cultivo embrionario in vitro en la especie porcina...

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García-Vázquez, F. A.; Matás, C.

Introducción

En esta segunda parte completamos la visión sobre el estado actual del cultivo embrionario in vitro en la especie porci-na, centrándonos en la Dinámica de los Cultivos embrionarios.

Dinámica del CE

En la dinámica del CE debemos tener en cuenta diferentes aspectos que pueden influir en el desarrollo embrionario. En este apartado vamos a ver algunos de estos factores.

• Medio secuencial: El embrión in vivo pasa por diferentes estados de desarrollo con diferentes necesidades metabólicas.

Por tanto, el cultivo in vitro requiere medios con los nutrientes adecuados en cada fase del desarrollo. En la especie humana, Gard-ner et al., (1996) analizaron la composición metabólica de los fluidos del oviducto y el útero a lo largo del ciclo menstrual y ob-servaron que las concentraciones de meta-bolitos a los que son expuestos in vivo los ovocitos y los embriones en sus primeros estadios varían a lo largo del tracto repro-ductor femenino. Para imitar esta situación se han desarrollado lo medios secuenciales los cuales aportan los nutrientes, oligoele-mentos y hormonas según el estadio de de-sarrollo embrionario aunque con un coste elevado. Además, un medio de cultivo bajo las condiciones en la que se desarrolla un embrión (por ejemplo temperatura y hume-dad) durante un largo periodo fácilmente

puede deteriorarse y no soportar el desarro-llo embrionario adecuadamente (Stewart-Savage y Bavister, 1988).

Generalmente el cultivo secuencial se ha llevado a cabo en dos medios distintos en los que variará tanto la composición como la concentración de sus compo-nentes. Ejemplos de medios comerciales secuenciales en la especie humana son el medio G1 y G2 (Gardner’s Growth Médium) (Gardner et al. 1998). El medio G1 está ba-sado en el nivel de carbohidratos presente en las trompas y aminoácidos esenciales para la división. También posee EDTA para secuestrar los cationes divalentes tóxicos y contrarrestar la actividad glicolítica del embrión. El medio G2 está basado en el nivel de carbohidratos en el útero, contie-

Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)

Francisco A. García-Vázquez y Carmen MatásDepartamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia

E-mail: [email protected], [email protected]. www.um.es/grupo-fisiovet.

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nº 34Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)

ne aminoácidos esenciales y no esenciales, pero no contiene EDTA. En bovino Lane et al., (2003) utilizaron estos medios secuen-ciales comerciales (G1.2/G2.2) frente a otros no secuenciales. Los resultados fueron simi-lares en cuanto a la calidad embrionaria, sin embargo, tras la transferencia de embriones obtuvieron mayor éxito con embriones que habían sido cultivados bajo un sistema se-cuencial. En la especie porcina también se ha estudiado este medio frente a un me-dio simple de una única etapa como es el NCSU23, sin embargo, en esta especie no se han mejorado los resultados con medio secuencial (Swain et al. 2001). Este hecho podría atribuirse a la diferente composición del medio más que al sistema secuencial ya que el NSCU23 contiene glucosa, glutamina y taurina pero no piruvato ni lactato como es el caso de G1 y G2. No obstante, el uso de diferentes medios según los requerimientos del embrión (medio secuencial) parece ser una metodología prometedora para la me-jora del desarrollo embrionario aunque la composición del medio variará no solo en función del estadio embrionario sino tam-bién en función de la especie.

• Sistema de cultivo dinámico: como ya se ha mencionado anteriormente, el uso de un medio estático (sin renovación) (Figura 4a) puede conllevar al acumulo de toxinas procedentes del metabolismo del embrión, como por ejemplo el amonio, y por otro lado no se renuevan los nutrientes esenciales. Por lo que se propone un nuevo sistema donde el medio se renueve cons-tantemente, es el denominado sistema de cultivo dinámico (Figura 4b). Además, según Gardner (1999) este sistema provoca un

menor estrés en el embrión, dando lugar a una mayor viabilidad. El problema de estos sistemas según algunos autores es no solo la eliminación de las productos tóxicos sino también de los factores beneficiosos (facto-res autocrinos y paracrinos) procedentes del propio embrión.

• Tranquilidad o estrés: En 2002, Leese propuso la siguiente hipótesis “…la super-vivencia de los embriones pre-implantacio-nes mejora con un bajo metabolismo; una situación que se lleva a cabo reduciendo la concentración de nutrientes en el medio de cultivo…”, por tanto según el autor la con-secuencia del cultivo embrionario in vitro es el aumento de la actividad metabólica y compromete la capacidad de desarrollo. Por otro lado, la reducción del metabolismo mediante agentes específicos incluyendo bajos niveles de oxígeno y bloqueantes químicos del metabolismo oxidativo mejora el desarrollo. Otra observación que apoya dicha hipótesis, sería que en los ovarios y en oviducto la temperatura es menor que en los tejidos adyacentes, lo que conlleva un descenso del metabolismo.

Sin embargo, esta teoría ha sido cues-tionada y otros autores plantean justa-mente la teoría opuesta ¿estresamos o no al embrión? La respuesta correcta a esta pre-gunta debe ser que en general, el estrés es-pecialmente de forma incontrolada y conti-nua causa serios daños y por tanto se debe evitar. Pero, se ha demostrado que en deter-minadas situaciones donde un apropiado y bien aplicado estrés ayuda a los gametos y embriones a aumentar su tolerancia a otras

Figura 4. a) Esquema del sistema estático de cultivo de embriones donde el medio no es renovado. b) Sistema dinámico en el cual el medio de cultivo es renovado constantemente.

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situaciones estresantes incluidas aquellos procedimientos que ocurren en el labora-torio (revisado por Vajta et al. 2010). Pry-benszky et al. (2008) describieron un méto-do donde usaban una determinada presión hidrostática como pre-tratamiento de ovocitos madurados in vitro, aumentando las tasas de división embrionarias y el de-sarrollo a estadio de blastocisto.

El fenómeno de que un estrés suble-tal induce una respuesta de mejora hacia otros tipos de estrés ha sido observado en todos los niveles de la vida desde bacte-rias a organismos multicelulares incluidos los humanos, es el denominado síndrome general de adaptación o también conocido como Ley de Selye (1963).

Sin embargo, las investigaciones que se han realizado parecen confirmar que el estrés crea una especie de protección, que bien podría tratarse del desarrollo de un es-tado de resistencia. Pero, todavía no hay da-tos suficientes para explicar con detalle que factores están involucrados en la respuesta al estrés de los gametos y embriones.

Evaluación de la calidad

embrionaria

Una vez que ya tenemos los embrio-nes, la siguiente pregunta seria ¿Cómo sabemos que los embriones obtenidos son de buena o mala calidad? Para ello existen

diferentes técnicas y procesos de evalu-ación embrionaria, pudiéndose clasificar en método invasivos (Figura 5) y no inva-sivos. Los métodos invasivos son aquellos en los cuales el embrión muere al aplicar la técnica de evaluación, y los no invasivos aquellos en los que todavía el embrión es viable. A continuación destacamos algunos de estos métodos.

Transferencia de

embriones

Finalmente, tras la obtención de los embriones, se requieren del desarrollo de sistemas biotecnológicos adecuados que

Figura 5. Blastocisto porcino de 6 días cultivado in vitro y teñido con Hoescht para la identificación de los núcleos celulares.

• Métodos NO INVASIVOS

Cronología desarrollo Evaluación morfológica Pruebas metabólicas (Respirometría) Formación blastocistos y eclosión Descendencia tras transferencia

• Métodos INVASIVOS

Recuento número células Análisis cromosónico y expresión génica Tinción diferencial Microscopía electrónica Estudio componentes celulares

Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)nº 13

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nos proporcionen una alta eficiencia en la transferencia embrionaria en estadios avanzados del desarrollo. En la especie por-cina, la transferencia embrionaria ha sido realizada con éxito mediante procedimien-tos quirúrgicos durante décadas (Figura 6) (Hazeleger y Kemp, 1999, Garcia-Vazquez et al. 2010), por lo que las aplicaciones co-merciales han sido en parte limitadas por este hecho. En los últimos años se han desarrollado diferentes técnicas para la transferencia embrionaria mediante en-doscopia o por métodos no quirúrgicos (transcervical) (revisado por Hazeleger y Kemp, 1999). Este último método permite la transferencia de embriones sin nece-sidad de anestesia, ni material quirúrgico ni personal altamente especializado, au-mentando la aplicación de esta técnica a nivel de campo con una considerable re-ducción de los costes.

Por tanto, con un desarrollo adecuado de la producción in vitro de embriones, incluyendo el cultivo embrionario, y la transferencia embrionaria podemos apli-car estas biotecnologías en otras áreas de la biomedicina como la producción de animales transgénicos por diversas metodologías como microinyección pro-nuclear, vectores virales, transgénesis mediada por espermatozoides… (Gadea y

García-Vázquez, 2010), clonación animal o la recuperación de animales en peli-gro de extinción. Además, en un futuro no muy lejano y cuando los sistemas de criopreservación embrionaria se encuen-tren más avanzados, estos embriones se podrían conservar de manera indefinida, pudiendo realizar intercambios genéticos de una manera más sencilla y efectiva.

Problemática CE porcino

y conclusiones

El limitado desarrollo de los embriones obtenidos in vitro hasta estadío de blasto-cisto y su menor calidad en comparación a los obtenidos in vivo, no se debe a un fallo puntual en el sistema de producción in vitro de embriones, sino a una combi-nación de determinados factores como una inadecuada o incompleta madura-ción citoplasmática, una inadecuada for-mulación de los medios de cultivo y unas condiciones de cultivo subóptimas (revisa-do por García-Roselló, 2005). Por tanto, se debe seguir investigando en las diferentes líneas que conlleva la producción in vitro embrionaria, con el fin de mejorar los ren-dimientos finales.

Agradecimientos

A todos los miembros de Departamen-to de Fisiología de la Facultad de Veteri-naria de la Universidad de Murcia.

Financiación

Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL-2009-12512-C02-01) y Fundación Sé-neca de la Región de Murcia (08752/PI/08).

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