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LICENCIATURA:

TRIMESTRE LECTIVO:

HORAS SEMANA:

NOMBRE DEL PROYECTO:

NOMBRE DEL ASESOR:

LUGAR DE SERVICIO:

? FECHA DE INICIO:

i Zavala Pere? Martin

6-54-02-67

8724475 1

C&S - Ingenieria Bioquímica Industrial.

94-P

20 Horas.

//r Estudio de la dinámica de Inmovilización de Bacterias anaerobias en Termofilia.

M. en C. Mónica Meráz Area de Microbiología, Depto. de Biotecnología.

7

-2

U A " I

9 de Septiembre de 1994.

FECHA DE TERMINACION: 9 de Marzo de 1995.

CLAVE: IBI.03 1.94

ZAVALA PEREZ MARTIN ~-

.M. en C. MONICA MERA2

' AREA DE MICROBIOLOGIA i PROFESOR TITULAR

DEPTO. DE BIOTECNOLOGIA

INFORME FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

"ESTUDIO DE LA DINAMICA DE INMOVILIZACIONDE BACTERIAS ANAEROBIAS EN TERMOFILIA "

INDICE

OBJETIVO Pagina 1

JUSTIFICACION 1

4

5

INTRIDUCCION - Etapas de Degradación - Microorganismos Anaerobicos termofilicos - Esquema de la Digestión Anaerobia - Degradación de la Materia Orgánica en Termofilia - Descripción de la Bacteria (Methanothrix) - Bases Fisicoquímicas de Adherencia Microbiana - Bases Bioquímicas para la Adhesión y Agregación - El Desarrollo de Biopelículas - Efecto del Tipo de Soporte

PLAN GENERAL, DE TRABAJO - Inóculo - Sistema de Inmovilización - Alimentación del Inóculo - Alimentación del Reactor - Actividad Acetoclástica - Determinación de Proteína - Determinación de SSV

METODOLOGIA - Preparación del Medio de Cultivo - Actividad Específica de las Partículas - Adición de Sustratos - Toma de Muestras - Análisis de Muestras - Determinación del Balance Poblacional por la Técnica

- Elaboración de la Curva Estándar de AGV - Elaboración de la Curva Estándar de Metano - Elaboración de la Curva Estándar de Proteína - Determinación de Sólidos Suspendidos Volátiles - Actividad Metanogénica

del número más Probable

2 3 4 5 6 7 7 8 8 9

10

10 10 10 11 11 11

12 12 13 13 14 14

15 16 16 17 18 20

6 RESIJLTADOS - Determinación de proteína - Determinación del Número más Probable - Determinación de Sólidos Suspendidos Volátiles - Actividad Metanogénica - Actividad Acetoclástica - Gráfica No. 1, Determinación de Proteína - Gráfica No. 2, Determinación del NMP - Gráfica No. 3 , Determinación de la Actividad Acetoclástica - Gráfica No. 4, Determinación de la Actividad Metanogénica

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

ANEXO - Determinación de la Curva Estándar de Proteína - Determinación de la Curva Estándar de Acetato - Determinación de la Curva Estándar de Metano - Gráfica No. 5, Curva Estándar de Metano - Gráfica No. 6, Curva Estándar de Acetato - Calculo de la Producción de Metano

10 BIBLIOGRAFIA

21 21 21 21 23 23 24 25 26 27

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30

31 31 31 32 33 34 35

37

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1.- OBJETIVOS:

- Determinar la dinámica de inmovilización de bacterias anaerobias (Methamthrix) sobre el soporte de polietileno.

- Se determinará la actividad acetoclástica que presentan las bacterias anaerobias sobre el acetato a los 30, 60, 90 y 120 días de inmovilización.

- Se evaluará la cantidad de proteína cada 30, 60, 90 y 120 días como una forma de cuantificar la biomasa inmovilizada.

- Se analizará la actividad metanogénica por las bacterias inmovilizadas.

- Se determinará la cantidad de sólidos suspendidos volátiles como una forma de conocer la cantidad de materia orgánica adherida a la superficie de los plásticos.

2.- JUSTIFICACION

Por la gran importancia que representa la inmovilización en condiciones termofiiicas en el tratamiento de efluentes industriales, procedentes de los procesos de transformación de productos alimenticios a elevadas temperaturas y por no existir información sobre este tema.

1

3.- INTRODUCCION

Desde ¡os años sesentas se ha venido desarrollando una creciente preocupación por el medio ambiente entre el hombre y el medio que le rodea. Por lo que, los "desechos industriales" han estado adquiriendo más importancia debido a la gran cantidad de desechos sólidos, líquidos y gaseosos que producen las industrias de transformación y otras, ya que estos desechos varían en cantidad y composición de acuerdo al tipo de industria y el proceso empleado en la transformación. Por lo que, actualmente son muy numerosas las industrias con problemas de dificil tratamiento y disposición de los desechos que producen, ya que estas contienen materia mineral suspendida, coloidal y disuelta, así como sólidos orgánicos y, para ello se busca la manera de disponer de estos lo más pronto posible y a un menor costo. Además de que estas pueden ser excesivamente ácidas o alcalinas y tener baja o alta concentración de materiales colorantes, inertes, orgánicos o tóxicos y posiblemente bacterias patógenas. La mayoría de los desechos orgánicos provenientes de las industrias de transformación pueden ser atribuibles a tratamientos biológicos, como son los desechos líquidos de las industrias lecheras, enlatadoras, empacadoras, textiles y papeleras; por lo que, el grado de tratamiento que requiere un desecho industrial, depende de la dilusión y características estabilizadoras de la corriente receptora, hasta obtener una concentración reducida a l mínimo en la planta de tratamiento. Por lo que los procesos de tratamiento que se emplean dependen de las características del desecho. En donde estos procesos son adaptaciones de la práctica del tratamiento de aguas negras y se modifican frecuentemente para obtener los resultados más eficaces, según sea el caso (Manual de tratamiento de aguas, 1964). Por consiguiente el progreso en la tecnología de tratamiento de aguas residuales industriales, agrícolas y urbanas por digestión anaerobia ha sido posible gracias a los avances logrados en el conocimiento de las bases microbiológicas, cinéticas y estequiométricas del proceso y a la aplicación de conceptos de diseños característicos aplicados en la ingeniería química. Ya que, la aplicación de los procesos anaerobios es ahora una alternativa interesante a los procesos aerobios, incluso para efluentes muy diluidos ( aguas residuales urbanas con concentraciones inferiores a 500 mg. DQO/L) y se considera económicamente favorable para el tratamiento de efluentes con una concentración hasta de 50 g de DQOL (Lema, 1993). La digestión anaerobia es un proceso complejo de conversión de la materia orgánica a acetato, bióxido de carbono, hidrógeno y finalmente metano. Este fenómeno tiene lugar en diversos tipos de ambientes como: pantanos, sedimentos de lagos, materia en descomposición anaerobia, fuentes calientes sulfurosas y en el tracto digestivo del ganado vacuno de ovejas y el hombre ( Guyot, 1988).

2

La biometanación es realizada por un conjunto de poblaciones bacterianas complejas, las cuales bajo condiciones ambientales particulares ( Potencial redox menores a -350 mv, pH cerca de la neutralidad) dan lugar a asociaciones estables. Por lo que en los ambientes naturales anaerobios que contienen compuestos orgánicos complejos, las bacterias metanogénicas están relacionadas con otras bacterias quimioheterótrofas para la degradación de la materia orgánica. La biometanación puede ocurrir en ambientes:

Psicrófilos 10 - 25" C. Mesófilos 30 - 40" C. Termófilos más de 45" C

en donde para esta última, se hace una distinción entre bacterias termotolerantes que crecen de 30 - 35" C, pero también a 50" C, y las bacterias termofilicas que tienen su temperatura óptima de crecimiento desde 55" C hasta 100" C ( Ramírez, 1992). Las especies bacterianas implicadas en el proceso de la digestión anaerobia de la materia orgánica, pueden ser diferentes de un lugar a otro, esto depende de las condiciones físicoquímicas como son la temperatura, pH, presión osmótica y la composición del sustrato ( Ramirez, 1992). Las bacterias metanogénicas pueden utilizar sólo en un número limitado de sustratos simples (H2-CO2, acetato, formato, metanol, metilaminas, etc.) y son dependientes de otros m icroorganismos fermentativos que degradan los compuestos orgánicos a sustratos que pueden utilizar, siendo los productos de fermentación ácidos orgánicos, H2 y C02, ácidos grasos de cadena corta (propionato y butirato) y otros productos de fermentación como: etanol y lactato que son oxidados a acetato por un grupo terminal, en donde el acetato es el precursor de 2/3 partes o mas del metano producido en mesofilia y termofilia en digestores anaerobios (Zinder, 1990).

E'TMAS DE DEGRADACIQN

En los estudios realizados por Mc, Inerney y col. (1981), propusieron un esquema en tres etapas para la producción de metano en los ecosistemas anaerobios. Por lo que, la transformación de las sustancias orgánicas complejas a metano se lleva a cabo por un gran número de bacterias que actúan sintróficamente aunque a distintas velocidades. La primera etapa consiste en la hidrólisis y acidogénesis de los compuestos de alto peso molecular (proteínas, lípidos, carbohidratos) a unidades químicas más simples como azúcares, aminoácidos y su fermentación a ácidos grasos volátiles (AGV), otros tipos de bcidos, alcoholes, hidrógeno y bióxido de carbono.

3

En la segunda etapa, las bacterias ( que deben existir en simbiosis con las metanogdnicas utilizadoras de hidrógeno) oxidan los alcoholes y ácidos grasos no volátiles (más de cuatro carbonos) a acetato e hidrógeno. En la tercera etapa, las metanogénicas (acetoclásticas y utilizadoras obligadas de hidrógeno) transforman el acetato, hidrógeno y bióxido de carbono en metano ( Monroy, 1993).

MICROORGANISMOS ANAEROBICOS TERMOFILICOS

Bacterias hidrolíticas de la digestión anaerobia:

ESPECIES SUSTRATO Clostridium thermocellum Celulosa Clostridium thermohydrosulhricum Almidón, Pectinas

Bacterias fermentativas de la digestión anaerobia:

2 2 2 4 6 4

ESPECIES SUSTRATO Clostridium thermo-aceticum Acetato Acetogenium kiwi Thermo-anaerobium brockii Iactato, acetato, etanol ;, c? Thermo-bacteroides acetoethilicus etanol, acetato, butirato, isobutirato tr, "_ Thermo-anaerobacter ethanolicus Etanol, acetato, lactato, isobutirato, I3

L,.; ;.I; r=j

Clostridium thermo-saccharolyticum Etanol, acetato, lactato, butirato, formato. 2 5 En los estudios realizados por Garcia (1990), hace una extensa clasificación taxonómica de ( -,

l % 7 I ?

otros generos y especies metanogénicas. Propiedades de Bacterias Metanogenicas termofílicas

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isovalerato.

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Cultivo Morfologia Topt ("C) td en acetato máxima de acetato

Methanothrix Filamentos, los 60 24 12-20 PM cuales se fragmentan faciimente en bacilos pequeños.

cocos grandes Methanosarcina Formación de 55 12 1-2.5 mM

1 en paquetes. I Tabla 1

4

ESQUEMA DE LA DICESTIQN ANAERQBIA

"" .. ~ "" ". .. "_ "_ - PRO'TEINAS CARBOHIDRA'TOS L I P I D O S ~

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I _ _ "" 1"""-

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VOLATILES 1' i __.__-

ANAEROBIA

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1

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ACETOCLASTICAS '\

HIDROGENOTROFICAS

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Fig. 1. Flujo de curbun a metano y dioxido dr carbono rn un biorwactor unuerubio

( Monroy, 1993)

5

DEGRADACION DE LA MATERIA ORGANICA EN ‘TERMOFILIA

El uso de digestores anaerobios termofilicos para la transformación de los residuos orgánicos a metano, hé uno de los primeros usos biotecnológicos empleados en termofilia. En donde la facilidad de estos procesos termofilicos hé demostrado primero por Rudolfs y Heukelekian en 1930. Desde entonces, se han realizado numerosos estudios en el laboratorio y en reactores a nivel piloto, demostrando que una amplia variedad de aguas domésticas, agrícolas e industriales pueden ser tratadas por digestores anaerobios termofilicos (Zinder, 1990). La ventaja de los digestores anaerobicos termofilicos es que el metabolismo promedio es más acelerado en relación a los correspondientes procesos mesofilicos, y los tiempos de retención se podrian disminuir a la mitad. Otra ventaja, es que en los procesos termofilicos las aguas presentan una baja viscosidad y los microorganismos patógenos son esencialmente pasteurizados, haciendo el producto final mis sanitario. La desventaja de los digestores anaerobicos termofilicos es que se requiere más energia para mantener la temperatura alta; aunque en muchos casos, el calor es un producto de despilfarro en algunas industrias: queseras, enlatadoras, vinicolas, textiles, lecheras y otros alimentos. Las vinazas en la digestión anaerobia es la alternativa más intensamente estudiada, debido a que es capaz de generar energia que puede ser utilizada en la planta industrial para cubrir parte de las necesidades de calor y/o electricidad (Amur y Col., 1993). En los digestores anaerobicos termofilicos los bajos tiempos de duplicación ofrecen una explicación parcial por la velocidad elevada de metanogénesis y el corto tiempo de retensión cuando se comparan con reactores anaerobios mesofilicos (Zinder, 1990).

6

DESCRIPCION DE LA BACTERIA A4e/hat~>/hrix

En 1983, Nozhevnikova y Yagodina describen un cultivo termofilico, el cual transforma el acetato a metano y lo describen morfologicamente similar a Mtthumfhrix soehtgenii. El cultivo fué obtenido de un lago termal localizado en Kamchatka, U.S.S.R., y otros cultivos similares heron obtenidos de biorreactores anaeroblos ter~nofilicos, donde el cultivo h e nombrado Methanothrix therntoacetophila. Mostró un crecimiento óptimo a una temperatura de 65" C y solo usaba acetato como sustrato para la metanogénesis, lo que es similar a h4ethatmthrix soehngenii. En los trabajos realizados por Zinder, obtuvieron un microorganismo similar en un biorreactor anaerobio termofilico y lo llamaron Methanothrix sp. cepa CALS-I . Lo cual resultó interesante, debido a que ambas bacterias presentaban vesículas de gas, mientras que en los cultivos de Methanothrix mesofilicos no se habían reportado. Las células de CAIS-I mostraron más vesiculas de gas después de haber consumido todo el acetato en el medio de crecimiento, por lo tanto el número de vesículas de gas por célula puede ser regulado por la disponibilidad del nutriente. El sustrato utilizado en la prueba para la metanogénesis por Methanothrix sp. cepa CALS-1 fui acetato y, el tiempo de duplicación a 60' C fié cerca de 24 horas y el pH óptimo cerca de 6.5 (Zinder, 1990).

BASES FISICOQUIMICAS DE ADHERENCIA MICRORIANA

Por su tamaño pequeño (micras), las bacterias pueden ser consideradas en algunos casos como partículas coloidales para explicar la agregación en términos de fenómenos de adhesión de coloides. A continuación se mencionan los 3 procesos básicos de inmovilizacibn de biomasa que ocurre anaerobicamente:

1 .- Se presenta la fijación de los microorganismos al soporte. 2.- La fi-iación microbial en partículas suspendidas. 3.- Los microurganismos son agregados en gránulos fuera de soportes a nivel microscopico.

Después de que una célula es transportada del seno de una solucibn a una superficie inorgánica por transporte pasivo (movimiento browniano) o activo (motilidad), la adhesión tiene lugar. Este paso inicial puede ser descrito por teorías fisicoquimicas en donde las superficies bacterianas estan cargadas negativamente a pH neutro y por lo tanto se repelen las unas a las otras. De acuerdo a la teoria eiectrocinética, la adhesión puede ser explicada como un proceso dependiente del tiempo, el cual resulta a partir de un balance entre fierzas electrostáticas de repulsión y fuerzas de atracción de Van der Waals, las cuales estan en función de la herza iónica de la superficie liquida.

7

La teoría dice que la adhesión rnicrobial se incrementa proporcionalmente con una disminución de la tensión superficial del sustrato, (aumento de hidrofobicidad) y que las células hidrhfobas se adhieren a url sustrato dado (Guiot, 1992).

BASES RIOQUIMICAS PARA LA ADHESION Y AGREGACION

El mayor factor biológico de adhesión y agregación es la propiedad que presentan los microorganismos para producir sustancias exopoliméricas (EPS). Después de que se ha iniciado el contacto a una superficie, se ha visto que las bacterias producen los exopolímeros para poder fijarse ellas mismas a la superficie del soporte o entre ellas mismas. La composición química del EPS consiste de homopolímeros simples o heteropolimeros muy complejos los cuales incluyen una amplia variedad de monosacaridos como: hexosas neutras, 6-deoxihexosa, polioles, ác. uronicos, ác. hialuronicos y aminoazúcares. Un gran porcentage de material de EPS es de peso molecular cerca de 10,000. Por lo que el EPS puede tener varias formas: capas delgadas o limo secreción viscosa periferica, cápsulas típicas rodeadas por una área larga de material fibroso, matriz de fibras desorganizadas, estructuras semejantes a fibras, material amorfo extendido entre las células. También se ha sugerido que el EPS provee una matriz para la formación de enlaces permanentes (enlaces polares extendidos entre grupos negativos [-COO -PO41 unidos por cationes multivalentes ) de -H de grupos hidroxíl proximos a carbohidratos (Guiot, 1992).

EL DESARROLLO DE BIOPELICULAS

Los pasos para el desarrollo de biopelicula se presentan sobre cualquier superficie expuesta a un medio acuoso. Este proceso implica varios pasos individualmente reconocibles:

1 .- La absorción de moléculas orgánicas a superficie del soporte. 2.- El transporte de las células microbiales a la superficie. 3 .- La adhesión de las células a materia inerte o entre ellas. 4.- La síntesis de estructuras de EPS que asegure la integridad de la biopelícula (adhesión permanente). 5.- Desarrollo de biopelícula como resultado del crecimiento de microorganismos. 6.- La separación de las partículas de biopelícula causado por las fuerzas cortantes del fluido.

Por lo tanto, el crccimiento de la biopelícula resulta del balance entre la colonización microbial y la acción de esfuerzos cortantes sobre la biopelicula y su multiplicación (Guiot, 1992).

8

EFECTO DEL TIPO DE SOPORTE

En observaciones realizadas a nivel laboratorio se encontró que la tensión superficial del soporte y la influencia del líquido en la adhesión celular, esta aumenta proporcionalmente con la hidrofobicidad. Sin embargo, en la práctica los resultados experimentales de las características de la superficie del soporte cambia en los primeros minutos de expuesto al medio, ya que la primer película de moléculas orgánicas adheridas a la superficie modifican las propiedades fisicsquímicas del soporte. Por consiguiente, la naturaleza química del soporte presenta poca importancia en la adhesión celular y la efectividad en la inmovilización de biomasa es probablemente más dependiente mecanicamente que termodinámicamente 6 por propiedades electrostáticas del soporte. Los siguientes materiales se han utilizado para inmovilización, y estos son mostrados respecto a su hidrofobicidad (la tensión suprficial disminuye desde 141 a 22 d l m E + 2 ) :

Tabla 2

Vidrio Poliestireno sulfonatado Poliexametileno adipamida Poliacetal (Nylon 6.6) Policarbonato Polimetilmetacrilato Poliuretano Polivinilcloruro (PVC) Polietileno de baja densidad Poliestireno Polietileno de alta densidad Polivinilfluoruro Polipropileno Politetrafluorotileno(teflón) (Guiot, 1992).

"

I

9

4.- PLAN GENERAL DE TRABAJO

Sistema de inmovilización:

La dinámica de inmovilización se realizó durante 120 días en un reactor de lecho fluidificado inverso y chaqueta con ¡as siguientes dimensiones: El reactor con un volumen aproximado de 500 ml; un sedimentador de 350 m1 y un regulador de flujo de 200 mi; 2 bombas peristalticas, una para bombear el medio de cultivo ( 9 m/hr) y la otra para bombear el agua a la chaqueta del reactor; un regulador para alimentar el medio de forma constante. Al reactor se le adicionaron aproximadamente 200 m1 de plásticos con la siguiente distribución de tamaño de Dartícula:

0.56 0.42 0.28

75.5 24.0 o. 5

l a b h 3

Inóculo: El inóculo utilizado para llevar a cabo la inmovilización h e un lodo anaerobio mesófilo adaptado a termofilia (SS" C) en lote, con una mezcla de ácidos grasos volátiles (AGVs) tales como acetato, propionato y butirato en proporciones de S00:250:250 mg de DQOL, hasta alcanzar una concentración de 3700mg de SSV/L y una actividad metanogénica de 0.00456 miligramos de CH4Ig SSV/ día. La observación al microscopio mostró bacterias metanogénicas agrupadas en sarcinas y bacilos formando filamentos largos. Alimentación de inóculo: La alimentación consistía en cambiar el medio de cultivo ( Balch y col, 1979) una vez a la semana y mantenerlo en incubación a 55" C. Alimentación del reactor: El cambio del medio de cultivo ( Balch y col, 1979) se realizaba cada tercer día adicionando 0.5 g de acetato de sodio, 0.5 g de glucosa anhidra y 1 m1 del inóculo.

El pH del medio se ajustaba a 7

Cada 30 días y durante un periodo de 120 días se realizaran las siguientes determinaciones:

- NMP. Para determinar cual es el balance poblacional de bacterias que se inmoviliza.

Bacterias: - Fermentativas - Hidrogenofilicas - Acetoclásticas

10

- ACT. ACETOCLASTICA. Para conocer cual es la actividad especifica de las partículas sobre el acetato, ya que su análisis nos permite seguir las actividades bacterianas de las cinkticas de biodegradación anaerobia de acetato.

- DET. DE PROTEINA. Como una forma de cuantificar la cantidad de biomasa inmovilizada (Sedmak y col, 1976).

Al finalizar la parte experimental del proyecto, se determinó la cantidad de sólidos suspendidos volátiles (Manual de técnicas de análisis para aguas residuales, 1992).

- SSV: Su determinación se llevo a cabo con el proposito de conocer la cantidad de materia orgánica adherida en la superficie de los plásticos de polietileno empleados en la inmovilización.(Manual de técnicas de andisis para aguas residuales, 1992).

1 1

5.- METODOLOCIA:

1 .- Preparación del medio de cultivo:

Solución mineral I de Balch, et al (1 979) a

Solución mineral 11 de Balch, et al (1979) a

Solución de Oligoelementos de Balch, et al (1979) a

Solución de Vitaminas de Balch, et al (1979)"" Solución de FeS04.7H20 (0.2%) Solución de NiCI2 (50 mdl) Solución de Resarsurina (O. 1%) NaHC03 Extracto de Levadura Peptona de Caseina Cisteina

12.5 ml. 12.5 2.5 1 .o 1 .O 1 .o 1 .o 2.0 g o. 1 o. 1 o. 5

Mezclar las soluciones y disolver en 1 litro de agua destilada, previamente hervida durante 1 O minutos y reducida con Nitrógeno otros 1 O.

a Estas soluciones se preparan 4 veces concentradas y se guardan en refrigeración.

antes de usarla. Esta solución se prepara 10 veces concentrada y se guarda en refrigeración, se agita bien

2.- Arranque y mantenimiento del reactor.

Para la inmovilización, se preparan las partículas de plástico con un tratamiento de acondicionamiento, el cual consiste en agitarlas a alta velocidad con un vert- px en un matraz de volumen sobrado agregando una cantidad de agua destilada, peptona de caseína y extracto de levadura. Este tratamiento dura de una a dos horas. Posteriormente, cuando los plásticos adquieren movilidad en el líquido, se drenan y se depositan en el reactor por la parte superior. Finalmente, el reactor y el sedimentador se llenan con el medio de cultivo al que previamente se le ha agregado 1 m1 del inóculo y 0.5 g de glucosa anhidra, y se eliminan las burbujas que puedan quedar en las mangueras. El medio de cultivo que se prepara para el mantenimiento del reactor es sin resarsurina y cisteina. Una vez preparado el medio de cultivo, puede ser esterilizado y guardarse en refrigeración para uso posterior. El reactor se mantiene cambiando el medio de cultivo cada tercer día, asegurandose de que el pH sea de 6.5 a 7.

12

7 . - Actividad específica de las partículas

Para determinar la actividad especifica sobre un sustrato de las partículas en inmovilización es necesario que esten libres de Iodos o de cualquier otro tipo de sólidos sedimentables. Con este fin el reactor se alimentará con medio fresco, pero no se inoculará durante los dos días previos a la cinética. El medio de cultivo para determinar la actividad específica es con medio Balch y col. (1979), reducido por ebullición bajo corriente de nitrógeno durante el tiempo necesario hasta obtener el vire del colorante (aprox. 10 minutos) y se enfría bajo corriente de nitrógeno. Ya que se enfrió un poco, se le agrega la cisteína y se vierte bajo corriente de nitrógeno en botellas serológicas de 60 ml, adicionando 20 m1 a cada una. Se tapan con tapón de hule, se anillan con aros de aluminio y se cambia de atmósfera con N2/C02 (80%/20 %) durante 1 minuto y se esteriiizan durante 10 minutos a 121" C. Para lavar las partículas se prepara en un matraz, medio Balch sin peptona de caseína, extracto de levadura, cisteína y resarsurina, reducido por ebullición y bajo corriente de nitrógeno por 10 minutos. Se enfria y se utiliza inmediatamente, pero puede ser esterilizado en caso de guardarse para uso posterior. En una probeta de 100 ml con "cola de rata" de vidrio en la parte inferior con una manguera de hule corta y una pinza Hoffman que servira para drenar el líquido, se ponen las partículas que se sacan del reactor por la parte de arriba. Cuando todo el material esta listo y frío, se introducen en la precámara las botellas sin los aros de aluminio, el matraz con medio Balch para lavados, las partículas en la probeta, una espatula pequeña y un matraz adicional para liquidos de desecho. Después de los vacíos subsecuentes en la precámara, todo el material se pasa a la cámara y las partículas en la probeta se lavan varias veces con medio Balch, se drena el líquido por la parte inferior y cualquier sólido sedimentable, de manera que solo queden en la probeta los plásticos limpios. Se destapan las botellas y las partículas se agregan a cada botella en volumenes de 5 ml a cada una, medidos con probeta y adicionados con la espatula a manera de cucharita. La cantidad de plásticos a agregar debe ser muy exacta a cada botella, ya que los errores en esta medición pueden llevar a diferencias importantes entre los triplicados en la forma en que la cinética se desarrolla. Al finalizar esta operación, las botellas se tapan con el tapón de hule, se sacan de la cámara y se colocan nuevamente los aros de aluminio.

4.- Adición de sustratos.

Los sustratos utilizados son acetato, propionato y butirato de sodio en concentra,ción 1 M Se preparan pesando las sales por separado para alcanzar esta concentración en un volumen de agua reducida. Las sales ya pesadas se ponen en botellas serológicas y se adiciona el agua reducida bajo corriente de nitrógeno. Se tapan con tapón de hule, se anillan y se esterilizan durante 10 minutos a 121" C.

Para la adición de sustrato se consideran para la cinética, tres botellas control a las cuales no se les agrega ningún sustrato y tres botellas para cada uno de los sustratos a utilizar. La adición de sustrato se hace en condiciones estkriles flameando las tapas de las botellas con alcohol y se utiliza jeringa de insulina estéril desechable purgada en corriente de nitróge.no para tomar el volumen del sustrato correspondiente para alcanzar una concentración I O mM y agregarlo a la botella de prueba de plásticos. Se utiliza una jcringa diferente para cada sustrato. N agregar el sustrato se inicia la actividad y las botellas se ponen en incubación a una temperatura de 60" C.

5.- Toma de muestras.

Las muestras se toman a intervalos regulares de tiempo. La muestra líquida de 0.5 m1 se toma con jeringa de insulina desechable que se ha purgado previamente en corriente de nitrógeno, evitando succionar o causar turbulencia a los plásticos y se deposita en un vial de plástico o vidrio y se congela para análisis posterior. Es recomendable utilizar una jeringa limpia para cada una de las muestras. La muestra gaseosa de O. 1 m1 se toma tambien con jeriga purgada, evitando humedecerla con la fase líquida y se inyecta directamente al cromatógrafo para la determinación de C 0 2 y CH4. En todos los casos las tapas de las botellas se tlamearan con alcohol antes de la toma de las muestras.

6.- Análisis de muestras.

Las muestras líquidas se analizaron por cromatografia de gases en un cromatógrafo HP 5890 con detector de ionización de flama en una columna de acero inoxidable empacada con AT- 1 O00 a las siguientes condiciones: Temperatura del Inyector = 210" c Temperatura de la Columna = 180" c Temperatura del Detector = 210" c Flujo del Nitrógeno - 30 ml/min. Flujo de Aire - 300 ml/min. Flujo de Hidrógeno - 1 O0 ml/min. Volumen de Inyección - 2 microlitros. Las muestras gaseosas se analizan en un cromatógrafo Gow-Mac con detector de conductividad térmica, en una columna de acero inoxidable empacada con Carbosphere 80/ 1 O0 con las siguientes condiciones: Temperatura del Inyector = 170" C Temperatura de la Columna = 140" C Temperatura del Detector = 190" C Flujo de Hélio - 50 ml/min. Volumen de Inyección - 0.1 ml

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14

7.- Determinacion de balance poblacional por la técnica del número más probable (NMI').

El balance poblacional se hace en tubos de Hungate por cuadruplicado para cada dilucicin a los que se les ha adicionado medio Balch reducido por ebullición bajo corriente de nitrógeno durante 10 minutos o el tiempo necesario para obtener el vire del colorante y se enfría bajo corriente de nitrógeno, ya que se enfría un poco, se le agrega la cisteína y se vierten bajo corriente de nitrógeno 5 ml a cada tubo, se tapan con el t a p h de rosca y septa y se cambia de atmbsfera con mezcla N2/C02 (80 %/20 %) durante 1 minuto, se esterilizan durante I O minutos a 121" C. Para obtener una suspensión de microorganismos, se toma un tubo de Hungate con medio ya estéril y se le agrega 1 cm de altura de plásticos medidos sobre el tubo con una regla, estos plásticos deben estar libres de sólidos sedimentables y limpios en la cámara anaerobia. Se saca de la cámara y se agita en vortex con una potencia 50 a 60 Hz por 5 minutos. Se flamea la tapa de este tubo y de todos los demás; de la fase liquida se toman 0.5 m1 con jeringa estéril y purgada en corriente de nitrógeno y se inocula cada uno de los 4 tubos de la primera dilucihn con esta cantidad. Esta sera la dilución 1 X10-1 y a partir de esta se inocularán los tubos subsiguientes para las demás diluciones. Se recomienda usar una jeringa estéril para cada una de las series de cada cuatríplicado. Se recomienda inocular una serie de tubos que contenga todas las diluciones que se manejarán, con el objeto de utilizarla como serie control. A esta serie no se le agregará ningún sustrato, pero se incubará y se le harán las determinaciones correspondientes al finalizar el tiempo de incubación. Después de la incubación se procede a adicionar los sustratos que se van a probar a las series respectivas, excepto a la serie control. Los sustratos utilizados dependen del grupo bacteriano que se desea cuantificar.

GRUPOS BACTERIANOS: 2 2 2 4 6 1

SUSTRATO:

bacterias acetoclásticas acetato de sodio bacterias hidrogenotrofas mezcla H2-CO2 (20%/80%) bacterias fermentativas glucosa Las sales de los ácidos y la glucosa se preparan como se indica en el punto número 4. La concentración final que se debe alcanzar en cada uno de los tubos es de 5 IM. La adición de sustrato se hace en condiciones esttiriles flameando las tapas de los tubos con alcohol y se utiliza jeringa de insulina estéril desechable y purgada en corriente de nitrógeno para tomar el volumen de sustrato correspondiente para alcanzar la concentración indicada y agregarlo al tubo de prueba. Se utilizará una jeringa diferente para cada sustrato. Para la mezcla de H2-CO2 (20%/80%), se adiciona a los tubos haciendo pasar el flujo del gas a través de una jeringa de vidrio empacada con fibra de vidrio, tapada con tapón de hule y sellada con aro de aluminio y esterilizada, en la que se colocará la aguja que se insertará en el tubo para alimentar el gas durante 2 minutos. La alimentación se realizara cada tercer día en condiciones estériles.

Al agregar los sustratos se inicia la determinación y los tubos junto con el control se ponen en incubación durante I5 días a la temperatura de 60" C. Después de este tiempo, se prueban los tubos para verificar cuales son positivos. En el caso de las bacterias acetoclásticas e hidrogenotrofas se determina el metano producido por cromatografia de gases como se indica en los puntos S y 6. La medición es cualitativa. En el caso de las bacterias fermentativas, se mide el pH a cada tubo. Los tubos que resulten con pH menor o igual a 6 se consideran positivos. Posteriormente se recurre a las tablas de NMP y se relaciona la cantidad de bacterias con los SSV y se reporta.

8.- Elaboración de curva estándar de AGV

Para la curva estándar de AGV (acetato, propionato y butirato de sodio) se preparan los estándares en concentraciones de 1, 5 y 1 O m M , a partir de una solución madre de AGV de 100 mM. Cada estándar se inyecta en el cromatógrafo como se indica en el punto 6.a. dos o tres veces, replicando las áreas registradas para cada concentración y cada compuesto. Cuando se han inyectado todos, se promedian las áreas registradas para cada concentración y cada compuesto. Se hace una regresión lineal para relacionar las áreas obtenidas y las concentraciones de cada compuesto y se obtienen los coeficientes de la recta, así como la correlación. Los coeficientes (pendiente y ordenada al origen) se introducen en el archivo para AGV del integrador. Finalmente, se inyecta un estándar para probar la exactitud de la calibración.

9.- Elaboración de curva estándar de metano

Para la curva estándar se preparan 10 botellas serológicas que contengan 25 m1 de agua destilada y reducida. Se tapan con tapones de hule y se anillan. Las cantidades de metano que se manejarán seran de 2,4,6,8,10 ml de metano que se tomarán directamente del tanque a una presión de 1 kg/cm2 en el regulador, con jeringa desechable de 10 m!. Estas cantidades se agregan a las botellas por duplicado. Ya preparadas las botellas se analiza cada una como se sefiala en el punto 6b. se registran las áreas y se relacionan las concentraciones de metano que se encuentra en la fase gaseosa de la botella con el siguiente cálculo: 1 mol de metano a 1 atm de presión corresponde a 3 1630 m 1 de metano, entonces.

" I ml de CH4 X 1 mol CH4 X 1E+6 Ltmd = 0.9033 pmol/ml f.g 35 ml f g 3 1630 m1 CH4 1 mol

16

Este mismo cálculo se hace para las demás concentraciones. Con las áreas y las concentraciones se elabora una regresibn lineal para obtener los coeficientes de la recta y la correlación.

10.- determinación de proteína

La determinación de proteína se hace utilizando azul brillante de Coomassie G-250 con ácido perclórico (Sedmak y col. 1976). El colorante se prepara como una solución al 0.06% en ácido perclórico al 3% y se filtra en filtro Whatman No. 1 para remover el material insoluble. La solución estándar de seroalbúmina bovina se prepara pesando 0.05 g de seroalbúmina bovina para obtener una solución de 50 pgramos/ml. La seroalbúmina se disuelve en 1 litro de una solución de NaCl O. 15 M y se guarda en congelación en frascos de 1 O m1 como solución de reserva. La curva estándar se prepara por duplicado mezclando las cantidades que se señalan en la siguiente tabla.

O o 2 .o o 1 0.2 1.8 10 2 0.4 1.6 20 3 0.6 1 . - I 30 4 0.8 1.2 40 5 1 .o 1 .o 50 6 1.2 0.8 60 7 1.4 0.6 70 8 1.6 0 .1 80 9 1.8 0.2 90 10 2.0 o 1 00 Tabla 4

- -

i

A los tubos de la curva estándar se les adicionan 2 ml del reactivo azul de Coomassie, se espera 2 minutos, se agitan bién y se lee en el cromatógrafo a 620 nm. Se relacionan las densidades ópticas obtenidas con las concentraciones y se obtiene la ecuación de la recta con la cual se correlacionan Ics resultados de las muestras de partículas para obtener las concentraciones.

17

Para obtener una suspensión de microorganismos, se toma un tubo de Hungate que contenga 4 m1 de amortiguador de fosfatos O. I M y se le agrega alrededor de 1 g de plásticos humedos, libres de sólidos sedimentables y limpios en la cámara anaerobiu. Se saca de la cámara y se agita con sonicador con una potencia de 5 0 a 60 Hz pot 15 minutos. Con una jeringa se saca todo el líquido de la suspensión y se deposita en una celda para espectrofotómetro. Se le agrega el reactivo de azul de Coomassie y se espera a que desarrolle el color. Se mide enseguida y se registra la densidad óptica. Este procedimiento se repite 3 ó 4 veces hasta que el amortiguador ya no desarrolle color y la lectura del espectrofotómetro sea cercana a cero. Por medio de la curva estándar se obtiene la concentracih de proteína detectada y la suma de las lecturas de estos "lavados" será el contenido total de proteína soluble en las partículas. Para relacionar la concentración de proteína con la cantidad de plásticos usados, el tubo de Hungate se destapa y se pone a secar a 60" C, durante 24 horas. Después de este tiempo se pesan cuidadosamente los plásticos y esta cantidad se relaciona con la concentración de proteína para expresarlo en microgramos de proteína soluble/gramo de soporte seco.

1 1 . - Determinación de sólidos suspendidos volátiles (SSV).

a.- Preparación del Filtro. Colocar los filtros de fibra de vidrio en el sistema de filtración, lavar 3 veces con 10 ml de agua destilada, succionar con la trampa de vacío hasta quitar el agua completamente, colocarlos en una charola de aluminio y secar en estufa a 100" C hasta obtener un peso constante. Después calcinar en la mufla a 550" C durante 15 minutos. Enfriar en desecador y balancear el peso y la temperatura. Repetir el proceso hasta peso constante. b.- Suspensión de microorganismos. Para obtener una suspensión de microorganismos., se toma una botella serológica que contenga 20 ml de agua destilada a pH de 5 y se le agregan 5 ml de plásticos libres de sólidos sedimentables y limpios en la cámara anaerobia. Se tapa con tapón de hule y se saca de la cámara y se agita con sonicador con una potencia de 50 a 60 Hz por 20 minutos. Con jeringa, se toma el volumen total de la suspensibn y se filtra a vacío en los filtros previamente puestos a peso constante. c.- Determinación de sólidos suspendidos totales (SST'). Se ponen los filtros en cápsulas de porcelana y se secan durante 1 hora a 100' C. Se enfrían en desecador para balancear el peso y la temperatura y se pesan. Se repita la operación hasta obtener peso constante.

Los SST se calculan de la siguiente manera:

ms-Ss_T_ = [Peso B - Peso A) X 1 O00 1 Vm

donde:

mg SST/I = miligramos de sólidos suspendidos totales por litro Peso A = peso del filtro seco, mg Peso B = peso del filtro + material seco, rng Vm = volumen de muestra utilizado, m1

d.- Determinación de sólidos suspendidos fijos (SSF). Los residuos obtenidos en el inciso anterior, los filtros con el material seco, se incineran en la mufla a 550" C durante 15 a 30 minutos. Dejar que el crisol con el filtro se enfrie parcialmente hasta que casi todo el calor se halla disipado y se transfiere a un desecador para enfriarlos totalmente. Pesar hasta obtener un peso constante.

Los SSF se calculan de la siguiente manera:

mg SSF = (Peso C - Peso A) X 1000 I Vm

Donde:

mg SSF/l= miligramos de sólidos suspendidos fijos por litro Peso C = peso del filtro + muestra incinerada, mg Peso A = peso del filtro seco, mg Vm = espacio de la muestra utilizada El procedimiento se repite 3 ó 4 veces hasta que no se detecte diferencia de peso. La suma de las determinaciones de los pesos de estos lavados será el contenido total de sólidos suspendidos totales y fijos (SST y SSF) respectivamente en las partículas.

e.- Determinación de sólidos suspendidos volátiles (SSV). Los SSV se obtienen por diferencia entre los SST y los SSF:

SSV = SST - SSF = mg/l

Para relacionar la concentración de sólidos con la cantida de plásticos usados, la botella serológica se destapa y se pone a secar a 60" C, durante 24 horas. Después de este tiempo se pesan cuidadosamente los plásticos y esta cantidad se relaciona con la concentración de sólidos para expresarlo en miligramos de SSV/g de soporte seco ( Manual de técnicas de análisis de aguas residuales, 1992).

19

12.- Actividad metanogénica

Se prepara el medio Balch como en el punto número 3 y se utilizan tres controles y tres muestras a las cuales se les agrega 0.25 m1 de acetato de sodio I M para obtener una concentración de 1 0 mM en cada una de estas ultimas y se analizan en el cromatógrafo de gases como en el punto 6. Este análisis se realiza cada hora durante 8 horas. La cantidad de metano se determina con la curva estándar y con la fórmula mostrada en el punto 9

20

6.- RESZJLTADOS

- Determinación de proteína.

30 4 584.24 0.4389 60 4 720.72 0.4254 90 3 53 1.20 0.4483

1331.14 1694.2 1 I 184.92

Tabla 5

- Número más probable (NMP).

- Fermentativas: 1X10l2 6X1010 3.2x1014 6x1 01 1

- Acetoclásticas: 6X 1 O 1 O00 6x1 O9 O

Tabla 6

- Sólidos suspendidos volatiles (SS\.:).

De los 4 filtros lavados, se ponen a secar en la estufa a 100" C hasta obtener peso constante:

Filtro Peso (8)

1

1 0.1244 0.1243 0.1242 0.1242 2 0.1252 O. 1250 0.1249 O. 1249 3 0.1268 0.1265 0.1264 0.1265 4 0.1244 0.1241 0.1240 0.1240

21

Después se calcinan en la mufla a 55" C durante 15 minutos, obteniendo:

Filtro Peso (g)

1 2 3 4

Se

O. 1234 O. 1240 O. 1256 O. 123 1

filtra la suspensión de mocroorganisrnos y se ponen en la estufa a 100" C durante una hora hasta peso constante, obteniendo:

Filtro Peso (S) 2 2 2 4 6 1

1 O. 1246 O. 1245 2 O. 1244 O. 1244 3 0.1259 0.1258 4 O. 1234 O. 1233

Con estos datos se calculan los sólidos suspendidos totales, sólidos suspendidos fijos y después los sólidos suspendidos volátiles.

~ _ _ _ Determinación SST (mgn) SSF (mgh) SSV (mgn) Plásticos (8) 1 55 15 2 20 5 3 10 5 4 10 O total 95 "" 25 70 1.5020 Tabla 7

Por lo tanto, l a cantidad de SSV = 70 mdl .

22

- Actividad metanogénica.

Con los datos obtenidos del punto 9 y aplicando la fórmula correspondiente se determina la cantidad de metano'producido durante las 8 hr. de actividad.

Tiempo Controles Metano Diferencia Metano Metano Metano (Hr) (Area) (Area) (Area) (ml) (pmoVml f.g.) (pmol CH4./pg dc proteína)

"_ O O O O o O 0

1 4332 4817 485 0.8276 0.7475 0.004643 2 4895 5554 659 0.8628 0.7793 0.004840 3 5955 6556 601 0.851 1 0.7687 0.004775 4 6763 8859 2096 1.1541 1.0425 0.006475 5 6146 8214 2068 1.1485 1.0374 0.006444 6 6745 7250 505 0.83 16 0.75 11 0.004665 7 6806 7984 1178 0.9680 0.8743 0.00543 1 8 7656 9047 1491 1.0315 0.9317 0.005787

0.04306 Tabla 8 Donde: Eg. = fase gaseosa.

_.

- Actividas acetoclástica.

Días CONCENTRACION DE ACETATO (mM)

Ti T 2 T 3 T 4 T 5 30 5.3263 6.3528 7.8675 9.6620 8.5452 60 11,752 12.096 11.029 13.209 10.434 90 14.975 15.399 16.318 15.577 15.270 120 13.298 15.879 11.892 11.738 11.345 Tabla 9 Donde T = tiempo.

23

W I- O 0

t- uI1 p7

',

\ \

', \

O O O cu

1" 1. " O O O O O O m O m F 7

-

O

O .r;t Y

-d. 8 cv

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W 2 Jzi m w

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O o s O O O o o o

7.-DISCUSION DE RESULTADOS:

Determinación de proteína

Como puede observarse en la grafica 1, se obtiene la mayor inmovilización en los primeros 30 dias. A los 60 días se logró obtener un aumento en concentración, pero a los 90 días se obtiene un decremento en esta, lo cual puede deberse a que en esta etapa, el reactor se desmontó y los plásticos se guardaron en botellas con medio Balch en la incubadora a 55" C durante 18 días aproximadamente, posteriormente se montó el reactor y se le determinó la cantidad de proteína. Además, esta determinación puede deberse a la manipulación de los plásticos al guardarlos y depositarlos nuevamente en el reactor y por los lavados en el cambio del medio de cultivo. A los 120 días se determinó un aumento en la concentración de ésta en relación a la determinación anterior.

Número mas probable

Por lo que respecta al NMP (ver grafica 2), en la primera determinación (30 días) puede observarse una similitud en la cantidad de bacterias a determinar ( fermentativas, hidrogenofilicas y acetoclásticas). A los 60 días puede apreciarse una disminución en la cantidad de bacterias acetoclásticas y en menor proporción las bacterias fermentativas e hidrogenofilicas, lo cual puede deberse a su determinación en tiempos desiguales de 15 hasta 25 días. A los 90 días, las bacterias acetoclásticas e hidrogenofilicas mostraron un aumento en el número de estas, por lo que podría deberse a una mejor adaptación realizada en los 18 días guardados en incubación, sin cambiar el medio Balch y sin la agitación mecánica de los plásticos en el medio líquido, ocasionando un aumento de estas bacterias ( acetoclásticas e hidrogenofilicas) ó como ya se mencionó, por no haber fijado un tiempo exacto en su determinación. A los 120 días puede observarse una desaparición de las bacterias acetoclásticas y las bacterias fermentativas e hidrogenofilicas practicamente permanecen constantes durante los 120 días que duró la inmovilización.

28

Actividad acetoclistica

A los 30 dias que se realizó la primer actividad, puede observarse (grafica 3) como va aumentando la concentración del acetato desde el tiempo inicial hasta los 4 días que dura la primer actividad acetoclástica. A los 60 días de la segunda actividad, puede observarse que la concentración de acetato permanece casi constante durante los 4 días que dura la actividad acetoclástica, excepto en al tercer día la concentración de acetato aumenta ligeramente y al día siguiente vuelve a bajar. A los 90 días de la tercer actividad, se observa que la concentración de acetato permanece constante durante el primer día, al segundo se observa una ligero incremento y al tercero vuelve a disminuir y su conentración permacece practicamente constante durante el lo, 3" y 4" dias. A los 120 días que se determinó la cuarta actividad, se registró un aumento en la concentración de acetato en el primer día, al segundo se registró una disminución y se mantuvo casi constante durante el 2', 3" y cuarto día. Por lo tanto, como puede observarse en esta gráfica No. 3 la concentración de acetato en el tiempo inicial es diferente para las cuatro actividades realizadas, lo cual no debería ser ya que se adicionó la misma concentración y volumen de acetato en el tiempo inicial para obtener una concentración de 10 mM de acetato como sustrato. El cromatógrafo registró una concentración en este tiempo desde 5 hasta 14 mM de acetato, por lo cual se concluyó que el crornatógrafo estaba sucio.

Actividad metanogénica

En la gráfica No. 4 de actividad metanogénica puede observarse como las bacterias realizan su máxima actividad en la primera hora, por lo tanto, es poco confiable ya que en la última determinación del N?víP se observó la desaparición de las bacterias acetoclásticas y por consiguiente, se puede considerar que el metano obtenido es producido por las bacterias hidrogenofilicas.

29

&-CONCLUSIONES:

Después de 120 dias de inmovilizacion en condiciones termofilicas utilizando partículas de polietileno como material de soporte, pudo observarse que de acuerdo con la cantidad de proteína determinada como una forma de conocer la cantidad de biomasa, se presentó la inmovilización como lo demuestra el número mas probable, la determinación de proteína y por los sólidos suspendidos volátiles. No hubo actividad acetoclástica por que el inóculo no está adaptado y además de que Mrthartothrix tiene buena actividad a baja concentración de acetato y su degradación es lenta.

30

9.- ANEXO

DETERMINACION DE LA CURVA ESTANDAR r x PROTEINA (620 NM)

AI graficar absorbancia vs concentración se obtiene el coeficiente de correlación.

a = 0.0691 b = 0.00591 r = 0.9762

Ec. de la recta: y = bx + a

2 2 2 4 6 1

ELABORACION DE LA CURVA ESTANDAR DE ACETATO

Preparación de la solución estándar de acetato.

I n " 5 m M io I" Sln. st acetato 10 50 ,1 O0

Ac. fórmico 30 30 30 H20 960 920 870

1 O00 1 O00 1 O00 Tabla 10

Se analiza en el cromatógrafo de gases HP 5890 corno se indica en el punto 6, obteniendo: Al graficar x vs el área, obtenemos el coeficiente de correlación.

123894 9.3560J Tabla 1 1

r = 0.9978 a = 11763.9 b = 11044.5 Ec. de la recta: y = bx + a

3 1

ELARORACION DE LA CURVA ESTANDAR DE METANO:

La concentración se determina como se indica en el punto 9. En el cromatógrafo Gow-Mac. Graficando mí de metano vs el área, obtenemos el coeficiente de correlación

Tubo metano Area (Y) Conc. (X) (pmoVml de fg)

1 2 6783 1.8066 r = 0.9944 2 4 12413 3.6132 a = -3597.8 3 6 23 5 84 5.4198 b = 4933.2 4 8 3073 1 7.2264 5 10 42 186 9.0330 Ec. de la recta y = bx + a

Tabh 12

32

II P. II

> b

t

\

hi

\

\

\ \ I\ \ \

O c3

O cv

a3

n - E W

om * I

(v o

F

i

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\

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\

4

. - 1 O O O O cv O 03 co

II II

\ \ \ \

\, ', \

\

O 6 O * N

o z

CALCULO DE L,A PKODUCCION DE METANO

Tenemos que r = 0.9944 al graficar los mi de metano vs el área a =; -3597.8 b = 4933.2

Para pasar el área obtenida de metano a m1 se saca por los valores obtenidos de a y b por la ec. y = bx + a

Para expresarlo a pmol/ m1 de f.g, empleamos la fbrmula:

.0.8276 "- m1 de CH4 X 3 S ill1 f. g

-

0.8628 ml de CH4 X 35 ml f.g

-

0 . 8 5 1 1 m1 de CH4 X 35 m1 f.g

-

- 1.1541 m1 deCH4 - X 35 m1 f.g

1.1485 ml de CH4 X 35 ml f.g

-

0.8316 ml d a - X 35 m1 f.g

fJ.9680 m 1 de CH, X 35 ml t g

1.0315 ml deCH4 X 35 m 1 f.g

-

" 1 mol= X 1E+6 Umol = 0.7475 pmol/ml f.g 31630 mlcIi4 I mol

1 mol CH4 X 1E+6 Umol = 0.7793 pmoVm1 f.g 31630 mll'H4 1 mol

1 mol CI-I, X 1E+6 Umol = 0.7684 pmol/ml f.g 31630 mlICkI4 1 mol

1 mol CFh X 1E+6 LLmol = 1.0425 p m d m l f.g 31630 m1TH4 1 mol

1 mol CH4 X 1E+6 Umo! = 1 .O374 j.lmol/ml f.g 31630 n11CH4 i lnol

1 mol CII, X lE+6 Llmol = 0.751 1 pmol/ml f.g 31630 ml CI14 1 mol

1 m o l CL l j X lE+6 Llrnol = 0.8743 pmol/ml f.g 3 1630 mll'€X4 I m o l

1 mol CH,l X 1E+6 Umol = 0.9317 prnol/ml f.g 3 1630 mIl'H4 1 mol

Para expresarlo en pmol de met./pg de proteína, se divide entre la concentración de proteína determinada a los 120 días en que se determino la actividad metanogénica.(160.98 pg/tnl).

35

0.7475/160.98 = 0.004643 pmol de met./pg de proteína 0.7793/160.98 = 0.004840 0.7684/160.98 = 0.004775 1.0425/160.98 = 0.006475 1.0374/160.38 = 0.006444 0.751 1/160.98 = 0.004665 0.8743/160.98 = 0.005431 0.93 17/160.98 = 0.005787

Tiempo MetanoMetano Metano Metano (Hr) (área) (ml) pmoVml de. f g pmol de met./pg de proteína.

O 485 659 60 1 2096 2068 505 1178 1491

o 0.8276 0.8628 0.85 1 1 1.1541 I . 1485 0.83 16 0.9680 1.0315

O 0.7475 0.7793 0.7684 1 .O425 I .O3 74 0.75 1 1 0.8743 0.93 17

0 0.004643 0.004840 0.004775 0.006475 0.006444 0.004665 0.00543 1 0.005787

Total = 0.04306 ""-""""

36

10.- RIBLIOCRAFIA:

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