Modulación de la actividad de proteínas inducida por la organización de su entorno molecular

Curso “Sistemas complejos en Biología y Medicina”FAMAF

Universidad Nacional de Córdoba2005

Maria Angelica PerilloFac.Cs.Ex.Fis.y Nat.

Universidad Nacional de Cordoba

ObjetivosObjetivos de la de la claseclase• Colocar en el contexto de nuestro trabajo, algunos

conceptos desarrollados en el curso tales como:

autoorganización

criticalidad y percolación

fenómenos independientes de escala

relaciones alométricas

• Mostrar evidencias acerca de la relación entre la mecanosensibilidad de proteínas y su función.

PROTEINASPROTEINAS

PROTEINA TIPO ENTORNOβ-Galactosidasa enzima soluble Citoplasma

Receptor GABAA transmembrana Bicapa lipídica

Fosfatasa alcalina placentaria enzima anclada Interfase membrana-agua

20 α-amino acidos forman parte de la estructura de proteinas.

Ajuste inducido por Ajuste inducido por el el ligandoligando

Hexoquinasa y su sustrato, la D-glucosa

Ambientes molecularesAmbientes moleculares

• Membrana

• Citoplasma

ModeloModelo del del mosaico fluidomosaico fluidoSinger y Nicholson (1972)Singer y Nicholson (1972)

Mocrografias electronicas de biomembranas

Criofractura

AsimetrAsimetríía a laterallateral

Microscopía de fuerza atómica de monocapas de dpPC en la interfase agua-aire transferidas a soportes sólido. Se observan dominios liquido condensados dispersos en dominios liquido-expandidos.

Microscopía bifotónica en vesículas unilamelares giganes (GUV). Correlación entre forma de los dominios y composición de mezclas binarias de fosfolípidos. Bagatolli L.A. & Gratton E. (2000) Biophys J, 79, 434-447.

Yuan C. & Johnston LJ. (2000). Distribution of GangliosideGM1 in L-a-Dipalmitoylphosphatidylcholine / Cholesterol Monolayers: A Model for Lipid Rafts.1 Biophys J, 79, 2768-2781.

T. Baumgart, S.T. Hess, and W.W. Webb (2003) Imaging coexisting fluiddomains in biomembrane models coupling curvature and line tension" Nature, 23 Oct. 2003,

Protein insertion into the MSG:DCP bilayer. Being placed into a bilayer, a nonbilayer-formingDCP creates a space at the interface (A). In the absence of proteins, the flat liquid crystallinebilayer enriched with DCP transforms into the inverted phase with negative curvature (B).When protein is inserted into the bilayer the volume of the headgroup region is increased,effectively neutralizing the tendency of DCP to be organized in inverted structures (C).

CompensaciCompensacióón n de de geometrgeometrííasas

Physiological Reviews, Vol. 81, No. 2, April 2001, pp. 685-740Molecular Basis of Mechanotransduction in Living Cells Owen P. Hamill and Boris Martinac

A membrane protein in changing conformation also undergoes changes in hydrophobic mismatch with the lipid bilayer. A: positive hydrophobic mismatch in which the protein promotes local positive curvature in the lipid bilayer. B: a protein conformation that promotes local negative curvature. C: neutral mismatch in which the protein does not distort the bilayer. [Modified from Fattal and Ben-Shaul(111).]

MolMolééculas ancladasculas ancladas y y curvaturacurvatura

Matriz extracelular Matriz extracelular y y CitoesqueletoCitoesqueletoLa matriz extracelular y el citoesqueleto son redes interconectadas de proteinas fibrosas.

Percolación: x/ej: parámetro crítico= [actina]= umbral de percolación (ver trabajos de Luisi, teorias de autopoyesis Varela y Maturana)

Filamentos intermedios

Microfilamentosde actina Microtubulos

Muchos receptores de membrana son proteinas transmembrana cuyos dominios intracelulares puede conectarse a la red del citoesqueleto.

Benavidez E.N. y A. Arce. Effects of phosphorylation and cytoskeleton affecting agents and GABAA receptor recruitmenti associated to acute stress, in synaptosomes. Pharmacol. Biochem. Behav. 72:1-10.

El estres induce un aumento en la densidad (reclutamiento) de R-GABAA en la membranas sinaptosomales.

Algunos agentes que desorganizan el citoesqueleto inhiben ese reclutamiento.

Demuestra que parte de la funcionalidad del receptor (reconocimiento del ligando), esta asociada a una interaccion receptor-citoesqueleto.

Modelo mecano-quimico de señalamiento intracelullarForgacs (1995) J.Cell.Sci.108,2131.

Las señales extracelulares llegan, via ligandos, a receptores de membrana y eventualmente puede propagarse hasta el nucleo.

- Union L-R --- cambios en energia conformacional ----- estres ---- puede transferirse al dominio intracelular.

-La deformacion se propaga y puede seleccionar configuraciones con energia molecular particular.

-Una molecula asociada a la red puede cambiar su conformacion y difundir o reorganizar localmente la red.

Difusion de proteina pequeña: 10µm en 10-2s

Propagacion de una deformación por medio de una red interconectada (sin considerar viscosidad del citosol): longitudinalmente 10µm en 10-9s

transversalmente 10µm en 10-8s

Este tipo de señalamiento provee velocidad y redundancia

CitoplasmaCitoplasmaAmbiente molecularmente superpoblado

citoesqueleto y otras proteinas

Sistema heterogéneo- Complejo sistema endomembranas: golgi, retículoendoplásmico, vesículas- Fibras

Interfases

Agua estructurada

Receptores tipo Receptores tipo canales canales activados por ligandosactivados por ligandos

Sitios de union alostericamente acoplados

Benzodiazepina

Compuesto R1 R2 R3 R4

Diazepam Cl CH3 H HFlunitrazepam NO2 CH3 H FClonazepam NO2 H H Cl

Espacioextracelular

Espaciointracelular

P

Px

Barbituratos

Esteroides

FlunitrazepamFlunitrazepam• Ligando del R-GABAA

• Modula alostéricamente al sitio de GABA

• Se incorpora a la bicapa lipidica y:

Disminuye elacticidad de membrana

Aumenta curvatura de membrana

CapasCapas monomoleculares monomoleculares en la en la interfase aguainterfase agua--aire aire ((Filmes Filmes de de LangmuirLangmuir))

∆V

π= Presión Lateral de Superficie

∆V= Potencial de superficie 0. =+ µγ dA

ndS

π = γw – γ m

Determination of compressibility modulus of Determination of compressibility modulus of dpPC monolayersdpPC monolayers

(a)Surface pressure (π)

(b)Compressibility modulus (K)

in the absence or in the presence of FNT at different concentrations in the subphase.

T=28 ± 0.5º C.

The arrows in (b) approximately indicate the phase transition point.

( )π

ππ

∂∂

⋅−=A

AK

Efecto de FNTZ sobre el tamaño de Efecto de FNTZ sobre el tamaño de vesículas vesículas multilamelaresmultilamelares de de dpPCdpPC

Per

cent

age

of L

ipos

omes

D=183±10 nm

D=255±20 nm

D= 525±33 nma)

gfeda

c)

b)

0

20

40

0

20

40

0

20

40

cb

[FNT] (µM)

a) 0

b) 50

c) 100

Efecto de FNTZ sobre la Efecto de FNTZ sobre la curvatura de la membranacurvatura de la membrana

Efecto de FNTZ sobre la Efecto de FNTZ sobre la exposicionexposicion de de dpPEdpPE en la en la lamelalamela externa de la externa de la membrana externa de membrana externa de liposomasliposomas

M uestra Con dicion % P E cuan tificad orespecto a l con tro l

Con tro l s in FN TZ 100Exp erim en ta con FN TZ 43

MLV: mezcla PC:PE (95:5 mol/mol)

Efecto de FNTZ sobre la Efecto de FNTZ sobre la curvatura de curvatura de bicapasbicapas mezclamezcla

Efecto de FNTZ sobre la curvatura de Efecto de FNTZ sobre la curvatura de membranas naturalesmembranas naturales

Control FNTZ50 µM, 60min

Vanadato100µM, 19 hs

Mutual compensation of the effects of Mutual compensation of the effects of FNTZ and FNTZ and lidocainelidocaine

FNTZ (µM)0 50 100 150

MI

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0 500 1000 1500Lidocaine (µM)

FNTZ alone inducesechinocytocis

Lidocaine alone induces stomatocytocis

Monoterpenos

-afectan la interacción R-GABAA con sus ligandos y el acoplamiento entre los sitio de benzodiazepinas y GABA.

-no desplazan a FNZ ni a GABA de sus sitios de union en R-GABAA

Efecto electrostático en el entorno del receptor?(Turina y Perillo, Biochim.Biophys.Acta, 2003)

Efecto mecano-elástico sobre la membrana?Experimentos de MS en filmes LB y sintesis de sonda de EPR

Capas monomoleculares en la interfase agua-aire preparadasa partir de membranas sinaptosomales

Tomado de Patus F,, Desnuelle P, and verger, (1978) BBA 507,62-70,

45°

?π

Transferencia de membranas sinaptosomales

Filmes Langmuir-Blodgett

Layer number0 1 2

0.0

0.4

0.8

1.2

Ejemplo de un experimento de transferencia.Línea roja: transferencia acumuladaLínea negra: tasa de transferenciaLínea verde: porcentaje de transferenica.

π=constante

Union de 3HUnion de 3H--FNZ a FNZ a membranas membranas sinaptosomales sinaptosomales en en filmes filmes LBLB

Free [3H]FNZ (nM)

0 10 20 30 40 50

Bou

nd [3 H

] FN

Z (fm

ol/b

all)

0

200

400

600

800

Free [3H]FNZ (nM)

0 20 40

[3 H] F

NZ

(fmol

/bal

l)

0

200

400

600InespecificTotal

[3H] FNZ (nM)

0 20 40 60

Boun

d [3 H

] FN

Z (fm

ol/b

all)

0

200

400

600

800

[3H] FNZ (nM)

0 50

[3H

] FN

Z (fm

ol/b

all)

0

500

1000TotalInespecifico

Free [3H]FNZ (nM)

0 2 4 6 8 10

Free [3H]FNZ (nM)

0 5 10

[3H

]FN

Z (fm

ol)

0

5

10

15

20

Suspension LB 35 mN/m LB 15 mN/mde vesiculas 2 capas 1 capa

Bou

nd [3

H]F

NZ

(fmol

/mg

prot

)

0

200

400

600

Free [3H[FNZ (nM)

0 20 40 60

Boun

d [3

H[F

NZ

(fmol

/mm

2)

0

5e-16

1e-15

2e-15

2e-15

3e-15

3e-15

Free [3H]FNZ (nM)

0 10 20 30 40 50[3 H

]FN

Z (fm

ol/b

olita

)0

50

100

150

200

250H

T

NS

LB 35 mN/m Controles1 capa

H: hexadecanoT: toluenoNS: no silanizado

ParParáámetros cinmetros cinééticos ticos de la de la uniunióón n de [de [33H]FNZ al RH]FNZ al R--GABAGABAAA

Bmax Muestra Kd (nM) (fmol/mg (fmol/bolita) (fmol/mm2)

Proteínas

MS buffer

2.33 ± 0.59

554.5 ±49.6

- - 0.054 mg (0.23 mg/ml)

MS water 0.95 ± 0.23 82.52 ± 4.031 - - 0.104 mg (0.45 mg/ml)

MSTbolita 1 capa 35 mN/m

25.59 ± 3.81

256.6 103

331±58.27

4.214 (1.29 ± 0.4) 10-3 mg/bolita

Sup, bolita 78.54 mm2

MSTbolita 1 capa 15 mN/m

50.67 ± 26.77 1.97 106 1184 ± 86.32 15.08 (0.6 ± 0.2) 10-3 mg/bolita Sup, bolita 78.54 mm2

MSTvidrio 2 capas 35 mN/m

40 ± (1.9 10-8) 0.0047 ± 0.3 - 2.42 ± 0.3 (5.4 ± 1.7) 10-3 mg/vidrio (51 ± 39) 10-6 mg/mm2

Membranas sinaptosomales: vesiculas en suspension (MS) o membranas transferidas a filme LB (MST).

Hmax 20.5 nm R 30.8

15 mN/m 1 capa

Hmax 80 nm R 23.8

Hmax 30.8 nm R 40.2 Hmax 85.6 nm R 88.7 Hmax 53.4 nm R 23.3 Hmax 21.2 nm R 24.2

AFM LBAFM LB--Membranas sinaptosomalesMembranas sinaptosomales35 mN/m 1 capa35 mN/m 2 capas Vidrio silanizado

(sin filme LB)

Hmax 33.3 nm R 20.7Hmax 409 nm R 495 Hmax 90.3 nm R 43.1 Hmax 154 nm R 97.9

Fosfatasa alcalina placentariaFosfatasa alcalina placentaria

HidrHidróólisislisis de ONPP de ONPP catalizada por catalizada por PAP

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Act.

esp.

(um

ol/m

in/m

g pr

ot)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0.24

0.28

(c)

(b)

(a)

Concentración de Sustrato (mM)

PAP

Curvas de actividad vs. concentración de sustrato de la enzima FAP contenida en membranas purificadas de placenta.(a) Membranas con un pretratamiento de alta

temperatura (15´a 60ºC) (b)Membranas sin tratamiento previo (c)Membranas transferidas a un soporte sólido (film L-B)

AFM AFM FosfatasaFosfatasa AlcalinaAlcalina PlacentariaPlacentaria

B

A Fragmento ω

Fragmento α ββ--GalactosidasaGalactosidasa de E.de E.colicoli

Fig. 2. Estructura de β-Gal. a) Tetrámero de β-Gal. Las líneas punteadas muestran los dos tipos de contacto entre los monómeros (línea A: Interfase larga y línea B: Interfaseactivadora) b)Monómero de β-Gal. Las flechas muestran la porción del monómero que corresponde a la α y ω complementación. (Tomado de Jacobson et al., 1994)

Penetration of Penetration of ββ--Gal in Gal in LangmuirLangmuir--filmsfilms

10 20 30 40

048

12

∆π

(mN

/m)

πi (mN/m)

π cut off

Time x 10-3 (sec)

Sur

face

pre

ssur

e (m

N/m

) β-Galactosidase

0 1 2 3 4 50

10

20

30(a)

β-Gal will not penetrate in highly packed membranes.

0. =+ µγ dA

ndS

π = γw – γ m

Lipid enzyme

π: lateral surface pressure

ππ

FILMES TIPO LANGMUIRFILMES TIPO LANGMUIR--BODGETTBODGETT

PEESSE kk

k+→+ →

←−

21

1

Cinética michaeliana

Cinética sigmoidea

nn

n

SKSVVo

].[].[

5.0

max=

CINCINÉÉTICA SIGMOIDEA: MODELOS TETICA SIGMOIDEA: MODELOS TEÓÓRICOSRICOS

i) Modulación alostérica directa:

- Modelo de Hill

- Modelo de Monod, Wyman and Changeaux (MWC) .

ii) Modulación alostérica indirecta:- Equilibrio conformacional de proteínas de membrana inducido

por el sustrato. - El papel del agua en los mecanismo de regulación alostérica- Cinética fractal .

Cinética Sigmoidea

HidrHidróólisislisis de de ONPG ONPG catalizada porcatalizada por ββ--Gal de Gal de K.K.lactislactisorganizadaorganizada en en filmesfilmes LB. LB.

CinCinééticatica fractal?fractal?

KMeff=Kf.2.exp(ge-1)/gslog (KMeff)=log (Kf)+((ge-1)/gs).log(2)

ge= [(0.98-0.993)/0.31]x.9.058+1ge=0.62

slope= 9.06=gsordinate= -11.58

Log [S]

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Log

V

-12

-10

-8

-6

-4

-2

logV vs Log SPlot 1 Regr

ge

m

P

m

P

gs

f Vv

Vv

KS

−

−

=

1.

[ONPG] (mM)

0 5 10 15 20 250.000

0.001

0.002

0.003

µmol

/ m

(b)

1

1.−

−

=

m

P

m

P

f Vv

Vv

KS

Log(S)

0.8 1.0 1.2 1.4

log(

Vm

ax)

-4.0

-3.5

-3.0

-2.5

-2.0

Log [Vmax]

Log [Vmax/2]

Log (Kf)

Log (KMeff)

gs

Vmax=0.002142KMeff=9.55Kf=9.84

Cinética

Michaeliana

Cinética fractal

Savageau (1995),J.Theor.Biol.176,115.

AFM AFM ββ--GalactosidasaGalactosidasa

3p.002 X

distance (pixel)

0 100 200 300 400 500 600

gray

val

ue

-4000

-2000

0

2000

4000

6000

8000

Acumulado

0 100 200 300 400 500 600-40

-20

0

20

40

60

DFA1 X 3P.002

log n

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2

log

F

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

1.486

AFM AFM ββ--GalactosidasaGalactosidasa

CinCinééticatica en en ambientes ambientes con con superpoblacisuperpoblacióónn macromolecularmacromolecularHodrólisis de ONPG catalizada por β-Gal

c)

[ONPG] (mM)0 5 10 15 20

Vo

(µm

ol/m

in/m

g.)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8ControlPEG 35%P/V

b)

[ONPG] (mM)

0 5 10 15 20

Vo (µ

mol

/min

/mg

prot

.)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

ControlPEG 25% P/V

[ONPG] (mM)0 5 10 15 20

Vo

(µm

oles

/min

/mg

prot

.)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

ControlPEG 15% P/V

Equilibrio termotrEquilibrio termotróópicopico de de ββ--GalGal

30 40 50 60 700

1

2

3

MLVs

agua

30 40 50 60 70

Cp

(Kca

l/mol

/ºC)

(x 1

05 )

0

1

2

3

PEG 25%

30 40 50 60 700

1

2

3

PEG 35%

30 40 50 60 700

1

2

3

46.4

Temperatura (ºC)

53.4

47.4

53.5 56.36

54.557.2

agua

30 40 50 60 700

1

2

3 53.4

46.4

48.4

52.354.5

Temperatura (ºC)

Sistemas BiologicosSistemas BiologicosSistemas biológicos• heterogéneos•complejos• abiertos• alejados del equilibrio• NO LINEALES

PUEDEN ADOPTAR DIVERSOS ESTADOS DINAMICOS DEPENDIENDO DE LOS VALORES QUE ADOPTEN SUS PARÁMETROS DE CONTROL

ESTADOS ALTAMENTE DEPENDIENTES DE LAS CONDICIONES INICIALES Y DE LA HISTORIA PREVIA

IMPREDICTIBILIDAD DEL COMPORTAMIENTO A LARGO PLAZO

Exponente de Lyapunov

• Originalmente: para investigar estabilidad de ecuaciones diferenciales no lineales

•Describe la rapidez con que aumenta o disminuye una perturbación en un sistema dinámico

λ>0 caos

λ<0 ordenλ = Σ log

d f(xn)

d xni=0

n1n

MapasMapas de de LyapunovLyapunov

Taken from Complexity and ‘art’: Liapunov graphs. Diethard JanßenDepartment of Designinformatics, Braunschweig School of Art. D-38118 Braunschweig, Germany. http://www.hbk-bs.de/Designinformatik/galerie/

Tesistas Tesistas y y BecariosBecarios

β-GalactosidasaJulieta SanchezEduardo ClopAlejandro CollinPedro ClopAnahi TurinaBenjamin CarusoGraciela MarinMarina Crescimbeni

R-GABAADaniel GarciaAnahi TurinaJackeline Kembro

Fosfatasa Alcalina PlacentariaEduardo Clop

ColaboradoresColaboradoresShirley Schreier (USP, Brasil)Eneida de Paula (Unicamp, Brasil)Gloria Yranzo (DQO, CsQs, UNC)Elisabeth Moyano (DQO, CsQs, UNC)Julio Zygadlo (Quim.Org. y Productos Naturales, FCEFyN, UNC)Damian Maestri (Quim.Org. y Productos Naturales, FCEFyN, UNC)Raul Marin (Quim.Biol., FCEFyN, UNC)