Facultad de Ciencias QumicasCurso de microbiologa DiagnsticaEnero 2010

CoprocultivoDiagnstico de laboratorio de Infecciones bacterianas gastrointestinales

M.A. MA OLGA GONZALEZ RANGELChihuahua, Chih., enero 2010

Coprocultivo

CoprocultivoEl diagnstico de las diarreas agudas bacterianas se realiza mediante la prescripcin de coprocultivos tpicos u orientados, realizados despus del interrogatorio

CoprocultivoDiagnstico de orientacin:Examen macroscpico y microscpico de las heces.Patgenos:Salmonella, Shigella, Campylobacter y YersiniaE coli y Virus.Diagnsticos epidemiolgicos clnicosPara Vibrio cholerae, Clostridium difficile o E coli enterohemorrgica

CoprocultivoDiarrea aguda segn la OMS:Emisin de al menos tres heces lquidas o blandas al da con menos de 14 das de antelacin.

CoprocultivoDe importancia para el microbilogo:Informacin de los signos clnicos como:Dolores abdominales, fiebre, aspecto de las heces, entre otros.

CoprocultivoObtencin de la muestra: Las heces recientemente recogidas se llevarn lo ms rpidamente posible al laboratorio. Si el anlisis es diferido, la muestra se puede conservar durante 12 a 24 horas a 4 C para evitar proliferacin bacteriana.

CoprocultivoObtencin y transporte de muestras fecales para el diagnstico de laboratorioCundo se toma la muestra Cuando el paciente tiene diarrea, lo antes posible luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros das) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos.Cunto se debe obtener Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un medio de transporte.Medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO debe usarse glicerol salino de tampn para el transporte de muestras de V. cholerae).Almacenamiento despus de la coleccin Refrigerar a 4C si los especmenes se recibirn en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a -70C. Las muestras fecales de pacientes con sospecha de tener clera pueden ser transportadas a temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es necesario; sin embargo, se prefiere la refrigeracin.Transporte Tubos sellados o recipientes a prueba de prdidas; colocar en un recipiente hermtico para proteger del hielo o hielo seco. Remitir en una caja aislada con paquetes de congelacin, hielo o hielo seco, para entrega al da siguiente.

CoprocultivoExamen macroscpico:Aspecto de las heces: lquidas, acuosas, mucosas, mucoso sangrientas, hemorrgicas, blandas. Orientan sobre patgenos responsables como: enteroinvasivo (Salmonella spp., Shigella spp) o enterotoxignico (Vibrio cholerae, E coli enterotoxignico)

CoprocultivoExamen microscpico:En fresco: Si las heces son lquidas, un examen directo entre porta y cubre permitir poner de manifiesto la presencia de leucocitos, hemates o la movilidad de bacterias como Campylobacter spp o Vibrio spp. La presencia de leucocitos se relaciona a una infeccin por grmenes invasivos (Salmonella, Shigella, Campylobacter) o por no invasivos productores de toxinas que inducen a lesiones mucosas clicas (C difficile toxignico)

CoprocultivoCultivo:La flora intestinal es una flora comensal compleja, por lo que se recomienda utilizar medios selectivos para aislar especficamente los enteropatgenas e inhibir la flora asociada.La recomendacin es:Un medio lactosado poco selectivo.Un medio ms selectivo, y Un medio selectivo de enriquecimiento, elegido en funcin de la bacteria a investigar.

CoprocultivoMedios selectivos de aislamiento para Salmonellas: se recomienda los que contienen sustratos por los caracteres de lactosa y reduccin de sulfatos: Agar SS, XLD, DCL (desoxicolato citrato lactosa), Hektoen.

CoprocultivoMedios selectivos de enriquecimiento: Se utiliza el medio de Mller-Kaufman, Caldo de selenito de Leifson, Caldo de Tetratoniato.Despus de 24 horas de incubacin, se resiembra en medios de aislamiento selectivos como el Sulfito de Bismuto.Se utilizan sistemticamente para aumentar la sensibilidad de deteccin de Salmonellas en las heces o en bacteriologa alimentaria.

CoprocultivoAgar bismuto sulfito (ABS)El agar bismuto sulfito (ABS), el cual es altamente selectivo, es el medio de preferencia para el aislamiento de S typhi. No obstante, el Agar Bismuto Sulfito no se debe utilizar para el aislamiento de S typhi si ha sido almacenado por ms de 24-36 horas. Se ha notificado que ABS inhibe los otros serotipos de Salmonella no S typhi, a no ser que sea refrigerado a 4C por lo menos 24 horas antes de ser utilizado. Cuando se cultivan muestras de fecales de portadores sospechosos detifoidea, el uso de una placa vertida de ABS puede favorecer el aislamiento.

CoprocultivoIdentificacin:Pruebas bioqumicas: galeras API 20E o 10S y medio Kigler. Pruebas como urea, movilidad, citrato, sustratos cromognicos C8 estereasa, entre otras.

CoprocultivoIdentificacin:Pruebas bioqumicas:sembrar en TSI y LIA adems de MIO. En general Salmonella es negativa a las pruebas de,ureasa, indol, lactosa y sacarosa y positiva a las pruebas de descarboxilacin de lisina y ornitina, as como generalmente producen H2S, pero existen variantes atpicas con reacciones positivas a lactosa o no descarboxilacin de lisina.

CoprocultivoIdentificacin:Identificacin antignica para determinar el serotipo segn el esquema de Kauffman- White.

CoprocultivoInterpretacin del coprocultivo estndar:En el caso de diarrea aguda, el aislamiento de Salmonellas, Shigella, Campylobacter o Yersinia tiene que ser siempre considerado como significativo.

CoprocultivoProcedimientos bsicos en la toma de muestras biolgicas para diagnstico.Materia Fecal: La muestra de materia fecal (diarreica, pastosa o formada) debe ser reciente (< de 24 hrs) Las heces obtenidas del suelo, excusado o paal no son aceptadas por la contaminacin ambiental a que fueron expuestas

CoprocultivoProcedimientos bsicos en la toma de muestras biolgicas para diagnstico.Hisopo Rectal: Emplear este tipo de muestra solamente en casos sospechosos de etiologa bacteriana.Tomar la muestra introduciendo la punta de un hisopo de algodn, previamente humedecido en solucin salina estril o medio de transporte, en el recto y rotarlo ligeramente. La presencia de un ligero color caf en el hisopo indica que la muestra ha sido bien tomada. Introducir el hisopo con la muestra hasta el fondo de un tubo de tapn de rosca con medio de transporte Cary-Blair.

Sistema de Identificacin MicrobianaBBL Crystal

Coprocultivo

CoprocultivoDurante un brote, las muestras de heces o de hisopados rectales deben obtenerse de entre 10 y 20 personas que cumplan los siguientes criterios: Actualmente tienen diarrea acuosa (clera) o diarrea sanguinolenta (disentera) La enfermedad se inici menos de 4 das antes del muestreo, y No han recibido tratamiento antimicrobiano para la enfermedad diarreica.Las muestras de fecales se deben obtener en los primeros estadios de cualquier enfermedad entrica, cuando los agentes patgenos estn por lo regular presentes en las heces en su mayor nmero, y antes de que el tratamiento antibitico se haya iniciado. Una excepcin a esta regla es el caso de las heces obtenidas de pacientes con enfermedad febril: en el caso de fiebre tifoidea, el agente etiolgico, Salmonella ser typhi, puede estar presente en las heces, en la mxima cantidad, en la segunda y tercera semanas de la enfermedad.

CoprocultivoObtencin de muestra de heces

Las muestras de heces deben colectarse en recipientes limpios, sin desinfectantes niresiduos de detergentes, y con las tapas bien cerradas y a prueba de derrames. Lasmuestras no deben sacarse de paales, porque pueden contener residuos dedesinfectantes u otros contaminantes. Las muestras fecales no preservadas deben,en lo posible, refrigerarse, y procesarse como mximo 2 horas despus de haberlasobtenido. Las muestras que no se pueden cultivar en un plazo de 2 horas despusde haberse obtenido, se deben colocar en medio de transporte y refrigerarinmediatamente.

CoprocultivoObtencin y transporte de muestras fecales para el diagnstico de laboratorio

Cundo se toma la muestra Cuando el paciente tiene diarrea, lo antes posible luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros das) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos.Cunto se debe obtener Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un medio de transporte.Medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO debe usarse glicerol salino de tampn para el transporte de muestras de V. cholerae).Almacenamiento despus de la coleccin Refrigerar a 4C si los especmenes se recibirn en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a -70C. Las muestras fecales de pacientes con sospecha de tener clera pueden ser transportadas a temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es necesario; sin embargo, se prefiere la refrigeracin.Transporte Tubos sellados o recipientes a prueba de prdidas; colocar en un recipiente hermtico para proteger del hielo o hielo seco. Remitir en una caja aislada con paquetes de congelacin, hielo o hielo seco, para entrega al da siguiente.

CoprocultivoMedios de transporte para muestras fecalesInformacin relativa a los medios apropiados para el transporte de muestras fecales que se sospecha contienen Shigella, Vibrio cholerae o Salmonella (incluido el serotipo typhi). Una vez que las muestras de un brote de enfermedad diarreica llegan al laboratorio, los laboratoristas deben seguir losprocedimientos para el aislamiento de Shigella o V. cholerae, segn si los informes recibidos indican que el brote parece ser disentera o una enfermedad parecida al clera. Las personas de quienes se sospecha que pueden tener tifoidea presentarn por lo regular fiebre sin diarrea, por lo que los laboratorios no reciben normalmente un gran nmero de muestras fecales durante los brotes de tifoidea. Sin embargo, hay veces en que se pueden enviar muestras fecales a un laboratorio para el diagnstico de infeccin por S typhi

CoprocultivoColocacin de las heces en el medio de transporteSi es posible, enfre el medio de transporte durante 1 a 2 horas en un refrigerador o caja nevera antes de utilizarlo. Se puede obtener una pequea cantidad de heces insertando en ellas un hisopo de punta de algodn estril o de polister y rotndolo. Si estn presentes mucus o detritus del epitelio intestinal, tambin debe obtenerse una muestra en el hisopo. Para seguir el muestreo de las heces en el hisopo:a) Inserte inmediatamente el hisopo que contiene material fecal dentro del medio de transporte.b) Empuje el hisopo completamente, hasta el fondo del tubo del medio de transporte.

Coprocultivoc) Rompa la parte superior del palillo con los dedos y deschelo.d) Ponga nuevamente la tapa de rosca en el tubo del medio de transporte y cirrela bien.e) Coloque el tubo en el refrigerador o en la caja nevera.

CoprocultivoObtencin de hisopados rectalesAlgunas veces se obtienen hisopados rectales en lugar de muestras de heces. Loshisopados rectales pueden obtenerse como sigue:a) Humedezca el hisopo en medio de transporte estril.b) Inserte el hisopo por el esfnter rectal 2 a 3 cm (1 a 1,5 pulgadas) y rtelo.c) Saque el hisopo del esfnter rectal y examnelo para estar seguro de que hay material fecal visible en el hisopo. (Si no, repita el procedimiento con el mismo hisopo.)d) Inserte inmediatamente el hisopo en el medio de transporte en fro (como se describe en la seccin anterior).e) Ponga el tubo en un refrigerador o caja nevera.El nmero de hisopos necesarios depender del nmero de placas a inocular.En general, si las muestras se van a examinar para detectar la presencia de msde un agente patgeno, ser necesario obtener al menos dos hisopos con heceso rectales por paciente, y ambos hisopos deben ser insertados dentro del mismotubo de medio de transporte. Una vez que el hisopo est colocado en el medio,debe permanecer en el tubo hasta que sea procesado en el laboratorio.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasAl igual que el resto de Enterobacteriaceae, S typhi es un bacilo (bastn) gramnegativo

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasLa bacteria Salmonella serotipo typhi (S. typhi), agente etiolgico de la fiebre tifoidea, causa alrededor de 16,6 millones de casos y 600.000 muertes al ao en todo el mundo. Los serotipos paratifodicos de Salmonella causan un sndrome similar a la fiebre tifoidea. Los aislamientos de los serotipos paratifodicos (por ejemplo, S. paratyphi A, S. paratyphi B y S. paratyphi C) son mucho menos frecuentes que los de S. typhi. En raras ocasiones, otros serotipos de Salmonella, como S. enteritidis, pueden tambin causar fiebre entrica. Como otros patgenos entricos, las infecciones por S. typhi se transmiten por los alimentos y el agua contaminados con heces de personas con infeccin aguda, excretores persistentes o portadores crnicos asintomticos.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasLas Salmonellas se pueden aislar en un Agar Sangre, pero por su importancia en muestras clnicas se han elaborado diversos medios diferenciales, selectivos y altamente selectivos.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasNORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS .Establece6.1.2 Caldo de enriquecimiento

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas6.1.2.1 Caldo selenito-cistinaFrmulaTriptona o polipeptona 5,00 gLactosa 4,00 gFosfato disdico 10,00 gSelenito cido de sodio 4,00 gL-cistina 0,01 gAgua destilada 1,00 lpH final: 7,0 ; 0,2 a 25CPreparacinDisolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril y distribuir en volmenes de 10 y 225 ml en recipientes estriles, segn se requiera.El caldo as preparado es transparente. De preferencia usarlo el mismo da de su preparacin.Si se desea conservar el medio por varios das, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110C, tomando entonces un color salmn.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasCaldo de selenito (SEL)

El caldo de selenito (SEL) se utiliza frecuentemente como un caldo deenriquecimiento para Salmonella, incluida S typhi. Para cualquier laboratorio puede ser ventajoso utilizar el SEL, porque tambin puede utilizarse como enriquecimiento para Shigella. El SEL solamente debe ser incubado durante 1416horas a 35C37C. Despus de la incubacin, el caldo de selenito debe ser estriado en un medio de agar selectivo (por ejemplo, EH o DXL).Control de calidad: Despus de enriquecer toda la noche en SEL, Salmonella spp.produce tpicamente un crecimiento de bueno a excelente cuando es estriada en agar MacConkey.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas6.1.2.2 Caldo tetrationatoFrmulaIngredientes Cantidades UnidadesProteosa peptona o triptona 5,0 gSales biliares 1,0 gCarbonato de calcio 10,0 gTiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 gAgua destilada 1,0 lpH final: 7,0 ; 0,1PreparacinDisolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril.Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en recipientes estriles. Guardar en refrigeracin.Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una solucin yodo-yoduro y 1 ml de solucin de verde brillante al 0,1% por cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo da de su preparacin.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas8.2 Aislamiento de Salmonella8.2.1 Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.8.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35 C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.8.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.Incubar las placas 24 hrs; 2 h a 35C.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas8.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas:Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasAgar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasAgar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasAgar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasAgar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas8.3 Identificacin bioqumica

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas8.4 Identificacin serolgica8.4.1 Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)

Aislamiento y Cultivo de SalmonellasPor lo tanto, si deseamos hacer un buen diagnstico bacteriolgico para el aislamiento e identificacin de bacterias entero - patgenas debemos utilizar los medios de enriquecimiento como alternativas que nos ofrecen resultados efectivos.

Aislamiento y Cultivo de Salmonellas

Algunos estudios de investigacin describen un incremento en la recuperacin de Salmonellas hasta de un 700% con el uso de medios de enriquecimiento

Aislamiento y Cultivo de Shigellas

El sello distintivo de la infeccin por Shigella es la diarrea con sangre, frecuentemente conocida como disentera. Sin embargo, en casi la mitad de los casos, las infecciones por Shigella causan diarrea aguda no sanguinolenta que no se puede distinguir clnicamente de la diarrea causada por otros agentes patgenos entricos

Aislamiento y Cultivo deVibrio

La mayora de los aislamientos de Vibrio cholerae obtenidos durante brotes de clera sern de los serogrupos toxignicos O1 u O139.

I

Antibiograma

Coprocultivo

Coprocultivo

Gracias