INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Mario Arias Zabala

Pregrado en Ingeniería BiológicaFacultad de Ciencias

Universidad Nacional de ColombiaSede Medellín

2013

PROGRAMA RESUMIDO

1. Breve reseña histórica2. Generalidades de los Procesos Bioquímicos3. Procesos Fermentativos3.1. Estequiometría de procesos fermentativos3.2. Cinética de procesos fermentativos3.3. Aspectos termodinámicos4. Técnicas del cultivo celular4.1. Cultivo discontinuo (batch)4.2. Cultivo alimentado (fed batch)4.3. Cultivo continuo5. Agitación de Medios de Cultivo6. Aireación de Medios de Cultivo7. Esterilización8. Escalado

BIBLIOGRAFÍA (Libros)

1. Doran, P. : Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. 1995.2. Blanch, H. and Clark, D.: Biochemical Engineering. Marcel Dekker. 1997.3. Casablancas, F. y López, J. (Editores): Ingeniería Bioquímica. Editorial

Síntesis.1998.4. Bailey, J. and Ollis, D.: Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill. 1986.5. Quintero, R.: Ingeniería Bioquímica. Editorial Alhambra. 1981. 6. Bu’Lock, J. y Kristiansen, B.: Biotecnología Básica. Edit. Acribia. 1991.7. Stanbury, P., Whitaker, A. and Hall, S.: Principles of Fermentation Technolo-

gy. Edit. Butterworth Heinemann. 1995.8. Nielsen, J. and Villadsen, J.: Bioreaction Engineering Principles. Plenum

Press. 1994.9. Wang, D. y otros: Fermentation and Enzyme Techonology. John Wiley and

Sons. 1979.10. Aiba, S., Humphrey, A. and Millis, N.: Biochemical Engineering. Academic

Press. 1973.11. Shuler, M. and Kargi, F.: Bioprocess Engineering: Basic Concepts. Prentice

Hall. 1992.

BIBLIOGRAFÍA (Revistas)

1. Biotechnology and Bioengineering

2. Biotechnology Progress

3. Journal of Fermentation and Bioengineering

4. Biochemical Engineering Journal

5. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly

6. The Chemical Engineering Journal and the Biochemical Engineering Journal

7. Process Biochemistry

8. Applied Biochemistry and Microbiology

9. Applied Microbiology and Biotechnology

10. Journal of Applied Microbiology

11. Letters in Applied Microbiology

12. American Journal of Biochemistry and Biotechnology

13. Biotechnology Advances

14. Critical Reviews in Biotechnology

15. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology

EVALUACIÓN DEL CURSO

Cuatro (4) pruebas escritas del 20% c/u: 80%

Trabajo final (documento y exposición): 20%

Temas Trabajo Final

• Fermentación Láctica• Fermentación Cítrica• Fermentación Alcohólica• Fermentación en Estado Sólido• Cultivo de Células Vegetales en Suspensión• Biopolímeros• Biohidrógeno

BREVE RESEÑA HISTÓRICA DE LA MICROBIOLOGÍA

1665 Hook describe la estructura celular del corcho.

1675 Leeuwenhoek mejora los lentes del microscopio y descubre formas de vida unicelular.

1750 Spallanzani aporta evidencias de que los m.o. no surgen espontánea-mente.

1828 Wohler sintetiza la urea, desmintiendo que los compuestos orgánicos sólo pueden ser sintetizados por organismos vivos.

1837 Cagniar, Schwann y Kutzing proponen, independientemente, que las levaduras son plantas y causan la fermentación.

1862 Pasteur postula que todos los procesos fermentativos resultan de activi-dad microbiana y descubre los m.o. anaerobios.

1876 Tyndall desarrolla el método de esterilización discontinua por calenta-miento.

1883 Koch introduce las técnicas del cultivo puro, incluyendo la caja de petri, inventadas por Ricardo Petri.

BREVE CRONOLOGÍA DE LA BIOTECNOLOGÍA

– 1865 Era pre-Pasteur: Bebidas alcohólicas (cerveza, vino); productos lácteos . (quesos, yogurt); otros alimentos fermentados.

1865 – 1940 Era Pasteur: Solventes orgánicos (etanol, butanol, acetona, glicerol); . ác. orgánicos (cítrico, acético, láctico); tratamiento aerobio de aguas

. residuales.

1940 – 1960 Era de los antibióticos: Penicilinas (tecnología de fermentación sumergi-. da); gran variedad de antibióticos; vacunas contra virus, transformaciones

. microbiológicas de esteroides; tecnología de la estructura de la célula ani- . mal.

1960 – 1975 Era post antibióticos: Aminoácidos; proteína unicelular (SCP); enzimas . (detergentes); tecnología de células y enzimas inmovilizadas; tratamiento . anaerobio de aguas residuales (biogás); polisacáridos bacterianos (goma . xantana); gasohol.

1975 – Era de la nueva biotecnología: Tecnología de los hibridomas; anticuerpos . monoclonales; tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética); . insulina humana.

AREAS DE INVESTIGACIÓN EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

• Optimización de procesos existentes.

• Desarrollo de nuevos procesos con base en células microbianas modificadas . genéticamente, células vegetales y células animales.

• Procesos con células y enzimas inmovilizadas.

• Nuevos diseños de biorreactores.

• Desarrollo de biosensores y sensores virtuales.

• Monitoreo y control asistido por computador de bioprocesos.

Generalidades de los procesos biológicos

La Ingeniería Bioquímica estudia el conjunto de operaciones que hacen uso de células (microbianas, vegetales o animales), o de componentes de dichas células (enzimas), para la obtención de bienes (productos útiles) o servicios (tratamiento de desechos contaminantes o aguas residuales) en condiciones económicas.

Este conjunto de operaciones constituyen los llamados Bioprocesos, Procesos Bioquímicos, Procesos Biotecno-lógicos o Procesos Biológicos.

Bioprocesos

• Procesos Enzimáticos: Utilizan enzimas o complejos enzimáticos aislados de las células, libres en suspensión en un medio líquido o inmovilizadas en soportes físicos. Son procesos catalíticos.

• Procesos Fermentativos: Utilizan células libres en suspensión o inmovilizadas en soportes físicos, tejidos celulares u órganos, como agentes de la biotransforma-ción. Son procesos autocatalíticos.

Biocatalizador: Células, enzimas o complejos enzimáti- cos.

Proceso Enzimático:

S + E P + E (Proceso Catalítico)

(Sustrato) (Enzima) (Producto) (Enzima)

S E P (Sustrato) (Enzima) (Producto)

Proceso Fermentativo:

S + Xo X + P (Proceso Auto-

(Sustratos o (Biomasa o (Biomasa) (Productos o catalítico)

Nutrientes) Inóculo) Metabolitos)

Inóculo: volumen, Vi, de suspensión de células viables, de concen-

tración adecuada capaz de garantizar, en condiciones económicas, la fermentación de un volumen, V, dado de medio.

Comúnmente: Vi = 0.05-0.1 V

Medio de cultivo: solución, normalmente acuosa, que contiene los nutrientes necesarios para las células.

• Medios sintéticos o definidos: composición exactamente definida; normalmente son medios selectivos (medios de laboratorio).

• Medios complejos: composición no conocida con exactitud (medios industriales). Ej.: melazas, suero de leche, licor de cocción de maíz.

Nutrientes:

• Fuente de carbono y energía: carbohidratos (glucosa, sacarosa, lac-tosa, celulosa, almidón, etc.), hidrocarburos, etc.

• Fuente de nitrógeno: nitrógeno elemental (N2), amoniaco, sales de amonio, úrea, caldo peptonado (hidrolizado de proteínas), extracto de levadura, harinas de soya o pescado, etc.

• Micronutrientes: sulfatos (S) y fosfatos (P) de Na, K u otros metales; precursores, vitaminas, hormonas, etc.

• Oxígeno (procesos aerobios): aire, aire enriquecido con O2, oxíge-no puro.

Sustrato limitante: nutriente presente en menor proporción estequio-métrica. Normalmente es la fuente de C y energía, aunque en algu-nos casos puede ser la fuente de N o el O2.

Diseño de Medios de Cultivo

a. Requerimientos Nutricionales y Ambientales Necesidades elementales Necesidades de nutrientes específicos Requerimientos energéticos Necesidades ambientales del cultivo

b. Objetivos del proceso Obtención de productos Producción de biomasa (proteína unicelular, SCP) Mantenimiento celular

c. Restricciones técnico-económicas Disponibilidad y costos de las materias primas Facilidad de recuperación de productos Control de contaminación

Preparación de medios

• Tipo y cantidad de nutrientes a emplear (formulación)• Esterilización• Ajuste de condiciones ambientales (T, pH, fuerza iónica,

homogenización, etc.)

Control del proceso: T, pH, agitación, nivel de espuma, concentraciones de O2 y CO2.

Fermentación: conversión de los componentes del me-dio en biomasa y productos o metabolitos, por la acción del biocatalizador (células o biomasa).

Optimización del proceso

• Tipo de fermentador• Modo de operación• Tipo de células• Medio de cultivo• Condiciones de operación más adecuadas (T, pH, agitación, etc.)• Control de variables más importantes

Separación y purificación del producto (Down stream processing)

Conjunto de operaciones de separación y purificación de la biomasa o de los metabolitos de interés (centrifugación, filtración, disrupción celular, intercambio iónico, cromatografías, separación con mem-branas, destilación, cristalización, precipitación, extracción, adsor-ción, secado, etc.).

Aspectos a estudiar en un bioproceso

• Estequiometría

• Cinética

• Termodinámica

• Fenómenos de Transporte

• Dinámica y Control

• Economía

ESTEQUIOMETRÍA DE PROCESOS FERMENTATIVOS

Objetivo

Establecimiento de relaciones cuantitativas entre los distintos componentes del proceso, a saber:

• Sustratos o nutrientes (S)• Biocatalizador, células o biomasa (X)• Productos o metabolitos (P)

Aplicaciones

• Formulación de medios de cultivo• Requerimientos de enfriamiento de biorreactores• Control por computador de biorreactores

Enfoques:

Molecular o microscópico: supone el conocimiento del conjunto de reacciones químicas que constituyen el metabolismo celular (mode-los de caja blanca) → Ingeniería Metabólica.

Enfoque Macroscópico

No considera los procesos que a nivel molecular ocurren en las células (modelos de caja negra). Se basa en balances elementales de materia, relaciones estequiométricas empíricas y en el conocimiento de la compo-sición elemental de la biomasa.

Características del enfoque macroscópico

• Se deben cumplir los balances de masa y energía.• No se tienen en cuenta los mecanismos o rutas de reacciones que el

sistema emplea.• Es aplicable para propósitos ingenieriles como formulación de medios y

control de biorreactores.• Se requiere conocer el contenido celular de todos los elementos para los

cuales se deban hacer los cálculos (composición elemental de la biomasa).• El número de nutrientes en el medio usualmente es muy grande y no todos

pueden ser incluidos en los cálculos.• Algunos nutrientes pueden ser limitantes o algunos productos pueden ser

inhibitorios.

Ecuación genérica del proceso:

• Fuente C + Fuente N + O2 → Células + Productos + CO2 + H2O

• CaHbOc + NlOmHn + O2 → CαHβOδNγ + CjHvOz+ CO2 + H2O

Donde:

CaHbOc: fórmula genérica para carbohidratos o hidrocarburos.

CαHβOδNγ: “fórmula empírica” de la biomasa.

NlOmHn: fórmula genérica para la fuente de nitrógeno.

CjHvOz: fórmula genérica para el producto extracelular.

Conocida la composición elemental de la biomasa, es posible asociarle una “fórmula empírica”.

Composición elemental de microorganismos

• Sólo 22 elementos químicos, son componentes esenciales de los organismos vivos.

• Elementos de la materia orgánica: C, O, H, N, P

• Iones monoatómicos: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-

• Elementos traza: Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, V, Mo, I, Si X: Elementos presentes sólo en algunas especies.

• La composición elemental de las células varía con la especie, el sustrato limitante, la rata de crecimiento celular, factores ambien-tales, etc.

Ejemplo: Composición elemental de la bacteria Escherichia coli.

Ejemplo: Determine la “fórmula empírica” de un microorganismo que tiene la siguiente composición porcentual en peso seco:

*10-3

Fórmula empírica: CH1.936O0.295N0.251

Ejemplo: Considere la siguiente ecuación química genérica, correspon-diente al crecimiento celular sin formación de productos extracelulares (metabolitos externos):

a CHxOy + b O2 + c HlOmNn → CHαOβNδ + d H2O + e CO2

x: Coeficientes estequiométricos (5 incógnitas)

Establezca las ecuaciones de balance elemental del proceso.

Solución:

• Balance de C: a = 1 + e (Ec. 1)• Balance de H: ax + cl = α + 2d (Ec. 2)• Balance de O: ay + 2b + cm = β + d + 2e (Ec. 3) • Balance de N: cn = δ (Ec. 4)

Conocidas las fórmulas empíricas de las fuentes de carbono y nitrógeno y de la biomasa, el sistema tendría 4 ecuaciones y 5 incógnitas (los 5 coe-ficientes estequiométricos), requiriendo otra ecuación para su solución.

La otra ecuación generalmente es una relación em-píricamente obtenida entre algún par de coeficientes es-tequiométricos. Estas relaciones se conocen genérica-mente como Factores de Rendimiento.

• Ejercicio: Determine los coeficientes estequiométricos del proceso anterior, si la fuente de carbono es el hexadecano, la fuente de nitrógeno es amoniaco y la biomasa tiene la fórmula empírica CH1.66O0.27N0.20. Se sabe además, por determinación experimental, que el factor de rendimiento Moles CO2 formadas/Moles O2

consumidas, también conocido como Cociente Respiratorio (RQ), es 0.43 moles CO2/mol O2.

Otros factores de rendimiento ampliamente usados

• Yx/s: Rendimiento de biomasa a partir del sustrato. (moles biomasa/mol sustrato, g biomasa/g sustrato).

• Yp/s: Rendimiento del producto a partir del sustrato. (moles producto/mol sustrato, g producto/g sustrato).

• Yp/x: Rendimiento de producto con respecto a la biomasa. (moles producto/mol biomasa, g producto/g biomasa).

• Yx/o: Rendimiento de biomasa con respecto al oxígeno. (moles biomasa/mol oxígeno, g biomasa/g oxígeno).

• Yc/o : Rendimiento de CO2 con respecto al oxígeno (RQ). (moles CO2/mol O2, g CO2/g O2).

Rendimiento Global y Rendimiento Instantáneo

YF/G = ∆F/∆G (Rendimiento Global)

∆F, ∆G: Variaciones en las cantidades de F y G en un intervalo finito de tiempo.

Para un reactor discontinuo (batch), de volumen constante, en el cual la reacción química entre F y G es la única fuente de variación de sus can-tidades, podemos definir:

Lim (∆F/∆G) = dF/dG = (dF/dt)/(dG/dt) = rF/rG = YF/G (Rendimiento ∆G→0 Instantáneo)

rF, rG: Ratas volumétricas de reacción de F y G.

Notas Por definición, los factores de rendimiento son siempre positivos. YF/G ≡ YFG

Rendimiento Teórico y Rendimiento Observado

• Rendimiento Teórico: Dado por la relación estequiométrica existente entre las sustancias relacionadas en el factor de rendimiento. Representa el máximo rendimiento posible.

• Rendimiento Observado: Dado por la relación ∆F/∆G, donde los ∆’s son los cambios medidos u observados en las cantidades de F y G en un intervalo dado de tiempo.

Ejemplo: Considere el proceso fermentativo de producción de biomasa dado por la ecuación:

S → X

∆X: Variación medida u observada en la cantidad de biomasa. ∆ST: Variación total medida u observada en la cantidad de sustrato.

Y’XS = ∆X/-∆ST (Rendimiento observado de biomasa con respecto al . sustrato).

En realidad: ∆ST = ∆SC + ∆SM

∆SC : Sustrato realmente utilizado para crecimiento celular. ∆SM: Sustrato utilizado para mantenimiento celular (movimiento, transporte .

activo de sustancias a través de membranas, recambio de componentes . celulares, etc.).

Por tanto:

YXS = ∆X/-∆SC (Rendimiento Verdadero o Teórico de biomasa con respecto al . sustrato).

Como ∆SC < ∆ST , entonces, YXS > Y’XS

Cuando, además de la biomasa, hay formación de productos extracelulares: ∆ST = ∆SC + ∆SM + ∆SP

Donde:

∆SP: Sustrato consumido para la formación de productos extracelulares.

Estequiometría del crecimiento celular con formación de productos extracelulares

Casos

• El producto principal aparece como resultado del metabolismo ener-gético primario. Ej.: Producción de etanol por S. cerevisiae.

• El producto es un metabolito secundario. Ej.: Producción de antibió-ticos por mohos.

• El producto surge del metabolismo energético. Ej.: Producción de á-cido cítrico por A. niger.

Sólo para procesos de la primera clase se puede expresar la este-quiometría del proceso por una única ecuación química que relacio-na la biomasa acumulada con el sustrato consumido y el producto formado.

Ecuación genérica:

aCwHxOy + bO2 + cNlOmHn → CHαOβNδ + dH2O + eCO2 + fCHvOz

• Conocidas las fórmulas empíricas de las fuentes de car-bono y nitrógeno, de la biomasa y el producto, se tendrí-an 6 incógnitas (los 6 coeficientes estequiométricos).

• Los balances elementales de C, O, H y N suministrarían 4 ecuaciones, faltando dos ecuaciones para poder resol-ver el sistema.

• Las dos ecuaciones faltantes se pueden obtener a partir de factores de rendimiento, experimentalmente hallados, o a partir de un balance de electrones.

Otra ecuación entre los coeficientes estequiométricos puede obtenerse de un balance de electrones.

Electrones Disponibles: número de electrones disponibles en un com-

puesto para transferir al oxígeno en la oxidación del compuesto hasta CO2, H2O y compuestos que contienen N. Se calcula a partir de la valencia de los distintos elementos que constituyen el compuesto.

C: 4; H: 1; O: -2; S: 6; P: 5; N: -3 (NH3), 0 (N2), 5 (NO-3).

Grado de Reducción (γ): número equivalentes de electrones disponibles en aquella cantidad del material que contiene 1 at-gr de C.

Ejemplo: Considere el sustrato CwHxOyNz. Calcule el número de electrones disponibles y el grado de reducción.

Solución

• No. de electrones disponibles: 4w + x - 2y – 3z• Grado de reducción (γs): (4w + x - 2y – 3z)/w

Balance de electrones

Los electrones disponibles para transferir al oxígeno son conservados du-rante el metabolismo. Así, para la reacción química genérica de producción de biomasa con formación de producto extracelular:

aCwHxOy + bO2 + cNlOmHn → CHαOβNδ + dH2O + eCO2 + fCjHvOz

el balance de electrones disponibles, con NH3 como fuente de nitrógeno, es:

aw γS – 4b = γX + fjγP

Donde:

γS : Grado de reducción del sustrato. γX : Grado de reducción de la biomasa. γP : Grado de reducción del producto.

La ecuación de balance de electrones anterior, provee otra ecuación que

relaciona los coeficientes estequiométricos (incógnitas) la cual, sumada a las ecuaciones de balance elemental y a los factores de rendimiento cono-cidos, permitirá determinar los coeficientes estequiométricos.

Demanda teórica de oxígeno

El requerimiento de oxígeno de un proceso fermentativo, está directamente relacionado con los electrones disponibles en el sustrato para transferir al oxígeno, pudiendo estimarse su demanda teórica a partir de un balance de electrones.

Así, para la fermentación representada por la ecuación genérica:

CwHxOy + aO2 + bNlOmHn → cCHαOβNδ + dH2O + eCO2 + fCjHvOz

Balance de electrones: w γS – 4a = c γX + f j γP

La demanda teórica de oxígeno (dada por el coeficiente estequiométrico a) será:

a = (w γS – c γX – f j γP)/4

De la ecuación: a = (w γS – c γX – f j γP)/4

obtenemos: 1 = ( 4a/w γS) + (c γx /w γS) + (f j γP/w γS)

Donde:

4a/w γS: Fracción de los electrones disponibles del sustrato que salen con el . oxígeno.

cγx /w γS: Fracción de los electrones disponibles del sustrato que salen con la . biomasa.

fjγP/w γS: Fracción de los electrones disponibles del sustrato que salen con el . metabolito extracelular.

En un proceso anaerobio en ausencia de formación de producto:

c γx /w γS = 1

Por tanto:

c = cmax = w γS / γx

Donde:

cmax : Máximo rendimiento teórico o termodinámico posible de biomasa.

Además:

YXS = cMX/MS

Donde:

YXS: Rendimiento de biomasa a partir del sustrato.

MX, MS: Masas moleculares de la biomasa y del sustrato respectivamente.

Por tanto: Yxs, max = w γS MX/ γx MS

Admitiendo como fórmula genérica para la biomasa la fórmula empírica:

CH1.8O0.5N0.2, el grado de reducción de la biomasa (γx) sería:

γx = 4 + 1.8 + 0.5 (-2) + 0.2 (-3) = 4.2

Análogamente: fmax = w γS/ j γP

fmax: Límite superior teórico de rendimiento del producto.

CINÉTICA DE PROCESOS FERMENTATIVOS

Cinética del Crecimiento Celular

Para que haya crecimiento de la biomasa en un cultivo, se requiere: Un inóculo viable Una fuente de energía Nutrientes esenciales fuentes de C, N, O, H, P, etc. Ausencia de inhibidores de crecimiento Condiciones físico-químicas adecuadas

Parámetros del crecimiento

Rata específica de crecimiento (μ) Tiempo de duplicación (td)

Rata específica de crecimiento (μ)

Dadas las condiciones adecuadas para el crecimiento en un cultivo batch homogéneo, se cumple:

dx α xdtdx = μ xdtdx/dt = μ x

μ = (1/x) dx/dtDonde:

x : concentración de la biomasa en el instante t (g l-1)dx/dt: rata volumétrica de crecimiento de la biomasa (g l-1 h-1)μ : rata específica de crecimiento (h-1). Es la rata de crecimiento por unidad de . biomasa presente.

Si μ es constante (crecimiento exponencial):

tX

Xo

dtxdx0

/

Por tanto: ln (x/xo) = µt

De donde: x/xo = eµt → x = xoeµt

Tiempo de Duplicación (td)

Es el tiempo necesario para que x = 2xo.

Si µ es constante (crecimiento exponencial):

ln 2xo/xo = µtd

De donde: td = ln 2/µ = 0.693/µ

Ejercicio: Si hacemos n = t/ td , donde n se denomina número de generaciones . demostrar que:

2n = x/ xo Ejercicio: En procesos fermentativos es común utilizar un inóculo cuyo tamaño

. es el 10% de la biomasa final. Hallar el número de generaciones, n.

Curva de Crecimiento Microbiano en Cultivo Batch

Fases lag

Adaptación de las células a un nuevo ambiente. Muy poco o ningún crecimiento celular. µ ≈ 0

Fase de aceleración

Se inicia el crecimiento celular. µ > 0 y variable. µ < µmax

Fase de crecimiento exponencial.

El crecimiento celular alcanza su máxima rata o velocidad. µ = µmax y constante. x = xo eµt

Fase de declinio

El crecimiento celular se hace más lento debido al agotamiento de uno o varios nutrientes o a la acumulación de productos inhibi-torios.

µ < µmax y variable.

Fase estacionaria

El crecimiento neto se hace cero (equilibrio entre crecimiento y muerte celular).

µ = 0

Fase de muerte celular

Lisis o pérdida de la viabilidad celular. µ < 0

Metabolismo endógeno (respiración endógena)

Cuando la energía de mantenimiento celular es provista por la oxidación o de-gradación de una parte de la propia biomasa, se dice que está ocurriendo el metabolismo endógeno.

dx/dt = -kexDonde:x: concentración celular (mol/l, g/l).dx/dt: rata de respiración endógena (mol cél./l-h). ke: constante específica de rata. Representa las moles de biomasa degrada- . das por mol de biomasa presente y por unidad de tiempo (h-1).

Crecimiento balanceado

Cuando las condiciones ambientales son favorables para las células, la com-posición de la biomasa permanece constante y las ratas específicas de forma-ción de cada componente celular son iguales entre sí e iguales a la rata espe-cífica de crecimiento, µ.

Este tipo de crecimiento se denomina crecimiento balanceado. El crecimiento celular durante la fase de crecimiento exponencial se aproxima al crecimiento balanceado.

Crecimiento Diáuxico

Cuando un medio contiene varias fuentes de carbono, pueden observarse múl-tiples fases lag, debido a que sólo cuando la fuente de carbono más fácilmente asimilable se agota, las células comienzan a usar las otras fuentes de carbono.

Gráficamente

Efecto de la concentración del sustrato limitante sobre el crecimiento celular en cultivo batch – Ecuación de Monod

Comúnmente existe un compuesto, normalmente el sustrato fuente de carbono y ener-gía, que es mayormente demandado siendo el que primero se agota.

Este componente se denomina sustrato limitante del crecimiento.

En procesos aerobios, el oxígeno puede llegar a ser el sustrato limitante del crecimiento celular. En otros casos, la fuente de N puede ser el sustrato limitante.

A menos que se diga lo contrario, asumimos que el sustrato limitante es la fuente de car-bono y energía.

En muchos procesos fermentativos, la rata específica de crecimiento, µ, depende de la concentración del sustrato limitante del crecimiento de acuerdo con la Ecuación de Monod:

Donde:S: concentración del sustrato limitante (g l-1).Ks: constante de saturación (g l-1).

SKs

S

max

El valor de Ks está relacionado con la afinidad de las células por el sustrato. Así, a ma-yor valor de Ks, menor afinidad de las células por el sustrato y viceversa.

Normalmente, los valores de Ks para carbohidratos son del orden de mg/l y para amino-ácidos, del orden de µg/l.

Ks es numéricamente igual a la concentración del sustrato cuando la velocidad especí-fica de crecimiento, µ, es la mitad de la velocidad máxima, µmax. Es decir:

Si µ = 0.5 µmax → Ks = S (numéricamente)

De la ecuación de Monod se deduce que :

Si S >> Ks → µ ≈ µmax (cinética de crecimiento de orden cero) Si S << Ks → (cinética de crecimiento de orden 1)

Notas

La ecuación de Monod no considera los mecanismos internos del crecimiento celular (metabolismo celular), por lo cual se dice que es un modelo no estructurado del crecimiento celular.

Cuando el crecimiento celular es inhibido por altas concentraciones del sustrato o de productos, deben ser incluidos términos adicionales a la ecuación de Monod, que tengan en cuenta estos efectos.

Existen otras ecuaciones o modelos (estructurados y no estructurados) para describir el crecimiento celular, cuando la ecuación de Monod no es aplicable.

La ecuación de Monod del crecimiento celular es un modelo matemático de dos parámetros (µmax y Ks), los cuales deben determinarse experimentalmente.

Ejercicio: Buscar en la literatura otras ecuaciones o modelos matemáticos para describir el crecimiento celular.

Determinación de los parámetros de la ecuación de Monod, µmax y Ks

La determinación de los parámetros de la ecuación de Monod puede hacerse más fácilmente si se utilizan formas linealizadas de dicha ecuación.

Formas linealizadas de la ecuación de Monod

Ecuación de Lineweaver-Burk:

Ecuación de Langmuir:

Ecuación de Eadie-Hofstee:

S

Ks 111

maxmax

S

KsS 11

maxmax

SKs

max

Gráficamente

Efecto de la temperatura sobre la rata de crecimiento

Las células poseen un valor de temperatura en el cual crecen más acti-vamente (temperatura óptima de crecimiento).

De acuerdo con el valor de la temperatura óptima de crecimiento, las células se clasifican en:

Sicrófilas T óptima < 20 oC Mesófilas T óptima 20-45 oC Termófilas T óptima > 45 oC

Efecto del pH sobre la rata de crecimiento

Análogo a lo que ocurre con la temperatura, existe un estrecho rango de pH (1-2 unidades de pH) en el cual cada tipo de células presenta la mayor rata de crecimiento.

Cinética de Formación de Productos Extracelulares

De acuerdo con la relación entre su síntesis y la generación de energía química celular (ATP), los productos de la fermentación se clasifican en:

Productos directamente asociados con la generación de energía en la célula. Ej.: Pro- . ducción anaerobia de metabolitos (etanol, butanol, acetona, ácido acético, ácido lácti- . co, etc.).

Productos indirectamente asociados con la generación de energía celular. Ej.: Ácido . cítrico, aminoácidos, nucleótidos, etc.

Productos no asociados a la generación de energía. Ej.: Antibióticos, vitaminas, etc.

Clasificación de las fermentaciones según Gaden

Tipo I

El producto principal aparece como resultado del metabolismo energético primario.

El producto resulta de la oxidación directa del sustrato fuente de energía. Ej.: fermen- . tación de glucosa a etanol.

La formación del producto está asociada al crecimiento.

Normalmente existe una relación estequiométrica fija entre el consumo de sustrato . (S), el crecimiento celular o producción de biomasa (X) y la formación del producto . (P).

Las velocidades o ratas volumétricas de consumo de sustrato (rs = -ds/dt), producción de biomasa (rx = dx/dt) y formación del producto (rp = dp/dt), son proporcionales entre sí. Es decir:

-k1 ds/dt = k2 dx/dt = k3 dp/dt

Donde:

s, x, p: concentraciones de sustrato, biomasa y producto, respectivamente . (mol/l, g/l).

rs, rx, rp: ratas volumétricas de reacción (mol/l-h, g/l-h).

k1, k2, k3: números positivos cercanos a 1.

Tipo II

El producto surge indirectamente del metabolismo energético. Ej.: Produc- . ción de ácido cítrico. Las ratas de reacción son de naturaleza compleja. Al igual que en el Tipo I, el cambio global de energía libre es negativo. Son observados varios máximos tanto en la rata de crecimiento como de . consumo del sustrato.

Existe una relación parcial entre la rata de formación del producto y la rata de cre- . cimiento. Es decir:

dp/dt = k1dx/dt + k2x (ecuación de Luedeking-Piret)

Si k1 >> k2 → Fermentación Tipo I.

Tipo III

Corresponden a la biosíntesis de moléculas complejas que no resultan del . metabolismo energético primario.

Ej.: Producción de metabolitos secundarios por células vegetales o de anti- . bióticos por hongos.

El metabolismo oxidativo, típico del crecimiento, es bajo en el momento en . que la formación del producto es máxima.

Las actividades metabólicas y el crecimiento alcanzan un máximo primero y . más tarde lo hace el producto, no estando su síntesis asociada al crecimien- . to.

La rata de formación del producto es proporcional a la concentración de la . biomasa. Es decir:

dp/dt = kx lo que corresponde a la ecuación de Luedeking-Piret cuando k2 >> k1

Independientemente del tipo de fermentación, se cumple que:

rp = dp/dt = qpx Donde:

rp : rata volumétrica de formación del producto (g l-1 s-1).

x : concentración de la biomasa (g l-1).

qp : rata específica de formación del producto o rata de formación del . producto por unidad de biomasa presente (s-1).

Es decir:

qp = (1/x) rp = (1/x) dp/dt

Generalmente qp es variable durante una fermentación discontinua.

Determinación de qp para la formación de productos directamente acoplados al metabolismo energético

El crecimiento y el mantenimiento son las principales funciones celulares que requieren energía. Por tanto:

Rata de generación de ATP = f (crecimiento, mantenimiento)

Si la rata de formación del producto está directamente asociada a la rata de generación de energía, entonces:

rp = YPX rx + mpxDonde:YPX: rendimiento teórico del producto con respecto a la biomasa. (g producto/g células)mp: rata específica de formación del producto debido al mantenimiento celular. . (tiempo-1)

Recordando que: rx = dx/dt = µx

Obtenemos: rp = (YPXµ + mp)x

Por tanto: qp = (1/x) rp = YPX + mp

Cinética de Utilización del Sustrato

En general:rs = -ds/dt = qsx (Ec. 1)

Donde:rs: rata volumétrica de consumo de sustrato (mol l-1 s-1).qs: rata específica de consumo de sustrato, g sustrato/g cél. x tiempo. (tiempo -1).

Nota

Rata específica de crecimiento (µ) [=]µ: masa cél/masa cél. x tiempo → tiempo-1

Rata específica de consumo de sustrato (qs) [=]qs: masa cél/masa sustrato x tiempo → tiempo-1

Rata específica de formación de producto (qp) [=]qp: masa cél/masa producto x tiempo → tiempo-1

Determinación de qs

1.Para consumo de sustrato sin formación de producto extracelular

El sustrato es usado para crecimiento y mantenimiento celular. Por tanto: (Ec. 2)

Donde:

ms: coeficiente de mantenimiento (g sust. consumido/g cél. x tiempo) (tiempo-1).

Como: (Ec. 3)

Entonces: (Ec. 4)

xmY

rr s

XS

xs

xdt

dxrx

xmY

rXS

s

Igualando la (Ec.1) con la (Ec. 4) obtenemos:

(Ec. 5)

En el caso de que la cinética de crecimiento celular se ajuste al modelo de Monod: (Ec. 6) Por tanto: (Ec. 7)

(Ec. 8)

Nota Para S = 0 → rs = 0 y la energía de mantenimiento es obtenida por… . metabolismo endógeno.

sXS

s mY

q

SKs

S

max

xmSKY

S

dt

dSr s

SXSs

max

sSXS

s mSKY

Sq

max

2. Para consumo de sustrato con formación de producto extracelular (Ec. 9)

Recordando que: y que:

obtenemos:

(Ec. 10)

De (1) y (10): (Ec. 11)

xmY

r

Y

rr s

PS

p

XS

xs

xrx

xqr pp

xmY

q

Yr s

XS

p

XSs

sPS

p

XSs m

Y

q

Yq

Efecto del mantenimiento sobre los rendimientos

Rendimientos observados

Donde:

rx, rs, rp: ratas volumétricas obtenidas experimentales de gráficos de

x, s y p vs. t

ds

dx

r

rY

s

xXS

'

dx

dp

r

rY

x

pPX '

ds

dp

r

rY

s

pPS

'

Relación entre rendimientos observados (Y’FG) y rendimientos verdaderos (YFG)

Sabemos que:

Invirtiendo la ecuación anterior obtenemos:

Si Yxs y ms son aproximadamente constantes, un gráfico de vs.

dará una línea recta de pendiente e intercepto

Análogamente:

sXS

XS

mY

Y

'

s

XSXS

m

YY

11'

'

1

XSY 1

smXSY

1

p

PXPX

mYY '

sXS

pPXPS

mY

mYY

TÉCNICAS DEL CULTIVO CELULAR

De acuerdo con la forma de conducirlos, los procesos biológicos pueden ser:

• Procesos por lotes, discontinuos o batch

• Procesos continuos

• Procesos semicontinuos

Procesos Discontinuos (Batch)

Forma más ampliamente utilizada a escala industrial para llevar a cabo los . bioprocesos. Tanto el medio de fermentación como el inóculo se introducen en el sistema . al comienzo de la operación. Bioprocesos con entrada y/o salida de corrientes gaseosas, pero no de co- . rrientes líquidas, se consideran como discontinuos. Facilidad de alcanzar y mantener condiciones asépticas durante la opera- . ción en periodos cortos. Reducción de la productividad global del proceso por los tiempos de limpie- . za, carga y descarga del biorreactor antes y después de cada corrida. Equipos de mayor volumen y mayor intensidad en el uso de mano de obra. Falta de homogeneidad del producto entre corridas. Concentración inicial alta de sustrato, pero baja concentración inicial de bio- . masa. Máxima concentración de sustrato inicial limitada por problemas de inhibi- . ción por el sustrato. Al final se tienen altas concentraciones de biomasa y producto, pero mínima . concentración de sustrato. Medio uniforme espacialmente (sistema homogéneo), pero de composición . variable en el tiempo (estado no estacionario).

CULTIVO CONTINUO vs. CULTIVO DISCONTINUO

Ventajas

• La velocidad de crecimiento se puede controlar y mantener indefinidamente fijando la tas de dilución.

• Se puede examinar el efecto de cambios en parámetros físicos y químicos sobre el crecimiento y la formación del producto a una velocidad de crecimiento dada.

• Se puede mantener constante la concentración de la biomasa manipulando la tasa de dilución.

• Se puede mantener el crecimiento limitado por un sustrato y estudiar los cambios en la composi-ción y actividad metabólica celular modificando el sustrato limitante del crecimiento.

• Permite determinar constantes cinéticas, energías de mantenimiento y rendimientos de creci-miento reales.

• Los resultados obtenidos en el cultivo continuo con frecuencia son más confiables y reproducibles

• Mayores productividades y menor pérdida de tiempo improductivo debido a descarga, limpieza y carga del fermentador.

• Requiere menos mano de obra y menor capital inicial (equipos más pequeños).

Desventajas

• El crecimiento por períodos largos puede ocasionar problemas de contami-nación.

• Para largos períodos de operación, los equipos deben ser confiables y la mejor calidad para evitar interrupciones mecánicas, etc.

• El crecimiento por largos períodos puede producir mutación de la cepa ori-ginal.

• No siempre se puede lograr la producción de algunos productos no asocia-dos al crecimiento, los cuales pueden requerir técnicas de cultivo especia-les (lotes alimentados u otros).

• El crecimiento en estado estacionario de m.o. filamentoso puede ser difícil debido a la viscosidad y naturaleza filamentosa de los mismos.

• Se requieren técnicas avanzadas de monitoreo y control del proceso asisti-das por computador.

PROCESO POR LOTES ALIMENTADOS (FED-BATCH)

Es un tipo de proceso semicontinuo, donde se adicionan uno o varios nutrientes mientras los pro-ductos permanecen en el fermentador hasta el final de la fermentación.

La etapa de llenado de una fermentación discontinua corresponde a un proceso discontinuo por lotes alimentados.

Ventajas

• Permite controlar la concentración de uno o varios nutrientes a través de su rata de alimentación.

• Es una poderosa herramienta para determinación de parámetros cinéticos y energéticos, así co-mo de tasas específicas de crecimiento celular.

• Es altamente ventajoso cuando existe inhibición por sustrato (metanol, etanol, ácido acético, etc.).

• Permite reducir el efecto de la represión por catabolito.

• Permite reducir la viscosidad del caldo o medio de cultivo durante la producción de biopolímeros (goma xantana, gelana, dextrana, pululana, etc.).

• Permite reducir el consumo de potencia de agitación y mejorar los procesos de transferencia de masa en procesos de producción de biopolímeros.

• Permite reponer la pérdida de agua por evaporación en procesos prolongados (producción de antibióticos).

TÉCNICAS DEL CULTIVO CELULAR

De acuerdo con la forma de conducirlos, los procesos biológicos pue-den ser:

• Procesos por lotes, discontinuos o batch• Procesos semicontinuos • Procesos continuos

Biorreactor de Tanque Agitado

Equipo más ampliamente utilizado para llevar a cabo los bioproce- . sos a escala industrial.

Por simplicidad, en su análisis inicial se acepta mezcla perfecta del . medio (reactor idealmente agitado), lo que implica sistema homogé- . neo (la misma composición y propiedades en cualquier punto del re- . actor).

Típicamente es un tanque cilíndrico, de acero inoxidable, agitado me-cánicamente.

Comúnmente: Di = 1/3 Dt; Ht ≥ 2Dt; Hi = Di; Db = 0.1Dt; L = Dt (fermenta-dor estándar).

Puede ser operado en forma discontinua, semi-continua o continua.