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Dalila Zanette
Alterações no perfil de expressão gênica e do imunofenótipo de CPHs CD34+ expandidas ex vivo
Panepucci RA, Molfeta GA, Araujo AG, Silva-Jr WA, Palma PBV, Menezes CCBO, Delgado MO, Covas DT
Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Zago
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Transplante de células progenitoras hematopoéticas de SCU
Menos utilizadas do que medula óssea ou sangue periférico mobilizado
Baixo numero de células
Afeta diretamente o sucesso do transplante
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Expansão in vitro: várias tentativas
Células expandidas apresentam menor enxertia
Perda da capacidade de repopulação in vivo ?????
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Maior obstáculo da expansão
A PRÓPRIA PROLIFERAÇÃO ESTIMULAA PRÓPRIA PROLIFERAÇÃO ESTIMULA
A DIFERENCIAÇÃO E A PERDA GRADUALA DIFERENCIAÇÃO E A PERDA GRADUAL
DA CAPACIDADE DE REPOVOARDA CAPACIDADE DE REPOVOAR
TER PROLIFERAÇÃO
Preservar auto-renovação
Evitar a diferenciação
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Na ausencia total de estroma: perda gradual da capacidade de repovoar
Quais os genes envolvidos nesta perda ?
Quais os genes afetados pela ausência do estroma ?
Melhores resultados até hoje: CPHs co-cultivadas com estroma humano
Maior obstáculo da expansão
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Objetivos
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Avaliar os efeitos da expansão sobre a expressão gênica de células CD34+
Avaliar os mecanismos genéticos envolvidos na adaptação ao meio ex vivo na ausência de estroma
Objetivos
Como estas mudanças alteram a capacidade de repovoar e a capacidadede diferenciação das células expandidas
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Células recém-isoladas
T0
- CD 34 pureza- Imunofenótipo- Viabilidade- CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCRCD34+
3 dias de cultivo
MNC
Células expandidas por 3 dias
T3
- Imunofenótipo- Viabilidade- CFC ensaios clonogênicos - RNA : microarrays e qPCR
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Protocolo de expansão utilizado
Free Style Medium (Invitrogen)1% de human albumin
TPO
FLT3 lig
SCF
IL-6
3 dias
Sem estroma e sem soro bovino fetal
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Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink
Cerca de 10.000 genes/transcritos
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13 amostras
T0 T3
In vitro Expanded for 3 days
2 pools 2 pools
Freshly isolated
Reguladas POSITIVAMENTE pela expansão
Reguladas NEGATIVAMENTE pela expansão
Microarrays de oligonucleotídeos: plataforma Codelink
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Resultadose
Discussão
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Viabilidade celular
t0 t3 t70
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
ViáveisApoptose precoceApoptose tardia e necrose
*p=0,038 *p=0,027
Tempo de Cultura
Po
rcen
tag
em d
e C
élu
las
Mais de 75% de viabilidadeNo dia 3
t0 : média 63% viáveist3 : média 75% viáveist7 : média 54% viáveis
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Expressão gênica
In vitro:
Quais as diferenças na expressão gênica de células CD34+recém-isoladas e expandidas ex vivo ?
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Microarrays : 40 genes mais expressos em T3
Gene Razão Gene Razão Gene Razão Gene Razão
UBTD1 126,3 TAS2R1 21,9 PACSIN3 15,8 AMBP 12,0
GSS 110,2 STAT2 21,7 PCK2 15,2 PLK1 11,8
ANGPTL3 66,6 PIH1D1 19,8 P2RX7 14,4 USP2 11,2
BBC3 60,2 AFG3L2 19,7 XPO7 14,2 IL9R 10,9
ADAM18 52,1 ITIH1 17,9 MRC1 13,9 CYLC1 10,8
CAMK4 48,7 WNT5B 17,9 PHLDA2 13,4 RBP4 10,5
PHLDA1 42,1 ADAMTS10
17,3 TDRD6 13,1 BUB1 10,4
TOM1L1 33,1 KIF1B 16,6 GAL 12,1 HSD3B7 10,1
KIF2C 25,2 GMIP 16,3 SMAD6 12,1 PGF 10,0
INMT 24,2 INMT 24,2 AMBP 12,0 FBLN1 10,0
DDX25 23,9 DDX25 23,9 PLK1 11,8 CD26 9,9
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Genes validados e classes funcionais (Real Time qPCR)
Proliferation
IL9RSMAD6
Apoptosis
BIRC5 or survivin
Cell cycle
CDC25CCCND1
WNT pathway
WNT5BWIF1GSK3B
Self-renewal
HOXB4Bmi-1
Polarity, cell division
AKT1PTEN
Processos associados à expansão ex vivo e à auto-renovação
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Via de sinalização WNT
Katoh M and Katoh M, 2007
Beta-catenin dependent Beta-catenin independent
CANONICAL NONCANONICAL
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Canônica
Regula a escolha do destino das células progenitoras durante o desenvolvimento
embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos
Não-Canônica
- Regula indiretamente a escolha do destino das células progenitoras durante o
desenvolvimento embrionário e também na homeostase dos tecidos adultos
através da inibição da via canônica
- Polaridade celular e migração celular
Via de sinalização WNT
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Via de sinalização WNT
Via não-canônica
Não sinaliza através da beta-catenin;
Em alguns casos inibe a via canônica;
Também necessita de Fzd como receptor, mas não precisa de LRP5/6;
A via NC, divide-se em 3 outras sub-vias: duas delas liberam íons Cálcio no citoplasma, que são a via da adesão e da morfologia celular. A terceira é a via da polaridade celular;
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Via de sinalização WNT
WNT1 (1,5)WNT2 (1,8)WNT2B (1,3)WNT3A (NA)WNT4 (-1,2)WNT5A (NA)WNT5B (10)WNT7A (-1,2)WNT10B (-1,2)WISP2 (1,2)WISP3 (1,0)FZD9 (7,5)GSK3B (-1,1)CTNNB1 (-1,5)AXIN 2 (1)WIF-1 (-5)DKK1 (4,8)
WNT5BInibe a via canônicaAtiva a via não-canônica ~WNT5A
FZD9Receptor
WIF1 Inibidor das duas vias, canônica e não-canônica
DKK1Inibidor específico da via canônica
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Polarização de CPHs cultivadas in vitro:
evento comum na ausência de estroma
e na presença e citocinas
Divisões assimétricas
Perda da capacidade de repopulação
Giebel et al, 2004Giebel B and Bruns I, 2008
Via de sinalização WNT e polarização
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Via não-canônica WNT
Divisões assimétricas
Polaridade
Auto-renovação
Outras vias regulama polarização:
PI3K-AKTSinalização do Cálcio
EGF
Via de sinalização WNT e polarização das CPH
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Não-canônica e PI3K-AKT
Kawasaki et al, 2007
Wnt and PI3K-AKT estão relacionadas em gliomas
Pu et al, 2008
Via de sinalização WNT e outras vias
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Dados divergentes sobre a via WNT e CPH
Wnt5a (não-canonica) : aumenta a atividade de repopulação das CPH
Wnt3a (canônica) : não aumenta a enxertia
Nemeth et al, 2007
Reya et al, 2003
A beta-catenina aumenta a auto-renovação in vitro
Jeannet et al, 2007
A hematopoese a longo-prazo independe de cateninas
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A via não-canônica está mais ativa nas células cultivadas ?
Isso interfere na capacidade de repovoar destas células ?
Hipótese
Via de sinalização WNT e CPH
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Silenciamento do Wnt5b
- siRNAs para o silenciamento do gene WNT5b
- faremos a cultura exatamente como antes, incluindo controles e também amostrasnas quais o WNT5B será silenciado
- Avaliaremos se houve transfecção através de um controle fluorescente
- avaliaremos se houve silenciamento do gene por real-time PCR para o WNT5B
- Avaliaremos se a proteína WNT5B é alterada, com Ac anti-WNT5b
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Consequências
Na morfologia: verificar polarização
Na expressão de marcadores de superfície
Na expressão gênica de alvos abaixo de WNT e outros membros da via WNT (WNT5A, WNT8A, DKK1, GSK3B, beta-catenin, OCT3/4, NANOG, SOX2 e Axin 2)
Na capacidade de formar colônias eritróides e mielóides
Na proliferação das células
Silenciamento do Wnt5b
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Genes mais expressos em CPHs cultivadas
Divisão celular
Mitose
Fuso Mitótico
Organização docitoesqueleto
Polaridade
Assimetria
Marcadores desuperfície
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Quiescence abrogation
Genes mais expressos em CPHs cultivadas : mitose
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KIF2C KIF1B
AURKB CPC complex
(+BIRC5, borealin, Incenp)
(p+)
centrômeros
KIF20APLK1
Fuso mitótico e centrossomos : interligam os eventos de :
Divisões assimétricas, polaridade e auto-renovação
Razões maiores do que 10
Genes mais expressos em CPHs cultivadas : fuso mitótico
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Validação dos genes mais expressos: qPCR
BIRC5
T0 T30.25
0.5
1
2
4
8
2-d
dC
t
CDC25C
T0 T30.5
1
2
4
8
16
2-d
dC
t
IL9R
T0 T30.1250.250.5
1248
163264
128256
2-d
dC
t
SMAD6
T0 T30.25
0.5
1
2
4
82-
dd
Ct
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GSK3B
T0 T30.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
2-d
dC
t
WNT5B
T0 T30.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
2-d
dC
t
WIF1
T0 T32.0×10-03
3.9×10-03
7.8×10-03
0.0156250.031250.06250.1250.250.5
12
2-d
dC
t
Validação dos genes da via WNT: qPCR
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Bmi-1
T0 T30.03125
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
2-d
dC
t
HOXB4
T0 T30.25
0.5
1
2
2-d
dC
t
PTEN
T0 T30.25
0.5
1
2
2-d
dC
t
Validação de genes de auto-renovação : qPCR
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Via não-canônica do WNT e expansão ex vivo
Silencing WNT5B
(siRNA)
Expressão de marcadoresee superfície
Ensaios clonogênicos
Proliferação
Ciclo celular
Polaridade
Expressão dos alvos e outros membros da vianão-canônica
To confirm:
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Microarrays : 10 genes menos expressos em T3
AREG -431 ARHGAP20 -16
IFI44L -62 ELAVL4 -15
TPPP3 -57 VPREB3 -15
CRTAC1 -53 CLEC4E -14
RGS1 -49 S100A12 -14
CXCL10 -38 KLF2 -13
SNF1LK -37 CD69 -13
SERPINA1 -25 RAG2 -12
CD20 -20 HIST2H2BE -12
PDE4B -16 SKT17B -12
GENE GENE t0 / t3 t0 / t3
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Amphiregulin ou AREG: 431 vezes menos expresso
Não há redundância funcionalcom outros ligantes de EGFR1Autócrina ou
parácrina
Fator auto-renovação células neurais adultas
Diferenças in vivo e in vitro ???
Epiregulin, Neuregulin, TGF-
AREG é expressa na placenta (gestação)
Membrana celular
Citoplasma
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Células CD34+/CXCR4+ > homing
CXCR4 e homing
CXCR4+SDF-1+
NICHONICHOCPHCPH
migram SDF-1+
SDF-1+
SDF-1+
As CPHs de SCU < homing do que CPHs de MO
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CXCR4 e homing
CXCR4
T0 T30.015625
0.03125
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
2-d
dC
t
p<0,0001
t0 t3
Razão= – 9 (microarray)Razão = -24 (qPCR) Ausência de estroma (SDF-1)
HIF-1 – 4 vezes menos expresso em t3
CD26 – 10 vezes menos expresso em t3
Via CXCR4/SDF-1
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Células CD34+/CXCR4+
t0 t30
250000
500000
750000
1000000
No a
bso
luto
de
célu
las
t0 t3
p = 0,8
T0 T30
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
t0 t3
p = 0,05
%
Expressão dinâmica do receptor CXCR4 na membrana – demora na enxertia
Maior capacidade de homing
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Genes reguladores de CPHs
Auto-renovação
Retenção na medula
Mobilização
Diferenciação
Proliferação
Funções críticas de CPHs
Fatores de transcrição
Reguladores extrínsecos
e
Reguladores intrínsecos
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Genes reguladores de CPHs
Reguladores intrínsecos
Fatores de transcrição nível de expressão
Símbolo do Gene Razãomicroarray
Razão qPCR
HOXB4 1,3 - 1,9
SLAMF1 1,5 NA
BMI-1 1,5 -3,3
FLT3 - 4,3 NA
SCL 2,8
RUNX1 1,1 NA
BMP4 -1,1
ZFX -1,2 NA
TEK ou Tie2 1,2 NA
MLL4 1,8 NA
ABCB1 -3.7 NA
Não houve grande alteração
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HOXB4 : homeobox B4
Super-expressão aumenta a expansão ex vivo e in vivo
Aumenta a capacidade de reconstituição
HOXB4
T0 T30.25
0.5
1
2
2-d
dC
t
Alvos não alteraram : FOXO3A, TNFRSF1B, BAMBI, SOCS2 e outros
Diferenciação expressão de HOXB4
t0 t3p=0,0002
Células cultivadas : razão = -2
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NotchFGF
Sinalização de citocinas
Hedgehog
Proteínas GTNF-TGF-
Apoptose/stress
Ciclo celular
Wnt
HOXB4 : homeobox B4
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Bmi-1 (polycomb group family member 4)
t0 t3
Bmi-1
T0 T30.03125
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
2-d
dC
t
p= 0,0005
Razão microarray = 1,5
Razão qPCR = -3,3
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Bmi-1
Divisões simétricas – auto-renovação intacta
Mantém células quiescentes, sem exaustão
Perda da expressão de Bmi-1 correlaciona-se com a perda da capacidade de reconstituição e com apoptose
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Bmi-1
Bmi-1
Bmi-1 ocasiona descontrole da proliferação e apoptose
Repressão da transcriçãode alvos p16INK4a e p19ARF
Proliferação
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Conclusões
Aumento do número total de células e do número de células CD34+
Aumento médio do número de células CD34+/CD38neg e CD34+/CD90+
Não houve indução da apoptose
Conservação da capacidade de diferenciação (ensaios clonogênicos)
Validação da expressão dos genes analisados no microarranjo por qPCR
A menor expressão de HOXB4 e Bmi-1, relacionados à perda gradativa da capacidade de auto-renovação e também associada à diferenciação
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Conclusões
Menor expressão de CXCR4 indica menor capacidade de homing e enxertia
A maior expressão de genes relacionados ao ciclo celular e mitose refletea grande atividade proliferativa das células cultivadas in vitro
A maior expressão de genes relacionados à organização do fuso mitótico parece estar vinculada à alterações na polaridade celular que interferem na ocorrência de divisoes assimétricas in vitro
Melhor compreensão da perda gradativa da capacidade de
auto-renovação e reconstituição associada à expansão in vitro