cuantificacion de los diferentes folatos (1)

Cuantificacin de los diferentesfolatos presentes en tomatillo

(Physalis ixocarpa) porcromatografa de lquidos

de alta resolucinQuantification of folatesin Physalis ixocarpaby high pressure liquidchromatography

JOS LUIS IBAVE GONZLEZ* Y M. OCHOA

ResumenEn este estudio se identificaron y determinaron las diferen-tes especies de folatos por medio de cromatografa liquidade alta resolucin en fase reversa, con deteccin de fluores-cencia, aunado a un tratamiento trienzimtico. Ladeconjugacin de las cadenas de glutamatos en los folatosse realiz mediante una columna de afinidad a folatos. Lacantidad promedio de folatos fue de 1.2 M/100 gramos depeso fresco. La composicin de las principales estructurasde folatos presentes en Physalis correspondi a 5-metil-tetrahidrofolato, tetrahidrofolato y 5-formil-tetrahidrofolato. Lavaloracin de estos importantes metabolitos dentro de la dietase ha soslayado debido a la dificultad implcita en su anli-sis. Es evidente que la falta de esta vitamina est implicadaen el riesgo de defectos del tubo neural y anencefalia, princi-palmente en embarazos no deseados, donde no se consumeuna dieta adecuada de suplementos antes de la concepcin.Este problema puede ser disminuido con la ingesta de fuen-tes de folatos en la dieta como Physalis ixocarpa.Palabras clave: tomatillo, folatos, HPLC.

__________________________________* Profesor-Investigador de la Facultad de Ciencias Agrotecnolgicas, Universidad Autnoma de Chihuahua, Campus

1. Chihuahua, Chihuahua, Mxico, 31310. Tel. (614) 4391844 y 45. [email protected]

AbstractAn efficient quantification method by HPLC wasimplemented for folates analysis in Physalisixocarpa (husk tomato). A trienzymatic treatmentwas used for the initial extraction of folates fol-lowed by glutamate deconjugation by a folate af-finity column. The average amount of folates was1.2 M/100 grams of fresh weight. The majorfolate structures present in Physalis were identi-fied as 5-methyl-tetrahydrofolate, tetrahydrofolateand 5-formyl-tetrahydrofolate. The importance ofthe methodology stresses the fact that the diffi-culty implied in the analysis was overcome. Sincethis vitamin is involved in several new born dis-orders such as neural tube defects and anen-cephaly, it is of great importance to provide suchelements in the diet and Physalis ixocarpa rep-resents an excellent source of folates.Keywords: green tomato (husk tomato), folates,HPLC.

Alimentos

Vol. I, No. 1 Enero-Abril 2007 9

Introduccin

l tomatillo (Physalis ixocarpa) es de amplio uso para la preparacinde salsas y platillos en la cocina mexicana y es una fuente importantepara el suministro de cantidades suficientes de folatos. Los folatos per-tenecen a las vitaminas del grupo B y son de gran importancia nutricionalE

para el ser humano. Estn compuestos de tres partes fundamentales: la uterina,con diferentes estados de oxidacin, que es una molcula de pABA, y final-mente de residuos de glutamato, los cuales imparten su estabilidad dentro dela clula. Estos compuestos son necesarios para prevenir enfermedadescardiovasculares, defectos del tubo neural, anencefalia (Berry et al., 1999;Czeizel y Dudas, 1992) y cncer (Giovannucci et al., 1995) por medio de ladonacin de un grupo metilo (llamado el ciclo de C1), necesario para la fabri-cacin de purinas y pirimidinas en la biosntesis de metionina y homocistena(Giovannucci et al, 1995). Su consumo es vital para una adecuada divisincelular y mantener la homeostasis (Wagner, 1995).

Las diferentes coenzimas in vivo depen-den de la cantidad y la biodisponibilidad al in-gerir folatos y despus de la prdida por vaurinaria, fecal y rutas catablicas (Mason, 1995;Boushey, 1995). Estudios recientes estipulanque el cido flico tiene la capacidad de pre-venir defectos del tubo neural, particularmenteal aumentar el sustrato disponible para lareductasa termolbil (5,10- methylenetetra-hydrofolato), lo que resulta en un aumento en laconversin de los aminocidos homocistena ymetionina, y por lo tanto elimina o reduce el ries-go de que no cierre el tubo neural (Fohr et al.,2002). Los folatos estn relacionados con laincidencia de anemia megaloblstica maternal,bajo peso del beb (Sauberlich, 1995) y alum-bramiento prematuro (School y Jonson, 2000).El consumo adecuado de alimentos ricos enfolatos (aproximadamente 392 mg/da) estasociado con la disminucin de un 22% de losniveles de homocistena en el cuerpo (Van Oartet al., 2003). La sensibilidad a la luz, calor y ox-geno de esta molcula la hacen susceptible alos mtodos empleados en la preparacin delos alimentos, ya que se pierde gran cantidad allixiviarse en el agua de coccin, puesto que esuna vitamina hidrosoluble. El mayor aporte defolatos en la dieta es por medio del consumode verduras.

Lo anterior sustenta la determinacin dela concentracin de folatos presente en los ali-mentos, que es crtica para la divisin celular,principalmente en mujeres embarazadas du-rante las horas iniciales de la concepcin y losprimeros tres meses de formacin del feto.Adecuados niveles de folatos previenen pro-blemas de anencefalia y defectos del tuboneural. Es determinante asegurar una cantidadadecuada de estos compuestos en la ingestade las mujeres en gestacin para evitar ries-gos al embrin, ya que los folatos son precur-sores de las bases nucleicas implicadas en labiosntesis del cido desoxirribonucleico.

El objetivo de esta investigacin fue iden-tificar y cuantificar los diferentes tipos de folatosbiolgicamente activos en los tejidos de toma-tillo (Physalis ixocarpa) mediante un mtodo es-tandarizado y efectivo por cromatografa de l-quidos de alta resolucin.

Materiales y mtodosEn este estudio se utiliz un cromatgrafo delquidos de alta resolucin (HPLC) de marca HPmodelo 1050 Agilent Instruments modelo 1100,equipado con una bomba cuaternaria, auto-muestreador, arreglo de diodos (DAD) condegasificacin por helio y un detector de fluo-rescencia (FLD), y con una columna Nucleosil


C-18 de 25 mm, 4.6, y 5mM. El HPLC es con-trolado por una PC con software HPChemStation; adems de una centrfugaEppendorf con temperatura controlada, unespectrmetro UV/Vis Cary-Varian y un ShakerNew Brunswick modelo CX, Thermolyne 1100.

Para el desarrollo del estudio fueron utiliza-dos los siguientes materiales: 5-metil-tetrahidrofolato, tetrahidrofolato, cido flico,5-formil-tetrahidrofolato, dihidrofolato (Sigma-Aldrich, St. Louis MO.), affi-gel 10 (bio-rad), ci-do trifluoroactico, folate binding protein (FBP,Sigma-Aldrich), azida de sodio, acetonitrilo gra-do HPLC, cido actico, DL-dithiotreithol(Sigma-Aldrich) fosfato de potasio monohidrata-do, fosfato de potasio dihidratado, agua gradoHPLC, -amilasa (Aspergillus oryzae, Sigma-Aldrich), proteasa (Streptomyces griseus,Sigma-Aldrich) y conjugasa pancretica de po-llo tipo 1 (Sigma-Aldrich).

Todos los compuestos empleados fueronde la mas alta pureza y las soluciones fueronfiltradas a travs de un filtro de nylon 0.22 m(Sigma-Aldrich).

La preparacin de la columna se realizde acuerdo a Gregory y Toth (1988) y Selhubet al., (1980), con algunas modificaciones. Setomaron 9.3 ml de agarosa Biorad Affi-Gel 10,se colocaron en una cpsula de porcelana, sehizo lavado con 3 volmenes de cama con aguaa 4 C, se pasaron a un matraz Erlenmeyer de

Figura 1. Tomatillo (Physalis ixocarpa)en diferentes estados fenolgicos.

50 ml y se colocaron en un agitador a 4 C y a150 rpm. La protena folate binding protein(FBP) se disolvi en un amortiguador defosfatos pH 7 y despus se aadi la agarosa,agitndose durante cuatro horas para formaruna buena unin entre ellas. Luego se sac yse lav con buffer de KAc 0.05 M a pH 4.9 tresveces; posteriormente se empac y se enjuagcon KAc 0.05 M en tres ocasiones, para un fi-nal con tres volmenes de cama con buffer defosfatos.

Para la preparacin de anlisis de los fru-tos de tomatillo, se adquirieron stos en dife-rentes centros comerciales del estado deChihuahua. La extraccin de la muestra se lle-v a cabo de acuerdo al mtodo de Selhub etal., (1980) y con las menores modificacionespropuestas por Gregory y Toth (1988), bajo luzamarilla de baja intensidad para impedir lafotodegradacin de los compuestos a deter-minar. A cada frasco de extracto se le agregel buffer de extraccin pH 7 y se calent a baomara por 10 min a 100 C, mientras se agitabaa 50 rpm durante 10 min. Posteriormente y deforma inmediata se puso en bao con hielo parabajar la temperatura y se aplic una corrientede nitrgeno para desplazar el oxgeno y evitarla oxidacin. Se centrifug por 20 min a unafuerza relativa de 13000 x g a 4C, separandoel sobrenadante y redisolvindose el residuoagitando de nuevo y centrifugndose por 10


min a 13000 x g a 4 C. Se juntaron lossobrenadantes y se afor a 50 ml con bufferde extraccin, lavndose nuevamente con ni-trgeno. Se tomaron 5 ml del sobrenadante yse pasaron a travs de la columna de FBP an-tes estabilizada con buffer de extraccin de 10ml y enjuagada con buffer de fosfatos 0.025Mcon 1M de NaCl a pH 7. Enseguida se lav nue-vamente con buffer de extraccin a un flujo de0.43 ml/min. por gravedad, fluyndose 0.02M(TFA)-0.02M (DTT) y lavados consecutivos0.025M de buffer de fosfatos, conteniendo 1Mde NaCl y de nuevo con buffer de extraccin.La columna de FBP se almacen con azida desodio 0.02 % en buffer de extraccin.

El tratamiento trienzimtico en los alimen-tos es necesario para determinar la cantidadde folatos total presente (Martn y Eintenmiller,1990). No todos los alimentos se comportanigual en el tratamiento trienzimtico, ya que notienen un pH de actividad definida (Tamura etal., 1997) y son usados para eliminar almidn yprotenas, que puedan causar interferencia endiferentes alimentos y por lo tanto incrementarla cantidad de folatos presentes (Cerna y Kas,1983; Tamura, 1998). Es por esto que todasestas tcnicas se realizan bajo luz amarilla paraeliminar la fotodegradacin. La preparacin dela -amilasa fue a una concentracin de 20 mg/ml, aadindose 2 ml a la muestra por 5 horasy 37 C, mientras que la concentracin de laproteasa fue de 10 mg/ml, aadindose 1 mlpor 0.30 g de muestra liofilizada 5 g de mues-tra fresca, preparndose con 0.1M de buffer defosfatos a 4.1, ajustando el pH con fosfatodibsico 0.1M y 57mM de cido ascrbico por 6horas a 37 C. La conjugasa pancretica (5 mg/ml) se prepar de acuerdo a Rader et al., (1998)y Gregory (1984), disolvindose por 3 horas a37 C en 1.42% de buffer fosfatos, conteniendo1% de cido ascrbico a pH de 7.8. Despusse calent en bao mara por 5 min., con elobjeto de desnaturalizar las enzimas y separarpor filtracin en un filtro de nylon 0.22 m.

Para la deteccin de folatos se utiliz ungradiente binario en sistema de cromatografade alta resolucin en fase reversa, columna C18nucleosil (150 x 4.6mm x 5 m) y dos detecto-res UV y fluorescencia. Todas las solucionesse prepararon con agua grado HPLC. El extracto

se coloc en fase isocrtica con buffer defosfatos, con concentracin de 30 mM, pH 2.2y en una relacin del 90% de buffer y 10% deacetonitrilo, seguido de una disminucin de steltimo a 85% y 15% respectivamente en los si-guientes 8 minutos, para volver al estado inicialen los siguientes 3 minutos. Se utiliz un flujode 0.8 ml/min y una longitud de onda de 290 nmen UV para cido flico, mientras que las con-diciones para el detector de fluorescencia fue-ron 290 nm de emisin y 356 nm de excitacinpara dihidrofolato, tetrahidrofolato y 5-metil-tetra-hidrofolato. En el caso de 5-formil-tetrahidrofo-lato se us una excitacin de 360 y 460 nm deemisin, respectivamente. La fase mvil con unpH cido tiende a tener pobres identificacionespara el 10 formiltetrahidrofolato, por la conver-sin a 5-10 metenil-tetrahidrofolato y la reduc-cin del dihidrofolato a tetrahidrofolato (DazDe la Garza et al., 2004; Robinson, 1971).

Resultados y discusinEn una gran cantidad de reportes cientficosse ha tratado de optimizar la preparacin de lamuestra y las condiciones cromatogrficas parala obtencin de una mayor cantidad de folatosde los diferentes materiales bajo estudio; sinembargo, a pesar de todos estos esfuerzos,slo se ha llegado a tratar de optimizar la canti-dad de muestra a extraer, dependiendo de lacapacidad de deteccin de los aparatos emplea-dos. Es por ello que al emplear Physalis comomaterial para cuantificar los niveles de folatospresentes se tuvo que trabajar en la adecua-cin del mtodo para garantizar la precisin dela medicin, por medio de la elucidacin de lacantidad mnima a detectar, llegndose a unaconclusin fundamental respecto a la cantidadmnima de muestra necesaria para lograrreproducibilidad del mtodo y detectar las con-centraciones de las diferentes estructuras re-lacionadas a folatos. Esta situacin arroj quecon un tamao de muestra de 5 g es suficientepara estar por encima de los lmites de detec-cin.

La capacidad de las columnas con FBP semidi con cido flico y se obtuvo en promedioun 92% de recuperacin de esta vitamina, conuna desviacin estndar de 6.2% y un flujo porgravedad entre 0.37-0.42 ml/min. Estos valo-


res se utilizaron como factor de correccin parala cuantificacin precisa de los folatos en to-matillo y determinar la aportacin de este im-portante complejo vitamnico en la dieta.

Los folatos de la matriz del tomatillo ex-trados mediante calor tienen unainterconversin del 10-formil-tetrahidrofolato a5-formil-tetra-hidrofolato. Es por eso que enocasiones no se detecta, ya que depende dela actividad y cantidad que tenga en cada ali-mento, o las sustancias que se emplean paraevitar oxidacin, como el 2-mercaptoetanol. Eneste estudio se detect una elevacin del con-tenido de cido flico como resultado de la oxi-dacin del dihidro-folato; adems, la importan-cia del uso de la combinacin de dosantioxidantes (2% w/v cido ascrbico y 2mMde 2-mercaptoetanol) da la estabilidad y con-vierte una cantidad de los folatos presentes ensu forma dihidrofolato a tetrahidrofolato, abrien-do la posibilidad de identificar y cuantificar lasdiferentes derivados de folatos y sus formasde estados de oxidacin. Lo anterior se llev acabo a pH de 4.1 para realizar la reduccin del5-metil-dihidrofolato a 5-metil-tetrahidrofolato,as como de dihidrofola-to a tetrahidrofolato,logrndose una mayor deteccin en fluores-cencia (Wilson y Horne, 1984; Gregory et al.,1990; Vahteristo et al., 1996). Estas formas sonde las que se han reportado como de mayoractividad dentro de las plantas y animales (fi-gura 2).

Durante la extraccin se tiene que prever

la cantidad de protena y almidn, ya que in-terfieren en la cuantificacin. Asimismo es ne-cesario tener una aproximacin de la concen-tracin posible de folatos que pueden estar pre-sentes, con el nmero adecuado de repeticio-nes para optimizar el tiempo de extraccin.Para lograr la digestin de las protenas y al-midones y liberar los folatos unidos a ellos, sedetermin que los tiempos para cada enzimafueron como sigue: -amilasa, 6 horas;proteasa, 2 horas; -carboxilasa, 4 horas. Conestos tratamientos fue posible evitar la degra-dacin trmica de los folatos a pesar de lostiempos tan largos para la digestibilidad.

La cantidad de folatos medidos usando elmtodo trienzimtico result en una precisinsuperior al 132% con respecto a la cuantifica-cin de estos compuestos a travs de la ac-cin exclusiva de la conjugasa, por lo que sedemuestra que los folatos en tomatillo se en-cuentran retenidos en la matriz celular del teji-do del alimento.

Para la identificacin y la cuantificacin delos folatos fue necesario determinar la longi-tud de onda apropiada para cada compuesto,ya que no todos pueden ser identificados a lamisma longitud, por ejemplo, la seal de de-teccin por fluorescencia para dihidrofolato esmuy baja en comparacin con las diferentesformas de tetrahidrohidrofolato.

En los resultados cromatogrficos (figuras3 y 4) se tom la mezcla racmica de cadafolato como un solo compuesto, ya que es muy

Figura 2. Principales derivados activos de folatos y las diferentes rutas metablicasen las cuales estn implicados (Ravanel et al., 2001).


complicado hacer la separacin de losismeros bajo la metodologa empleada.

A pesar de la gran dificultad para la detec-cin y cuantificacin de estos metabolitos comoresultado del pH propio del alimento y que afec-ta la estabilidad de los mismos, fue posibleobtener una excelente reproducibilidad delmtodo y buenos resultados en la cuantifica-cin total de folatos (1.21 mol/100g, en base apeso fresco), por lo que se ha podido elucidarque Physalis ixocarpa es una fuente adecuadapara proporcionar cantidades de folatos impor-tantes en la dieta.

En el cuadro 1 se muestran las diferentesformas cuantificadas de folatos en tomatillo,que presenta niveles importantes del metabolito5-metil-tetrahidrofolato, el cual se considera elde mayor significancia biolgica. Si asumimosque la ingesta per capita alcanza niveles de 3.5kg/ao (SAGARPA, 2001), es necesario intro-ducir campaas para promover su consumo,porque representa una fuente importante defolatos. Hay que recordar todos los problemasasociados con mujeres en edad frtil(Sauiberlich, 1971; Scholl et al., 2000).

El impacto positivo que tiene el tomatilloen la dieta, por desconocimiento, se ha igno-rado, ya que siempre se asocia como produc-to tpico de la comida mexicana. Se analizaronsus potenciales basndose en la prevencin dedefectos de tubos neurales y anencefalia, prin-cipalmente en embarazos no planeados, me-diante la cuantificacin del aporte de folatos pre-sentes en este producto.

El uso de la extraccin trienzimtica fueefectivo, obteniendo niveles ms altos que elempleo de una sola enzima, la conjugasa. En

el mtodo trienzimtico se obtuvieron nivelesde folatos hasta de 1.8 veces por encima de laconjugasa, debido principalmente a la interfe-rencia causada por la presencia de polmeros(almidn y protenas) que atrapan a este tipode compuestos. Sin embargo, su potencial ra-dica en la prevencin de defectos del tuboneural.

Para una adecuada deteccin de folatosen concentracin reducida, que es lo que ocu-rre comnmente en los alimentos, se requiereutilizar mtodos de separacin e identificacincon tcnicas de alta sensibilidad (Vahteristo etal., 1996), empleando cromatografa de lqui-dos de alta resolucin con deteccin de fluo-rescencia, con lmites inferiores que oscilanentre 0.03 a 2.3 pmol/100L en el punto de in-yeccin (Gregory et al., 1984). Adems de serun mtodo rpido en comparacin con el co-mnmente empleado (que se basa en una prue-ba microbiolgica), tambin permite determi-nar las diferentes especies de folatos presen-tes como monoglutamatos y poliglutamatos, ascomo sus estados de oxidacin.

Figura 4. Identificacin de diferentes especiesderivada de folatos como monoglutamatos con

detector de UV y arreglo de diodos ( 290 nm) enPhysalis ixocarpa.

Figura 3. Anlisis con detector de fluorescenciapara la identificacin de diferentes especies deriva-

das de folatos como monoglutamatos (exitacin290, emisin 356) en Physalis ixocarpa.

Cuadro 1. Cantidades de los diferentesestructuras derivadas de los folatos

presentes en tomatillo (Physalis ixocarpa).

Compuesto

cido Flico5 formil-tetrahidrofolatoDihidrofolatoTetrahidrofolato5 metil-tetrahidrofolatoTotal

Cantidad mol/100 g(media)0.1850.41520.09120.52261.2114


La ms alta concentracin de folatos selogr al tratar las muestras a pH de 4.1, ya queinhibi la actividad de la enzima conjugasaendgena contenida en la matriz del alimentoy por lo tanto afect la extraccin de este tipode compuestos (Gregory et al., 1990). A estepH se optimiz la actividad de la proteasa yamilasa para la extraccin completa de losfolatos del tejido del tomatillo. Es probable quealgunos de ellos se encuentren atrapados enprotenas y carbohidratos y, por consiguiente,tienen que ser sometidos a un proceso de di-gestin para su liberacin y correcta cuanti-ficacin en el alimento.

Al terminar el proceso de extraccin de losfolatos se recomienda inmediatamente inyec-tarlos, ya que al ser almacenados a bajas tem-peraturas se reduce su concentracin, debidoal deterioro y destruccin por exposicin a laluz.

El total de las formas de folatos antes deltratamiento trienzimtico es significativamentediferente despus del tratamiento trienzimtico(Nehmatallah, 2003), o se incrementa la con-centracin de compuestos, principalmente deconversin de dihidrofolatos a tetrahidrofolatos,ya sea por conversin como resultado de la tem-peratura, extraccin cida y el uso deantioxidantes (Lucock et.al., 1995). De formasimilar, empleando como fluyente de la colum-na el cido trifluoroactico y DL-dithiotreithol, sepueden perder derivados del folato como 5-HCO-THF, que tiene una gran inestabilidad apH bajos y puede convertirse parcialmente a5,10 metenil THF (Robinson, 1971).

ConclusionesEste es el primer reporte en la literatura endonde se ha trabajado con tomatillo (husktomato), que resulta ser una excelente fuentede folatos, por lo que su consumo o introduc-cin en la dieta, sobre todo en mujeres con po-tencial de gestacin, representa un alimentoideal para evitar o reducir el ndice de defectosdel tubo neural y anencefalias en recin naci-dos. Se ha establecido una metodologa parala identificacin y cuantificacin de los diferen-tes folatos presentes en Physalis ixocarpaempleando una modificacin en la metodolo-ga por HPLC, basada en un detector de fluo-

rescencia que ofrece rapidez y precisin, su-perando lo reportado en donde se emplean en-sayos microbiolgicos, que muchas veces noson tan sensibles en la cuantificacin por sercantidades muy pequeas de folatos en losalimentos. Aunado a lo anterior, se cuenta conuna excelente tcnica de extraccin de folatosde la matriz por el mtodo trienzimtico y laafinidad de folatos en columnas con protenasinmovilizadas para la purificacin de la mues-tra.

Durante la extraccin se dio una variacinde los resultados con una desviacin estndarde 6.2%, debido a que se compraron tomatillosen diferentes tiendas y diferentes fechas (entrefebrero y abril), que pueden cambiar en su com-posicin debido a factores biticos y abiticosteniendo variaciones en la cantidad de folatos obien expresndose ms algunos folatos debidoa su actividad interna en el tomatillo.

Los niveles de folatos encontrados enPhysalis permiten elucidar su importancia comoalimento constitutivo en una dieta que ayude apreparar balanceos nutrimentales entre los ti-pos de alimentos que debemos consumir, prin-cipalmente para mujeres en edad reproductiva.

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Recibido: Marzo 24, 2006/Aceptado: Agosto 19, 2006

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cuantificacion de los diferentes folatos (1)

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