Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa

Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các

chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase

và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR

Thân Văn Minh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: GS.TS Trương Nam Hải

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về Pichia pastoris; α-factor và geneMF(ALPHA)1; các protein

ngoại lai và kỹ thuật Real-time PCR. Nghiên cứu về các vật liệu như: chủng vi sinh

vật và các gene biến nạp; mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR; hóa chất, enzyme

và các thiết bị máy móc; phần mềm và các loại môi trường và dung dịch. Trình bày

các phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lên men và nuôi cấy các chủng P. pastoris

tái tổ hợp; phương pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P. Pastoris; kỹ thuật PCR;

kỹ thuật Real-time PCR; xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0. Đưa ra kết

quả và thảo luận: Lên men các chủng P. pastoris tái tổhợp; tách chiết và tinh sạch

RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men; tối ưu điều kiện cho phản ứng Real-

time PCR; kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1; real-time PCR về biểu

hiện của gene MF(ALPHA)1; so sánh kết quả Real-time PCR và Microarray.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Di truyền hóa sinh học; Nấm men

Content

MỞ ĐẦU

Những kết quả phân tích so sánh hệ transcriptome của chủng P. pastoris đối chứng,

chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase cho thấy có 6 gen có sự khác

biệt trong biểu hiện gen giữa các chủng nghiên cứu trong đó có gen mã hóa pheromone lai

alpha (MF(ALPHA).

Kỹ thuật Real-time PCR đánh giá sự biểu hiện của gen sẽ có độ nhạy, độ chính xác lớn hơn

và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn hơn để đánh giá sự biểu hiện của gen

(MF(ALPHA)1 từ đó có những định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao

mức độ biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng nấm men P. pastoris tái tổ hợp.

2

Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa

Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và

Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR”

Công việc được tiến hành tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris

1.1.1. Đặc điểm hệ biểu hiện P. pastoris

P. pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae sinh vật nhân chuẩn, có khả năng trao đổi

methanol.

Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P. pastoris đều có nguồn gốc từ chủng dại

NRRL-Y 11430.

Bảng 1.1: Các chủng biểu hiện P. Pastoris

Tên chủng Kiểu gen Kiểu hình

X-33 Chủng dại Mut+

GS115 his4 Mut+His

-

KM71H his4 arg4 aox1Δ::AGR4 Muts His

-

GS115/Albumin his4 Muts

MC100-3 his4 ar4g aox1Δ::SAGR4

aox2Δ::Phis4 Mut

-His

-

SMD1168 Pre4Δ his4 Mut+His

- khuyết protease

SMD1165 Prb 1 his4 Mut+His

- khuyết protease

1.1.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện P. pastoris

P. pastoris có khả năng thực hiện nhiều biến đổi sau dịch mã đặc trưng của sinh vật

nhân chuẩn .

Có promoter mạnh như AOX1 hoặc GAPDH.

Chất cảm ứng biểu hiện protein là methanol, rẻ tiền. Quá trình lên men có thể được thực hiện

nhanh chóng .

1.1.3. Quá trình chuyển hóa methanol ở P. pastoris

Quá trình chuyển hóa methanol xảy ra trong bào quan chuyên biệt là peroxisome để

tránh tác dụng gây độc của hydrogen peroxide.

1.1.4. Cơ chế tiết protein ở nấm men

Mặc dù nhiều trình tự tín hiệu tiết khác nhau đã được sử dụng thành công, trình tự tín

hiệu tiết prepropeptide α-factor của S. cerevisiae được xem là thành công nhất .

1.1.5. Vector biểu hiện gene ngoại lai của P. pastoris

1.1.5.1. Đặc điểm chung của vector biểu hiện của P. pastoris

1. Promoter mạnh: thường là promoter AOX1

2. Có một hoặc nhiều vị trí đa cắt nối (MCS).

3. Trình tự kết thúc dịch mã.

4. Gen chỉ thị chọn lọc

5. Một trình tự cần thiết cho sự sao chép và tồn tại của plasmid trong vi khuẩn

4

1.1.5.2. Vector pPIC9

1.1.6. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris

Các vector biểu hiện trong P. pastoris được thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay

locus his4. Giống như ở S. cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định quá trình biến nạp vào

P. pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng trong bộ gene nấm men. DNA

tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản sao trong bộ gene tế bào chủ.

Ở chủng Mut+ hoặc (Mut

s), gene sát nhập tại locus his4 do sự trao đổi chéo giữa locus his4

của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện (Hình 1.5). Kết quả có thể cho một hoặc nhiều

bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình His+. Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới

hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut+ hay MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng. Các dòng nấm

men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+ biến nạp.

1.2. Tổng quan về α-factor và gen MF(ALPHA)1

Nhân tố alpha là một chuỗi peptide gồm 13 amino acid (aa) được mã hóa bởi 2 gen cấu

trúc riêng biệt, MF1, MF2. Gen MF(ALPHA)1 không có trong chủng P. pastoris gốc ban đầu,

nhưng trong vector biểu hiện pPIC9, do đó được đưa vào các chủng nấm men P. pastoris

trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp.

1.3. Tổng quan về các protein ngoại lai trong đề tài

1.3.1. Tổng quan về Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2) ở người được biết đến dấu tiên như yếu tố kích thích tăng trưởng tế

bào T, nó là một lymphokine có khả năng quản lý đáp ứng miễn dịch mạnh và đã được xác

định như một chất dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư.

1.3.2. Tổng quan về α-amylase:

Amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết glycoside của tinh bột, glycogen và

các polysaccaride tương tự. α-Amylase của nấm men như S. fibuligera đã được nghiên cứu

gồm 6 trình tự aixit amin có tính bảo thủ cao nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme.

1.4. Kỹ thuật Real-time PCR

1.4.1. Tổng quan về Real-time PCR

Trong kỹ thuật PCR truyền thống kết quả của thí nghiệm chỉ được xác định khi đã hoàn

tất các công đoạn của thí nghiệm, do đó công đoạn PCR thường mất rất nhiều thời gian. Sự ra

đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bước đột phá trong công nghệ sinh học. Kỹ thuật này

cho phép xác định kết quả của thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chính vì

vậy được gọi là “Real-time”. Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định lượng

rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao (độ

lệch chuẩn nhỏ hơn 0,2 chu kỳ) Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định

lượng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại

cao.

5

1.4.2. Phân tích kết quả Real-time PCR

1.4.2.1. Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR (amplification graph)

1.4.2.2. Chu kỳ ngƣỡng (Ct)

Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó được đường biển diễn

khuếch đại cắt đường nền (basal cycle).

1.4.2.3. Biểu đồ nóng chảy

Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm DNA đích ở chiều dài,

nên có thể phân biệt được được đường biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của sản

phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay là từ dimer primer bằng tính chất đặc trưng

đó chính là nhiệt độ chảy (melting To, Tm), Nhiệt độ chảy của sợi đôi DNA tùy thuộc vào

thành phần GC và chiều dài của nó: Thành phần GC càng cao thì Tm càng cao, sợi đôi càng

dài thì Tm càng cao. Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài hơn nên sẽ có Tm cao hơn là Tm

của sản phẩm khuếch đại từ dimer primer.

1.4.2.4. Phƣơng pháp so sánh định lƣợng tƣơng đối 2ΔCt

Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có

chu kỳ ngưỡng chênh nhau 1 đơn vị tương đương với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lượng

RNA của gene đích. Tỷ lệ lượng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng được tính theo công

thức:

Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T)

.

6

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

2.1.1. Chủng vi sinh vật và các gen biến nạp

Chủng nấm men P. pastoris SMD1168 [ pep4, his4] đã tích hợp pPIC9.

- P. pastoris pPIC9 chủng đối chứng – control.

- P. pastoris pPIC9Amy (chủng Amy).

- P. pastoris pPIC9IL-2 (chủng IL-2).

2.1.2. Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR

Tên mồi Trình tự nucleotide

IPP1-Fw 5’-TACGGTGCCTTCCCTCAG-3’

IPP1-Rv 5’-TCCCTCATCCAACAAAGCCATAAC-3’

MF(ALPHA)1-Fw 5’-CTGCAGTTTTATTCGCAGCATCC-3’

MF(ALPHA)1-Rv1 5’-GCAGCAATGCTGGCAATAGTAG-3’

2.1.3. Hóa chất, enzyme và các thiết bị máy móc

Hóa chất, enzyme:dùng các hóa chất enzyme dùng cho sinh học phân tử.

Máy móc và thiết bị:Máy Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche version 2.0.

2.1.4. Phần mềm

Phần mềm LightCycler 4.0.

2.1.5. Các loại môi trƣờng và dung dịch

a. Môi trường nuôi cấy chọn lọc và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm mem Pichia

pastoris.

b. Dung dịch tách chiết mRNA từ nấm mem

- Dung dịch BY1 gồm có 1M sorbitol, 0.5M EDTA có bổ sung thêm 0.1% mercaptoethanol

và zymolase tới nồng độ cuối cùng là 300 µg/ml.

- Dung dịch RLT theo bộ kit được sử dụng để phá thành tế bào và được bổ sung 1%

mercaptoethanol trước khi sử dụng.

- Dung dịch RW1 được sử dụng để làm sạch mẫu tách chiết.

- Dung dịch RPE được bổ sung ethanol theo tỉ lệ 1 RPE: 3 Ethanol được sử dụng để làm sạch

mẫu tách chiết.

c. Dung dịch xử lý DNA lẫn trong các mẫu RNA tách chiết

- Dung dịch EDTA 25mM.

- Dung dịch DEPC 1%: Pha DEPC trong nước đến nồng độ 1% để loại bỏ toàn bộ RNase

trong nước, sau đó đem khử trùng dung dịch để loại bỏ DEPC.

- Dung dịch RLT và RPE (kit QiaGen).

d. Dung dịch loại bỏ Rnase

7

- Dung dịch DEPC 1% để được dung dịch sử dụng cho quá trình loại bỏ RNase trong môi

trường.

e. Dung dịch sử dụng điện di DNA trên gel agarose

- Dung dịch DEPC 1% để được dung dịch sử dụng cho quá trình loại bỏ RNase trong môi

trường.

f. Dung dịch sử dụng điện di SDS-PAGE

2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp lên men và nuôi cấy các chủng P. pastoris tái tổ hợp

2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P. Pastoris

a. Phương pháp xử lý dụng cụ thí nghiệm để loại bỏ mRNA

- Toàn bộ dụng cụ thí nghiệm như: pipet, đầu tip, ống ly tâm, không có RNase. Pipet được

chúng tôi lau sạch bằng dung dịch DEPC 1%. Đầu tip và ống ly tâm là sản phẩm đã được

chứng nhận không có RNase và DNase.

- Các dụng cụ khác như bể chứa, khay đổ điện di, chai thủy tinh pha dung dịch cũng được

ngâm dung dịch DEPC 1% trong khoảng 2h trước khi khử trùng ướt.

- Nước cất 1 lần, 2 lần và các dung dịch cần thiết khác được bổ sung DEPC trước khi khử

trùng để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn RNase trong dung dịch.

b. Phương pháp tách chiết mRNA tổng số

Dịch tế bào nuôi cấy được kiểm tra OD600 trên máy quang phổ để xác định lượng tế bào

cần thiết cho việc tách chiết. Số lượng tế bào tối đa theo khuyến cáo của QiaGen là khoảng

5.107 tế bào cho một cột tách chiết. Mẫu RNA tổng số của tế bào nấm men được tách chiết

dựa trên kit tách chiết của Qiagen (RNeasy Mini Kit), trong đó tế bào được phá theo phương

pháp dung giải enzyme. Lấy 5x107 tế bào ly tâm ở 5000 vòng/ phút(v/p) trong 5 phút ở 4

0C,

sau đó hòa trong 2 ml đệm Y1 (1M Sorbitol, 0.1 M EDTA, pH 7.4; 0.1% β-ME and 250 unit

lyticase). Hỗn hợp lắc nhẹ trong 30 phút ở 30°C để tạo tế bào trần. mẫu được ly tâm trong 5

phút ở 8000 v/p để thu tế bào trần. Kết tủa thu được hòa trong 350 μl buffer RLT có chứa 1.43

M β-mercapto ethanol rồi khuấy mạnh nhằm dung giải tế bào trần . Hỗn hợp được bổ sung 1

thể tích cồn ethanol 70%, đảo đều rồi đưa lên cột RNeasy có chưa mang loc Cartridges co tac

dụng cố định RNA. Cột RNeasy sau đó được ly tâm ở 13000 vòng trong 15 giây và phần dịch

đi qua màng sau đó sẽ bị loại bỏ. Màng lọc gắn RNA của cột RNeasy được rửa lần 1 với

700μl dung dịch đệm RW1 và rửa lần 2 và lần 3 mỗi lần với 500 μl dung dịch đệm RPE qua

ly tâm 1 phút ở 13000v/p. Sau đó, màng lọc được ly tâm thêm 1 phút nữa ở 13000v/p để loại

bỏ đệm dư thừa. Màng lọc được đưa sang ống eppendorf mới; bổ sung 50 μl nước đã được xử

lý với DEPC và ly tâm trong 1 phút ở 13000v/p để thu mẫu mRNA tổng số . Đê qua trinh thu

mâu hiêu qua , bươc thôi mâu có thể đươc tiên hanh 2 lân.

Mẫu RNA được xử lý với DNaseI (6 units) để loại bỏ DNA tạp. Hỗn hợp phản ứng ủ ở 37°C

trong thời gian 30 phút. Thêm 11 ul dung dịch EDTA 25mM, trộn đều ủ ở 65°C trong 10 phút

8

để dừng phản ứng bất hoạt enzyme DNase I. Cuối cùng, mẫu tinh sạch qua cột lần nữa để loại

bỏ enzyme DNaseI và dung dịch đệm phản ứng.

2.2.3. Kỹ thuật PCR

Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có

chu kỳ ngưỡng chênh nhau 1 đơn vị tương đương với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lượng

RNA của gene đích. Tỷ lệ lượng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng được tính theo công

thức:

2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR

Phản ứng Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh

quang SYBR Green I. Chất này có đặc điểm là khi trong dung dịch có DNA mạch kép thì nó

sẽ gắn vào các sợi kép này và phát quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Ưu điểm của

SYBR Green I là có nhiễu nền thấp và không gắn quá chặt vào sợi kép nên không làm ảnh

hưởng nhiều đến hiệu suất của PCR. Máy LightCycler được lập trình để thu nhận các tín hiệu

huỳnh quang phát ra từ mẫu trong thời gian phản ứng. Lượng sản phẩm PCR càng lớn, tín

hiệu thu được sẽ càng mạnh. Từ những tín hiệu này, máy sẽ số hóa và lưu lại dưới dạng dữ

liệu thô.

2.2.5. Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0

Xác định chỉ số Ct (Crossing Point) của mẫu. Trong một phản ứng Real-time PCR,

chu trình mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt lên trên mức huỳnh quang nền được gọ i

là Ct (Crossing Point) của mẫu đó. Trong đồ thị, Ct được thể hiệu khi đường cong đi lên đột

ngột, là điểm mà sản phẩm PCR bắt đầu hiện diện trong số liệu. Ct của một mẫu phụ thuộc

vào nồng độ DNA ban đầu của mẫu đó. Một mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp sẽ cần nhiều

chu trình hơn và có chỉ số Ct cao, trong khi mẫu có nồng độ cao hơn sẽ cần ít chu trình hơn và

có Ct thấp.

Định lượng tương đối đơn sắc/đơn kênh (Relative Quantification-Mono Color): Phân tích

định lượng tương đối dựa trên cơ sở là nồng độ DNA tại Crossing Point là như nhau với tất cả

các mẫu chứa cùng một loại DNA đích. Mỗi mẫu đòi hỏi một số chu trình khác nhau để đạt

tới Crossing Point, tùy thuộc vào nồng độ DNA ban đầu trong mẫu. Đến cuối thí nghiệm,

nồng độ DNA của các mẫu cũng khác nhau, phụ thuộc vào số chu trình đã được hoàn thành

sau khi mẫu đó đạt tới Crossing Point. Phương pháp định lượng tương đối sử dụng Ct, mức độ

hiệu quả của phản ứng, số chu trình, và một số giá trị khác để xác định nồng độ DNA của các

mẫu đã tăng như thế nào khi kết thúc PCR. Các tính toán sau đó sẽ được sử dụng để so sánh

giữa các mẫu và tính ra tỉ lệ cuối cùng giữa gene đích và gene tham chiếu.

Đường cong nóng chảy (Melting Curves) và đỉnh nóng chảy (Melting Peak): Nhiệt độ nóng

chảy của DNA có thể thay đổi trong một khoảng rộng, phụ thuộc vào trình tự, độ dài, và

thành phần GC của chuỗi. Chỉ cần sai khác một base giữa hai DNA đã có thể dẫn tới sự thay

đổi nhiệt độ nóng chảy. Chính bởi vậy, các chỉ số về nhiện độ nóng chảy có thể được sử dụng

để nhận diện sản phẩm DNA. Để phân tích nhiệt độ nóng chảy, sự phát huỳnh quang của các

mẫu cần được theo dõi trong khi nhiệt độ của máy LightCycler tăng lên chậm và đều. Khi

9

nhiệt độ tăng, mức độ phát huỳnh quang sẽ giảm. Trong trường hợp của chất nhuộm SYBR

Green I, sự giảm này xảy ra do sự tách nhau của các mạch đơn trong DNA mạch kép, dẫn tới

sự giải phóng các phân tử SYBR Green I.

10

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Lên men các chủng P. pastoris tái tổ hợp

Các chủng P. pastoris SMD1168 mang vector pPIC9 được nuôi cấy trên môi trường

MD đặc. Kết quả điện di trên đã khẳng định các gene ngoại lai đã được đưa vào chủng P.

pastoris MSD1168 và biểu hiện thành protein ngoại lai, đây là cơ sở để có thể tiến hành các

thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men

3.2.1. Tách chiết RNA tổng số

Kết quả trên hình cho thấy trên đường chạy có 2 băng điện di sắc nét, tương ứng với hai

băng 28S và 18S của rRNA ribosome. Sự xuất hiện của các băng này chứng tỏ RNA không bị

phân cắt và mẫu đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm.

3.2.2. Tinh sạch mRNA

Khi tách RNA luôn có lẫn một lượng DNA nhất định ở trong mẫu nên phải loại bỏ

lượng DNA này, vì để kết quả phân tích Real-time PCR đòi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ

tinh sạch cao và đặc biệt không bị lẫn DNA [30], nếu mẫu RNA còn lẫn DNA sẽ ảnh hưởng

trực tiếp tới kết quả thì nghiệm do DNA đó sẽ được nhân lên, nên việc loại bỏ DNA là yêu

cầu bắt buộc.

Mẫu được xử lý bằng enzyme DNaseI ở 37°C trong 30 phút để enzyme hoạt động loại bỏ toàn

bộ DNA còn lại trong mẫu. Tiếp đó là bất hoạt enzyme bằng EDTA 25mM và cho mẫu qua

cột để thu sản phẩm RNA có độ tinh sạch cao và không lẫn DNA.

Để kiểm tra và đánh giá được chúng tôi dùng các phương pháp sau:

- PCR với mẫu RNA tổng số với cặp mồi đặc trưng cho gene il-2.

- Điện di so sánh kết quả trước và sau khi loại DNA bằng enzyme DNaseI.

- Thực hiện Real-time PCR với mẫu RNA để kiểm tra chất lượng của RNA có đảm bảo hay

không.

a. Điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại DNA bằng enzyme DNaseI.

Qua ảnh điện di chúng ta thấy mẫu sản phẩm RNA tổng số sau khi xử lý loại DNA và làm

sạch qua cột RNeasy-mini của QiaGene có độ sạch cao hơn

b. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của DNA trong mẫu RNA tách chiết.

Khi mẫu RNA đã được xử lý bằng enzyme DNaseI thì các DNA lẫn sẽ bị phân giải hết,

để khẳng định được điều này và đồng thời thử đánh giá sảm phẩm tách, chúng tôi tiến hành

chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene il-2 để chứng minh mẫu có DNA hay không và chạy

Real-time PCR để kiểm tra mRNA trong mẫu.

11

Kết quả thí nghiệm này sẽ cho chúng ta đánh giá được chất lượng của mẫu RNA về cả

phương diện mẫu có lẫn DNA hay không và mẫu có đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng Real-

time PCR hay không.

Trên đường chạy số 2, 3 là sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA ở các chủng

P. pastoris mang gene il-2. Trên đường chạy 4,5 là sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử

lý loại DNA ở các chủng P. pastoris mang gene mã hóa cho amylase. Các băng điện di không

xuất hiện chứng tỏ không còn DNA trong mẫu RNA tổng số. Trên đường chạy số 6 là chạy

PCR với mẫu RNA tổng số của chủng control. Trên đường chạy điện di số 7 là chạy Real-

time PCR với mẫu con đối chứng âm không mang gene ngoại lai nên không có băng nào.

3.2.3. Đo hàm lƣợng các mẫu RNA tổng số

Mẫu

Lần lên men 1 Lần lên men 2 Lần lên men 3

ng/µL A260/280 ng/µL A260/28

0 ng/µL

A260/28

0

A-0h 471,1

2 2,17 913,80 2,21 391,02 2,20

A-6h 619,3

7 2,24 620,53 2,21 385,47 2,20

A-

12h

324,9

7 2,20 614,46 2,21 326,78 2,22

A-24 585,0

5 2,23 142,87 2,20 507,42 2,23

A-

48h

672,9

8 2,21 449,67 2,18 617,99 2,22

A-

72h

521,0

2 2,19

1130,6

9 2,19 598,58 2,21

A-

96h

742,3

2 2,20 631,76 2,20 466,49 2,19

C-0h 399,8

8 2,18 802,78 2,21 457,88 2,15

C-6h 470,0

5 2,15 730,30 2,19 408,68 2,18

C-

12h

356,6

3 2,19 600,96 2,20 559,64 2,21

C-

24h

566,2

0 2,22 35,59 2,30 470,52 2,15

C-

48h

587,1

8 2,22 672,00 2,18 730,92 2,22

C-

72h

593,2

1 2,19 982,23 2,20 408,52 2,21

C-

96h

706,8

3 2,20 655,07 2,19 355,59 2,20

I-0h 581,6

5 2,23 717,58 2,21 361,24 2,18

I-6h 387,8

1 2,19 697,24 2,22 503,49 2,23

I-12h 320,9 2,20 604,04 2,22 776,55 2,22

12

6

I-24h 569,9

1 2,21 193,63 2,18 181,14 2,07

I-48h 686,0

0 2,23

1002,0

5 2,20 391,02 2,20

I-72h 704,1

5 2,21

1291,5

8 2,19 395,47 2,20

I-96h 916,1

5 2,22 656,81 2,19 336,78 2,22

Từ bảng 3.1 trên có thể thấy nồng độ mRNA trong các mẫu đều khá cao, với mẫu thấp nhất

đạt 320 ng/µL, các mẫu đều có chỉ số A260/A280 lớn hơn 1,8 phần lớn các mẫu cao hơn 2,0

đây là kết quả hợp lý vì sản phẩm chứa phần lớn là RNA. Với kết quả trên cho thấy RNA thu

được đủ điều kiện để sử dụng cho Real-time PCR.

3.3. Tối ƣu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR

3.3.1. Tối ƣu điều kiện Real-time PCR với gene chuẩn IPP1

Tối ưu nồng độ mRNA trong phản ứng Real-time PCR

Tiến hành phản ứng PCR với các nồng độ 50, 100, 250, 500 ng/µL. Kết quả điện di cho thấy,

ở nồng độ mRNA khuôn là 100 ng/µL cho kết quả Real-time PCR tốt nhất.

Kết quả Real-time PCR khi thay đổi nhiệt độ gắn mồi

Chúng tôi tiến hành phản ứng Real-time PCR với nồng độ mRNA 100ng/µL được tiến hành

với chương trình chạy ban đầu có điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 54°C lên 58°C, và nhận thấy

ở nhiệt độ 58°C cho kết quả tốt nhất.Như vậy, đã thành công trong việc thiết lập chương trình

và phản ứng Real-time PCR với gene chuẩn IPP1.

3.3.2. Tối ƣu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1

3.4. Kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1

Trước khi tiến hành thí nghiệm với gene đích cần nghiên cứu là MF(ALPHA)1, chúng tôi đã

thực hiện Real-time PCR nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 trong các

chủng control, Amy và IL-2 tại các thời điểm nghiên cứu 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ.

Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 của các mẫu trong Real-time PCR.

Chu kỳ ngưỡng (Ct)

Mẫu Lên men lần I Lên men lần II

Contro 0h 16.35 16.51

13

l

24 h 18.47 18.67

48 h 20.21 19.79

Amy

0h 15.96 16.55

24 h 18.64 18.51

48 h 20.43 19.65

IL-2

0 h 14.91 16.51

24 h 18.79 18.91

48 h 19.26 20.09

3.5. Real-time PCR về biểu hiện của gene MF(ALPHA)1

3.5.1. Kết quả Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1

Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính mức độ biểu hiện của gene MF(ALPHA)1 với mức

độ biểu hiện của các gene ngoại lai (il-2 và amylase).

Cuối cùng chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm của phẩn ứng Real-time PCR bằng cách

điện di trên gel agarose 1%. Kết quả ảnh điện di cho thấy các gene MF(ALPHA)1 được nhân

lên ở các chủng Amy và Il-2 và. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích đỉnh nóng chảy

bên trên.

3.5.2. Phân tích so sánh mức độ biểu hiện gene MF(ALPHA)1

Thời

điểm thu

mẫu

Giá trị Ct trung bình

Control Amy IL-2

0h 25,60 ±

1,41 20,70 ± 0,26

20,02 ±

0,23

6h 26,77 ±

0,90 14,75 ± 0,48

16,26 ±

1,19

12h 26,56 ±

0,98 15,22 ± 0,47

15,61 ±

0,77

24h 26,40 ±

0,59 15,96 ± 0,78

16,84 ±

0,83

48h 26,52 ±

0,89 16,45 ± 0,31

17,01 ±

0,72

72h 26,51 ±

0,90 16,65 ± 0,35

17,19 ±

0,53

96h 26,72 ±

1,00 17,16 ± 0,35

17,64 ±

0,65

3.5.2.1. So sánh mức độ biểu hiện của gene theo thời gian lên men trong từng chủng.

Kính thước khác nhau của hai gene, do vai trò khác nhau của hai gene đối với bản thân tế bào

P. pastoris khi biểu hiện…

So sánh Control

0h 6h 12h 24h 48h 72h

6h 0,30 - - - - -

12h 0,34 1,16 - - - -

24h 0,38 1,29 1,11 - - -

48h 0,35 1,19 1,03 0,92 - -

14

72h 0,36 1,20 1,04 0,93 1,01 -

96h 0,31 1,04 0,90 0,80 0,87 0,86

Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P.

pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình.

Thời gian

thu mẫu

Amy

0h 6h 12h 24h 48h 72h

6h 61,82 - - - - -

12h 44,74 0,72 - - - -

24h 26,78 0,43 0,60 - - -

48h 19,03 0,31 0,43 0,71 - -

72h 16,60 0,27 0,37 0,62 0,87 -

96h 11,67 0,19 0,26 0,44 0,61 1,42

Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P.

pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình.

Thời gian

thu mẫu

IL-2

0h 6h 12h 24h 48h 72h

6h 13,55 - - - - -

12h 21,26 1,5

7 - - - -

24h 9,04 0,6

7 0,43 - - -

48h 8,07 0,6

0 0,38 0,89 - -

72h 7,11 0,5

2 0,33 0,79 0,88 -

96h 5,21 0,3

8 0,24 0,58 0,64 0,73

3.5.2.2. So sánh mức độ biểu hiện của gen MF(ALPHA)1 theo thông số về chủng.

3.6. So sánh kết quả Real-time PCR và Microarray

Phân tích Real-time PCR đều cho ra các kết quả khá tương đồng nhau về xu hướng biểu

hiện của đoạn gene MF(ALPHA)1 ở các chủng nghiên cứu. Cụ thể là biểu hiện của chủng

control tại các thời điểm rất thấp so với chủng Amy và IL-2.

15

KẾT LUẬN

Đã tách chiết thành công các mẫu RNA tổng số phục vụ cho tiến hành thí nghiệm Real-

time PCR. Các mẫu đều đạt chất lượng về nồng độ và độ tinh sạch cao, đảm bảo yêu cầu.

Đã tối ưu hóa thành công phản ứng và chương trình chạy Real-time PCR với 2 gene

chuẩn là IPP1 và gene đích MF(ALPHA)1.

Thiết lập thành công phản ứng Real-time PCR sử dụng SYBR GREEN I, trên hệ máy

LightCycler 2.0 và phân tích trên phần mềm LightCycler 4.0 của Roche để định lượng tương

đối sự biểu hiện phiên mã của tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 trong các chủng tái tổ hợp sinh

Amylase và Interleukin-2.

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu mức độ biểu hiện ở cấp độ protein của các chủng P. Pastoris ctái tổ hợp

sinh Amylase và Interleukin-2 ở các thời điểm khác nhau trong nuôi cấy bawnfd kĩ thuật

ELISA.

References

Tài liệu tham khảo tiếng Việt:

1. Nguyên Văn Hùng (2010), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng

thường gặp, NXB Y học.

2. Võ Thị Thương Lan (2009), Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo dục, Hà

Nội.

Tài liệu tham khảo tiếng Anh:

3. Dorak MT (2006), Real-time PCR, Taylor & Francis, New York.

4. Higgins DR, Cregg JM (1998), Pichia protocols, Humana Press, Totowa, N.J.

5. Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, Kubista M (2003), "A new minor groove

binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR".Nucleic Acids Res, 31

(8), p. 21-45.

6. Bustin SA (2000), "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse

transcription polymerase chain reaction assays".J Mol Endocrinol, 25 (2), p. 169-193.

7. Bustin SA (2002), "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription

PCR (RT-PCR): trends and problems".J Mol Endocrinol, 29 (1), p. 23-39.

8. Caplan S, Kurjan J (1991), "Role of alpha-factor and the MF alpha 1 alpha-factor

precursor in mating in yeast".Genetics, 127 (2), p. 299-307.

9. Catala C, Rose JK, York WS, Albersheim P, Darvill AG, Bennett AB (2001),

"Characterization of a tomato xyloglucan endotransglycosylase gene that is down-

regulated by auxin in etiolated hypocotyls".Plant Physiol, 127 (3), p. 1180-1192.

16

10. Cereghino JL, Cregg JM (2000), "Heterologous protein expression in the

methylotrophic yeast Pichia pastoris".FEMS Microbiol Rev, 24 (1), p. 45-66.

11. Cha HJ, Dalal NN, Bentley WE (2005), "Secretion of human interleukin-2 fused with

green fluorescent protein in recombinant Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol,

126 (1), p. 1-11.

12. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000), "Recombinant protein expression

in Pichia pastoris".Mol Biotechnol, 16 (1), p. 23-52.

13. Daly R, Hearn MT (2005), "Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a

useful experimental tool in protein engineering and production".J Mol Recognit, 18

(2), p. 119-138.

14. Du J, Yang H, Zhang D, Wang J, Guo H, Peng B, Guo Y, Ding J (2010), "Structural

basis for the blockage of IL-2 signaling by therapeutic antibody basiliximab".J

Immunol, 184 (3), p. 1361-1368.

15. Duong CT, Le TTH, Nguyen TN, Nguyen HT, Le TLA, Truong NH (2011),

"Microarray-Based Transcriptome Analysis of Recombinant Pichia Pastoris Strains

Overexpressing Alpha-Amylase and Interleukin-2".International Journal of

Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), 2 (1), p. 6.

16. Fuller RS, Sterne RE, Thorner J (1988), "Enzymes required for yeast prohormone

processing".Annu Rev Physiol, 50 p. 345-362.

17. Ginzinger DG (2002), "Gene quantification using real-time quantitative PCR: an

emerging technology hits the mainstream".Exp Hematol, 30 (6), p. 503-512.

18. Han MJ, Jeong KJ, Yoo JS, Lee SY (2003), "Engineering Escherichia coli for

increased productivity of serine-rich proteins based on proteome profiling".Appl

Environ Microbiol, 69 (10), p. 5772-5781.

19. Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO (2006), "Process technology for

production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris".Biotechnol

Prog, 22 (6), p. 1465-1473.

20. Jelicks LA, Naider FR, Shenbagamurthi P, Becker JM, Broido MS (1988), "A type II

beta-turn in a flexible peptide: proton assignment and conformational analysis of the

alpha-factor from Saccharomyces cerevisiae in solution".Biopolymers, 27 (3), p. 431-

449.

21. Klein D (2002), "Quantification using real-time PCR technology: applications and

limitations".Trends Mol Med, 8 (6), p. 257-260.

22. Kurjan J (1985), "Alpha-factor structural gene mutations in Saccharomyces cerevisiae:

effects on alpha-factor production and mating".Mol Cell Biol, 5 (4), p. 787-796.

23. Kurjan J, Lipke PN (1986), "Agglutination and mating activity of the MF alpha 2-

encoded alpha-factor analog in Saccharomyces cerevisiae".J Bacteriol, 168 (3), p.

1472-1475.

17

24. Li P, Anumanthan A, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Duzgunes N,

Renugopalakrishnan V (2007), "Expression of recombinant proteins in Pichia

pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 142 (2), p. 105-124.

25. Liss B, Roeper J (2004), "Correlating function and gene expression of individual basal

ganglia neurons".Trends Neurosci, 27 (8), p. 475-481.

26. Manfredi JP, Klein C, Herrero JJ, Byrd DR, Trueheart J, Wiesler WT, Fowlkes DM,

Broach JR (1996), "Yeast alpha mating factor structure-activity relationship derived

from genetically selected peptide agonists and antagonists of Ste2p".Mol Cell Biol, 16

(9), p. 4700-4709.

27. Michaelis S, Herskowitz I (1988), "The a-factor pheromone of Saccharomyces

cerevisiae is essential for mating".Mol Cell Biol, 8 (3), p. 1309-1318.

28. Murasugi A, Tohma-Aiba Y (2003), "Production of native recombinant human

midkine in the yeast, Pichia pastoris".Protein Expr Purif, 27 (2), p. 244-252.

29. Nevoigt E, Kohnke J, Fischer CR, Alper H, Stahl U, Stephanopoulos G (2006),

"Engineering of promoter replacement cassettes for fine-tuning of gene expression in

Saccharomyces cerevisiae".Appl Environ Microbiol, 72 (8), p. 5266-5273.

30. Peters IR, Helps CR, Hall EJ, Day MJ (2004), "Real-time RT-PCR: considerations for

efficient and sensitive assay design".J Immunol Methods, 286 (1-2), p. 203-217.

31. Pfaffl MW (2001), "A new mathematical model for relative quantification in real-time

RT-PCR".Nucleic Acids Res, 29 (9), p. 113-45.

32. Radonic A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A (2004), "Guideline

to reference gene selection for quantitative real-time PCR".Biochem Biophys Res

Commun, 313 (4), p. 856-862.

33. Svanvik N, Stahlberg A, Sehlstedt U, Sjoback R, Kubista M (2000), "Detection of

PCR products in real time using light-up probes".Anal Biochem, 287 (1), p. 179-182.

34. Trimble RB, Atkinson PH, Tschopp JF, Townsend RR, Maley F (1991), "Structure of

oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic

yeast Pichia pastoris".J Biol Chem, 266 (34), p. 22807-22817.

35. Walker NJ (2002), "Tech.Sight. A technique whose time has come".Science, 296

(5567), p. 557-559.

36. Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP (1997), "Continuous

fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification".Biotechniques, 22 (1), p.

130-131, 134-138.

37. Wright A, Morrison SL (1997), "Effect of glycosylation on antibody function:

implications for genetic engineering".Trends Biotechnol, 15 (1), p. 26-32.

38. Zipper H, Brunner H, Bernhagen J, Vitzthum F (2004), "Investigations on DNA

intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and

methodological implications".Nucleic Acids Res, 32 (12), p. 133-103.

18

39. Kurjan J, Herskowitz I (1982), Structure of a yeast pheromone gene (MF alpha): a

putative alpha-factor precursor contains four tandem copies of mature alpha-factor.

41. http://www.eolss.net/Sample-Chapters/C17/E6-58-04-09.pdf

42. http://www.invitrogen.com

43. http://www.sciencemag.org

44. http://www.yeastgenome.org