Cromatografia Liquida - CLAE

UNISULANÁLISE INSTRUMENTAL

Profa. Denise Esteves Moritz

O que é Cromatografia ?

Definição:

A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária.

A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial .

O que é Cromatografia a Líquido HPLC?

Definição: Na técnica de cromatografia a líquido a

fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido .

O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.

Instrumentação para HPLC

CLAE -HPLC

Fase móvel(amostra)

Fase estacionária(Componentes retidos)

Migrações diferenciais

Analitomov ⇋ Analitoest

K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição

INSTRUMENTAÇÃO

pumpinjector

columnoven

detector

One pump used to control 4 reservoirs; mixing is donebefore pump.

MIXER

data processor

Fase móvel

Instrumentação para HPLC

PURGAINJETOR

COLUNAFM

BOMBA

DETECTOR

Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC

Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais :

Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a

amostra na fase móvel ; Coluna cromatografia :

É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ;

Detector :É o dispositivo que tem a função de detectar os

componentes eluídos da coluna cromatográficas

Componentes auxiliares de um HPLC

Bomba :

É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );

É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas.

Fornece uma alta pressão.

BOMBA

- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)

- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário

- Mede a pressão sobre o sistema

- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)

Componentes auxiliares de um HPLC

Válvula de purga: É o dispositivo que permite a troca rápida de

solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno.

Misturador: É o dispositivo que homogeneíza a mistura de

solventes quando operando com gradiente de eluição .

Fase estacionária

Colunas Cromatográficas

Fases estacionárias :

Sílica- C8

Sílica- C18

Sílica- C18 ( ODS)

Sílica- NH2

Sílica- Diol

Sílica

Troca Iônica

Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca

Resinas DVB-ST porosas

Pré-Coluna:

É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica .

Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.

SÍLICA (suporte + usado):

- Resistência mecânica- Variedade de forma, tamanho de partículas e poros

- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea

COLUNAS CROMATOGRÁFICAS

Si

OH

SiHO OH

Si

OH

Si

OH

SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS

LIVRES GEMINAL VICINAIS

influenciam no grau de acidez da sílica

Fase Estacionária

A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica.

São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas.

Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.

MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL

- QUIMICAMENTE LIGADAS

- HÍBRIDAS

- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS

Fases Quimicamente Ligadas

C18 (ODS)

forte

C8

amostra

amostra

amostra

C4

média

fraca

POLIMÉRICAS

Pré-hidrólise do agente silanizante

- Rede tridimensional mais espessa- Maior estabilidade

- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento

FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS

Matriz orgânica-inorgânica

- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais- Menor quantidade de grupos de silanóis- Ultra-fast cromatografia

Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano

(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH

RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS

-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA

- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS

- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)

• Poli(etileno)• Poli(butadieno)• Poli(estireno)• Poli(dimetilsiloxano)• Poli(metiloctilsiloxano)• Poli(metiloctadecilsiloxano)• Poliéteres• Polissacarídeos• Poliaminas• Polinucleotídeos• Poliamidas• Proteínas

SílicaZircôniaTitâniaAlumina

PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO

INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)

INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS

LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO

INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO

ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

Fases estacionárias Interações

C8

PH

C2

van der Waals

van der Waals

van der Waals

Si

Si

Si

Fases estacionárias Interações

CN

NH2

2OH

Dipolo/Dipolo

OH

Si NH

H

OSi

OH

OOH

H

SiN

OH

C

Ligação de hidrogênio

Ligação de hidrogênio

Fase Estacionária

PRS

CBA

SAX

Eletrostática

Eletrostática

Eletrostática

H3+N

SO3-Si

Si

H3+N

O-

O

N+(CH3)3Si

-O3S

Fases estacionárias

Interações

Fase Estacionária

Processo de Eluição

Definição:

Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária.

Série eluotrópica

Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

Força eluente:

É uma medida da energia de adsorção do solvente

Cromatografia com fase normal:

Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar.

Cromatografia com fase reversa:

Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.

DETECTORES - Classificação

UNIVERSAIS:Geram sinal para qualquer

substância eluída.

SELETIVOS:Detectam apenas substânciascom determinada propriedade

físico-química.

Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito

DETECTORES

UV

FLUORESCÊNCIA

MS

ELETROQUÍMICO

IR

POLARÍMETRO

É mais comum, usado na CLAE.

Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta.

São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes.

Detectores Detectores Ultra violeta:Ultra violeta:

Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.

- Seletivo (moléculas com cromóforos)

- Comprimento de onda (λ) fixo

- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)

- Varredura (DAD)

- Solventes também absorvem

Ultra violeta (UV-visível):

ÁguaMeOHACNAcetonaHexanoClorofórmioTHF

190 210 200 330 200 245 215

λ nmSolvente

Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV

- Seletivo (moléculas que fluorescem)

- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas

- Mais sensível que UV por ser emissão

- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente.

- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila

Fluorescência:

Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::

Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna

- Não- seletivo

- Sensível a variações de:- Temperatura- Pressão- Fluxo- Composição fase móvel

- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar

- Muito usado em cromatografia preparativa

Indice de refração:

Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)

- Destrutivo

- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)

- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI

- Análise de micro e macromoléculas.

- Alta sensibilidade

Espectrometria de massas:

MODOS DE SEPARAÇÃO

NORMAL

REVERSO

TROCA IÔNICA

MODO NORMAL

MECANISMO DE INTERAÇÃO:

ADSORÇÃO

Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel

Fase móvel: mistura de solventes orgânicos

Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino

MODO REVERSO

INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DOSOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA

HIDROFOBICIDADE

Fase estacionária: APOLARFase móvel: H2O, MeOH, CH3CN

ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO

Tempo de Retenção e Hidrofobicidade

OH

OH

C18 (ODS)

forte

Interaçãofraca

HidrofobicidadeHidrofobicidade

Se a amostra possui CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica : grupo aromático

Se a amostra possui -COOH : grupo

carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxi

A hidrofobicidade

será forte

A hidrofobicidade

será fraca

TROCA IÔNICA

MECANISMO DE INTERAÇÃO :

ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)

Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)

Aniônicas: amônio quaternário, aminasCatiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico

Microsseringas para Injeção

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Obs: Seringa de HPLC

Seqüência

Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos Condicionamento da coluna com fase móvel Monitoramento da linha de base Injeção das amostras

PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

FATOR DE RETENÇÃO (k)

FATOR DE SEPARAÇÃO ()

NÚMERO DE PRATOS (N)

Cromatograma

tR

tM

TEMPO

SIN

AL

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)

tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um

composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)

A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:

TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

w2 na linha de base

BANDA CROMATOGRÁFICA

Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fasesNão leva em conta o tempo morto da coluna

FATOR DE RETENÇÃO (k)

tr – tok =to

tr = tempo retenção analito

to = tempo morto da coluna

t r o

ok = t t

Se: t0 = 1,5 mint1 = 3,5 mint2 = 4,2 min

k1 = 1,3

k2 = 1,8

FATOR DE SEPARAÇÃO ()

k2

=k1

AVALIA A SELETIVIDADE

Se:

k1 = 1,3 k2 = 1,8

= 1,38

k1 = 1,3

k2 = 1,8

k2=

k1

= 1 não houve separação

NÚMERO DE PRATOS (N)

Mede a eficiência do sistemaDepende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel

trN = 5,54w0,5

2

Resolução

é função da

Seletividade ()Eficiência da coluna (N)

Fator de retenção (k)

Resolução

Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05

FASE MÓVEL

- Solvente grau HPLC (alta pureza)

- Filtração (membrana 0.45 μm)

- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático)

- Purgar os solventes

MODOS DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICO:

Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.

GRADIENTE: - Variação da composição da fase móvel (FM)

ao longo da corrida.- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)

Mudança no modificador orgânico

ab

cd

ab

cd

[ MeOH/H2O ]par crítico : c,d

[ THF/H2O ]par crítico : a,b

ab

cd [ MeOH/THF/H2O ]

1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)

2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)

3) EXTRAÇÃO:

- LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Filtração

É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 m mesh para a remoção do material insolúvel.

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO

Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante

AMOSTRA

PADRÃO

Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do

analito suspeito

ANÁLISE QUANTITATIVA

A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector

Cálculo de área:

ANÁLISE QUANTITATIVA

Se ambos os compostosrespondessem igualmente aodetector poderíamos usar a relação:

Massa A Área AMassa B Área B

No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.

PADRONIZAÇÃO EXTERNA

Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão.

Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:

PADRONIZAÇÃO EXTERNA

Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra.

É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado.

Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância

PADRONIZAÇÃO INTERNA

Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração.

Mx = massa do componente xMa = massa da amostraMp = massa do padrãoAp = área do padrãoAx = área corrigida do componente x

PADRONIZAÇÃO INTERNA

A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada

Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.

APLICAÇÕES

APLICAÇÕES cont…

APLICAÇÕES cont…

TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.

AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6