cuadernos de hematología 2008 · 2013-03-07 · Índice editor asociado: dra.florindagilsanz...

Cuadernos de Hematología 2008Directores:

Dr. José María Fernández-Rañada

Servicio de HematologíaHospital QuirónMadrid

Dr. Adrián Alegre Amor

Servicio de HematologíaHospital Universitario de la PrincesaMadrid

Actividad Acreditadapor la Comisión de

Formación Continuada

0,7 Créditos

Mód

ulo 1

Con el aval de:

Índice

Editor asociado:

Dra. Florinda Gilsanz

Servicio de HematologíaHospital Universitario 12 de Octubre, Madrid

Cuadern

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de

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ato

logía

Mód

ulo 1

Alteraciones moleculares en las neoplasiasmieloproliferativas crónicas y su repercusión clínica

Dra. Enriqueta Albizua Huarte, Dra. Rosa María Ayala Díaz,y Dr. Joaquín Martínez-López

Mieloma múltiple. Impacto de las alteracionescitogenéticas y moleculares

Dr. Joaquín Martínez-López, Dra. Pilar Martínez Sánchezy Dra. Elena Fernández Redondo

Leucemia mieloide crónica.Importancia del seguimiento de la respuesta moleculary mecanismos de resistencia

Dra. Pilar Martínez Sánchez

Factores pronósticos de la leucemia linfática crónicaDra. Antonia Rodríguez Izquierdo

ISBN: 978-84-691-4100-7DL:

Alteraciones molecularesen las neoplasias

mieloproliferativas crónicasy su repercusión clínica

Cuadernos

deHem

atología Enriqueta Albizua Huarte

Rosa María Ayala DíazJoaquín Martínez-López

Servicio de Hematología

Hospital Universitario 12 de OctubreMadrid

I

El descubrimiento de la mutación JAK2V617F ha sido un hito en elconocimiento de las neoplasias mieloproliferativas (NMP) crónicasPhiladelphia negativas. Una nueva mutación de una tirosinquinasa enla base molecular de estas neoplasias hematológicas.

Su detección por técnicas moleculares es sencilla y rápida, y consti-tuye en estos momentos una herramienta esencial en el diagnósticode las NMP.

Su impacto en el diagnóstico de las NMP ha sido tan importante, que hahecho necesaria la revisión de los criterios de la WHO de 2001 y formaparte ahora de los criterios mayores diagnósticos en PV, TE y MFP.

Su posible asociación con eventos trombóticos en TE y PV apunta aque pueda convertirse en un nuevo marcador pronóstico de riesgotrombótico.

La cuantificación de la mutación JAK2V617F debe considerarse unaherramienta muy útil en la valoración pronóstica inicial del paciente yen la evaluación de los nuevos inhibidores de JAK2.

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Resumen

Mutaciones somáticas adquiridasde JAK2 y MPL en la fisiopatogeniade la policitemia vera, trombocite-mia esencial y mielofibrosis primaria

En 1951, William Dameshek acuñabael término de síndromes mieloprolife-rativos (SMP), para agrupar a pPolici-temia vera (PV), trombocitemia esen-cial (TE), mielofibrosis primaria (MFP),leucemia mieloide crónica (LMC) yeritroleucemia, y especulaba que laautoperpetuación de una mieloprolife-ración trilineal subyacía en su etiopa-togenia1. Posteriormente se demos-traba su origen clonal en la célulastem hematopoyética. Sin embargo,la relación etiopatogénica entre lastres primeras entidades, aunque sos-pechada, ha tardado más de 5 déca-das en evidenciarse. En 1983, el des-cubrimiento de la alteración respon-sable de LMC, el gen de fusiónBCR/ABL, establecía un paradigmade alteración molecular asociada a untumor, que no sólo tenía utilidad diag-nóstica sino que, además, abría laposibilidad de identificar dianas tera-péuticas específicas, como es el casodel primer inhibidor de una tirosinqui-nasa (TK) (imatinib).

Así, en las dos últimas décadas seha involucrado a distintas TK en laetiopatogenia de los SMP (que a par-tir de ahora denominaremos neopla-sias mieloproliferativas –NMP–)

La mutación JAK2V617F en PV, TEy MFP

En la primavera de 2005, 4 grupos detrabajo independientes descubrían, almismo tiempo y por vías diferentes,

la mutación de otra TK, JAK2,JAK2V617F: la sustitución de guani-na por timina en el nucleótido 1849,del exón 14, con el consiguientecambio de valina por phenilalaninaen el codón 617. Esta mutación sedemostraba mediante técnicas desecuenciación en la mayoría de lasPV y en el 50% de las TE y MFP2-5.

JAK2 ha sido una de las últimas TKdescubiertas a principios de la déca-da de los 90, y pertenece a la fami-lia de otras Janus quinasas (JAK1,JAK3 y TYK2). El gen que codificaesta proteína se sitúa en el cromoso-ma 9. De localización citoplasmática,JAK2 media señales procedentes decitoquinas (CK) (EPO, IL-3, SCF, IGF-1 y TPO) a través de su unión a laporción intracitoplásmica de susreceptores R- homodiméricos tipo I(EPO-R, GSC-R y MPL) y receptoresheterodiméricos tipo I y II (gp130,receptores de la familia de IL3 yreceptor de IFNγ). La unión de la CKa su receptor provoca la transfosfori-lación de las dos proteínas JAK2,que fosforilan los residuos tirosina desu receptor, con el consiguientereclutamiento y activación de PI3K,RAS y STAT5. Esta cascada deseñales intracelulares, a través de lavía JAK2/STAT5, regula la prolifera-ción, diferenciación celular y apopto-sis. JAK2 es también necesario parala maduración y el tráfico de los Rhomodiméricos tipo I, como R-EPOy MPL, y esencial para la eritropoye-sis. La mutación JAK2V617F tienelugar en el dominio de homología 2(JH2) pseudokinasa, que se conside-ra de actividad inhibitoria sobre el

1

Cuadernos de Hematología - 2008

dominioquinasa activador, JH1. Laconsecuencia de esta mutación pun-tual es la activación constitutiva de lavía JAK2/STAT5, incluso en ausenciade CK, al escapar a la contrarregula-ción negativa fisiológica, y la perpe-tuación de las señales de prolifera-ción, diferenciación y de superviven-cia celular.

JAK2V617F es una mutación puntual,somática, adquirida, presente sólo enpatologías hematológicas, fundamen-talmente en SMPC Phi Neg (PV, TE,MFP) pero no exclusivamente.

Evidencias de la implicación de lamutación JAK2V617F en la mielo-proliferaciónExisten múltiples evidencias de laimplicación de la mutación JAK2-V617F en la mieloproliferación, en lafisiopatogenia de las NMP Phi neg;en especial en PV. En trabajos invitro, JAK2V617F está presente sóloen aquellos progenitores eritroidescapaces de crecer en ausencia deEPO y de formar cultivos de coloniaseritroides endógenas, rasgo comúndistintivo de las NMP clásicas Phinegativas. Por otro lado, la transfec-ción de JAK2V617F en líneas celula-res eritroides dependientes de CKproduce la autofosforilación de JAK2y la activación de STAT5, MAPK, PI3-K y AKT-3 en ausencia de CK y unaumento de sensibilidad a las mis-mas. Además, las células hematopo-yéticas homocigotas tienen una ven-taja proliferativa sobre las heteroci-gotas. In vivo, se ha reproducido laPV en modelos murinos al realizartrasplante de progenitores hemato-

poyéticos con celulas stem hemato-poyéticas transfectadas con la muta-ción JAK2V617F, desarrollando unfenotipo policitémico, con eritrocito-sis y esplenomegalia.

MPLW515L/K: mutaciones somá-ticas adquiridas en el gen de TPOen MFP Y TE

En 2006, el grupo de Gilliland enEE.UU. descubría una mutaciónsomática adquirida en el receptor dela TPO, la mutación MPLW515L (elcambio de guanina por timina en elnucleótido 1544, con la sustituciónde triptófano por leucina en el codón515 de la región transmembrana) enMFP JAK2V617F negativas6. Poste-riormente se descubría otra en elmismo codón, MPLW515K7. Estasmutaciones están presentes enaproximadamente el 5% de las MFPy el 1% de las TE.

Mutaciones de JAK2 en el exón 12en PV JAK2V617F negativas

En 2007, el grupo de Green en Cam-bridge descubría 4 mutaciones en elexón 12 de JAK2 –también en eldominio autoinhibidor pseudoquina-sa y con ganancia de función– enpacientes con PV JAK2V617F nega-tivas8. Actualmente se conocen, almenos, otras 10 más, que implicanmecanismos de mutación, deleción yduplicación y se detectan en el 3%de la PV. Tanto en las mutacionesMPLW515L/K como en las del exón12 se ha demostrado también in vitroe in vivo su implicación fisiopatogéni-ca en la mieloproliferación.

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Dra. Enriqueta Albizua Huarte, Dra. Rosa María Ayala Díaz y Dr. Joaquín Martínez-López

¿Cómo explicar la paradoja deuna misma mutación, JAK2V617F,con varios fenotipos diferentes:PV, TE y MFP?

Aunque inicialmente una de las hipó-tesis barajadas era que el fenotipofinal se relacionaba con el nivel delprogenitor en que se adquiría la muta-ción, trabajos posteriores han demos-trado que la mutación ya está presen-te en las células stem hematopoyéti-cas; de modo que la heterogenicidadfenotípica no depende del tipo celularen que ocurre la mutación.

La teoría vigente actualmente consi-dera que la combinación de factorescomo la dosis de mutación, predis-posición alélica, factores dependien-tes del huésped, y mutaciones adi-

cionales darían lugar al fenotipo final(Fig. 1). La cantidad o carga de célu-las JAK2 mutadas parece afectar alfenotipo: la teoría de un continuum,partiendo de la observación de queniveles bajos de expresión (heteroci-gosis) de la mutación dan lugar a TE,y niveles más elevados sucesivamen-te a MFP y PV (homocigosis). Lacorrelación entre carga mutacional yfenotipo de enfermedad parececorroborada en el último año tantopor trabajos de cuantificación de lacarga tumoral en las tres patologías,como indirectamente por su repro-ducción en modelos animales. Hay,además, múltiples evidencias de quemodificadores genéticos del huéspedinfluyen en el fenotipo: el hecho deque en NMP familiares, algunos pre-

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Figura 1. Modelo de la patogénesis molecular de PV, TE y MFP (modificado de Levine,Educacional ASH2006)

TE (trombocitemiaesencial);MFP (mielofibrosisprimaria);LMC (leucemia mieloidecrónica);SMD (síndromemielodisplásico);CSH (célula stemhematopoyética)

senten la mutación adquiridaJAK2V617F y otros no; el sexo: TEes más frecuente en mujeres y PV enhombres; la asociación en NMPJAK2V617F positivas entre ciertospolimorfismos de JAK2 y del recep-tor de EPO con fenotipo de PV o TE.

Por otro lado, aunque la mutaciónJAK2V617F es un evento fisiopato-génico fundamental en PV, se postu-la que no es el evento clonogénicoinicial. Así mismo, existen cada vezmás evidencias de que tampoco loes en el resto de las NMP. La consi-deración de que las mutaciones deJAK2 o MPL constituyen un eventogenético secundario que acontecesobre una predisposición genéticaheredada, y sobre una probableadquisición previa de un clon tumoralen la stem cell, va cobrando cadavez más peso. Además, las observa-ciones de mutaciones concurrentesJAK2V617F y del exón 12 en unpaciente con PV, de MPL con un clonminoritario de JAK2V617F en MFP, ode que en las NMP JAK2V617F posi-tivas que evolucionan a leucemiaaguda el clon presente en la transfor-mación carezca de la mutación son,todas ellas, compatibles con la hipó-tesis de que eventos clonales adicio-nales estén implicados en la patogé-nesis de PV, TE y MFP. Por otro lado,un trabajo reciente del grupo de Vain-chenker demuestra que JAK2V617Festimula la recombinación homólogay la inestabilidad genética.

Los estudios iniciales siempre distin-guían entre individuos heterocigotosu homocigotos para la mutación. Sin

embargo, trabajos posteriores hanevidenciado una mayor complejidad,demostrando que en un mismo indivi-duo pueden coexistir células en hete-rocigosis, homocigosis y no mutadas,por lo cual sería más correcto hablarde carga tumoral.

Métodos de screening en ladetección de las mutaciones deJAK2 y MPL

Detección de JAK2 V617F

En los dos últimos años se han des-arrollado numerosos métodos parala detección de JAK2V617F (Tabla I),pero la interpretación de los resulta-dos debe realizarse en el contexto dela sensibilidad del test. En este senti-do, la frecuencia de esta mutaciónen PV se eleva de 73 a 97% si se uti-liza AS-PCR (sensibilidad 3%) enlugar de secuenciación directa (sen-sibilidad 20%). Por otro lado, los fal-sos positivos aumentan si se utilizanmétodos ultrasensibles (sensibilidad0,01%) capaces de detectar nivelesbajos de JAK2V617F incluso en indi-viduos sanos. En general, se prefie-ren los métodos cuantitativos porqueson capaces de medir la carga delalelo mutado y monitorizar la res-puesta al tratamiento. Por otro lado,en la mayoría de los procedimientospublicados se realiza la determina-ción de JAK2V617F en ADN de gra-nulocitos de sangre periférica o demédula ósea, sin que se haya podi-do apreciar hasta el momento unadiferencia significativa en los resulta-dos obtenidos con cualquiera de losdos tipos de muestra.

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Las técnicas más frecuentementeempleadas para detectar esta muta-ción son las siguientes:

• Secuenciación de ADN (sensibili-dad alrededor del 20%)2,3,5

• Pirosecuenciación (sensibilidadestimada del 5%)

• Curva de fusión (método semi-cuantitativo con una sensibili-dad entre 1 y 10%)

• PCR alelo-específica (métodocuantitativo, con el sistemaARMS se obtiene una sensibili-dad de 1-2%)9

• Análisis de restricción BsaXI (dis-tingue entre mutaciones enhomocigosis y heterocigosis)2

Desde un punto de vista práctico, serecomienda inicialmente como pro-cedimiento de screening un método

de PCR en tiempo real seguido de lacurva de fusión u otro método consensibilidad similar. Las muestraspositivas con esta técnica para lamutación V617F serían reanalizadasposteriormente, empleando una PCRa tiempo real alelo-específica, a fin decuantificar la cantidad de célulasmutadas; ya que, como se comentaposteriormente, puede ser un factorpronóstico, que determine decisio-nes terapéuticas y permitiría, ade-más, evaluar la respuesta a un posi-ble tratamiento9.

Detección de mutaciones en elexón 12 de JAK2

La detección de varias anomalías enel exon 12 de JAK2 (mutaciones pun-tuales, inserciones y deleciones) seha realizado mediante AS-PCR utili-zando ADN de granulocitos o de san-

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Tabla I

Frecuencias y métodos de detección de la mutación JAK2V617Fen las NMP clásicas

Método dedetección

PVmutación JAK2

V617F (homocigotos)

TEmutación JAK2

V617F (homocigotos)

MFPmutación JAK2

V617F (homocigotos)

James y cols.(2005) Secuenciación 89 (30) 43 43

Levine ycols(2005) Secuenciación 74 (25) 32 (3) 35 (9)

Kralovics y cols(2005) Secuenciación 65 (27) 23 (3) 57 (22)

Baxter y cols(2005)

Secuenciación/ PCRalelo-específica 97 (26) 57 (0) 50 (19)

Jones y cols(2005)

ARMS/pirosecuenciación 81 (33) 41 (7) 43 (29)

Levine y cols(2006)

Taqman alelo-específica 99 72 39

Martínez-López Jy cols (2007)

Sondas deHibridación 87 61 50

PV Policitemia Vera; TE Trombocitemia Esencial; MFP Mielofibrosis Primaria

gre periférica total8 o por secuencia-ción directa de los productos dePCR, usando digestión con AseI8.

Detección de mutaciones en MPL

Los métodos más empleados para ladetección de las mutaciones MPLW-515L y MPLW515K son: la secuen-ciación directa6 y AS-PCR.

Impacto diagnóstico de las altera-ciones moleculares

El descubrimiento de la mutaciónJAK2V617F en PV, TE y MFP –y delas mutaciones en el exón 12 en PV yde MPLW515L/K en MFP y TE– haocasionado tal impacto en el diag-nóstico de estas entidades que nosólo se ha impuesto como pruebadiagnóstica esencial en la clínica coti-diana, sino que ha obligado a efec-tuar la revisión de los criterios diag-nósticos de la WHO (World Health

Organization) vigentes desde 2001 yha llevado al grupo de expertos enestas enfermedades a publicar unanueva propuesta para las tres NMPPhi negativas clásicas en 200710.Entre los nuevos criterios diagnósti-cos destacan varios puntos:

1) la mutación JAK2V617F, lasmutaciones en el exón 12 yMPLW515L/K pasan a formarparte de los criterios mayores,hecho que permite simplificar eldiagnóstico, sobre todo en PV;

2) los criterios de exclusión des-aparecen en PV ante la potenciade JAK2V617F presente en el95% de los casos y en las muta-ciones del exón 12 en el 3%, y

3) se ratifica la importancia de labiopsia de médula ósea (BMO)como criterio mayor en TE yMFP, de modo que su realiza-ción al diagnóstico resulta indis-pensable (tabla IIA).

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Tabla IIA

Policitemia vera

CRITERIOS PROPUESTOS WHO 2007

Criterios de Inclusión

Necesarios (1 mayor y 2 menor ó 2 mayor y 1 menor)

Criterios mayores1. Hb>18,5g/dl en hombreHb> 16,5 g/dl en mujero incremento de la masa eritroide

2. Presencia de la mutación JAK2V617F u otra JAK2

Criterios menores1. Cambios de MO compatibles con PV2. Niveles de EPO bajos3. Formación endógena de colonias eritroides in vitro

Criterios de Exclusión

Desaparecen

WHO (Organización Mundial de la Salud); MO (médula ósea); EPO (eritropoyetina); TE (trombocitemia esencial);MFP (mielofibrosis primaria); LMC (leucemia mieloide crónica); SMD (síndrome mielodisplásico)

Si los resultadosno son

compatibles conPV, considerarpolicitemia

congénita conmutación REpo

PV altamenteprobable PV probable PV posible PV improbable

Biopsia MO noesencial aunque

opcional

Biopsia MOrecomendada paraconfirmación del

diagnóstico

Biopsia de MOy screening demutaciones enel exon 12 de

JAK2

Considerarpolicitemiasecundariaincluyendopolicitemia

congénita conmutación de VHL

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Casi todos los pacientes con PV pre-sentan la mutación JAK2V617F que,empleando técnicas lo suficiente-mente sensibles, se detecta en másdel 95% de los enfermos. Por estemotivo, el estudio de esta mutaciónha modificado sustancialmente laevaluación y los criterios diagnósti-cos de esta enfermedad. El estudiode la mutación JAK2V617F debeincluirse como prueba inicial en elestudio de enfermos con poliglobu-

lia. Tefferi propone un algoritmo parael diagnóstico diferencial, donde losprimeros pasos son el estudio de lamutación y la determinación de losniveles de EPO sérica. El estudio delas mutaciones del exón 12 estaríaindicado en aquellos casos en queno se detectara la mutaciónJAK2V617F y los niveles de EPOfueran normales o bajos. La BMO serecomienda en todos los casos paraconfirmación11 (Fig. 2).

V617F(+) yEPO baja

V617F(+) pero EPOnormal o alta

V617F(-) peroEPO baja

V617F(-) y EPOnormal o alta

Detección de la mutación JAK2V617F en sangre periférica ymedida de los niveles séricos de eritropoyetina

Figura 2. Algoritmo diagnóstico ante sospecha de policitemia vera (modificado de Tefferi19.Leukemia 2007)

8



La utilidad y rentabilidad diagnósticade la mutación de JAK2V617F (yMPLW515L/K) en TE y MFP es muchomenor puesto que, al estar presentesólo en el 50% de los casos, su valorpredictivo negativo es sub-óptimo enestas dos enfermedades.

En TE cabe destacar, además de loreferido previamente, que el dintel detrombocitosis baja a ≥450 x 109/l, yque, en presencia de marcador clonal(JAK2V617F, MPLW515L/K, u otros),datos de trombocitosis reactiva aso-ciada no excluyen el diagnóstico deTE si se cumplen los tres criteriosmayores (tabla IIB). En el algoritmodiagnóstico propuesto por Tefferi paraTE, el estudio de la mutación JAK2-V617F, BCR/ABL y la BMO con cito-genética son esenciales11 (Fig. 3).

Es importante recordar que la muta-ción JAK2V617F, aunque muy carac-terística, no es específica de las NMPPhi negativas clásicas, ya que sepuede detectar también en otraspatologías mieloides: en el 50% delas anemias refractarias con sidero-blastos en anillo y trombocitosis(ARSA-T), en el 20% de los síndro-mes mielodisplásicos (SMD) atípicosy en el 3% de los SMD o leucemiasagudas mieloblásticas (LAM) denovo. De modo que, ante la sospe-cha de TE, la detección de la muta-ción JAK2V617F no descartaría unSMD o MFP si bien conviene resaltarque no se detecta en patología tumo-ral no mieloide ni en LMC.

En MFP, las mutaciones JAK2V617F(presente en el 50%) y MPLW515L/K

Tabla IIB

Trombocitemia esencial



Necesarios (debe tener todos los criterios)

1. Cifra de plaquetas mantenida ≥450x109L

2. Cambios en MO compatibles con TE

3. Marcador clonal:

JAK2V617F

Otro marcador clonal

Criterios de exclusión

Ausencia de criterios WHO para:

PV

MFP

LMC

SMD

Si no es JAK2V617F:

Evidencia de trombocitosis reactiva


9


(en el 5%) se incluyen como criteriosmayores, así como la BMO, y desapa-rece la subdivisión entre fase pre-fibrótica y fibrótica10 (tabla IIC). Encuanto al algoritmo diagnóstico pro-puesto por Tefferi ante la sospecha deMFP, al igual que en TE, el estudio dela mutación JAK2V617F y la BMO concitogenética son esenciales, ademásde la tinción para reticulina11 (Fig. 4).

No queremos acabar sin resaltar dosconsideraciones de interés, conteni-das en la nueva revisión de la WHO:

1) a propósito de los casos descri-tos recientemente de trombosis

venosas abdominales idiopáti-cas (TVAI) con JAK2V617F posi-tivo, que no cumplen criteriosconvencionales de PV ni TE, porel momento deben considerarse“NMP no clasificables” y existeun claro consenso en incluir lamutación JAK2V617F en elestudio de screening de trom-bofilia ante estas TVAI;

2) por otro lado, los casos deARSA–T con la mutación JAK2-V617F (50%) podrían tratarse enrealidad de verdaderos casos deNMP (TE o MFP) con sideroblas-tos en anillo.

TE, PV o MFPaltamenteprobables

Biopsia de MO yCitogenética

TE y MFPtodavía posibles

Considerartambién LMC

Uso criterios WHO 2008para diagnóstico

específico

Considerar FISH paraBCR-ABL en ausencia delcromosoma Ph pero con

presencia demegacariocitos pequeños

e hipolobulados

V617F(+) V617F(-)

Detección de la mutación JAK2V617F en sangre periférica

Figura 3. Algoritmo diagnóstico ante la sospecha de trombocitemia esencial(modificado de Tefferi19. Leukemia 2007)

10



Repercusión pronóstica

JAK2V617F y su asociación ariesgo trombótico, supervivenciay transformación a leucemiaaguda en PV, TE y MFP

Al ser la trombosis una presentaciónhabitual en TE y PV y una de las prin-cipales complicaciones en el cursode ambas enfermedades, su relacióncon la mutación JAK2V617F ha sidoobjeto de múltiples estudios.

El trabajo del grupo de Cambridgeencontró mayores complicaciones

trombóticas venosas en las TEJAK2V617F positivas, junto conniveles de hemoglobina (Hb) y leuco-citos más altos12. También se ha des-crito un mayor riesgo trombótico enTE homocigotas, frente a las hetero-cigotas o las carentes de la mutación.No obstante, publicaciones posterio-res presentan resultados discordan-tes, que podrían justificarse porquelos estudios comparativos inicialeseran cualitativos, en función del esta-do mutacional (mutado versus nomutado), y retrospectivos. Sin embar-

Tabla IIC

Mielofibrosis Primaria



Necesarios (todos los mayores; 2 menores)

Criterios mayores

1. Cambios de MO compatibles con MFP

2. Marcador clonal:

JAK2V617F

MPLW515L/K

Otros marcadores clonales

Criterios menores

1. Leucoeritroblastosis

2. Incremento de LDH

3. Anemia

4. Esplenomegalia

Criterios de exclusión

Ausencia de criterios WHO para:

PV

MFP

LMC

SMD

Si no es JAK2V617F

Evidencia de mielofibrosis reactiva


11


go, en los últimos meses, los estu-dios publicados establecen la com-paración en términos cuantitativos,en función de la carga tumoral. Deeste modo, dos series de pacientescon TE, aunque también retrospecti-vas, muestran que tanto la presenciade la mutación JAK2V617F como sucarga alélica se asocian con mayorriesgo trombótico13,14.

En cuanto a PV, aunque no existe evi-dencia de diferencias entre pacienteshomocigotos y heterocigotos, el ries-go trombótico aumenta significativa-mente cuando se analiza respecto ala carga tumoral: mayor cuando éstaes superior al 75-80% al diagnóstico,de acuerdo a los trabajos de Vannuc-chi y de Silva15, aunque el grupo deTefferi no corrobora estos resultados.

En resumen, los estudios publicadosen estos tres últimos años parecenidentificar a JAK2V617F como unposible marcador pronóstico detrombosis en PV y TE. Sin embargo,no se pueden establecer todavíaconclusiones definitivas y se requie-ren estudios prospectivos, realizadoscon la misma metodología. De con-firmarse, la determinación precisade la carga tumoral, por medio detécnicas cuantitativas –en vez de lasimple detección cualitativa– tendríaun papel decisivo a este respecto.

En relación a la posible asociaciónentre JAK2V617F y la superviven-cia o transformación a leucemiaaguda –en PV y TE–, no hay datosconcluyentes.

Figura 4. Algoritmo diagnóstico ante la sospecha de mielofibrosis primaria(modificado de Tefferi19. Leukemia 2007)

LMC MFP probablepero se utiliza lahistología paraexcluir otrasneoplasiasmieloides

Podría ser MFPpero tambiénSMD u otrasneoplasiasmieloides

Si los megacariocitosson pequeños ehipolobulados

considerar FISH paraBCR-ABL y utilizar lahistología para el

diagnóstico específico

CromosomaPh (+)

V617F(+) oDel(13q)

Otras anomalíascitogenéticas

Citogenética normaly V617F(-)

Biopsia de MO, tinción de reticulina, estudios citogenéticos y detección de lamutación JAK2V617F en sangre periférica

12



En MFP, por ahora los resultados sondivergentes en términos de supervi-vencia y evolución a leucemia aguda.Por otro lado, la evaluación del trata-miento mediante la cuantificación dela mutación JAK2V617F por PCRalelo específica ha demostrado suutilidad, cuando estos enfermos sesometen a trasplante alogénico deprogenitores hematopoyéticos.

Aplicaciones terapéuticas:inhibidores de JAK2 como dianasterapéuticas

La identificación de la mutaciónsomática JAK2V617F ha potenciadoel desarrollo de pequeñas moléculasinhibidoras cuya diana selectiva es eldominio quinasa, activador, de JAK2,y ha supuesto el inicio de una tera-péutica dirigida a la patogénesis enNMP16.

Los inhibidores de JAK2 pueden cla-sificarse en “inhibidores JAK2 selecti-vos” o de Clase I, desarrollados parainhibir primariamente la diana JAK2quinasa (ej.: TG101209, TG101348,INCBO18424, XL019) y los “inhibido-res JAK2 no selectivos”, no desarro-llados inicialmente para NMP, peroque presentan un potencial terapéuti-co en estas patologías a través deuna significativa actividad inhibitoriade JAK2 quinasa. En éstos, la dianaprimaria puede ser FLT3 (CEP-701),aurora quinasas (AT9283) o histonaDeacetilasa (ITF2357)17.

Estudios preliminares indican queestas pequeñas moléculas inhiben elcrecimiento dependiente de señalesconstitutivas de la vía JAK2/STAT,

suprimiendo fundamentalmente elcrecimiento de progenitores portado-res de la mutación JAK2V617F, conactividad clínica significativa17,18. Otros,como (TG101209), también han mos-trado una inhibición similar en pacien-tes con la mutación CMPLW515L/K,carentes de JAK2V617F. Datos recien-tes sugieren la posibilidad de queincluso aquellos pacientes con NMPno portadores de la mutaciónJAK2V617F presenten un crecimientodependiente de la vía JAK-STAT, deforma que los agentes que actúansobre esta diana serían también efec-tivos en ellos8,16.

Algunos de los inhibidores previa-mente descritos se encuentran enestos momentos en ensayos clínicosen pacientes con estadios avanza-dos de MFP (con y sin mutación enJAK2 o MPL), así como en post-PV/TE MFP, PV y TE JAK2V617 posi-tivas. Es el caso de TG101348,INCBO18424, XL019 y CEP-70118,19.

Por el momento sólo se han comu-nicado los datos con INCB018424,en más 40 pacientes con MFP, yparece que los resultados prelimina-res son alentadores, respecto al per-fil de toxicidad y su eficacia frente ala esplenomegalia y síntomas cons-titucionales.

En general, dado que el número depacientes tratados en los diferentesensayos es pequeño, resulta prema-turo establecer conclusiones respec-to a la seguridad y actividad dedichos fármacos. De forma similar,también lo es establecer el efecto de

13


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los mismos frente a la anemia, leuco-eritroblastosis, mielofibrosis, anoma-lías citogenéticas y carga mutacionalde JAK2V61720.

En un futuro cada vez más próximo,el posible empleo terapéutico de losinhibidores de JAK2 en la prácticaclínica podría monitorizarse con lacuantificación de la mutación JAK2V617F.

ConclusionesEl estudio de la mutación JAK2-V617F ha tenido un gran impacto enla aproximación diagnóstica a lasNMP, en especial a la PV, y constituyeun gran avance en el conocimientofisiopatogénico de las NMP. JAK2-V617F podría convertirse en el primermarcador biológico independiente,junto a los factores pronósticos con-vencionales para PV, TE y MFP. Es,además, una diana terapéutica parala que se están desarrollando nuevosfármacos específicos.

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14



De las siguientes afirmaciones, ¿cuál es la falsa?

El diagnóstico de PV se puede establecer con la detecciónde JAK2V617F+ y niveles bajos de EPO

Es imprescindible la biopsia de MO para el diagnóstico deMFP.

Es imprescindible la biopsia de MO para la confirmación deldiagnóstico de PV.

La ausencia de la mutación JAK2V617F en PV no excluye eldiagnóstico.

El diagnóstico de TE debe incluir biopsia de MO y citogenética.


La interpretación de la detección de la mutación JAK2V617Fdebe realizarse en el contexto de la sensibilidad del test.

Los métodos de AS-PCR (PCR alelo-específica) son los mássensibles.

Como método de screening de la mutación JAK2V617F nose recomienda test con sensibilidad inferior a 1% para evitarfalsos positivos.

En los síndromes mieloproliferativos JAK2V617F+ cuando elobjetivo es evaluar el pronóstico y la respuesta al tratamien-to, se recomienda utilizar métodos cuantitativos (AS-PCR).

No se han descrito individuos sanos portadores de la muta-ción JAK2V617F.

Cuestionario

EvaluaciónAlteraciones moleculares en las

neoplasias mieloproliferativas crónicas ysu repercusión clínica

1

2

a

b

c

a

b

c

d

e

d

e


Los nuevos criterios propuestos por la WHO para el diagnósti-co de MFP no distinguen entre fase prefibrótica y fase fibrótica.

Los nuevos criterios propuestos por la WHO para el diag-nóstico de TE sitúan el nivel de plaquetas con ≥450x10-9/l.Para el diagnóstico de PV, las nuevas clasificaciones de laWHO simplifican los criterios diagnósticos.

En los casos de sospecha de PV, ante la ausencia de muta-ción de JAK2V617F es recomendable realizar el screening demutación en el exón 12 de JAK2.

Para el diagnóstico de los síndromes mieloproliferativosPhiladelfia negativos no es necesario el estudio citogenético.

De los siguientes tipos de fármacos, ¿cuáles tienen actividad inhibi-toria JAK2 quinasa?

Inhibidores JAK2 selectivos

Inhibidores FLT3

Inhibidores aurora quinasas

Inhibidores histona deacetilasa

Todos los previos

En relación a la mutación JAK2V617F es falso que:

JAK2 es una tirosinquinasa, cuya mutación puntual JAK2-V617F otorga ventaja proliferativa al escapar al mecanismode contrarregulación negativa

Se ha demostrado su asociación a riesgo trombótico en TE

No está presente en síndromes mielodisplásicos

Los modificadores del huésped influyen en el fenotipo final dePV, TE o MFP.

Está presente en el 50% de las MFP


4

3 a

b

c

d

e

a

bc

d

e

5

a

bc

d

e

Cuestionario

Respuestascorrectas:1.c2.e3.e4.e5.c

Mieloma múltiple.Impacto de las

alteraciones citogenéticasy moleculares

Cuadernos

deHem

atología Dr. Joaquín Martínez-López

Dra. Pilar Martínez SánchezDra. Elena Fernández Redondo

Servicio de HematologíaHospital Universitario 12 de Octubre

Madrid

II

Desde el punto de vista patogénico se describen dos grandes gru-pos de mielomas: los mielomas hiperdiploides y los mielomas nohiperdiploides. Estos últimos presentan traslocaciones recurrentesdel gen IGH en más del 85% de los casos, así como mayor frecuen-cia de alteraciones en otros cromosomas.

Desde hace años se acepta que la patogenia del mieloma es un pro-ceso en múltiples pasos, con la adquisición secuencial de distintasalteraciones que provocan la progresión de la enfermedad.

Tanto las células mielomatosas como las células del estroma y lascélulas endoteliales producen moléculas que estimulan la angiogéne-sis. Estas moléculas son fundamentales en la fisiopatogenia del mie-loma múltiple.

Las alteraciones citogenéticas se pueden encontrar en cualquierestadio de la enfermedad. Así, las gammapatías monoclonales designificado incierto pueden presentar anomalías citogenéticas, algu-nas de ellas de mal pronóstico.

Miel

omam

últip

le.Im

pacto

delas

alter

acio

nes

citog

enéti

casy

mol

ecul

ares

Resumen

En el mieloma existen varias alteraciones citogenéticas, de mal pro-nóstico, tales como los cariotipos hipodiploides complejos y las tras-locaciones t(4;14) (p16;q32) y t(14;16) (q32,q23).

La enfermos con la t(11;14) (q13;q32), la t(6;14) o con cariotipo hiper-diploide tienen un mejor pronóstico.

La deleción de 13q14 está presente en el 40% de los casos de mie-loma múltiple y por sí sola no confiere mal pronóstico.

Mielom

amúltiple.Im

pactodelasalteraciones

citogenéticasym

oleculares

Alteraciones moleculares en elmieloma múltiple y modelosfisiopatogénicos

El mieloma múltiple (MM) es la conse-cuencia de una expansión clonal decélulas plasmáticas. Puesto que lapráctica totalidad de los MM produ-cen y secretan una inmunoglobulina(Ig) monoclonal o parte de ella (cono-cida como paraproteína o compo-nente M), se han estudiado exhausti-vamente los genes que codifican lasIgs, especialmente el gen de la cade-na pesada de la Ig (gen IGH) localiza-do en el cromosoma 14 1.

La capacidad para reordenar el ADNgerminal es exclusiva de las célulaslinfoides y, siendo la célula plasmáti-ca el último estadio madurativo dellinfocito B, el estudio de los reorde-namientos del gen IGH y de losgenes de las cadenas ligeras IGLκ eIGLλ en las células tumorales, hapermitido formular la teoría actualsobre el origen del MM 1.

Así, una célula B que en los estadiospro-B y pre-B ha reordenado laregión variable de los genes de lasIgs, sale de la médula ósea y llega alganglio linfático. En su paso por elcentro germinal suceden dos fenó-menos cruciales: las hipermutacio-nes somáticas en la secuencia delADN provocadas por el contacto conlos antígenos y la recombinación conla región constante que expresaráfinalmente la Ig, mediante el plega-miento de la cadena de ADN (estefenómeno se conoce como CSR, delinglés class switch recombination).Es en este momento donde tienen

lugar los primeros eventos patogéni-cos: recombinaciones aberrantes enel proceso de CSR con traslocacio-nes en el locus de IGH 14q32; hiper-diploidía (generalmente los mielomashiperdiploides no tienen traslocacio-nes en el cromosoma 14), y probableexpansión celular seleccionada poralgún antígeno.

Portando estas alteraciones, la célu-la sale del ganglio linfático, completasu maduración a célula plasmática yemigra de nuevo a la MO. Ahora yase la puede considerar una célulapremaligna, que ha adquirido la habi-lidad para sobrevivir y proliferar, quese caracteriza por inestabilidadgenética y que, por tanto, es sus-ceptible a posteriores eventos onco-génicos que la abocarán a la com-pleta transformación tumoral.

Desde el punto de vista patogénicose describen dos grandes grupos demielomas: los mielomas hiperdiploi-des y los mielomas no hiperdiploides.Estos últimos presentan traslocacio-nes recurrentes del gen IGH en másdel 85% de los casos, así comomayor frecuencia de alteraciones enotros cromosomas. Bien directamen-te por una traslocación cromosómicaconocida entre IGH y otros genes, obien por un mecanismo desconocidoen el resto de los casos, en más del95% de los mielomas podemosencontrar cambios en la expresión deciclina D, siendo ésta un reguladorpositivo del ciclo celular (tabla I) 2,3.

Se acepta, desde hace años, que lapatogenia del mieloma es un proce-

1


so en múltiples pasos, con la adqui-sición secuencial de distintas altera-ciones que provocan la progresiónde la enfermedad. A la inestabilidadcromosómica adquirida con loseventos primarios en el centro germi-nal (traslocaciones IGH, hiperdiploi-día y sobreexpresión de ciclina D), sevan sumando otras alteraciones,como traslocaciones secundarias deIGH o mutaciones en oncogenescomo RAS, que se han relacionadocon el paso de fases asintomáticasde la enfermedad a MM sintomático(Fig. 1) 2,3.

Posteriormente se pueden añadireventos tardíos que serían los res-ponsables de la progresión a fasesmás proliferativas y agresivas. Entreestos eventos se incluyen: inactiva-ción de reguladores del ciclo celular(p18INK4c), mutaciones o delecio-

nes del gen TP53 (cromosoma 17q)y alteraciones del oncogén MYC.Otras anomalías frecuentes son lasalteraciones en el cromosoma 1,especialmente ganancias en el brazolargo, que proporcionan a la célulauna ventaja de crecimiento y supervi-vencia que conducen a la progresióny agresividad de la enfermedad 2,3.

Muchos otros mecanismos sesuman a la lista de eventos patogé-nicos junto con a las alteracionesgenéticas de la célula plasmática quese describen como los eventos tem-pranos (origen) y tardíos (desarrollo)de esta enfermedad.

Un fenómeno epigenético destacadoes la hipermetilación de ciertosgenes, lo que provoca el silencia-miento del gen y, por tanto, la pérdi-da de su función.

2


Dr. Joaquín Martínez-López, Dra. Pilar Martínez Sánchez y Dra. Elena Fernández Redondo

Tabla I

Traslocaciones recurrentes en el gen IGH, relación con los genesde ciclina D y clasificación patogénica del MM

Grupo Traslocación Gen Ciclina D Ploidía Frecuencia

6p21 t(6;14) CCND3 D3 NoH 3%

11q23 t(11;14) CCND1 D1 NoH, D 16%

4p16 t(4;14) FGFR3/MMSET D2 NoH > H 15%

16q2320q11

t(14;16)t(14;20)

c-mafmafB D2 NoH

D1 D1 H 34%

D1+D2 D1 y D2 H 6%

D2 D2 H, NoH 17%

ninguno NoH 2%

NoH: no hiperdiploide; H: hiperdiploide; D: diploide

El microambiente de la médula ósea(MO) ha sido sin duda uno de losprotagonistas de la patógena delMM en los últimos años. El MM es untumor que se expande en la MO yque establece una íntima relacióncon ella. La unión de las células plas-máticas tumorales con las células delestroma medular activa la secreciónde citoquinas (IL-6, IGF-1, VEGF,SDF-1α) que provienen tanto de lascélulas tumorales como del estroma.Estas citoquinas activan importantesrutas de señales intracelulares comoERK, JAK/STAT y PI3-K/Akt cuyasdianas posteriores van a ser proteí-nas antiapoptóticas y nuevas citoqui-nas. Simultáneamente, la activaciónde la vía de NFκB mediada tambiénpor la adhesión celular, actúa comoun regulador positivo de las molécu-

las de adhesión (ICAM-1, VCAM-1)que continúan favoreciendo estaunión entre células plasmáticas yestroma. Se crea así un círculo deinterrelaciones que sostiene el creci-miento celular, la supervivencia, laresistencia a drogas y la migración 4.

Finalmente, tanto las células mielo-matosas como las células del estro-ma y las células endoteliales produ-cen moléculas que estimulan laangiogénesis. El aumento de la acti-vidad angiogénica no es sólo un epi-fenómeno del crecimiento tumoral,sino que además actúa como pro-motor del mismo 4.

Los arrays de expresión y los arrays deADN (técnicas de momento circuns-critas al ámbito de la investigación)

3


Figura 1. Fisiopatogenia y cronología de la aparición de las alteraciones genéticas y molecularesen el mieloma múltiple

han contribuido a esclarecer muchosde los mecanismos que modifican lafisiología en el MM. Los arrays deexpresión (estudio del ADNc) permitenel estudio simultáneo de miles degenes en la misma muestra y losarrays de ADN analizan el número decopias existentes de un gen 5,6,7.

Algunas de las aportaciones de losestudios de perfiles de expresióngénica son las siguientes:

• Ayudan a disecar la biología dela enfermedad: las diferencias deperfiles de expresión entre loscontroles normales, los pacien-tes con gammapatía de significa-do incierto y el MM, permitenespecular sobre algunos de loseventos necesarios para la trans-formación desde fases asinto-máticas de la enfermedad a mie-loma clínicamente establecido.También han permitido describirlas rutas de señales intracelula-res alteradas en esta enferme-dad. Así conocemos que lalesión ósea, producida por undesequilibrio entre la resorción yla formación de hueso, se acom-paña de diferencias de expresiónde los genes que regulan lahomeostasis normal del mismo.

• En la clínica pueden utilizarsecomo herramienta diagnóstica(aunque esto no es útil demomento) y pronóstica, ya quedistintos perfiles de expresiónparecen definir distintos compor-tamientos clínicos. Además, sonla base de nuevas clasificacionesmoleculares de la enfermedad.

• Resultan imprescindibles parael desarrollo de nuevos fárma-cos. Así, hasta un 40% de losmielomas presentan una activa-ción continua de la vía deNFκB, que a su vez está regu-lado por el proteosoma. Uno delos nuevos y más importantesfármacos desarrollados en losúltimos años, el bortezomib,actúa precisamente inhibiendoal proteosoma.

Por su parte, los arrays de ADNponen de manifiesto pérdidas oganancias de material genético queno se pueden detectar con la citoge-nética convencional.

Es evidente que el hecho de conocerlas alteraciones genéticas y losmecanismos moleculares de laenfermedad nos acerca a la com-prensión de esta neoplasia. La hete-rogeneidad que siempre se haobservado en cuanto a la clínica y laevolución de los pacientes, puedeser el reflejo de la complejidad bioló-gica subyacente. Las alteracionesgenéticas, como se revisará másadelante, han mostrado valor pro-nóstico en numerosos estudios. Lasnuevas clasificaciones consideranlas alteraciones moleculares paradefinir distintos tipos de mielomas.Pero sin duda lo más determinantepara el paciente, es que se han apro-bado en los últimos años nuevos fár-macos muy eficaces y se estánensayando muchos más, basándoseen el conocimiento de la biologíatumoral 5,6,7.

4



Alteraciones citogenéticas en elmieloma múltipleEn el mieloma múltiple la infiltraciónde la médula ósea por células plas-máticas es muy variable, existenenfermos con una infiltración masivaen el lugar de la punción medular yotros con una infiltración muy baja.En los pacientes con infiltraciónmenor de un 10% y en algunas oca-siones enfermos con infiltración entreun 10% y un 20%, los estudios decitogenética convencional y molecu-lar no son válidos. Esto es debido aque la sensibilidad de las técnicascitogenéticas se sitúa alrededor del10%. Un estudio citogenético normalen un enfermo con una infiltración dela médula ósea baja es probable quearroje un resultado falso negativo. Enestas situaciones es recomendable obien realizar purificación de célulasplasmáticas o técnicas de marcaje delas células plasmáticas medianteanticuerpos monoclonales. Posterior-mente se realizará hibridación in situfluorescente de las alteracionesgenéticas más relevantes en el mielo-ma múltiple 8.

Las alteraciones citogenéticas sepueden encontrar en cualquier esta-dio de la enfermedad. Así, las gam-mapatías monoclonales de significa-do incierto pueden presentar anoma-lías citogenéticas, algunas de ellasde mal pronóstico, como la del13q ytraslocaciones del gen IGH. La pro-porción de gammapatías monoclo-nales de significado incierto con alte-raciones citogenéticas es ligeramen-te menor que la encontrada en elmieloma sintomático. La presencia

de estas alteraciones citogenéticasen este grupo de enfermos no se haasociado a una progresión más rápi-da y no es indicativo de que tenga-mos que empezar a tratar 8.

En el mieloma aparecen varias alte-raciones citogenéticas, de mal pro-nóstico, cuando los enfermos sontratados con quimioterapia y/o tras-plante de progenitores hematopoyé-ticos. Aquellos enfermos con carioti-pos hipodiploides complejos, traslo-caciones t(4;14) (p16;q32), t(14;16)(q32,q23) y del17q13 tienen un pro-nóstico claramente peor que el restode los enfermos. La amplificación delcromosoma 1 se detecta en un ter-cio de los casos, confiere mal pro-nóstico en algunas series y en otrasno, por lo que su papel pronósticoaún no está claro 8,9.

Los enfermos con la t(11;14)(q13;q32), la t(6;14) o con cariotipohiperdiploide tienen un mejor pro-nóstico que el resto de pacientescuando son tratados con quimiotera-pia convencional y/o trasplante deprogenitores hematopoyéticos.

Finalmente, hay varias alteracionesgenéticas que se asocian con perfilesclínicos muy concretos. Así los enfer-mos con t(11;14) (q13;q32) suelenser oligosecretores, con expresiónsólo de cadenas ligeras, morfologíalinfoplasmática y expresión de CD208.

La deleción de 13q14 está presenteen el 40% de los casos de mielomamúltiple y generalmente está asocia-da a otras alteraciones citogenéticas.

5


Considerada desde finales de losaños 90 como un factor de mal pro-nóstico, varios estudios recientesdemuestran que su presencia deforma aislada no es un dato de malpronóstico y que sólo asociada a lat(4;14) o a cariotipos hipodiploideses cuando realmente confiere malpronóstico. Además, el empleo denuevos fármacos, como bortezomiby lenalidomida, disminuye el impactopronóstico de esta alteración genéti-ca, ya que estos fármacos parecenser más eficaces en enfermos conalteraciones genéticas de mal pro-nóstico 10,11.

Los enfermos con alteraciones cito-genéticas de mal pronóstico respon-

den de forma insuficiente al tratamien-to convencional; por ello, el empleode bortezomib o lenalidomida en pri-mera línea sería una opción muyapropiada. En el momento actual,mientras que no se disponga de suuso en primera línea, lo que se pro-pone es una evaluación muy estre-cha de estos enfermos, y si no seobtiene una respuesta adecuada,emplearlos de forma precoz 12,13.

En muchos centros, debido a sucomplejidad, no existe disponibilidadde estudios citogenéticos. En estecaso, la actitud sería similar pero yano sólo centrada en los enfermos decitogenética de mal pronóstico sinoen todos los casos.

6



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¿Cuál de las siguientes respuestas sobre las alteracionescitogenéticas en el mieloma múltiple es falsa?

Las gammapatías monoclonales de significado incierto nopresentan alteraciones citogenéticas de mal pronóstico

La t(4;14) es una traslocación de mal pronóstico en el mielo-ma múltiple tratado con quimioterapia convencional

Los estudios citogenéticos en mieloma múltiple con una infil-tración medular menor del 10% por células plasmáticas noson válidos

La delección 13q14 por sí sola no confiere mal pronóstico enel mieloma múltiple

¿Cuál de estas alteraciones genéticas y moleculares es frecuente enfases avanzadas y agresivas del mieloma múltiple?

Mutaciones de c-MYC

t(4;14)

Deleción 13q14

t(11;14)

Los estudios de microarrays en el mieloma múltiple han sido útilespara todas la siguientes aplicaciones excepto una, señálala:

Ser claves para el desarrollo de nuevos fármacos

Identificar nuevas traslocaciones

Mejorar la clasificación pronóstica

Desarrollar nuevos fármacos

Cuestionario

EvaluaciónMieloma múltiple. Impacto de las

alteraciones citogenéticas y moleculares

1

2

3

a

b

c

a

b

c

d

a

b

c

d

d

¿Cuál de estas alteraciones citogenéticas es de buen pronóstico enel mieloma múltiple?

t(4;14)

Deleción de 17q13

Cariotipo hipodiploide

t(11;14)

¿Cuál de las siguientes afirmaciones es correcta sobre la fisiopatogeniadel mieloma múltiple?

Existe 1 tipo de mieloma múltiple: el hiperdiploide

Los fenómenos de angiogénesis no son importantes

Casi siempre está implicado un gen productor de ciclinas

Las traslocaciones del gen IGH son un fenómeno secundario

Mieloma múltiple. Impacto de lasalteraciones citogenéticas y moleculares

4a

b

c

d

5a

b

c

d

CuestionarioRespuestascorrectas:

1.a2.a3.b4.d5.c

Leucemia mieloide crónica.Importancia del seguimientode la respuesta molecular ymecanismos de resistencia

Cuadernos

deHem

atología Dra. Pilar Martínez Sánchez

Servicio de Hematología

Hospital Universitario 12 de Octubre

Madrid

III

La leucemia mieloide crónica tiene una huella genética (cromosomaPhiladelphia formado por la traslocación entre los cromosomas 9 y22) y un correlato molecular (gen de fusión BCR/ABL) que sirven parael seguimiento de la respuesta al tratamiento.

Con la utilización de los nuevos fármacos inhibidores de tirosinquina-sas se consigue que la mayoría de los pacientes alcancen respues-tas citogenéticas completas, lo que origina que las técnicas molecu-lares adquieran más importancia en el seguimiento, debido a sumayor sensibilidad.

El seguimiento molecular de la enfermedad se realiza a través de lacuantificación de la expresión del transcrito patológico de fusiónBCR/ABL, por técnicas de PCR cuantitativa.

La cuantificación de BCR/ABL tiene además importancia pronósticay ayuda a tomar decisiones terapéuticas en el manejo de los pacien-tes con LMC.

Leuc

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cia Resumen

Ante una falta de respuesta al fármaco o una pérdida de respuesta,se deben investigar los posibles mecanismos de resistencia.

Entre los mecanismos de resistencia más estudiados encontramoslas mutaciones en el dominio quinasa de ABL, que dificultan la unióndel fármaco a la proteína quimérica y, por tanto, la correcta actividadantitumoral del mismo.

Para un seguimiento óptimo de la respuesta al tratamiento, se reco-mienda un estudio molecular cada tres meses, así como el estudiode mutaciones en los casos con una indicación establecida.

Leucemiamieloidecrónica.Importanciadelseguimientodelarespuestamolecularymecanismosderesistencia

Importancia del seguimiento de larespuesta molecular en la leucemiamieloide crónica

La leucemia mieloide crónica (LMC)es una expansión clonal de célulasprogenitoras hematopoyéticas carac-terizada clínicamente por hiperplasiamieloide, leucocitosis con basofilia yesplenomegalia. A nivel genético escaracterística la presencia del cro-mosoma Philadelphia, que se originapor la traslocación recíproca entrelos brazos largos de los cromoso-mas 9 y 22 t(9;22) (q34;q11). El des-cubrimiento en el año 1985 del gende fusión BCR/ABL en el cromoso-ma Philadelphia marcó el comienzode una nueva era en el conocimientode las bases moleculares de la LMCy posibilitó el diseño de nuevas molé-culas que inhiben la actividad tirosin-quinasa de la proteína oncogénicaBCR/ABL (imatinib y más reciente-mente otros inhibidores tirosinquina-sa de segunda generación). Aunquelas técnicas citogenéticas continúansiendo el gold standard para monito-rizar la respuesta al tratamiento delos pacientes con LMC Philadelphiapositiva, una vez alcanzada la res-puesta citogenética completa (RCC),el único método que nos permitemonitorizar los niveles de enferme-dad del paciente es el estudio mole-cular. Para ello se emplea la técnicade la reacción en cadena de la poli-merasa (PCR), mediante la cual seamplifica el transcrito de fusiónBCR/ABL. Si tenemos en cuenta queen la actualidad, con el tratamientocon inhibidores de tirosinquinasa(ITK), más de un 80% de los pacien-tes alcanzan RCC1, es necesario

introducir estas técnicas de análisismás sensibles, que nos permitanmedir más y mejores respuestas altratamiento. En los enfermos quealcanzan RCC, el nivel del transcritoBCR/ABL sigue disminuyendo con eltiempo, incluso en algunos casoshasta pasados tres años de la obten-ción de la respuesta citogenética.

Las definiciones de las respuestas seresumen en la figura 1. En el estudioIRIS (International Ramdomized trialof Imatinib versus Interferon/Ara-C),estudio de referencia desde el iniciode la era de imatinib, se calculó ydeterminó el nivel de expresión deltranscrito BCR/ABL basal al diag-nóstico, tomando el valor de lamedia de expresión de 30 de lospacientes del estudio. Posteriormentey con este valor al diagnóstico comoel 100%, se definió la respuesta mole-cular mayor (RMM) como la disminu-ción de la expresión en 3 logaritmosrespecto a esta media, lo que expre-sado en porcentaje sería alcanzar unnivel inferior al 0,1% respecto al nivelbasal2. A partir de aquí cada labora-torio debe establecer un nivel basal ycalcular las diferencias respecto alobtenido en el estudio IRIS, para asíestablecer un factor de correcciónque permita emitir un resultadoreproducible y de uso internacional.Otra forma de homogeinizar losresultados es el uso de un calibradoruniversal, para el cálculo de los mis-mos, que esté al alcance de todoslos laboratorios. La respuesta mole-cular completa (RMC) se define comola desaparición de la detección deBCR/ABL mediante PCR convencio-

1


nal o la disminución de 4,5 logaritmosmediante PCR cuantitativa. Si bieneste concepto no tiene hoy por hoyuna traducción pronóstica, es muyprobable que a no muy largo plazosea un paso previo e imprescindiblehacia la curación de la enfermedad.

La calidad de la respuesta molecularse ha incluido, así mismo, en la defi-nición de respuesta subóptima y enlas señales de alarma durante elseguimiento de la enfermedad3 (tablaI). En términos moleculares, se con-sidera como respuesta subóptima lafalta de RMM a los 18 meses de tra-tamiento con imatinib o la pérdida dedicha respuesta una vez alcanzada.La falta de RMM a los 12 meses detratamiento, o el aumento del niveldel transcrito patológico, comproba-do en más de una muestra, en cual-

quier momento del seguimiento sonalertas que nos obligan a monitorizarmás estrechamente al paciente(tabla 1). La recaída molecular sedefine como el aumento del nivel deexpresión del transcrito BCR/ABL deun logaritmo, comprobado en dosdeterminaciones consecutivas. Cuan-do esto ocurre, la probabilidad derecaída de la enfermedad es alta, ypor ello deben considerarse señalesde alarma para inquirir sobre lasposibles causas y, si es necesario,modificar el tratamiento del enfermo.Otras aportaciones del estudio mole-cular en el seguimiento de los pacien-tes con LMC son las siguientes:

• Se ha observado que una res-puesta molecular precoz seacompaña siempre de una futu-ra respuesta mejor. Las reduc-ciones tempranas del nivel del

2

Leucemia mieloide crónica. Importancia del seguimientode la respuesta molecular y mecanismos de resistencia


Figura 1. Definición de las respuestas citogenética y molecular

transcrito BCR/ABL (reducción aun 20% a los dos meses del trata-miento) se asocian con una mayorprobabilidad de conseguir una res-puesta citogenética mayor4.

• Las respuestas moleculares pre-dicen la duración de la RCC; así,los pacientes que en el momen-to de alcanzar RCC tienen tam-bién una RMM, observan menosprobabilidad de perder la res-puesta citogenética5.

• Una respuesta molecular tem-prana puede predecir la buenaevolución y ausencia de progre-sión de la enfermedad; lospacientes que en el momento delograr RCC tienen una disminu-ción mayor de 3 logaritmos en el

nivel de BCR/ABL, permanecenen remisión y progresan conmenos frecuencia que aquellospacientes con un nivel inferior derespuesta6. Cuando se consigueuna RMM en los primeros 18meses de tratamiento, aumentala supervivencia libre de progre-sión (SLP)1, que es el objetivodel tratamiento en estos momen-tos, y es uno de los datos quepermite monitorizar si la respues-ta obtenida es o no óptima y sies preciso iniciar una actitudterapéutica diferente.

• Por último, el aumento de losniveles del transcrito BCR/ABLdurante el seguimiento de pacien-tes que están en RCC, es un

3


Tabla I

Definición de fallo del tratamiento, respuesta subóptimay signos de alarma

Tiempo Fallo Respuesta subóptima Alarmas

Diagnóstico

Alto riesgo, del9q+,Alteracionescitogenéticas adicionalesen células Ph+

+3 meses Ausencia de RH Menos de RHC

+6 mesesMenos de RHC

Menos de RC(Ph+>95%)

Menos de RCP(Ph+>35%)

+12 meses Menos de RCP(Ph+>35%) Menos de RCC Menos de RMM

+18 meses Menos de RCC Menos de RMM

Cualquier momento

Pérdida de RHC

Pérdida de RCC

Mutación

Alteracionescitogenéticas adicionalesen células Ph+

Pérdida de RMM

Mutación

Cualquier aumento en elnivel de BCR/ABL

Otras alteracionescromosómicas en célulasPh-

RH: respuesta hematológica; RHC: respuesta hematológica completa; RC: respuesta citogenética;RCP: respuesta citogenética parcial; RCC: respuesta citogenética completa; RMM: respuesta molecular mayor

indicador temprano de la pérdi-da de respuesta7.

A pesar de la importancia de la cuan-tificación del transcrito BCR/ABL,persisten todavía diversos problemasmetodológicos que dificultan el usouniversal de esta técnica. Los prime-ros estudios moleculares en LMCempezaron con el objetivo de evaluarla respuesta tras el trasplante alogé-nico, empleando técnicas de PCRcualitativa. En la actualidad, la PCRcuantitativa es el método de elec-ción. Esta técnica permite calcular elnivel de expresión del transcritoBCR/ABL mediante un cocienteentre el número de copias del trans-crito patológico y el número decopias de un gen control (general-mente ABL o beta-glucoronidasa).Entre las ventajas de los estudiosmoleculares se incluyen la rapidez, labuena correlación que existe entrelos niveles en la médula ósea y lasangre periférica (con las ventajasque supone poder realizar el estudioen esa última) y la capacidad dedetectar niveles de enfermedad resi-dual muy bajos. Entre los inconve-nientes hay que señalar: la no des-preciable incidencia de falsos negati-vos derivados de la degradación delARN o de la sensibilidad baja de laprueba, problemas, no obstante,que pueden ser detectados median-te el uso de controles internos y unapobre reproducibilidad de los resulta-dos, sobre todo inter-laboratorio,debido a que la PCR se realiza utili-zando distintos procedimientos y a lafalta de consenso universal para

expresar los resultados. Los pasosprevios a la PCR, que incluyen laobtención y transporte de la muestra,la eliminación de los eritrocitos, laextracción del ARN y la retrotranscrip-ción a ADN complementario resultancruciales para el resultado final de ladeterminación y pueden variar muchoentre laboratorios. Así mismo, existendistintos métodos de PCR cuantitati-va en tiempo real. Finalmente losresultados pueden expresarse dediferentes maneras: teniendo encuenta un gen control, respecto alvalor en la muestra al diagnóstico,con el cálculo de la media de expre-sión de un grupo de muestras, o utili-zando una muestra como calibrador.Todas estas circunstancias han pues-to de manifiesto la necesidad deestandarizar y armonizar la metodolo-gía, tarea que ha supuesto un impor-tante trabajo a los expertos durantelos últimos años2, 8.

Mecanismos de resistencia a imatinib

Las resistencias al tratamiento conimatinib pueden ser primarias osecundarias, según el momento enque se producen9,10. La resistenciaprimaria se define como la falta derespuesta hematológica o citogenéti-ca significativa dentro de los plazosesperados y se considera un fallo deltratamiento; esto ocurre en el 4-6%de todos los casos en fase crónica,en el 24% de los casos en fase ace-lerada y en el 66% en fase blástica.La resistencia secundaria es la rea-parición progresiva del clon leucémi-co después de una respuesta inicialal fármaco; su frecuencia es de un7% a los dos años en los casos que

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iniciaron tratamiento con imatinibprecozmente, de un 27% en loscasos que iniciaron el tratamiento deforma más tardía, de un 60% en faseacelerada y hasta de un 90% en cri-sis blástica. En estos casos es pocoprobable que mantener el tratamien-to con imatinib conlleve algún bene-ficio9. La respuesta subóptima (tablaI) se considera también una resisten-cia al tratamiento si bien, a diferenciade los enfermos anteriores, estospacientes pueden todavía beneficiar-se de proseguir con el fármaco, aun-que con una evolución menos favo-rable a largo plazo.

Los mecanismos de resistencia des-critos hasta ahora se resumen en latabla II. En los casos de resistenciaprimaria las causas más probablesparecen ser las alteraciones en lostransportadores del fármaco y laactivación de nuevas rutas de seña-

les celulares, independientes deBCR/ABL. Por el contrario, los meca-nismos más probables de las resis-tencias adquiridas o secundarias sonel exceso de proteína tumoral por laamplificación del gen (este mecanis-mo suele ser más importante en fasesavanzadas) y la adquisición de muta-ciones en el dominio ABL quinasa.

1) Mutaciones en el dominio ABLquinasaHasta el momento se han descrito almenos 73 mutaciones diferentes queoriginan la sustitución de 50 aminoá-cidos, aunque sólo 7 de ellas supo-nen el 85% de los casos. La mayoríade los aminoácidos implicados en laresistencia alteran la conformaciónde la proteína y con ello su unión alfármaco3.

Entre las mutaciones que afectan ala unión directa de imatinib a ABL y

5


Tabla II

Clasificación de los mecanismos conocidos de resistencia a ITK

Resistencia Primaria

FarmacológicaAbsorción disminuidaInteracciones medicamentosasFalta de cumplimiento terapéutico

Celular

Disminución del transporteintracelular del fármaco (hOCT1)Aumento del transporteextracelular (MDR1, ABCG2)

Molecular

Mecanismos independientes deBCR/ABLHeterogeneidad de laenfermedad

Resistencia Secundaria Molecular

Selección de un subclón mutadoEmergencia de una rutaoncogénica alternativaOtros mecanismos no definidos

en primer lugar, por su importanciapronóstica y su frecuencia (15%),encontramos la mutación T315I. Latreonina, que proporciona un átomode O2 que forma el puente de unióncon el hidrógeno del fármaco, essustituida por isoleucina, que contie-ne un grupo hidrocarbono extra queinhibe la unión con imatinib10. Estamutación confiere resistencia total aimatinib y a los nuevos ITK. Otramutación descrita en el sitio de unióndel fármaco es la F317L/I.

En segundo lugar están las mutacio-nes en la región P-loop (phospate-loop), que es el lugar de unión delATP; entre éstas encontramos L248V,G250E, Q252H, Y253H y E255K.Las mutaciones de esta zona modi-fican la flexibilidad del P-loop y des-estabilizan la conformación requeridapara unirse a imatinib. Se ha sugeri-do que los pacientes con estasmutaciones tienen peor pronósticoque los que presentan otras muta-ciones, pero esto no se ha confirma-do en todos los estudios11. Los nue-vos ITK parecen vencer las resisten-cias a imatinib producidas por estasmutaciones.

Un tercer grupo de mutaciones estánlocalizadas en la región de activación:F328L, G383D, L384M, L387F/M,M388L; en esta región la quinasapuede adoptar dos conformaciones,una abierta o activa, y la otra cerradao inactiva. El imatinib provoca la con-formación inactiva y es incapaz deunirse a la forma activa. Las mutacio-nes en esta zona alteran el balanceenergético requerido para estabilizar

la forma cerrada o inactiva, lo quefavorece la forma abierta o activa, a laque no se puede unir el fármaco.

Por último hay un cuarto grupo demutaciones, que se encuentran enel dominio catalítico, que afectantambién a la unión con imatinib:M351T, E355G/D, K357R, F359V.

La frecuencia de mutaciones es dife-rente en las distintas fases de laLMC. Así, antes de comenzar el tra-tamiento con imatinib, la frecuenciade mutaciones es nula en fase cróni-ca y muy baja en otras fases de laenfermedad. En pacientes en trata-miento con imatinib y que muestranrespuesta al mismo, la frecuencia demutaciones puede llegar hasta un20%, no obstante, no está claro quese asocien necesariamente con laprogresión de la enfermedad. Es enlos casos de resistencia o recaída dela enfermedad cuando se considerarelevante la presencia de mutacio-nes; en fase crónica se detectanmutaciones en un 30% de las resis-tencias o recaídas, en fase aceleradaalrededor del 50% y en crisis blásticahasta del 75%.

2) Sobreexpresión de BCR/ABL

En estos casos, debido a la amplifi-cación del gen12 (se pueden ver múl-tiples copias del gen por FISH), hayun aumento de expresión de la pro-teína que tiene que ser inhibida porlas dosis terapéuticas del fármaco.En algunos estudios se sugiere quela sobreexpresión transitoria deBCR/ABL puede ser un fenómenotemprano en la resistencia a imatinib,

6



7


que precede a la emergencia de unclon dominante que porta mutaciónen el dominio quinasa.

3) Alteración en lostransportadores del fármaco

Los niveles intracelulares de imatinibson cruciales, incluso en el trata-miento de los casos resistentes porotro mecanismo como las mutacio-nes, existiendo algunas mutacionesque no impiden completamente launión del fármaco, pudiéndose supe-rar la resistencia en la medida en quese asegure una mayor concentracióndisponible del fármaco, siendo eneste punto donde los transportado-res transmembrana de la droga sonde vital importancia. Uno de estostransportadores es la glicoproteína-P, un producto del gen MDR1 (gende multirresistencia a drogas), queactúa expulsando el fármaco de lacélula. Si el fármaco no está en unaconcentración determinada puedeperder su efecto antileucémico10.Otro transportador de imatinib es elhOCT1 (human organic cation trans-porter 1), que media el transporte deImatinib al interior de la célula y suinhibición disminuye la concentraciónintracelular del fármaco, lo quepuede predecir una peor respuestaal mismo10,13. Se ha comprobadoque los niveles de expresión de estegen son mayores en los pacientesque alcanzan RCC a los 10 meses.Esto sugeriría que los pacientes conexpresión basal de hOCT1 baja noalcanzarían la RCC debido a nivelesinsuficientes del fármaco. Otro trans-portador menos estudiado, esBCRP/ABCG2 (breast cancer resis-

tance protein), que es probable quepueda estar implicado también en laresistencia, dado que funciona comobomba que expele el fármaco de lacélula y cuya expresión parece estaralterada en los casos resistentes10.

4) Mecanismos independientes deBCR/ABL

Los fenómenos epigenéticos seencuentran dentro de este grupo. Lametilación de los genes, propiedadque hace que se altere su control, enausencia de alteraciones en lasecuencia de ADN como mutacio-nes, deleciones o traslocaciones esuno de los más conocidos, modifi-cándose el control tanto por hipo-metilación como por hipermetilación.Otro mecanismo es la sobreexpre-sión de genes, que se ha estudiadomediante técnicas de microarrays.Se ha encontrado sobreexpresión degenes con actividad antiapoptótica ocon propiedades de transformaciónmaligna y de genes implicados enseñales de transducción y regulacióntranscripcional. Esto sugeriría querutas posteriores a BCR/ABL e inde-pendientes de su actividad tirosin-quinasa pueden ser factores impor-tantes que confieren resistencia aimatinib10.

Finalmente, la resistencia puedeestar condicionada por otras quina-sas que no son BCR-ABL, o porotras rutas posteriores e indepen-dientes de la quinasa. Aunque BCR-ABL desencadena la transformaciónmaligna en la LMC, hay datos eninvestigaciones recientes acerca delpapel de las vías independientes de

8



BCR-ABL en el desarrollo y progre-sión de la enfermedad, en particular,de la familia de las Src quinasas. LasSrc quinasas son capaces de promo-ver diversos aspectos de la progre-sión tumoral. Lyn y otras Src quina-sas mantienen la supervivencia celu-lar y pueden interferir en vías inde-pendientes tanto anteriores comoposteriores a la vía de BCR-ABL. Seha detectado activación persistentede la quinasa Lyn en pacientes conresistencia al imatinib, pero que nopresentan mutaciones de ABL 14. Enlas células leucémicas la expresión yactivación de Lyn es heterogénea ypuede alterarse por imatinib. En lafase temprana o sin tratamiento(denominada “normal”) en la ruta deseñales BCR-ABL es anterior a Lyn yotras Src quinasas. Así, Lyn se activaa través de BCR-ABL y es un efectorde la transformación maligna, portanto la inhibición de BCR-ABL porimatinib puede controlar la actividadde Lyn. No obstante, la exposición aimatinib altera la expresión de Lyn oinduce cambios en el control de suactivación y bien por sobreexpresión,autoactivación o asociación conotras proteínas adaptadoras, la acti-vación de Lyn adquiere independen-cia total o parcial de BCR-ABL y eneste punto ya no se puede controlarsolamente con imatinib.

5) Niveles inadecuados de imatiniben plasma

Se deben analizar cuando el pacien-te no responde de forma adecuada,se sospecha una interacción conotro fármaco, desarrolla efectosadversos graves, y finalmente, cuan-

do se sospecha que el paciente noestá tomando el fármaco de formacorrecta. La certeza de que los nive-les plasmáticos de imatinib están enrango terapéutico cuando hay sospe-cha de alguna de las circunstanciasprevias, debería preceder a otrosestudios, en los casos en que hayadisponibilidad de esta determinación.

Recomendaciones para unacorrecta monitorización molecularSe debe proceder a la cuantificacióndel transcrito BCR/ABL en MO o, pre-feriblemente, en SP en todos losenfermos con diagnóstico de LMCPhiladelphia positiva. Si bien esteestudio no sustituye a la citogenética,realizar la PCR cuantitativa cada 3meses ayuda a monitorizar mejor larespuesta y la velocidad de la misma,identifica a los pacientes que respon-den más lentamente y detectaría deforma precoz un posible aumento enla expresión del transcrito, desenca-denando la alerta 2,15. En la práctica,muchos centros realizan FISH comotécnica de evaluación de la respues-ta citogenética; en estos casos, siem-pre que el nivel de la FISH sea menora un nivel <10% sería necesario reali-zar citogenética convencional paraconfirmar la RCC. Una vez alcanzadala RCC, sería suficiente un seguimien-to molecular cada 3 meses si se con-sigue RMM y los niveles del transcritopermanecen estables. Esto es asíporque en diferentes estudios se havisto que en los pacientes en RMMno se encuentran alteraciones citoge-néticas adicionales, siendo la apari-ción de clones Philadelphia negativosexcepcional y sin clara significación.

9


En los casos en que se detecte unaumento de la expresión de BCR/ABLconfirmada en dos muestras conse-cutivas, se debe realizar citogenéticapara descartar la adquisición de nue-vas anomalías clonales que puedenasociarse a la progresión, o detectaranormalidades en las células Phila-delphia negativas que pueden aso-ciarse, aunque de forma poco fre-cuente, con mielodisplasia o leuce-mia aguda.

En cuanto al estudio de mutacionesen el dominio ABL quinasa, las reco-mendaciones actuales son lassiguientes: este estudio no es nece-sario al diagnóstico del paciente enfase crónica, ni cuando el pacientemantiene RCC, ya que la probabili-dad de detectarlas en estos momen-tos es muy baja y su significado esincierto. Se deben de realizar en lossiguientes supuestos:

a) en fase crónica cuando hay resis-tencia primaria al tratamiento o sedetecta resistencia adquirida porla pérdida de respuesta citogené-tica mayor o por el aumento deltranscrito >1 logaritmo confirma-do en dos muestras por PCRcuantitativa;

b) en fases avanzadas, en todoslos casos al diagnóstico y debe-rá repetirse siempre si en estasfases hay resistencia primaria oadquirida;

c) en los pacientes que pasan atratarse con ITK de segundageneración, al inicio del trata-miento y de forma periódica.

Conclusiones

El concepto de la monitorización dela respuesta al tratamiento de la LMCdebe evolucionar, y la monitorizaciónmolecular para el seguimiento del

Figura 2. Recomendaciones del seguimiento molecular

10



mismo se propone como una estra-tegia adecuada y armónica debido ala respuesta ocasionada por el usode los fármacos ITK y a las opcionesterapéuticas que siguen emergiendo.La respuesta molecular es un indica-dor sensible de la remisión citogené-tica y de la ausencia de progresiónde la enfermedad. El aumento de losniveles de BCR/ABL puede indicarde forma precoz la aparición deresistencia a imatinib o la apariciónde un subclón que porta una muta-ción. La monitorización molecularpermite tomar decisiones acerca de

la actitud terapéutica. Por todo esto,es fundamental el esfuerzo en laestandarización de la técnica, ya quepermitirá mejorar el seguimiento delos pacientes. Se recomienda elestudio de mutaciones en el dominioABL quinasa, porque además deexplicar el mecanismo de resistenciaen algunos pacientes, nos puedeorientar a elegir el fármaco más ade-cuado. Finalmente, respecto a losmecanismos de resistencia a los fár-macos ITK, éstos son múltiples, pro-bablemente simultáneos y todavía engran parte desconocidos.

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Paciente que tras el diagnóstico de LMC ha iniciado tratamiento conimatinib a dosis estándar. La cuantificación de BCR/ABL a los 9 meseses del 10% ¿cuál de las siguientes afirmaciones es la respuestacorrecta?

Debe considerarse como una respuesta subóptima y plantearel cambio de tratamiento a un ITK de segunda generación

Debe considerarse como fallo de tratamiento y cambiar a unITK de segunda generación

Debe considerarse la respuesta citogenética que presentabaa los 6 meses y repetirse a los 12 meses para establecer elfallo o la respuesta subóptima al tratamiento

Debe considerarse como una alarma para monitorizar másestrechamente al paciente

A los 18 meses de seguimiento de un paciente con LMC, la cuantifi-cación de BCR/ABL es de 0,08% ¿Cuál de las siguientes afirmacio-nes es la respuesta correcta?:

El paciente ha obtenido RMM y podemos abandonar lamonitorización molecular

El paciente tiene un dato de pronóstico favorable en cuantoa la duración de la supervivencia libre de progresión

Debemos repetir la cuantificación en el plazo de un mes paraconfirmarlo

El resultado no aporta información de pronóstico adicional siel paciente ya había alcanzado RCC a los 12 meses

Cuestionario

EvaluaciónLeucemia mieloide crónica.

Importancia del seguimiento de la respuestamolecular y mecanismos de resistencia

1

2

a

b

c

a

b

c

d

d

¿Cuál de las siguientes afirmaciones es la respuesta correcta?Un aumento de los niveles de BCR/ABL de 1 ó más logaritmos duranteel seguimiento:

Puede ser un indicador precoz de pérdida de respuesta

Se debe confirmar con otra muestra en el plazo de un mes

Se debe proceder a realizar estudio de mutaciones de ABL quinasa

Todas las respuestas anteriores son correctas

¿Cuál de las siguientes afirmaciones es la respuesta correcta?Respecto a las mutaciones en el dominio de ABL quinasa:

Son la causa más frecuente de resistencia primaria a imatinib

Son frecuentes en la fase crónica y su detección implica inva-riablemente que la enfermedad va a progresar

La mutación T315I se localiza en el lugar de unión de ABL aimatinib, por lo que es resistente a este fármaco, pero mues-tra cierta sensibilidad a ITK de segunda generación

Si iniciamos tratamiento con un ITK de segunda generaciónpor fallo de tratamiento con imatinib o por respuesta subópti-ma, debemos de estudiar la presencia de mutaciones en ABLquinasa antes de iniciar el nuevo fármaco

Entre los mecanismos de resistencia a imatinib ¿cuál de las siguientesafirmaciones es la respuesta correcta?:

Las mutaciones de ABL quinasa se detectan hasta en un 75%de los casos en crisis blástica resistentes al tratamiento

Las mutaciones en la zona P-loop son las más importantes porestar localizadas en la región de activación de la molécula

El transportador hOCT1 media el transporte de imatinib al exte-rior de la célula, por lo que los niveles altos de este transportadorse han descrito como un mecanismo de resistencia al fármaco

Cuando el paciente no se toma el fármaco de forma correctase pueden desencadenar mecanismos de resistencia inde-pendientes de BCR/ABL


3a

b

c

d

4

5

a

b

c

d

a

b

c

d

Cuestionario

Respuestascorrectas:

1.c2.b3.d4.d5.a

Factores pronósticosde la leucemia

linfática crónica

Cuadernos

deHem

atología Dra. Antonia Rodríguez Izquierdo

Servicio de HematologíaHospital Universitario 12 de octubre

Madrid

IV

La leucemia linfática crónica (LLC) constituye la forma de leucemia más fre-cuente en el mundo occidental, representando aproximadamente el 40% detodas las leucemias. Está caracterizada por una proliferación clonal y unaprogresiva acumulación de linfocitos neoplásicos de aspecto maduro en SP,médula ósea (MO), ganglios linfáticos, hígado, bazo y otros órganos.

Esta enfermedad presenta un curso clínico extremadamente variable y difí-cil de predecir hasta la fecha. De este modo, encontramos pacientes quesobreviven durante años incluso sin necesidad de tratamiento y que final-mente fallecen por otras causas, y pacientes con formas progresivas y rápi-damente fatales incluso tras la instauración de una terapia agresiva.

Se ha descrito una importante heterogeneidad en cuanto a presencia dealteraciones cromosómicas, el estado mutacional de los genes IgVH, y otrosfactores moleculares, reflejándose en cambios en niveles de expresión deCD38 y ZAP-70, así como otras moléculas. A pesar de la existencia de unperfil de expresión homogéneo en la LLC, la expresión de un reducidonúmero de genes se encuentra asociada con variables biológicas precisas,como el grado de activación de NFκB, y esta variabilidad se encuentra ade-más asociada al comportamiento clínico de la enfermedad.Fa

ctore

spro

nósti

cosd

elal

euce

mia

linfá

ticac

róni

ca

Resumen

Dada la variabilidad en el curso clínico de la enfermad sería deseablepoder realizar una evaluación del riesgo de progresión de cada pacientey valorar los beneficios de instaurar una terapia precoz más agresiva.

Entre los factores con valor pronóstico en LLC se encuentran: a) esta-dio clínico; b) Parámetros de laboratorio como alto recuento linfocitario(10 x107/µl), tiempo de duplicación linfocitario (inferior a 6 meses), ele-vación de la cifras de LDH (lactato deshidrogenasa), niveles en suero deTK (timidinquinasa), B2-microglobulina y CD23 soluble; c) histología deMO; d) alteraciones citogenéticas; e) estado mutacional de los genesIgVH; f) expresión de CD38 y ZAP-70.

Las nuevas técnicas de análisis molecular masivo identifican genes cuyaexpresión define grupos pronósticos. La mayoría de los resultados obte-nidos en los estudios de microarrays no han sido validados y sería nece-sario el uso de esta técnica en ensayos clínicos.

La citogenética y el estado mutacional IgVH son actualmente los mejorespredictores de curso clínico. Sin embargo, hay que continuar la búsque-da de otros marcadores de igual o mejor valor pronóstico que permitaestratificar los pacientes en función de un riesgo y asignarlos a unadeterminada terapia en función del mismo.

Factorespronósticosdelaleucemia

linfáticacrónica

Introducción

La leucemia linfática crónica (LLC) esuna entidad neoplásica englobadadentro de la clasificación actual de laOMS de los síndromes linfoproliferati-vos y constituye la forma de leucemiamás frecuente en el mundo occiden-tal, representando aproximadamenteel 40% de todas las leucemias. Afec-ta de forma predominante a personasde edad avanzada, con una media deedad al diagnóstico de 60 años. Res-pecto a la distribución por sexos, esmás frecuente en hombres que enmujeres con una proporción 2:1.

Está caracterizada por una prolifera-ción clonal y una progresiva acumu-lación de linfocitos neoplásicos deaspecto maduro en SP, médula ósea(MO), ganglios linfáticos, hígado,bazo y otros órganos. En más del95% de los casos, las células expre-san un fenotipo B, siendo el fenotipoT un hecho raro (2-5%).

El National Cancer Institute-sponso-red Working Group on ChronicLymphocytic Leukemia (NCI-WG onCLL) establece los criterios para eldiagnóstico de LLC1:

1. Cifra absoluta de linfocitos en SP≥ 5 x109/l,

2. Infiltración ≥ 30% de linfocitos enMO.

3. Monoclonalidad e inmunofenoti-po característico.

La determinación del inmunofenotipose ha convertido en esencial para eldiagnóstico de la enfermedad. Loslinfocitos B representan cerca del90% de la celularidad de la LLC. Es

característica la baja expresión deinmunoglobulinas de superficie (IgM oIgD), la existencia de monoclonali-dad, revelada por la expresión de lacadena ligera κ o λ y la co-expresiónde CD5 con marcadores de célula Bcomo CD19 y CD20. Las célulasexpresan CD23, CD27, HLA-DR yhay un considerable grado de hetero-geneidad en la expresión de CD79b,CD22, FMC7, CD25, CD11c y molé-culas de adhesión. Desde el punto devista diagnóstico, es posible usar unacombinación de marcadores paradistinguir esta entidad de otros tras-tornos linfoproliferativos en ocasionesmorfológicamente indistinguibles.

En cuanto a las manifestaciones clíni-cas, más del 60% de los casos sediagnostican en fase asintomática yhabitualmente es un examen rutinariode SP el que establece la sospechadiagnóstica. En las formas sintomáti-cas, las manifestaciones clínicas estánen relación con la acumulación de lascélulas leucémicas en los tejidos y conla inmunodeficiencia asociada, siendolos síntomas más frecuentes: debili-dad, fatiga, sudores nocturnos, fiebre,pérdida de peso, infecciones bacteria-nas y víricas e incluso tendencia alsangrado. En el examen físico, elhallazgo más típico son las adenopa-tías y la afectación del bazo y el híga-do también puede estar presente. A lolargo de la evolución de la enfermedadpueden aparecer fenómenos autoin-munes como AHAI, hipogammaglo-bulinemia, segundas neoplasias ytransformaciones histológicas a linfo-ma de alto grado (Síndrome de Rich-ter) y transformación prolinfocítica.

1


De forma particular, esta enfermedadpresenta un curso clínico extremada-mente variable y difícil de predecirhasta la fecha. De este modo,encontramos pacientes que sobrevi-ven durante años incluso sin necesi-dad de tratamiento y que finalmentefallecen por otras causas, y pacien-tes con formas progresivas y rápida-mente fatales incluso tras la instaura-ción de una terapia agresiva.

Recientemente se han desarrolladodrogas altamente eficaces y poten-cialmente curativas en LLC: fludara-bina, anticuerpos monoclonales anti-CD20 (Rituximab®) o anti-CD52(Campath®) y las diferentes modali-dades de trasplante hematopoyéti-co. Sin embargo, la estrategia tera-péutica y el momento de inicio de lamisma aún es controvertido, debidoa la existencia de formas indolentes yel dudoso beneficio que una terapiaprecoz aporta sobre la supervivenciade esta enfermedad.

Etiología y patogénesis de laenfermedadPese a los avances en el conoci-miento de esta enfermedad, la causade la misma permanece aún desco-nocida. Se ha descrito un mayorriesgo de desarrollar la enfermedadentre familiares de primer grado depacientes con LLC que el esperadoen la población general.

Se han descrito alteraciones cromo-sómicas en más del 80% de loscasos, pero la presencia de trasloca-ciones balanceadas es rara y lasalteraciones consisten fundamental-

mente en ganancias o pérdidas dematerial genético afectando a genesimplicados en apoptosis y resistenciaa drogas como p53 (17p13) y ATM(11q22-23).

En la LLC existe una progresiva acu-mulación de linfocitos B leucémicos,con una baja tasa de proliferación yuna vida prolongada reflejo de la exis-tencia de defectos en la vía de apop-tosis y las vías de crecimiento y dife-renciación celular. Proteínas involucra-das en el control de la apoptosis comoBCL-2, BAX y BCL-XL, se encuentrandesreguladas en la LLC. Las célulasleucémicas de aproximadamente el90% de los pacientes presentan altosniveles de BCL-2 aunque raramenteesto es debido a traslocaciones 2.

Partiendo de la existencia de unavariabilidad en el estado mutacionalde los genes que codifican para laregión variable de la cadena pesadade las inmunoglobulinas (IgVH), se hapostulado un doble origen de la célu-la neoplásica. Así pues, los casosque presentan mutaciones a estenivel podrían tener su origen en lacélula B de memoria tras un estímu-lo antigénico a su paso por el centrogerminal, mientras que los casos nomutados podrían originarse a partirde las células B vírgenes de SP, folí-culos primarios y zona del mantoperifolicular 3.

Factores pronósticosDurante la pasada década, las inves-tigaciones a nivel genético-molecularhan revelado una importante diversi-dad en esta enfermedad. Esta hete-

2

Factores pronósticos de la leucemialinfática crónica

Dra. Antonia Rodríguez Izquierdo

rogeneidad deriva de la presencia dediversas alteraciones cromosómicas,el estado mutacional de los genesIgVH, y otros factores, reflejándose encambios en niveles de expresión deCD38 y ZAP-70, así como otrasmoléculas. Además, cuando loscasos son divididos en categoríasbasadas en estas diferencias, existeuna relación con la variabilidad delcurso clínico de la enfermedad. Asípues, la presencia de algunas altera-ciones cromosómicas como son laspérdidas de las regiones 11q14 y17p13, la ausencia de mutacionesen los genes IgVH o la expresión dealtos niveles de CD38 o ZAP-70 seasocian a un peor pronóstico, for-mas más agresivas y supervivenciasmás cortas (tabla I) 4,5,6,7.

Hasta hace pocos años, los análisismoleculares de las enfermedades

neoplásicas se han basado en elestudio de genes individuales y confunción conocida. La aparición de lasnuevas técnicas de análisis molecu-lar masivo, hace posible analizar deforma simultánea la expresión demiles de genes, y profundizar en elconocimiento de los complejos cam-bios moleculares que subyacen enuna neoplasia.

Así pues, los resultados muestrancómo a pesar de la marcada hetero-geneidad de la LLC, esta enferme-dad representa una sola entidad,existiendo una firma molecularcomún a todos los casos, que sugie-re que todos ellos comparten elmismo mecanismo de transforma-ción neoplásica. En este proceso detransformación están implicadosgenes involucrados en las rutas quecontrolan el desarrollo y superviven-

3


Tabla I

Factores pronósticos en LLC

Referencia Factor pronósticoSupervivencia

(mediana/meses)

Döhner y cols. 4

Del 17p

Del 11q

Trisomía 12

Cariotipo normal

Del 13q

32

79

114

111

133

Crespo y cols. 5ZAP-70 >20%

ZAP-70 <20%

90

No alcanzada

Kröber y cols. 6CD38 > 7%

CD38<7%

79

114

Hamblin y cols. 7IgVH no mutado

IgVH mutado117

293

cia de la célula B como son la vía deseñalización desde BCR y la vía deactivación del factor de trascripciónNFκB. A pesar de la existencia de unperfil de expresión homogéneo en laLLC, la expresión de un reducidonúmero de genes se encuentra aso-ciada con variables biológicas preci-sas, como el grado de activación deNFκB, y esta variabilidad se encuen-tra además asociada al comporta-miento clínico de la enfermedad 8,9.

Dada la variabilidad en el curso clíni-co de la enfermad, sería deseablepoder realizar una evaluación delriesgo de progresión de cadapaciente y valorar los beneficios deinstaurar una terapia precoz másagresiva. Hasta la fecha, se han des-crito varios factores con valor pro-nóstico en LLC:

Estadio clínico

Clásicamente, el pronóstico de laLLC se ha determinado por los sis-temas clínicos de estadificación deBinet y Rai 10,11. Estos sistemas defi-nen la enfermedad en distintos esta-dios: temprano (Rai 0, Binet A),intermedio (Rai I/II, Binet B) y avan-zado (Rai III/IV, Binet C) con media-nas de supervivencia de 10, 5-7 y 1-3 años respectivamente. Sin embar-go, el curso clínico de pacientes per-tenecientes a un mismo grupo esheterogéneo y, además, estos siste-mas son insuficientes para predecirprogresión de la enfermedad enpacientes diagnosticados en esta-dios tempranos de enfermedad querepresentan cerca del 80% de loscasos.

Parámetros de laboratorio

Se han descrito parámetros relacio-nados con la masa tumoral o activi-dad de la enfermedad que se asociancon un peor pronóstico de la enfer-medad: alto recuento linfocitario (10x107/µl), tiempo de duplicación linfo-citario (inferior a 6 meses) y elevaciónde la cifras de LDH (lactato deshidro-genasa). Así mismo, altos niveles ensuero de TK (timidinquinasa) 12, B2-microglobulina 13 y CD23 soluble 14 seasocian con peor pronóstico.

Histología de la MO

El patrón de infiltración de la MOpuede ser difuso, nodular, intersticialo mixto. El patrón más frecuente esel mixto, aunque el difuso predominaen fases avanzadas de la enferme-dad. El patrón difuso frente al restode patrones se correlaciona conpeor pronóstico.

Citogenética

La aplicación de la técnica FISH(Fluorescence In Situ Hybridization),que utiliza células en interfase, detec-ta alteraciones cromosómicas enmás del 80% de los casos de LLC.Estos estudios han identificado comolas alteraciones más frecuentes: tri-somía del cromosoma 12 (15%), alte-raciones a nivel 13q14 (54% sola y36% compleja) y pérdidas en lasregiones 11q22-q23 (17%) y 17p13(8%) que afectan, entre otros, a losgenes ATM y p53, respectivamente, ypérdida de la región 6q (7%) 4. Altera-ciones en el brazo largo del cromoso-ma 13 revelan pérdida de materialque inicialmente se sugirió afectaba

4



al gen RB1 (Retinoblastoma 1), sinembargo, se ha demostrado que laregión perdida es telomérica a estegen y se postula que un posible gensupresor de tumores pueda encon-trarse en este área.

La presencia de alteraciones cromo-sómicas específicas ha sido asocia-da con algunas características de laenfermedad, así pues, la trisomía delcromosoma 12 se relaciona con unamayor proporción de prolinfocitos ypeor pronóstico 15. Los casos conpérdida 11q22-q23 presentan mar-cada afectación adenopática conformas progresivas de enfermedad,en pacientes de edades más jóvenesy menores tasas de supervivencialibre de tratamiento. Los casos conpérdida de la región 17p13 tienenuna mayor resistencia al tratamiento

y al igual que la pérdida de la región11q se asocia a menores tasas desupervivencia 16.

Pacientes con un cariotipo normal,alteraciones a nivel 13q14 comoalteración única y trisomía 12 tienenmejor pronóstico que aquellos conpérdidas a nivel 17p13 y 11q22-q23(tabla I) 4.

Estado mutacional de los genesIgVH

En 1999, dos grupos de forma inde-pendiente observaron, en aproxima-damente la mitad de los casos deLLC, la presencia del fenómeno deHipermutación Somática (HMS) enlos genes IgVH. El proceso de HMS(Fig. 1) es un mecanismo normal quegenera un aumento en la diversidad

5


Figura 1. Eventos moleculares en la diferenciación y maduración del linfocito B

de anticuerpos en respuesta a unantígeno. Este proceso introducemutaciones puntuales a nivel de losgenes IgVH que definen el sitio deunión al antígeno y está confinado alos centroblastos del centro germinalde un folículo linfoide 17.

En función de esta observación, loscasos se dividieron en 2 subgruposcon significación patogénica y pro-nóstica según la homología entre lasecuencia VH observada y la secuen-cia VH original. Aquellos casos conuna homología >98% se considera-ron no mutados (40%) y mutados(60%) si diferían en >2% de lasecuencia original. La mediana desupervivencia en el grupo no mutadoera de 8 años, mientras que el grupomutado presentaba supervivenciasmás prolongadas con una medianade 25 años (tabla I) 6,7. Debemosseñalar que la presencia de altera-ciones desfavorables (17p- y 11q-)ocurre de forma más frecuente enlos casos no mutados y las alteracio-nes favorables (13q- simple o com-pleja) ocurren más frecuentementeen los casos mutados. Además, inde-pendientemente del estado mutacio-nal, la utilización de unos determina-dos genes VH, como es el caso de lafamilia VH 3-21, se asociaba a peorpronóstico 6,7.

Los estudios de perfil de expresióngénico revelan un patrón de expresiónhomogéneo en todos los casos deLLC, independientemente del estadomutacional, y sólo un grupo limitado degenes se encuentran diferencialmenteexpresados entre estos subgrupos 18,19.

Expresión de CD38

El nivel de expresión de CD38 se hamostrado como un indicador pro-nóstico en LLC, asociándose mayo-res niveles de expresión a un com-portamiento clínico más agresivo(tabla I) 6.

Expresión de ZAP-70

ZAP-70 es una tirosinquinasa que seexpresa en condiciones normales encélulas T y NK pero no en células Bnormales. Las células B neoplásicasde la LLC expresan de modo abe-rrante esta proteína y los niveles deexpresión de la misma son altamen-te variables entre los casos. Laexpresión de ZAP-70 se correlacionacon el estado mutacional del genIgVH hasta en un 90 % de los pacien-tes así como con progresión de laenfermedad y con supervivencia(tabla I). Aquellos pacientes queexpresan mayores niveles de ZAP-70se encuentran en el grupo no muta-do y presentan una progresión másrápida y supervivencias más cortas.En los estudios de perfil de expresióngénica, entre los genes descritoscomo diferencialmente expresadosentre los casos mutados y no muta-dos, también se encuentra ZAP-70.Así pues, ZAP-70 se ha esbozadocomo el mejor marcador indirecto delestado mutacional y como un impor-tante factor pronóstico en la LLC 5,18.

La existencia de dos grupos en fun-ción del estado mutacional de losgenes IgVH hizo plantear la posibleexistencia de dos enfermedades dis-tintas englobadas en una misma

6



7


entidad. Así pues, dos grupos demanera independiente 18,19 utilizaronlos estudios de expresión con micro-arrays con la intención de identificardiferentes subtipos de enfermedaddentro de la LLC y diferencias a nivelgénico entre las células leucémicas ylos diferentes subtipos linfocitarios.En ambos estudios se encontró unperfil de expresión génica común atodos los casos, independiente delestado mutacional y que distinguíaclaramente esta entidad de las célu-las B normales y de otras neoplasiaslinfoides, sugiriendo que todos loscasos compartían el mismo mecanis-mo de transformación o el mismo ori-gen celular. Además, este perfil deexpresión se aproximaba más al per-fil con las células B de memoria que alde otros subtipos celulares. No obs-tante, ante la dramática diferencia enel comportamiento clínico de los gru-pos definidos por el estado mutacio-nal de los genes IgVH, analizaron lasdiferencias de expresión entre estosgrupos, existiendo un pequeñonúmero de genes diferencialmenteexpresados entre los casos mutadosy no mutados. Este grupo de genesse hallaba especialmente representa-do por genes involucrados en laseñalización desde el receptor de lacélula B, sugiriendo que alteracionesa este nivel pueden influir en el cursoclínico de ambos grupos. El gen másdiferencialmente expresado entreambos grupos resultó ser ZAP-70. Enlas células B existe una quinasa rela-cionada con ZAP-70 que traduce laseñal desde el receptor de la célula B,Syk, planteándose la posibilidad de

que ZAP-70 podría influir en la señali-zación de la célula B 5,18. Además, elestudio de Rosenwald y cols., mos-traba una posible aplicación clínica deestos hallazgos, permitiendo asignarcorrectamente los pacientes a undeterminado subtipo de LLC con sólo1-3 genes cuya expresión se hallabadiferencialmente expresada.

Rodríguez y cols. identifican en la firmamolecular de la LLC un grupo degenes que controlan el desarrollo nor-mal y supervivencia de la célula B através de las vías de señalizacióndesde BCR y la vía de activación delfactor de trascripción NFκB, sugirien-do la implicación de estas vías en lapatogénesis de la enfermedad. Estegrupo relaciona la variabilidad clínicade la LLC con la expresión de dos gru-pos de genes, implicados en la señali-zación de BCR y la activación deNFkB. La expresión de estos genesidentifica tres grupos pronósticos conuna supervivencia libre de tratamientoa los 5 años del 83, 50 y 17% 8,9.

Hasta la fecha, la mayoría de los resul-tados obtenidos en los estudios demicroarrays no han sido validados enotras series de pacientes o medianteotros métodos de análisis molecular ysería necesario el uso de esta técnicaen ensayos clínicos en los que losdatos de expresión génica pudiesenidentificar subgrupos de pacientescon diferencias en la respuesta a laterapia evaluada en el ensayo.

De los factores enumerados anterior-mente, la citogenética y el estado

8



mutacional son actualmente losmejores predictores de curso clínico,independientemente del estadío clí-nico. Sin embargo, hay que conti-nuar la búsqueda de otros marcado-

res de igual o mejor valor pronósticoque permita estratificar los pacientesen función de un riesgo y asignarlosa una determinada terapia en funcióndel mismo.

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9


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Respecto a las manifestaciones y curso clínico de la leucemialinfática crónica (LLC) ¿cuál de las siguientes afirmaciones no escierta?:

Más de la mitad de los casos se diagnostican en faseasintomática

Entre las complicaciones más frecuentes que podemosencontrar a lo largo de la evolución se encuentran lasinfecciones

La LLC puede transformarse en linfoma de alto grado

El curso clínico es poco variable entre los pacientes con LLC

En cuanto a la patogénesis de la enfermedad, señale la respuestaincorrecta

Se han descrito alteraciones cromosómicas en más del 80%de los casos

Es frecuente la presencia de traslocaciones balanceadas

Se han descrito defectos en las vía de apoptosis, crecimientoy diferenciación celular

El 90% de los pacientes presentan altos niveles de BCL-2

¿Cuál de las siguientes alteraciones cromosómicas no es frecuente enla LLC?

Trisomía cromosoma 12

Del 17p13

Del 11q14

t(11;14)

Cuestionario

EvaluaciónFactores pronósticos de laleucemia linfática crónica

1

2

3

a

b

c

a

b

c

d

a

b

c

d

d

Entre los factores pronósticos descritos en la LLC se encuentra:

Alteraciones cromosómicas

Estado mutacional IgVH


Todas las anteriores son ciertas

La presencia de uno de los siguientes factores se asocia a peorpronóstico en la LLC:

Expresión baja de ZAP-70

Pérdidas en la región 11q

Homología de secuencia IgVH < 2% respecto a secuenciaoriginal

Tiempo de duplicación linfocitaria > 24 meses

Factores pronósticos de laleucemia linfática crónica

4a

b

c

d

5a

b

c

d


1.d2.b3.d4.d5.b

Factores pronósticosde la leucemia

linfática crónica

Cuadernos

deHem

atología Dra. Antonia Rodríguez Izquierdo

Servicio de HematologíaHospital Universitario 12 de octubre

Madrid

IV

La leucemia linfática crónica (LLC) constituye la forma de leucemia más fre-cuente en el mundo occidental, representando aproximadamente el 40% detodas las leucemias. Está caracterizada por una proliferación clonal y unaprogresiva acumulación de linfocitos neoplásicos de aspecto maduro en SP,médula ósea (MO), ganglios linfáticos, hígado, bazo y otros órganos.

Esta enfermedad presenta un curso clínico extremadamente variable y difí-cil de predecir hasta la fecha. De este modo, encontramos pacientes quesobreviven durante años incluso sin necesidad de tratamiento y que final-mente fallecen por otras causas, y pacientes con formas progresivas y rápi-damente fatales incluso tras la instauración de una terapia agresiva.

Se ha descrito una importante heterogeneidad en cuanto a presencia dealteraciones cromosómicas, el estado mutacional de los genes IgVH, y otrosfactores moleculares, reflejándose en cambios en niveles de expresión deCD38 y ZAP-70, así como otras moléculas. A pesar de la existencia de unperfil de expresión homogéneo en la LLC, la expresión de un reducidonúmero de genes se encuentra asociada con variables biológicas precisas,como el grado de activación de NFκB, y esta variabilidad se encuentra ade-más asociada al comportamiento clínico de la enfermedad.Fa

ctore

spro

nósti

cosd

elal

euce

mia

linfá

ticac

róni

ca

Resumen

Dada la variabilidad en el curso clínico de la enfermad sería deseablepoder realizar una evaluación del riesgo de progresión de cada pacientey valorar los beneficios de instaurar una terapia precoz más agresiva.

Entre los factores con valor pronóstico en LLC se encuentran: a) esta-dio clínico; b) Parámetros de laboratorio como alto recuento linfocitario(10 x107/µl), tiempo de duplicación linfocitario (inferior a 6 meses), ele-vación de la cifras de LDH (lactato deshidrogenasa), niveles en suero deTK (timidinquinasa), B2-microglobulina y CD23 soluble; c) histología deMO; d) alteraciones citogenéticas; e) estado mutacional de los genesIgVH; f) expresión de CD38 y ZAP-70.

Las nuevas técnicas de análisis molecular masivo identifican genes cuyaexpresión define grupos pronósticos. La mayoría de los resultados obte-nidos en los estudios de microarrays no han sido validados y sería nece-sario el uso de esta técnica en ensayos clínicos.

La citogenética y el estado mutacional IgVH son actualmente los mejorespredictores de curso clínico. Sin embargo, hay que continuar la búsque-da de otros marcadores de igual o mejor valor pronóstico que permitaestratificar los pacientes en función de un riesgo y asignarlos a unadeterminada terapia en función del mismo.

Factorespronósticosdelaleucemia

linfáticacrónica

Introducción

La leucemia linfática crónica (LLC) esuna entidad neoplásica englobadadentro de la clasificación actual de laOMS de los síndromes linfoproliferati-vos y constituye la forma de leucemiamás frecuente en el mundo occiden-tal, representando aproximadamenteel 40% de todas las leucemias. Afec-ta de forma predominante a personasde edad avanzada, con una media deedad al diagnóstico de 60 años. Res-pecto a la distribución por sexos, esmás frecuente en hombres que enmujeres con una proporción 2:1.

Está caracterizada por una prolifera-ción clonal y una progresiva acumu-lación de linfocitos neoplásicos deaspecto maduro en SP, médula ósea(MO), ganglios linfáticos, hígado,bazo y otros órganos. En más del95% de los casos, las células expre-san un fenotipo B, siendo el fenotipoT un hecho raro (2-5%).

El National Cancer Institute-sponso-red Working Group on ChronicLymphocytic Leukemia (NCI-WG onCLL) establece los criterios para eldiagnóstico de LLC1:

1. Cifra absoluta de linfocitos en SP≥ 5 x109/l,

2. Infiltración ≥ 30% de linfocitos enMO.

3. Monoclonalidad e inmunofenoti-po característico.

La determinación del inmunofenotipose ha convertido en esencial para eldiagnóstico de la enfermedad. Loslinfocitos B representan cerca del90% de la celularidad de la LLC. Es

característica la baja expresión deinmunoglobulinas de superficie (IgM oIgD), la existencia de monoclonali-dad, revelada por la expresión de lacadena ligera κ o λ y la co-expresiónde CD5 con marcadores de célula Bcomo CD19 y CD20. Las célulasexpresan CD23, CD27, HLA-DR yhay un considerable grado de hetero-geneidad en la expresión de CD79b,CD22, FMC7, CD25, CD11c y molé-culas de adhesión. Desde el punto devista diagnóstico, es posible usar unacombinación de marcadores paradistinguir esta entidad de otros tras-tornos linfoproliferativos en ocasionesmorfológicamente indistinguibles.

En cuanto a las manifestaciones clíni-cas, más del 60% de los casos sediagnostican en fase asintomática yhabitualmente es un examen rutinariode SP el que establece la sospechadiagnóstica. En las formas sintomáti-cas, las manifestaciones clínicas estánen relación con la acumulación de lascélulas leucémicas en los tejidos y conla inmunodeficiencia asociada, siendolos síntomas más frecuentes: debili-dad, fatiga, sudores nocturnos, fiebre,pérdida de peso, infecciones bacteria-nas y víricas e incluso tendencia alsangrado. En el examen físico, elhallazgo más típico son las adenopa-tías y la afectación del bazo y el híga-do también puede estar presente. A lolargo de la evolución de la enfermedadpueden aparecer fenómenos autoin-munes como AHAI, hipogammaglo-bulinemia, segundas neoplasias ytransformaciones histológicas a linfo-ma de alto grado (Síndrome de Rich-ter) y transformación prolinfocítica.

1


De forma particular, esta enfermedadpresenta un curso clínico extremada-mente variable y difícil de predecirhasta la fecha. De este modo,encontramos pacientes que sobrevi-ven durante años incluso sin necesi-dad de tratamiento y que finalmentefallecen por otras causas, y pacien-tes con formas progresivas y rápida-mente fatales incluso tras la instaura-ción de una terapia agresiva.

Recientemente se han desarrolladodrogas altamente eficaces y poten-cialmente curativas en LLC: fludara-bina, anticuerpos monoclonales anti-CD20 (Rituximab®) o anti-CD52(Campath®) y las diferentes modali-dades de trasplante hematopoyéti-co. Sin embargo, la estrategia tera-péutica y el momento de inicio de lamisma aún es controvertido, debidoa la existencia de formas indolentes yel dudoso beneficio que una terapiaprecoz aporta sobre la supervivenciade esta enfermedad.

Etiología y patogénesis de laenfermedadPese a los avances en el conoci-miento de esta enfermedad, la causade la misma permanece aún desco-nocida. Se ha descrito un mayorriesgo de desarrollar la enfermedadentre familiares de primer grado depacientes con LLC que el esperadoen la población general.

Se han descrito alteraciones cromo-sómicas en más del 80% de loscasos, pero la presencia de trasloca-ciones balanceadas es rara y lasalteraciones consisten fundamental-

mente en ganancias o pérdidas dematerial genético afectando a genesimplicados en apoptosis y resistenciaa drogas como p53 (17p13) y ATM(11q22-23).

En la LLC existe una progresiva acu-mulación de linfocitos B leucémicos,con una baja tasa de proliferación yuna vida prolongada reflejo de la exis-tencia de defectos en la vía de apop-tosis y las vías de crecimiento y dife-renciación celular. Proteínas involucra-das en el control de la apoptosis comoBCL-2, BAX y BCL-XL, se encuentrandesreguladas en la LLC. Las célulasleucémicas de aproximadamente el90% de los pacientes presentan altosniveles de BCL-2 aunque raramenteesto es debido a traslocaciones 2.

Partiendo de la existencia de unavariabilidad en el estado mutacionalde los genes que codifican para laregión variable de la cadena pesadade las inmunoglobulinas (IgVH), se hapostulado un doble origen de la célu-la neoplásica. Así pues, los casosque presentan mutaciones a estenivel podrían tener su origen en lacélula B de memoria tras un estímu-lo antigénico a su paso por el centrogerminal, mientras que los casos nomutados podrían originarse a partirde las células B vírgenes de SP, folí-culos primarios y zona del mantoperifolicular 3.

Factores pronósticosDurante la pasada década, las inves-tigaciones a nivel genético-molecularhan revelado una importante diversi-dad en esta enfermedad. Esta hete-

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rogeneidad deriva de la presencia dediversas alteraciones cromosómicas,el estado mutacional de los genesIgVH, y otros factores, reflejándose encambios en niveles de expresión deCD38 y ZAP-70, así como otrasmoléculas. Además, cuando loscasos son divididos en categoríasbasadas en estas diferencias, existeuna relación con la variabilidad delcurso clínico de la enfermedad. Asípues, la presencia de algunas altera-ciones cromosómicas como son laspérdidas de las regiones 11q14 y17p13, la ausencia de mutacionesen los genes IgVH o la expresión dealtos niveles de CD38 o ZAP-70 seasocian a un peor pronóstico, for-mas más agresivas y supervivenciasmás cortas (tabla I) 4,5,6,7.

Hasta hace pocos años, los análisismoleculares de las enfermedades

neoplásicas se han basado en elestudio de genes individuales y confunción conocida. La aparición de lasnuevas técnicas de análisis molecu-lar masivo, hace posible analizar deforma simultánea la expresión demiles de genes, y profundizar en elconocimiento de los complejos cam-bios moleculares que subyacen enuna neoplasia.

Así pues, los resultados muestrancómo a pesar de la marcada hetero-geneidad de la LLC, esta enferme-dad representa una sola entidad,existiendo una firma molecularcomún a todos los casos, que sugie-re que todos ellos comparten elmismo mecanismo de transforma-ción neoplásica. En este proceso detransformación están implicadosgenes involucrados en las rutas quecontrolan el desarrollo y superviven-

3


Tabla I

Factores pronósticos en LLC

Referencia Factor pronósticoSupervivencia

(mediana/meses)

Döhner y cols. 4

Del 17p

Del 11q

Trisomía 12

Cariotipo normal

Del 13q

32

79

114

111

133

Crespo y cols. 5ZAP-70 >20%

ZAP-70 <20%

90

No alcanzada

Kröber y cols. 6CD38 > 7%

CD38<7%

79

114

Hamblin y cols. 7IgVH no mutado

IgVH mutado117

293

cia de la célula B como son la vía deseñalización desde BCR y la vía deactivación del factor de trascripciónNFκB. A pesar de la existencia de unperfil de expresión homogéneo en laLLC, la expresión de un reducidonúmero de genes se encuentra aso-ciada con variables biológicas preci-sas, como el grado de activación deNFκB, y esta variabilidad se encuen-tra además asociada al comporta-miento clínico de la enfermedad 8,9.

Dada la variabilidad en el curso clíni-co de la enfermad, sería deseablepoder realizar una evaluación delriesgo de progresión de cadapaciente y valorar los beneficios deinstaurar una terapia precoz másagresiva. Hasta la fecha, se han des-crito varios factores con valor pro-nóstico en LLC:

Estadio clínico

Clásicamente, el pronóstico de laLLC se ha determinado por los sis-temas clínicos de estadificación deBinet y Rai 10,11. Estos sistemas defi-nen la enfermedad en distintos esta-dios: temprano (Rai 0, Binet A),intermedio (Rai I/II, Binet B) y avan-zado (Rai III/IV, Binet C) con media-nas de supervivencia de 10, 5-7 y 1-3 años respectivamente. Sin embar-go, el curso clínico de pacientes per-tenecientes a un mismo grupo esheterogéneo y, además, estos siste-mas son insuficientes para predecirprogresión de la enfermedad enpacientes diagnosticados en esta-dios tempranos de enfermedad querepresentan cerca del 80% de loscasos.

Parámetros de laboratorio

Se han descrito parámetros relacio-nados con la masa tumoral o activi-dad de la enfermedad que se asociancon un peor pronóstico de la enfer-medad: alto recuento linfocitario (10x107/µl), tiempo de duplicación linfo-citario (inferior a 6 meses) y elevaciónde la cifras de LDH (lactato deshidro-genasa). Así mismo, altos niveles ensuero de TK (timidinquinasa) 12, B2-microglobulina 13 y CD23 soluble 14 seasocian con peor pronóstico.

Histología de la MO

El patrón de infiltración de la MOpuede ser difuso, nodular, intersticialo mixto. El patrón más frecuente esel mixto, aunque el difuso predominaen fases avanzadas de la enferme-dad. El patrón difuso frente al restode patrones se correlaciona conpeor pronóstico.

Citogenética

La aplicación de la técnica FISH(Fluorescence In Situ Hybridization),que utiliza células en interfase, detec-ta alteraciones cromosómicas enmás del 80% de los casos de LLC.Estos estudios han identificado comolas alteraciones más frecuentes: tri-somía del cromosoma 12 (15%), alte-raciones a nivel 13q14 (54% sola y36% compleja) y pérdidas en lasregiones 11q22-q23 (17%) y 17p13(8%) que afectan, entre otros, a losgenes ATM y p53, respectivamente, ypérdida de la región 6q (7%) 4. Altera-ciones en el brazo largo del cromoso-ma 13 revelan pérdida de materialque inicialmente se sugirió afectaba

4



al gen RB1 (Retinoblastoma 1), sinembargo, se ha demostrado que laregión perdida es telomérica a estegen y se postula que un posible gensupresor de tumores pueda encon-trarse en este área.

La presencia de alteraciones cromo-sómicas específicas ha sido asocia-da con algunas características de laenfermedad, así pues, la trisomía delcromosoma 12 se relaciona con unamayor proporción de prolinfocitos ypeor pronóstico 15. Los casos conpérdida 11q22-q23 presentan mar-cada afectación adenopática conformas progresivas de enfermedad,en pacientes de edades más jóvenesy menores tasas de supervivencialibre de tratamiento. Los casos conpérdida de la región 17p13 tienenuna mayor resistencia al tratamiento

y al igual que la pérdida de la región11q se asocia a menores tasas desupervivencia 16.

Pacientes con un cariotipo normal,alteraciones a nivel 13q14 comoalteración única y trisomía 12 tienenmejor pronóstico que aquellos conpérdidas a nivel 17p13 y 11q22-q23(tabla I) 4.

Estado mutacional de los genesIgVH

En 1999, dos grupos de forma inde-pendiente observaron, en aproxima-damente la mitad de los casos deLLC, la presencia del fenómeno deHipermutación Somática (HMS) enlos genes IgVH. El proceso de HMS(Fig. 1) es un mecanismo normal quegenera un aumento en la diversidad

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Figura 1. Eventos moleculares en la diferenciación y maduración del linfocito B

de anticuerpos en respuesta a unantígeno. Este proceso introducemutaciones puntuales a nivel de losgenes IgVH que definen el sitio deunión al antígeno y está confinado alos centroblastos del centro germinalde un folículo linfoide 17.

En función de esta observación, loscasos se dividieron en 2 subgruposcon significación patogénica y pro-nóstica según la homología entre lasecuencia VH observada y la secuen-cia VH original. Aquellos casos conuna homología >98% se considera-ron no mutados (40%) y mutados(60%) si diferían en >2% de lasecuencia original. La mediana desupervivencia en el grupo no mutadoera de 8 años, mientras que el grupomutado presentaba supervivenciasmás prolongadas con una medianade 25 años (tabla I) 6,7. Debemosseñalar que la presencia de altera-ciones desfavorables (17p- y 11q-)ocurre de forma más frecuente enlos casos no mutados y las alteracio-nes favorables (13q- simple o com-pleja) ocurren más frecuentementeen los casos mutados. Además, inde-pendientemente del estado mutacio-nal, la utilización de unos determina-dos genes VH, como es el caso de lafamilia VH 3-21, se asociaba a peorpronóstico 6,7.

Los estudios de perfil de expresióngénico revelan un patrón de expresiónhomogéneo en todos los casos deLLC, independientemente del estadomutacional, y sólo un grupo limitado degenes se encuentran diferencialmenteexpresados entre estos subgrupos 18,19.

Expresión de CD38

El nivel de expresión de CD38 se hamostrado como un indicador pro-nóstico en LLC, asociándose mayo-res niveles de expresión a un com-portamiento clínico más agresivo(tabla I) 6.


ZAP-70 es una tirosinquinasa que seexpresa en condiciones normales encélulas T y NK pero no en células Bnormales. Las células B neoplásicasde la LLC expresan de modo abe-rrante esta proteína y los niveles deexpresión de la misma son altamen-te variables entre los casos. Laexpresión de ZAP-70 se correlacionacon el estado mutacional del genIgVH hasta en un 90 % de los pacien-tes así como con progresión de laenfermedad y con supervivencia(tabla I). Aquellos pacientes queexpresan mayores niveles de ZAP-70se encuentran en el grupo no muta-do y presentan una progresión másrápida y supervivencias más cortas.En los estudios de perfil de expresióngénica, entre los genes descritoscomo diferencialmente expresadosentre los casos mutados y no muta-dos, también se encuentra ZAP-70.Así pues, ZAP-70 se ha esbozadocomo el mejor marcador indirecto delestado mutacional y como un impor-tante factor pronóstico en la LLC 5,18.

La existencia de dos grupos en fun-ción del estado mutacional de losgenes IgVH hizo plantear la posibleexistencia de dos enfermedades dis-tintas englobadas en una misma

6



7


entidad. Así pues, dos grupos demanera independiente 18,19 utilizaronlos estudios de expresión con micro-arrays con la intención de identificardiferentes subtipos de enfermedaddentro de la LLC y diferencias a nivelgénico entre las células leucémicas ylos diferentes subtipos linfocitarios.En ambos estudios se encontró unperfil de expresión génica común atodos los casos, independiente delestado mutacional y que distinguíaclaramente esta entidad de las célu-las B normales y de otras neoplasiaslinfoides, sugiriendo que todos loscasos compartían el mismo mecanis-mo de transformación o el mismo ori-gen celular. Además, este perfil deexpresión se aproximaba más al per-fil con las células B de memoria que alde otros subtipos celulares. No obs-tante, ante la dramática diferencia enel comportamiento clínico de los gru-pos definidos por el estado mutacio-nal de los genes IgVH, analizaron lasdiferencias de expresión entre estosgrupos, existiendo un pequeñonúmero de genes diferencialmenteexpresados entre los casos mutadosy no mutados. Este grupo de genesse hallaba especialmente representa-do por genes involucrados en laseñalización desde el receptor de lacélula B, sugiriendo que alteracionesa este nivel pueden influir en el cursoclínico de ambos grupos. El gen másdiferencialmente expresado entreambos grupos resultó ser ZAP-70. Enlas células B existe una quinasa rela-cionada con ZAP-70 que traduce laseñal desde el receptor de la célula B,Syk, planteándose la posibilidad de

que ZAP-70 podría influir en la señali-zación de la célula B 5,18. Además, elestudio de Rosenwald y cols., mos-traba una posible aplicación clínica deestos hallazgos, permitiendo asignarcorrectamente los pacientes a undeterminado subtipo de LLC con sólo1-3 genes cuya expresión se hallabadiferencialmente expresada.

Rodríguez y cols. identifican en la firmamolecular de la LLC un grupo degenes que controlan el desarrollo nor-mal y supervivencia de la célula B através de las vías de señalizacióndesde BCR y la vía de activación delfactor de trascripción NFκB, sugirien-do la implicación de estas vías en lapatogénesis de la enfermedad. Estegrupo relaciona la variabilidad clínicade la LLC con la expresión de dos gru-pos de genes, implicados en la señali-zación de BCR y la activación deNFkB. La expresión de estos genesidentifica tres grupos pronósticos conuna supervivencia libre de tratamientoa los 5 años del 83, 50 y 17% 8,9.

Hasta la fecha, la mayoría de los resul-tados obtenidos en los estudios demicroarrays no han sido validados enotras series de pacientes o medianteotros métodos de análisis molecular ysería necesario el uso de esta técnicaen ensayos clínicos en los que losdatos de expresión génica pudiesenidentificar subgrupos de pacientescon diferencias en la respuesta a laterapia evaluada en el ensayo.

De los factores enumerados anterior-mente, la citogenética y el estado

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mutacional son actualmente losmejores predictores de curso clínico,independientemente del estadío clí-nico. Sin embargo, hay que conti-nuar la búsqueda de otros marcado-

res de igual o mejor valor pronósticoque permita estratificar los pacientesen función de un riesgo y asignarlosa una determinada terapia en funcióndel mismo.

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Respecto a las manifestaciones y curso clínico de la leucemialinfática crónica (LLC) ¿cuál de las siguientes afirmaciones no escierta?:

Más de la mitad de los casos se diagnostican en faseasintomática

Entre las complicaciones más frecuentes que podemosencontrar a lo largo de la evolución se encuentran lasinfecciones

La LLC puede transformarse en linfoma de alto grado

El curso clínico es poco variable entre los pacientes con LLC

En cuanto a la patogénesis de la enfermedad, señale la respuestaincorrecta

Se han descrito alteraciones cromosómicas en más del 80%de los casos

Es frecuente la presencia de traslocaciones balanceadas

Se han descrito defectos en las vía de apoptosis, crecimientoy diferenciación celular

El 90% de los pacientes presentan altos niveles de BCL-2

¿Cuál de las siguientes alteraciones cromosómicas no es frecuente enla LLC?

Trisomía cromosoma 12

Del 17p13

Del 11q14

t(11;14)

Cuestionario

EvaluaciónFactores pronósticos de laleucemia linfática crónica

1

2

3

a

b

c

a

b

c

d

a

b

c

d

d

Entre los factores pronósticos descritos en la LLC se encuentra:

Alteraciones cromosómicas

Estado mutacional IgVH


Todas las anteriores son ciertas

La presencia de uno de los siguientes factores se asocia a peorpronóstico en la LLC:

Expresión baja de ZAP-70

Pérdidas en la región 11q

Homología de secuencia IgVH < 2% respecto a secuenciaoriginal

Tiempo de duplicación linfocitaria > 24 meses

Factores pronósticos de laleucemia linfática crónica

4a

b

c

d

5a

b

c

d


1.d2.b3.d4.d5.b

cuadernos de hematología 2008 · 2013-03-07 · Índice editor asociado: dra.florindagilsanz...

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