compatible con programaciones de fase mvil.

Los detectores que miden propiedades de la solucin y que requ ierencompensacin por efecto del disolvente, su ele nserms difciles de e s -tabiliza r, en especial cuando se realizan programaciones de la fase m-

vil.

Se han probado diversos detectores cuyo funcionamiento se basa endiver sas propiedades de la solucin, pero la gran mayora de el los slohan tenido un xito limitado y esto ha impedido su adopcin definitiva.

Actualmente existen dos tipos de detectores de uso muy gene ra liz a-

do que se describen a continuacin:

DETECTOR DE NDICE DE REFRACCIN

Mide la diferencia entre los ndices de refraccin del disolvente puroy de La solucin de la muestra que sale de la columna; de esta manera se detecta cualquier cambio en la composicin de La fase mvil. Ea res puesta de este detector es universal y su sensibi lidad es moderada, porLo peneral del orden de microgramos o partes por milln.

Desafortunadamente, debidoa la respuesta universal, es muy dif -cil efectuar programaciones de fase mvil con este detector, que ade-ms es sensible a las variaciones de flujo y de la temperatura. Para poder observar diferencias en el ndice de refr accin del orden de1 x 10" unidades, se requiere un control de temperatura de 0,0001C.


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Hay dos modelo s distintos de este tipo de detector, que se ilustran en la s f iguras 14 y 15.

d

Fi g. 1. Det ect or de I ndi ce de r ef r acci n, t i po "desvi aci n",a) Fuent e l umi nosa; b) aber t ur a; c) l ent e col i mador a; d) c el -das anal t i ca y de r ef er enci a; e) espej o; f ) aj ust e pt i co decer o; (?) Fot ocel da; y h) ampl i f i cador . ( Repr oduci da del cat -l ogo " Chr omat ogr aphy", f i g. 10, pg. 70, por cor t es a de Wat er sAssoci at es. )

i t

Fi g. 1S. Det ect or de ndi ce de r ef r acci n, t i po "Fresnel ".a) Fuent e l umi nosa; b) Pr oyect or ; c) pr i sma y cel das; d) f o-t ocel da. ( Repr oduci da de "Moder n Pract i ce of Li qui d Chr omat ogr aphy" por J . J . Ki r kl and, f i g. 3. 13, pg. 118. Cor t e-

s a de J ohn Wi l ey Sons, I nc. , Hueva Yor k, N. Y. )

Uno de el l os, l l amado r ef r act met r o de desvi aci n, se bas a en el

despl azami ent o pt i co de un r ayo de l uz, que es pr opor ci onal a la di f e-

r enci a del ndi ce de r ef r acci n ent r e dos l qui dos. El ot r o se f unda en

el pr i nci pi o de Fr esnel , segn el cual en l a i nt er f ase ent r e el pr i s ma

de vi dr i o y al gn l qui do, l a cant i dad de l uz t r ansmi t i da y r ef l ej ada e s

pr opor ci onal al ngul o de i nci denci a de l a l uz y al ndi ce de r ef r acci n

del l qui do.

En el r ef r act met r o do desvi aci n ( Fi g. 14), un r ayo de l uz pasa a

t r avs de unaaber t ur a (a) y es c ol i mado por el l ent e (b), at r avi esa l e

gol asc el das (e), que cont i enen, r espect i vament e, el di sol vent e pur o y la

sol uci n que sal e de l a col umna, es r ef l ej ado por un espej o (d) y enf o-

cado a t r avs de un mec a ni s mo de aj ust e pt i co cer o l e), i nci di endo m s

t arde sobr e l a super f i ci e de una f ot ocel da f). El ngul o de i nci denci a


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del rayo de luz sobre la otocelda est determinado por el ngulo de des

vacinque resu ltade la diferencia entre los ndices de refr accin de loslquidos en ambas celdas. Confo rme el rayo cambia su ngulo de in ci -dencia sobre la fotocelda, se gen era una seal, que es amplificada y r e -presentada grficamente por el registrador.

El esquema ptico de un ref ractmetro de tipo Fr es ne l (Fig. 15)consta de dos rayos de luz colimados y de igual intensidad, que pasana travs de un prisma e inciden sobre la interfase vidriolquido de las celdas de referencia y muestra, respectivamente. Dichas celdas, deaproximadamente 3 mic rolit ros cada una, consisten en cavidades ovaladas en una pequea pieza de tefln, ubicada entre el prisma y una placa de sostn. E l ajuste grueso del ngulo de incidencia de la luz se reali za rotando el cuerpo del proyector. La diferencia de intensidad de la luztransmitida a travs de las celdas est en funcin de los ndices de r e -fraccin de ambos lquidos y se mide por medio de una fotocelda doble,

la cual genera una seal que es registrada grficamente.

Ambos modelos miden cambios en el ndice de refrac cin hasta de10"7 unidades. El re fractmetro de desviacin es menos sens ible a loscambios de temperatura y es ms compatible con La programacinde fase mvil; tiene un intervalo lineal menor , es muy sensible a las vi -braciones o movimientos del instrumento, y sus cavidades o celdas noson tan pequeas como las del ref ractm etro de Fresne l. Este ltimo,en cambio, es considerado ms sensible y menosadecuado pa ra pr ogr a -mac iones de fase mvil, sus celdas son de volumen ms pequeo, es ms

sensible a los cambios de temperatura y, adems, es necesar io inter-cambiar prismas para abarcar por completo el intervalo de ndices derefraccin.

De todo lo anterior se desprende que el detector de ndices de r e -fraccin es un detector de respuesta universal, que requ iere compensa-cin por el disolvente, que es moderadamente sensible y que nodestruye la muestra. Su estabilidad es buena, es sensible a los cambios de temperatura y de flujo y la seal que genera puede ser po-sitiva o negativa segn que el ndice de refraccin de la solucin que

contiene la muestra sea mayor o menor que el ndice de refraccin del disolvente, La programacin de fase mvil es muy difcil , el intervalolineal es aproximadamente 3000 y la sens ibilidad var a un poco, de acuer -do con el fabricante, pero en genera l es del orden de partes por milln.

DETECTOR DE LUZ ULTRAVIOLETA

Su funcionamiento se basa en la absorc in de luz por parte de lamuestra al pasar a travs de ella un haz de luz monocromtica u ltr a-violeta. Es lgico suponer que la respuesta de este detector se r se -

lectiva, ya que slo se detectarn los compuestos que absorban luz dela longitud de onda a la que opera el detector.

Este fotmetro de luz ultravioleta, como tambin se llama, es r e -lativamente insensible a los cambios de flujo y de temperatura, y s ie m -pr e y cuando el disolvente no absorba en grado aprec iab le en la longitudde onda que opera el fotmetro, se r muy fcil efectuar program aciones


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de fa se mvil. Po r otra parte, podemos deci r que, actualmente, e'stees el detector ms sens ible en cromatograf a lquida: en condicionesptimas se pueden obtener sensibilidades de hasta 0,005 unidades deabsorcin, y si el compuesto absorbe intensamente en e! ultravioleta,es posible detectar cantidades de muestra del orden de 2 nanogramos.

La mayor parte de los diseos comerc ial es operan a una longitud deonda de 254 6 280 nm,* utilizando como fuente de luz ultravioleta unalmpara de mercur io de baja presin.

Un diseo esquemtico de este detector se muesta en la figura 16.El haz de luz, proveniente de una lmpara de mercur io, es p rim era-mente colimado y despus se hace pasar a travs de dos celdas , una deella s de re ferenc ia o compensacin; los rayos de luz emergentes se ha-cen pa sar por filt ros especf icos con el objeto de obtener la longitud de

onda requerida (254 6 280 nm). La intensidad es medida por una fotocelda doble que genera una seal que, despus de ampli ficarse, es r e -presentada grficamente por el regis trador. Dicha seal se puede ob-tener como porcentaje de luz transmitida o absorb ida, siendo msconveniente la segunda i,absorbancia) pues es directamente proporcionala la concentracin de la muestra. De hecho, la nica desventaja deeste detector es su respuesta selectiva; sin embargo, aun para compues-tos que presentan su mximo de absorcin a una longitud de onda distintade 254 6 280 nm, la sensibi lidad es buena.

Fi g. 16, Det ect or de l uz ul t r avi ol et a, a) Fuent e l umi nosa; b) l ent e

col i mador a; c) cel das anal t i ca y de ref er enci a; d) vent ana de cuar zo;e) f i l t r o; f ) f ot ocel da. ( Repr oduci da de "Basi c Li qui d Chr omat ogr a-phy" por Ni na Hadden y F. Bauman, f i g. 6 5, pg. 6 9, 1972. Cort esi ade Var i an Associ at es, Pal o Al t o, Cal i f or ni a. )

\

41 Un nanometro , nm, equivale a 10' metros .


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Pa ra evitar pro blem as con la fase mvil y raido en el detector, seemplean disolventes de grado de pureza espectroscpica como fases m -vile s y se toman las precauciones adecuadas para que no se formen b u r -bujas en Las celdas.

Si durante la programac in de fase mvil, sta cambia en grado ap re cia ble su absorci n en el ultravioleta, es necesar io utilizar la celda derefe ren cia con el propsito de compensar esta absorcin. Si el diso lven-te no abso rbe o si la abso rcin es constante, la celda de ref ere nc ia sepuede dejar vacia o bien llena con el disolvente empleado.

Como se dijo ya, las celdas de cualqu ier detector deben se r de unvolumen pequeo con el objeto de evitar un ensanchamiento de las ban-das de elacin; asimism o, en este detector, se requ ier e que la luzatraviese la solucin que contiene la muestra por lo menos una cierta

longitud mnima. En la mayo ra de los detectores, la sc el da s tienen una

longitud de paso de la luz de 1 cm y un volumen que var a entre 8 y 30micro l i tros .

En res me nes lcito cons idera r al detector de luz ultravioleta co -mo el ms sensible y de uso ms genera lizado en crom ato graf a lqui -da, en espec ial en el campo de las inves tigaciones b ioqu micas, porquemuchos compuestos de inters biolgico absorben intensamente en laregin ultravioleta. L a muestra no resulta altera da por el proceso dedeteccin y el in tervalo lineal es de aproxim adamente 3 000; este d et ec -tor no es sensible a los cambios de flujo o de temp era tur a y es apto p a-ra programaciones de fase mvil.


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5ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

ANALISIS CUALITATIVO

La separacin e identificacin de diversos compuestos en una mez-cla es un pro blema complejo y requie re, en muchos casos, el uso dediferentes tcnicas.

La crom atog ra fa lquida es en esencia una tcnica de senaracin

IV no de identificacin.j y aunque es posib le obtener alguna informacinde tipo cualitativo, en gen eral siemp re se requ iere dealguna tcnica nocromatogrfica para efectuar la identificacin certera de un compuesto determinado.

Hay algunas tcnicas y parmetros puramente cromatogrficos que,en muchas ocas iones, pueden se rv ir de gua o de aprox imacin a laidentificacin de un compuesto, pero debe recordarse que no son con fiables en grado absoluto.

Medidas de Retencin

El volumen de fase m vil requerido para eluir un compuesto de lacolumna cro matogrf ica se llama volumen de retencin. Po r otra p ar -te, se conoce como tiempo de retencin el tiempo transcurrido desde laintroduccin de la muestra en la columna hasta el momento en que eluye el compuesto en cuestin. La medicin, tanto delvo lumen de reten-cin como del tiempo de retencin (t), se inicia desde el momento enque se introduce la muestra en la columna hasfca el momento en que apa-rece el mx imo del pico en la grfica trazada por el regis trador. Ahora bien, aunque ambas medidas se expresen en diferentes unidades,son equivalentes, puesto que el flujo de la fase mvil se mantiene cons-tante.

Cuando las condiciones de operacin se mantienen constantes, lostiempos o volmenes de retencin son reproducbles, pero no es fcil mantener invariables el flujo, la temperatura, la cantidad de fase l -quida en la columna, la composicin de la fase mvil, etc, , y por con-siguiente es muy difc il reproducir datos obtenidos en diferentes labo -ratorios .

0 Suponiendo que las condiciones de operacin sean constantes, eltiempo de retencin ser caracterstico de una sustancia dada, pero nounico, ya que no hay que olvidar que dos o ms sustancias pueden tenerun mismo tiempo de retencin. La forma de efectuar una identificacines comparando los tiempos de retencin de las sustancias por iden-tificar con los tiempos de retencin de sustancias patrones, aunque, co -mo se dijo ya, esto no basta para una identificacin cer tera.


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Hay diversas formas de evaluar los tiempos de retencin queson ms fciles fie reproducir que los tiempos de retencin ab so lu -tos (tu), mencionados antes. En prime r lugar, consideremos el tiem -po de retencin corregido o ajustado ( -r ), segn se muestra de manera grf ica en la figura i 7; ste es el tiempo de retencin absoluto menos

el tiempo de retencin de algn compuesto que no experimenta retencinalguna en la columna. Existen adems los tiempos de retencin re la -tivos, que son el cociente obtenido de dividir el tiempo de retencin corregido del compuesto en cuestin por eltiempo de retencin de algncompuesto patrn, que puede ser uno de los componentes de la mezcla. Los tiempos de retencin, ajustados o corregidos, son ms fciles dereproducir que los absolutos, pero los tiempos de retencin relativos, son ms confiables porque slo dependen de la temperatura, las carac-tersticas de la columna y la composicin de la fase mvil.

Comparacin entre Diferentes Columnas

La confiabiLidad en la identificacin cromatogrfi ca se puede aumen-tar si se examina el comportamiento de la muestra en diversas colum-nas, ya que es muy difcil que dos compuestos presenten exactamenteun mismo tiempo de retencin en diferentes columnas. Es ta compara-cin se puede efectuar entre columnas que contienen diversas fa ses l -quidas, o bien entre columnas de diferentes tipos de cromatograf a, tales como, la cromatografa de permeacin, la cromatograf a lquidolquido, etc.

Comparacin entre Miembros de Series Hom&logas

En muchos casos no Be dispone de los compuestos patrn apropiados

para efectuar la comparac in de los tiempos de retencin. S se dispo-ne de una mezcla de los m iem bros de una serie homloga, se puederegistrar grficamente el logaritmo de los tiempos de retencin en fun-cin clei nmero de tomos de carbono de cada miemb ro. Mediante laextrapolacin del grf ico obtenido se logra la identificacin de una su s-tancia dentro de una misma serie homloga.


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Comparacin de las Respuestas de Diversos Detectores

La relacin de las respuestas que presenta un nico compuesto endos o m s detectores distintos suele ser caracte rfstica del mismo. P a -ra obtener esta relacin, se hace pasar el efluente de la columna porvarios detectores conectados, ya sea en serie o en paralelo, y las res-puestas se representan grficamente de modo simultneo en un registra-dor de varios canales,

Las combinaciones posibles son el detector de luz ultravioleta y elde ndice de refraccin, o bien dos detectores de luz ultravioleta queoperen a diferentes longitudes de onda. Uno de los ar reglos posibles deesta tcnica se muestra en la figura 18.

Fig. 18. Sistema de deteccin mltiple, a ) Cmara de inyec-cin; b) columna; c) detector de luz ultravioleta; d) detector de ndice de refraccin; e) recolector de fracciones.

Tcnicas Auxiliares

La nica manera de identificar una sustancia con un cien por ciento de seguridad es utilizando alguna tcnica auxil iar, como por ejemplo:la espectrometr a de masas , la resonancia magntica nuclear, etc.Conviene advert ir que en muchos casos se requiere ms de una de estas tcnicas para poder identificar la sustancia con certeza.

Asimismo, pero en forma menos segura, es posible utilizar las

reacciones qumicas de ciertos grupos funcionales para obtener una in-dicacin de la naturaleza de la sustancia problema; en gen era l estasreacciones son sensibles a microgramos de muestra.

Muchos anlis is espectroscpicos se llevan a cabo di rectamente conel disolvente usado para eluir la muestra; si la cantidad obtenidapara el anlisis es demasiado pequea, se recomiendan columnas de. ma-yor capacidad.


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ANLISIS CUANTITAT IVO

El anlisis cuantitativo de mezclas de sustancias siempre ha siclofcil de efectuar mediante cualquier tcnica cromatogrfica con resul-tados vl idos. En la actualidad el an lis is cuantitativo por medio de lacromatografa lquida de alta presin es tan confiable como el realiza-do por cromatografa de gases.

En general, todo anlis is cuantitativo puede d ivid irse en var ias etapas:

Muestreo Separacin y deteccin Integracin de las seales Clculo de la composicin Interpretacin estadstica.

La etapa de muest reo no puede ser descrita con la debida propiedaden esta monograf a, y slo se mencionar que es una etapa crtica , so-bre todo en cierto tipo de muest ras , como son las de or igen biolgico, Si la muestra requie re alguna preparacin o tratamiento previo, stedebe realizarse con todo cuidado.

La segunda etapa puede ser la fuente de muchos errores debidos amltiples factores. Po r ejemplo, puede haber descomposicin o ad so r-cin irreversible de los componentes de la muestra en la columna, ya

sea por efecto de la fase mvil o del material de relleno de la columna. La sensibilidad, linear idad y especificidad del detector son tambin muyimportantes. El tamao de la muestra debe estar dentro del intervalolineal del detector; los cambios de flujo, de temperatura y las fallas electrnicas pueden afectar las caractersticas de la respuesta del de-tector; por otra parte, el detector puede se r completamente "ciego" a undeterminado tipo de muestras o bien su sensibilidad variar para com-puestos de diferente estructura. Po r estas razones se recomienda te-ner cuidado al interpretar los resultados.

La tercera etapa, integracin de las seales, se lleva acabo por di-ver sa s tcnicas que var an en cuanto a complejidad y exactitud. El p ro -psito de esta etapa es trans fo rmar de alguna fo rma la intensidad de lasseales emitidas por el detector en medidas que puedan relac ionarse con la cantidad de muestra. La s seftales obtenidas, en la mayor a delos detectores, aparecen en el registrador como picos de forma apro-

ximadamente 1gaussiana", cuya altu ra o rea se utiliza como una m e-

dida de tipo cuantitativo.

A continuacin se de scr ib ir cada una de las tcnicas manuales e

instrumentales que se conocen para integrar las reas de los picos.a) Altura dei pico. Aunque el rea es una medida ms prec isa , la

altura se emplea mucho porque es muy simple de obtener, aunque esmucho ms sensible a variaciones instrumentales. Si se mantienenconstantes las condiciones de operacin del instrumento y se efectauna buena calibr acin, es posible obtener datos cuantitativos muy acep -tables .


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Si los picos estn completamente distorsionados o asim tricos , o sila columna est sobrecargada de muestra o la cantidad de la muestra est fuera del Intervalo lineal del detector, no debe utilizarse esta tc-nica. Si hay desviacin de la lnea base, la altura del pico se obtieneinterpolando la lnea base entre el principio y el fin de cada uno.

b) A ltara por el ancho a la mitad de la altura . Cuando los picos sonsimtr icos tienen aproximadamente la forma de un tringulo, y es poresto que el rea se mide multiplicando la altura del pico por el ancho medido a la mitad de la altu ra. No es conveniente usar el ancho medi-do en la base del pico, ya que por lo gene ral los picos tienen cierta ten-dencia a co lear1 o, dicho en otra forma, a extender sus finales.

Esta tcnica es sencilla y si bien no da una medida muy exacta del rea real, el r ea medida es proporcional a la cantidad dem ues tra. La

pre cis in de esta tcnica depende de la simetra del pico y de la re la -cin entre su altura y ancho; en gene ral slo se recomienda para picossimtricos, cuyo ancho, a la mitad de la altura, pueda med irse concierta precisin.

c) Triangu lacin. Este mtodo consiste en trazar tangentes a am -bos lados del pico hasta formar un tringulo con la lnea base y luego apl icar la frmula de la bas e multiplicada por la mitad de la altura. Este mtodo es menos p reciso que el anterio r y est sujetoa er ro re s altrazar las tangentes.

d) Co rta r y pes ar. Este mtodo es labor ioso y lento, pero es bas -tante pre cis o. Bsicamente lo que se hace es determ inar el peso porunidad de rea del papel utilizado en el registrador, recortar despus los picos trazados en el papel del regi st rado r y pesarlo s, y de esta forma se determin a su rea . La prec isin de este mtodo en general es buena,pero depende de muchos fac tores, como son el cuidado que hay que te-ner al reco rtar tos picos, la homogeneidad del papel, etc.

e) Planm etro. Utilizar planmetros para medir reas no ofrece

ventaja alguna aprecia ble sob re los mtodos anter iores . E l proceso eslento, depende mucho de la habilidad personal y su precisin excede ala del mtodo de la triangulacin. Con picos asim tricos se exper imen-ta una ligera ventaja sobre otros mtodos manuales, y si el propsito es obtener mejores datos conviene hacer varias mediciones.

f) Integradores de diaco. ste es quizs elmtodo ms convenien-te de medir re as; el integrador trans forma la seal que recibe el re -gis trador en una se rie de trazos en el papel que se pueden relacionar con las r ea s de los picos. La precis in es muy buena, y slo ofrece

cierta dificultad en casos de picos no resueltos por completo o que p re -senten una desviacin de la lnea base.

La precisin del integrador depende en cierto grado de la precisin del reg ist rador, y su costo no es muy elevado si se considera la utili-dad que presta.


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g) Integradores electrnicos. Los mtodos de integracin electr-nica proporcionan datos de una preci sin en muchas ocasiones superior a la del mismo cromatgrafo. La seial que recibe el reg istr ador es trans -formada directamente en unidades relacionadas con el rea y la concen-tracin. Por desgracia el costo suele ser igual o muy super ior al de un

cromatgra fo de mediana calidad, sin embargo, si el nmero de mue s-tras a tratar es elevado, se justifica la inversin econmica.

Tambin se emplean sistemas de computacin; muchos de estos ins -trumentos proporcionan o son capaces de presentar directamente re su l-tados y datos completos del an lis is , tales como tiempos de retencin,reas, factores de correccin, porcentajes de composicin, etc.

La cuarta etapa en el anli sis cuantitativo es el clculo de la com -posicin de la muestra que se lleva a cabo por los siguientes mtodos:

a) Normalizacin de las reas

bt Cal ibracin externa

el Uso de un patrn interno.

Normalizacin. Este mtodo puede ap lica rse con o sin factores decorr eccin, dependiendo de la precis in requerida y de la muestra . Enesencia, relaciona las reas obtenidas con elporcentaje de composicinde la mezcla, como se indica en la figura 19.

% A1~? ----- ------------ 1001 Area To ta l

Esta tcnica requ iere que todos los componentes de la mezc la seaneluidos y que la respuesta del detector sea igual para todos ellos, con-dicin sta que por lo comn no se cumple y que da lugar a que la no r-

malizacin de reas lleve implcito el uso de factores de correccin ode respuesta, como tambin se llaman. La respuesta de diversos com-puestos puede var iar de acuerdo con el detector empleado; por esto,para log rar me jores resultados, es necesario obtener los factores derespuesta de los diversos compuestos que constituyen la mezcla.

cromatografia liquida de alta presion

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