daniella mota silva
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DANIELLA MOTA SILVA
CULTIVO IN VITRO E CITOGENÉTICA DE Cyrtopodium
saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação de Genética e Melhoramento de
Plantas, da Universidade Federal de Goiás,
como requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Genética e Melhoramento de
Plantas, área de concentração: Conservação e
melhoramento de espécies do Cerrado.
Orientador:
Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov
Coorientadora:
Profa. Dra. Daniela Melo Silva
Goiânia, GO - Brasil
2012
2
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as
grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível”.
(Charles Chaplin)
Ao meu pai, João Batista da Silva (in memorian)
pelo exemplo de amor incondicional, honestidade e determinação,
a minha mãe, Maria José Mota Silva pelo seu amor, simplicidade,
meu ancoradouro seguro em todos os momentos da vida.
Aos meus irmãos Diego e Virginia pelo
apoio e incentivo de sempre.
DEDICO
Ao meu amor Luciano presente em todos os
3
momentos de minha vida, e parte fundamental desse trabalho.
OFEREÇO
Amo todos vocês!
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, primeiramente por proporcionar em minha vida grandes realizações.
À Universidade Federal de Goiás pela oportunidade concedida para a realização
desse curso de mestrado e a CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Programa de Pós-Graduação de Genética e Melhoramento de Plantas e
Programa de Pós-Graduação em Agronomia, a Coordenação, professores, funcionários e
alunos (colegas de aula), sobretudo pelas pessoas que cruzaram meu caminho, seja por
curtos ou longos momentos, porém com a certeza das lições compartilhadas.
Ao Professor Orientador Dr. Sérgio Tadeu Sibov meus sinceros agradecimentos
pela enorme paciência, dedicação, amizade e, sobretudo confiança, apoio e credibilidade
que me deu em todo curso de mestrado, obrigada.
Ao Luciano, meu querido amor, que sempre esteve nos bons e maus momentos, pelo
companheirismo, apoio, incentivo, paciência, pelas sugestões que enriqueceram este
trabalho, pela ajuda na elaboração da estatística, e principalmente por todo seu amor.
Ao Laboratório de Anatomia Vegetal e professoras Maria Helena, Maria Tereza e
Letícia pela disposição, atenção e uso dos equipamentos do laboratório.
À professora Doutora Daniela Melo pelo auxílio, sugestões, apoio e contribuição
com reagentes para a citogenética e principalmente pela amizade e simpatia de sempre.
Ao Professor Doutor Aparecido Divino da Cruz (Peixoto) por disponibilizar as
instalações do Laboratório Replicon (PUC-Goiás) para tentativas com a citogenética.
Ao Professor Doutor Cláudio Carlos pelas sugestões e auxílio sobre a citogenética.
Ao Alex do Laboratório Replicon (PUC-Goiás) pelo auxílio e dúvidas sobre o
experimento de citogenética.
Às professoras e amigas Maurízia e Iraídes pelo apoio e incentivo na área de
cultura de tecidos, pelas divertidas viagens a congressos e principalmente pela amizade.
À professora Doutora Leila Garcês pelo auxílio e sugestões e uso de equipamentos
do laboratório de Microorganismos.
Às seguranças Selma e Vaneide, pela amizade e boas conversas na frente do ICB.
À todos do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, os novos e os antigos,
Talita, Fernanda, Marina, Diego, Lívia, Paulo, Marcos I, Marcos II, as minhas ex-
estagiárias Juliana e Barbara, Catherine, Nicholas, Diego II, Gabriel, Gessika, Lílian,
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Daniella pelo auxílio,ótimo convívio, pela amizade e alegria em muitos momentos de
descontração e divertidas horas de confraternização, que são essenciais nesse trajeto.
À todos do Laboratório de Microorganismos em especial, Kellen, Jacque, Carlos,
Alini, Acássio pelo apoio e auxílio em muitos momentos, pela amizade e brincadeiras pelo
corredor do ICB e pelas divertidas horas de confraternização.
A minha querida Mãe pela paciência, compreensão, apoio, dedicação, amor
incondicional e por fornecer todas as condições para que eu me dedicasse ao mestrado, e
por acreditar em mim.
Ao meu querido irmão Diego pela atenção, auxílio na montagem de figuras e
tabelas, por todo seu apoio, generosidade e fraternidade.
A todos meus amigos que, mesmo sem muito compreender o que acontecia comigo,
me apoiaram neste período, e compreenderam a minha ausência em muitos momentos.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse
trabalho, mesmo que não foram citados, meu muito obrigado.
6
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... 8
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 9
LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS ................................................................................... 111
RESUMO ............................................................................................................................. 13
ABSTRACT ......................................................................................................................... 14
1 INTRODUÇÃO. .............................................................................................. 17
2.1 FAMÍLIA ORCHIDACEAE ............................................................................. 17
2.1.2 Importância econômica e mercado mundial de orquídeas .......................... 20
2.2 O GÊNERO Cyrtopodium R. Br. ...................................................................... 22
2.3 A ESPÉCIE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. ......................................... 23
2.4 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS ................................................ 25
2.4.1 Cultura de tecidos vegetais ............................................................................. 25
2.4.2 Reguladores de Crescimento .......................................................................... 27
2.4.2.1 Auxinas .................................................................................................................... 27
2.4.2.2 Citocininas ............................................................................................................... 29
2.4.3 Germinação assimbiótica ................................................................................ 30
2.4.3.1 Teste de viabilidade de sementes............................................................................. 30
2.4.3.2 Germinação assimbiótica de orquídeas ................................................................... 31
2.5 CITOGENÉTICA DE ORQUÍDEAS ............................................................... 33
2.7 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 35
3 MICROPROPAGAÇÃO DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.
(ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)
RESUMO ............................................................................................................................. 43
ABSTRACT ......................................................................................................................... 44
3.1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 44
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 46
3.2.1 Teste de viabilidade das sementes .................................................................. 46
3.2.2 Germinação assimbiótica in vitro ................................................................... 47
3.2.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum ........... 48
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 50
3.3.1 Teste de viabilidade das sementes .................................................................. 50
7
3.3.2 Germinação assimbiótica in vitro ................................................................... 51
3.3.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum ........... 55
3.3.3.1 Altura ................................................................................................................. 55
3.3.3.2 Número de brotos .............................................................................................. 57
3.3.3.3 Número de folhas .............................................................................................. 59
3.3.3.4 Número de raízes e comprimento da maior raiz ................................................ 60
3.3.3.5 Formação de calos ............................................................................................. 62
3.4 CONCLUSÕES ................................................................................................. 63
3.5 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 64
4 CITOGENÉTICA DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.
(ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)
RESUMO ............................................................................................................................. 70
ABSTRACT ......................................................................................................................... 70
4.1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. ...71
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 72
4.2.1 Material Vegetal .............................................................................................. 72
4.2.2 Germinação assimbiótica in vitro ................................................................... 73
4.2.3 Testes para análises cromossômicas ............................................................ 733
4.2.3.1 Protocolo de digestão enzimática com celulase/pectinase ................................ 74
4.2.3.2 Protocolo usando corante reativo de Schiff seguido de esmagamento .............. 74
4.2.3.3 Protocolo usando corante orceína acética seguido de esmagamento ................ 74
4.2.3.4 Protocolo usando raízes tratadas com regulador de crescimento ...................... 75
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 76
4.4 CONCLUSÕES ................................................................................................. 80
4.5 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 81
5 CONCLUSÕES GERAIS ............................................................................... 83
6 ANEXO ............................................................................................................. 84
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Escala de estádios de diferenciação de plântulas de Cyrtopodium
saintlegerianum germinadas in vitro (Stewart et a., 2003) .......................
48
Tabela 3.2
Concentrações dos reguladores de crescimento ANA (Ácido
naftalenoacético) e BAP (6-Benzilaminopurina) nos tratamentos utilizando o
meio KC modificado (Arditti, 1977) para a diferenciação dos
protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum.......................................... 49
Tabela 3.3
Efeito das concentrações de ANA e BAP na altura de Cyrtopodium
santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90
dias de cultivo............................................................................................. 56
Tabela 3.4
Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de brotações de
Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC
(modificado) aos 90 dias de cultivo........................................................... 57
Tabela 3.5
Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de folhas
Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC
(modificado) aos 90 dias de cultivo...........................................................
59
Tabela 3.6
Efeito das concentrações de ANA e BAP no número de raízes de
Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC
(modificado) aos 90 dias de cultivo........................................................... 61
Tabela 3.7
Efeito das concentrações de ANA e BAP na formação de calos de
Cyrtopodium saintlegerianum cultivadas in vitro em meio KC
(modificado) aos 90 dias de cultivo........................................................... 63
Tabela 3.8
Lista de espécies do gênero Cyrtopodium com os respectivos números
cromossômicos (2n) .................................................................................. 79
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Plantas de Cyrtopodium saintlegerianum fixadas em troncos de
palmeira (macaúba) (A). Folhas e raízes pneumatóforas e pseudobulbos
em período chuvoso (B).............................................................................
24
Figura 2.2 Orquídea Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. epífita, apresentando
inflorescência paniculada e ramificada (A). Flor (B) e cápsula (C).
Barras = 1 cm.............................................................................................
25
Figura 3.1 Protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum nas fases de crescimento
3 a 5 inoculados em meio de multiplicação com diferentes
concentrações de ácido naftalenacético (ANA) e 6-benzilaminopurina
(BAP) (Ae B) ............................................................................................
49
Figura 3.2 Sementes de Cyrtopodium saintlegerianum submetidas ao teste de
tetrazólio (TTC). A - sementes no tratamento T1 (12 h imersas no TTC);
B - sementes no tratamento T2 (24 h imersas no TTC) ............................
50
Figura 3.3 Porcentagem de germinação de sementes de Cyrtopodium
saintlegerianum 35 dias após a inoculação em diferentes tratamentos.
MS: meio Murashige & Skoog (1962) completo; MS ½: meio
Murashige & Skoog (1962) com redução da metade da concentração
dos macronutrientes; KC: meio Knudson (1946) e KC (modif.): meio
Knudson modificado (Arditti et al., 1977) ................................................
52
Figura 3.4 Efeito comparativo de meios de cultura e estádio de desenvolvimento na
germinação assimbiótica de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum
após 15 semanas. Meio MS (T1), meio MS ½ (T2), meio KC (T3), meio
KC modificado (T4). ( Média Média ±0,95 Intervalo de confiança).
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de
Tukey no nível de 5% ................................................................................
54
Figura 3.5 Estádios de desenvolvimento da germinação assimbiótica de
Cyrtopodium santlegerianum após 15 semanas de cultivo. Sementes
com embrião intumescido no meio MS ½ macronutrientes estádio 1 (A);
Estádio 2 ruptura do tegumento sem rizóides no meio MS (B); Estádio 2
e 3, tegumento rompido e aparecimento de rizóides (C); Estádio 3,
protomeristema com presença de muitos rizóides no meio KC (D);
Estádio 4, protocormos emitindo a primeira folha meio KC modificado
(E); Estagio 5, desenvolvimento e alongamento da primeira folha meio
KC modificado (F) ....................................................................................
55
Figura 3.6 Metáfases mitóticas pouco coradas e de difícil visualização utilizando o
protocolo 2 para pontas de raízes de Cyrtopodium saintlegerianum
obtidas de plântulas germinadas e desenvolvidas in vitro. Setas indicam
células em metáfases. Barra = 36 μm ........................................................
77
10
Figura 3.7 Metáfases mitóticas e núcleos interfásicos visualizados após utilização
do protocolo 4 para pontas de raízes de Cyrtopodium saintlegerianum
obtidas de plântulas germinadas e desenvolvidas in vitro. Tratamento
(T1) com regulador de crescimento ANA (A e B); Tratamento (T2) sem
regulador de crescimento (C e D). Barra = 50 μm ....................................
78
11
LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS
º ’ – Coordenadas geográficas, em graus e minutos, respectivamente
% – Porcentagem
± – Amplitude de variação
µm - Micrômetro
µmol – Micromol
µg – Microgramas
°C – Grau Celsius
A – altura
ABCSEM - Associação Brasileira do Comércio de Sementes e Mudas
ANA – Ácido naftaleno acético
BAP – 6-benzilaminopurina
C - calos
CR - comprimento da maior raiz
cm – Centímetro
EUA – Estados Unidos da América
g – Grama
g kg-1 - gramas por kilo
g.L-1 – Grama por litro
h – Hora
ha – Hectare
is – Índice de seleção
IBAMA – Instituto Brasileiro de Meio Ambiente
ICMBIO - Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
KC – Meio Knudson C
KH2PO4 – Fosfato de potássio monobásico
km2 – quilômetro quadrado
L – Litro
m – Metro
m2 – Metro quadrado
mg.L-1 – Miligrama por litro
mL – Mililitro
12
mm – Milímetro
MS – Meio Murashige & Skoog (1962)
MS½ - Meio Murashige & Skoog (1962) com redução da metade da concentração dos
macronutrientes
mS/cm – metro siemens por centímetro
Na2HPO4 – Fosfato de sódio dibásico
NB – Número de brotos
NF - Número de folhas
NR - Número de raízes
NPK – Nitrogênio/ Fósforo e Potássio
pH – Potencial hidrogeniônico
PVC – Plástico feito de policloreto de polivinila
® - Marca registrada
SEBRAE – Serviço Brasileiro de Apoio as Micro e Pequenas Empresas
sp. – Espécie
T – Tratamentos
TDZ - Thidiazuron
Tz ou TTC - Cloreto de 2, 3, 5 trifenil tetrazólio
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RESUMO
MOTA-SILVA, D. Micropropagação e citogenética de Cyrtopodium saintlegerianum
Rchb. f. (Orchidaceae: Cyrtopodiinae) 2012. 95 f. Dissertação (Mestrado em Genética e
Melhoramento de Plantas) - Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia, 2012.1 2
Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f é espécie epífita da região Centro-Oeste,
distribuída no Planalto Central brasileiro, e tem ampla distribuição geográfica no Brasil. É
encontrada em de troncos de palmeiras, formando grandes touceiras. Possui características
para ornamentação, pela beleza de sua inflorescência, contudo não são encontrados na
literatura estudos sobre sua conservação ou propagação. Assim, esse trabalho teve como
objetivo o estabelecimento de protocolos para germinação assimbiótica, efeitos de
fitohormônios, aclimatização e a caracterização cromossômica da espécie. Em 2010, para o
estabelecimento de protocolos para a micropropagação, cápsulas foram coletadas em uma
área de pastagem no município de Mossâmedes, GO, foram previamente desifestadas em
seguida parte das sementes foram separadas e testadas em corante tetrazólio a 1%. Para o
cultivo assimbiótico, foram testados diferentes meios de cultura e diferentes concentrações
e combinações de BAP/ANA em 16 tratamentos. Foram testados substratos combinados e
adubação com fertilizante químico e orgânico para a aclimatização das plântulas. Para o
cariótipo da espécie, o material vegetal foi proveniente de plantas cultivadas in vitro em
meio de cultura. Foram testados quatro protocolos, com diferenças quanto a solução
enzimática para o amolecimento das raízes, os corantes, concentração do anti-mitótico e
solução de hidrólise, e o uso de regulador de crescimento para indução de raízes in vitro.
Todos os protocolos tiveram em comum raízes pré-tratadas com anti-mitótico 8-
hidroxiquinoleína (0,002M) em geladeira durante 24 horas. Em seguida nos protocolos as
raízes foram fixadas em Carnoy 3:1 por 18 horas o primeiro e o segundo protocolo e o
terceiro e o quarto por 24 horas em temperatura ambiente. Depois estocados a -20ºC no
próprio fixador, para posterior análise (apenas o quarto protocolo). As raízes dos
protocolos foram coradas com diferentes corantes: hematoxilina, reativo de Schiff, orceína
acética e Giemsa respectivamente. A germinação foi satisfatória em todos os meios de
cultura. Para o meio suplementado com auxina/citocinina combinadas as melhores
concentrações para a variável altura foi 0,2 mg L-1 de ANA sem adição de BAP e o
controle sem adição de reguladores. Os melhores meios que induziram grande número de
brotações foram 4 mg L-1 de BAP e 4 mg L-1 de BAP / 0,2 mg L-1 de ANA. O número de
folhas foi melhor avaliado nas concentrações de BAP sem ANA nas concentrações 1,0; 2,0
e 4,0 mg L-1. Os tratamentos com maior número de raízes foram o controle sem adição de
reguladores de crescimento, e nas dosagens de 0,2, 0,5, 1,0 mg L-1 de ANA sem
adição de BAP, assim como o comprimento da maior raiz foi favorecido pelos
mesmos tratamentos. O maior número de calos se deu no tratamento com
concentrações de 1,0 BAP mg L-1 sem adição de ANA. Para a citogenética de C.
saintlegerianum o melhor protocolo avaliado foi com regulador no qual foi obtido
metáfases, no entanto os cromossomos se encontravam condensados, e o numero de
cromossomos encontrado foi de 2n=48.
Palavras chave: orquídeas, cultura de tecidos, cariótipo.
1 Orientador: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov. EA-UFG. 2 Co-Orientadora: Profa. Dra. Daniela Melo Silva. ICB-UFG
14
ABSTRACT
MOTA-SILVA, D. Micropropagation and cytogenetic of Cyrtopodium saintlegerianum
Rchb. f. (ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae) 2012 95 f. Dissertation (Master in Genetic
and Plant Bredding) – College of Agronomy, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,
2012.1 2
Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f is an epiphytic species typical of the
Midwest, especially in distributed Brazilian Central Plateau, and has a wide geographical
distribution in Brazil. It is usually found in the trunks of palm trees, forming large clumps.
It has good features for ornamentation, for the beauty and size of its inflorescence,
however, are not found in the literature about its conservation, methods for its spread or
that could be used in floriculture and landscaping. Thus, this study aimed to establishing
protocols for germination asymbiotic effects of phytohormones and acclimatization and
characterization of chromosomal species. In 2010, the establishment of micropropagation
protocols, capsules were collected in a pasture area in the municipality of Mossâmedes,
GO, then the part previously sterilized seeds were separated and tested in a 1% tetrazolium
dye.. For cultivation was tested asymbiotic different culture media and then tested after
different concentrations and combinations in treatments BAP 16 / ANA, to finally evaluate
the acclimatization substrates combined and fertilized with chemical fertilizers and
organic. For the karyotype of the species, the plant material is derived from plants grown
in vitro in culture medium. We tested four protocols, with differences in enzyme solution
for softening the roots, dyes, anti-mitotic concentration of the solution and hydrolysis, and
the use of growth regulators for root induction in vitro. All protocols were in common
roots pretreated with anti-mitotic 8-hydroxyquinoline (0.002 M) in refrigerator for 24
hours. Then protocols roots were fixed in Carnoy 3:1 for 18 hours the first and second and
third and fourth protocol for 24 hours at room temperature. After stored at -20 º C in the
same fixative for further analysis (only the fourth protocol). The roots of the protocols
were stained with different dyes: hematoxylin, Schiff, acetic orcein and Giemsa
respectively.The results of germination was satisfactory in all culture media. For medium
supplemented with auxin / cytokinin combined the best concentrations for variable height
were 0.2 mg L-1 NAA and BAP without adding control without addition of regulators. The
best means to induce large numbers of shoots were 4 mg L-1 BAP and 4 mg L-1 BAP / 0.2
mg L-1 NAA. The number of leaves was rated best in the concentrations of BAP without
NAA at concentrations of 1.0, 2.0 and 4.0 mg L-1. The treatments with the highest number
of roots were control without added growth regulators at doses of 0.2, 0.5, 1.0 mg L-1 NAA
without addition of BAP, as well as the length of roots was favored by the same treatments.
The largest number occurred in callus treatment with concentrations of 1.0 mg L-1 BAP
without adding ANA. For cytogenetics C. saintlegerianum the best protocol was evaluated
with the regulator which was obtained metaphases, however chromosomes were
condensed, and the number of chromosomes was found to be 2n = 48.
Key words: orchids, tissue culture, karyotype.
1 Advisor: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov. EA-UFG. 2 Co-Advisor: Profa. Dra. Daniela Melo Silva. ICB-UFG.
1 INTRODUÇÃO
A família Orchidaceae constitui um dos maiores e mais diversos agrupamentos
de angiospermas, compreende 40% do grupo das monocotiledôneas (Dressler, 1993).
Apresenta cerca de 25.000 espécies (Croix, 2008) e mais de 100.000 híbridos em todo o
mundo o que possibilita a ocorrência de grande variabilidade de cores, formas e tamanhos
de folhas e flores (Pasqual et al., 2005). Segundo Barros (2012) são aceitos no Brasil 2432
espécies sendo 1622 endêmicas no país, distribuídas em todos os domínios fitogeográficos.
São descritas para o Cerrado 682 espécies de orquídeas (Barros et al., 2012).
Dentre as espécies encontradas nesse Bioma, o gênero Cyrtopodium Rchb. f compreende
50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da Florida até o norte da Argentina
(Romero-González et al., 2008). Segundo Batista & Bianchetti (2005) o centro de
diversidade do gênero é o Cerrado brasileiro, onde ocorrem pelo menos 29 espécies.
Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f é uma espécie epífita típica da região
Centro-Oeste, especialmente distribuída no Planalto Central brasileiro, e tem ampla
distribuição geográfica no Brasil. Geralmente é encontrada na metade superior de troncos
de palmeiras do gênero Acrocomia (macaúba) formando grandes touceiras de raízes
pneumatóforas que abrigam uma grande diversidade de organismos (Menezes, 2000) onde
oferecem boas condições para a germinação e desenvolvimento dessa espécie e de outras
orquídeas epífitas.
O bioma Cerrado encontra-se distribuído em 24% do território brasileiro. É
considerado um dos hostspots para conservação da biodiversidade mundial, pois possui
alto nível de endemismo (Myers et al., 2000). No entanto, a expansão das atividades
agropastoris modificou cerca de dois milhões de km2 originais do bioma que foram
transformados em pastagens e plantações de culturas anuais (Klink & Machado, 2005).
Assim, nos últimos 50 anos, organismos e ecossistemas tem se tornado cada vez mais
vulneráveis à extinção, e as orquídeas correspondem a 10% de toda flora predisposta a esse
risco (Koopowitz et al., 2003).
16
Técnicas de cultura de tecidos vegetais são empregadas principalmente na
produção de plantas em larga escala, as quais permitem multiplicar genótipos superiores
isentos de vírus e outros patógenos em curto espaço de tempo (Souza et al., 2006). Tem
sido amplamente aplicadas na propagação de orquídeas, garantido a preservação de muitas
espécies e atendendo a demanda do mercado por esta família de plantas consideradas as
mais apreciadas pelo consumidor brasileiro (SEBRAE, 2010).
Visando a preservação da espécie e de suas características com alto potencial
ornamental, além da inexistência de publicações sobre a espécie, esse trabalho teve como
objetivo o estabelecimento de protocolos para germinação assimbiótica, efeitos de
fitohormônios e a caracterização cromossômica da espécie C. saintlegerianum.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 FAMÍLIA ORCHIDACEAE
A família Orchidaceae, pertence a Ordem Asparagales, classe
Liliopsida e à Divisão Magnoliophyta (Dressler, 1993). Constituem um dos
maiores e mais diversos agrupamentos das angiospermas, com 20.000 a 30.000
espécies distribuídas por todo o mundo (Dressler, 2005; Mendonça et al., 2008).
Apresenta distribuição cosmopolita, mas sua maior concentração ocorre nas
regiões tropicais (Hall, 2009).
A família Orchidaceae era dividida em cinco subfamílias:
Apostasioideae, Cypripedioideae, Epidendroideae, Orchidoideae e Spiranthoideae.
Porém, segundo Pridgeon et al. (2006) as mais recentes análises filogenéticas
demonstraram que Spiranthoideae está inserida dentro de Orchidoideae e
apontaram Vanilloideae como uma subfamília separada de Epidendroideae. Mais
de 3.500 espécies são encontradas no Brasil sendo considerado o terceiro país do
mundo em diversidade, perdendo apenas para Equador e Colômbia (Souza &
Lorenzi, 2008).
A família Orchidaceae é notável pela sua diversificada morfologia
floral e vegetativa sendo essa última mais variável que a primeira e isso pouco
surpreende quando se considera a variedade de habitats que as espécies dessa
família podem habitar. As orquídeas adaptaram-se aos mais variados ambientes.
Podem ser terrestres crescendo em savanas, campos, em ambientes turfosos de
mata fechada e em áreas úmidas como brejos. Podem ser epífitas sobre árvores ou
arbustos abrigadas ou não da luz e rupícolas com a difícil tarefa de se manterem
vivas nos afloramentos rochosos, apesar das constantes oscilações de temperatura
desses ambientes (Arditti, 1992).
18
São monocotiledôneas e perenes, em grande parte. Ao contrário da
maioria das plantas, as quais produzem endosperma e são capazes de alimentar o
embrião em seus primeiros estágios de vida, as orquídeas utilizam-se de processos
simbióticos, ou seja, fungos simbiontes (tambem chamados micorrízicos) para
induzir o processo de germinação. Estes fungos simbiontes tornam-se fonte de
nutrientes advindos de sua digestão enzimática pela própria planta hospedeira e
que são utilizados para o desenvolvimento do protocormo, a partir do embrião
contido na semente madura (Peterson et al., 1998; Pereira et al., 2003).
Gradativamente, o protocormo torna-se capaz de realizar a fotossíntese
e este processo será o responsável pela nutrição da planta desenvolvida (Pereira et
al., 2003). Assim, na planta adulta a micorriza não é mais necessária, no entanto,
algumas espécies de orquídeas saprófitas nunca serão capazes de realizar
fotossíntese plenamente e permanecem dependentes do fungo por toda a vida
(Arditti, 1967).
As orquídeas são constituídas morfologicamente de raiz, caule, folha,
inflorescência, flor, fruto e semente (Paula & Silva, 2001). Quanto ao hábito de
crescimento, as orquídeas podem ser monopodiais (ereto) ou simpodiais
(prostrado). As monopodiais tem crescimento contínuo do caule, desenvolvimento
sempre na vertical, as raízes aéreas são expostas quando envasadas, não
apresentam bulbos e as hastes florais saem das axilas das folhas. As simpodiais
apresentam um eixo cujo crescimento cessa no fim de cada estação, emitindo na
base um novo ramo, que forma um pseudobulbo e eventualmente uma nova flor
(Pasqual et al., 2005).
Segundo Kerbauy (1998), as raízes das orquídeas são responsáveis
principalmente pela fixação além de ser o único sítio ativo de fixação de dióxido
de carbono e atuar na propagação vegetativa realizando a fotossíntese. Pode
também estimular o enraizamento, permitir o maior acúmulo de nutrientes
aumentando a sobrevivência das plantas ex vitro. O sistema radicular das orquídeas
é dotado de um tecido multisseriado denominado velame, que reveste as raízes e
aloja fungos micorrízicos, que auxiliam na nutrição destas plantas e permite
estocar água evitando o déficit hídrico, uma adaptação imprescindível, o qual
funciona como uma barreira física a transpiração e a desidratação (Pridgeon et al.,
19
1999) em períodos de seca prolongada, especialmente em áreas de cerrado. Além
de oferecer proteção mecânica e suporte.
As folhas das orquídeas estão dispostas disticamente no caule, e podem
ser sustentadas pelo caule ou pseudobulbo, Sua venação foliar é disposta
paralelamente e podem ser caducas com zona de abcisão limitada no pseudobulbo
(Dressler, 1981). Possuem diferentes formas e formatos, podem ser membranosas,
carnosas ou coriáceas, nesse caso armazenam água e outras substâncias (Withner et
al., 1974).
Os caules ou pseudobulbos são responsáveis por armazenar água e
auxiliam na manutenção do balanço hídrico da planta, principalmente quando há
pouca disponibilidade desse elemento (Braga, 1977). Algumas espécies que não
possuem pseudobulbo, as folhas e raízes se transformam nesse órgão e passam a
acumular substâncias de reservas e água (Stancato, 1999).
Nessas espécies sem pseudobulbos, a grande maioria epífita e
monopodial, o caule é aéreo, ereto e herbáceo e nele são inseridas as folhas. Após a
floração, ocorre a emissão de brotações, que podem ser divididas dando origem a
uma nova planta (Moraes et al., 2002). Em algumas orquídeas do gênero
Cyrtopodium os pseudobulbos são caracterizados por apresentarem vários nós e,
após a floração, as gemas axilares se desenvolvem formando novos brotos
(Caramaschi, 2001).
As orquídeas são apreciadas principalmente pela grande diversidade de
formas, cores e aromas de suas flores. Seu tamanho pode variar de 2 - 3 mm a 15 –
20 cm (Arditti, 1967). As flores são compostas pela coluna e perianto com seis
elementos. A coluna é fusionada com o filete da antera fértil e o estilete. O perianto
possui três sépalas externas e três pétalas internas, sendo uma delas modificada
denominada labelo, que é responsável muitas vezes por atrair o polinizador ou
como plataforma para outros insetos visitantes, otimizando o transporte do pólen
para outra flor, possibilitando a fecundação (Ferrarezi et al., 2007).
Alguns grupos de orquídeas formam inflorescências com centenas de
flores, que podem ser apicais, laterais ou paniculadas, formando ramos, corimbo ou
umbelas. Suas flores podem abrir simultaneamente ou em sucessão. Outras
geralmente apresentam brácteas em sua base. Estas brácteas, de tamanhos
20
diferenciados, são, em algumas espécies, até mais vistosas que as flores como em
espécies do gênero Cyrtopodium (Cribb et al., 2003).
O fruto formado caracteriza-se por ser deiscente, seco e
fotossintetizante do tipo cápsula. Possui três carpelos que ao atingir a maturação
abrem e liberam no ambiente milhões de sementes minúsculas e sem endosperma
(Dressler, 1993). A partir disso, as poucas sementes que germinam são associadas
a fungos micorrízicos, característica singular que torna a densidade das populações
relativamente baixa (Shimura & Koda, 2005).
2.1.2 Importância econômica e mercado mundial de orquídeas
O setor de floricultura movimenta mundialmente US$ 18 bilhões
(produtor) e US$ 54 bilhões (base mercado consumidor). No Brasil, os números no
varejo giram em torno de R$ 2,6 bilhões. O mercado produtor movimenta R$ 700
milhões e o atacadista R$ 1,1 bilhão (ABCSEM, 2011).
A média anual de consumo de flores e plantas ornamentais no Brasil
é de R$ 13,00 a R$ 15,00 por pessoa, constatando-se, ainda, diferenças
consideráveis no consumo das populações das diversas regiões do País. Os maiores
índices de compra dessas mercadorias ocorrem nos Estados do Rio Grande do Sul,
Santa Catarina, São Paulo, Minas Gerais e também no Distrito Federal. O Brasil
possui cerca de 5,1 mil produtores de plantas e flores de todos os tamanhos
responsáveis pelo cultivo de quase oito mil hectares. O consumo brasileiro de
flores e plantas ornamentais está abaixo do consumo per capita europeu, que é de
US$ 70,00 por habitante/ano (ABCSEM, 2011). Os maiores consumidores são:
Alemanha, Suíça, Holanda (SEBRAE, 2010).
A comercialização e cultivo de orquídeas ocorrem principalmente
devido a beleza, exoticidade e aroma de suas flores. Esta atração teve inicio no
século XVIII (Rocha & Cavalheiro, 2001) se tornando mais sofisticada,
competitiva e com maior demanda a partir do final da década de 90 (Stancato et al.,
2001).
A análise do mercado brasileiro global de flores e folhagens envasadas para
o ano de 2008 permite constatar que as orquídeas em geral são as principais
espécies comercializadas com 20,55% de participação nas vendas finais ao
21
consumidor. Esses números agregam as duas principais espécies comerciais de
orquídeas no Brasil: Phalaenopsis e Cymbidium. As orquídeas do gênero
Cymbidium foram contempladas com vendas globais de pouco mais de R$ 8,76
milhões (que representaram 1,32% de participação no mercado global de flores e
folhagens envasadas), enquanto as Phalaenopsis agregaram vendas totais de pouco
mais de R$ 6,9 milhões em 2008 (que representaram 1,05% de participação no
mercado de flores e folhagens envasadas). Outras espécies aparecem em segundo
lugar que são os crisântemos envasados, com vendas anuais da ordem de R$ 70,88
milhões (10,71%), seguidos por lírios (5,64%), violetas (4,77%), kalanchoes
(4,76%), azaléias (4,15%), bromélias (2,38%) e begônias (1,67%) (SEBRAE,
2010).
A cadeia produtiva de flores em especial as orquídeas, tornou-se com o
tempo mais especializada, atendendo todas as exigências do mercado. Com isso, o
produto (orquídea) tornou-se mais competitivo, e outras classes sociais (C e D),
não apenas a classe A passaram a consumir de forma compulsória para várias
ocasiões. A compra foi facilitada em diversos postos de vendas como gardens,
supermercados e mais ainda via internet. As vendas desbancaram os principais
concorrentes como chocolates, CDs e perfumes. Assim, o setor vem se tornando
mais consistente e cresce continuamente (SEBRAE, 2010).
Em relação às exportações de orquídeas, o valor total foi de US$
219,86 mil em 2009. Os principais países de destino foram Japão (53,08%),
Alemanha (21,74%), EUA (12,27%) e Holanda (8,08%), além de Ucrânia, Taiwan,
Hong Kong, África do Sul e Chile (Junqueira & Peetz, citado por Faria et al.,
2011).
O verdadeiro valor das orquídeas provém da produção de flores para
corte, principalmente híbridos dos gêneros Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium,
Paphiopedilum e Cymbidium, compondo principalmente cenários decorativos de
casamentos, aniversários e em arranjos florais de eventos variados (Faria et al.,
2010). As mesmas espécies são também bastante vendidas em vasos para
ornamentação e cultivo doméstico.
A Tailândia, por exemplo, vem especializando-se na produção de flores
de orquídeas de exportação para grandes cidades ao redor do mundo. Em 2001,
exportou mais de 3 milhões de plantas vendidas por cerca de 40 milhões de
22
dólares. Desde então, o ministério da agricultura da Tailândia reconheceu o
potencial desta produção e tem procurado melhorar a qualidade e atratividade de
seus clones concedendo certificados aos melhores produtores (Thailand News,
2008).
No Brasil, há também grande potencial de mercado em exposições
organizadas por associações de orquidófilos em todo país, e os híbridos são os
mais procurados. Muitas pessoas cultivam orquídeas como hobby, havendo
inúmeros grupos preocupados com a preservação dessas plantas por todo o mundo
(ex.: American Orchid Socity; International Orchid Conservation; Coordenadoria
das Associações de Orquidófilos do Brasil), além dos órgãos ambientais
competentes (IBAMA; ICMBIO).
Além do forte potencial comercial das orquídeas, elas possuem
importante papel na indústria. São utilizadas na composição de perfumes e
aromatizantes de alimentos, a exemplo da espécie Vanilla planifolia Andrews,
fonte do aromatizante baunilha, o qual é extraído de frutos secos desta espécie
(Raven et al., 1999). Outros gêneros têm importância em outros países como
Dendrobium que são usados em infusões de efeito calmante na China e suas flores
desempenham importante papel em cerimônias religiosas em outros países da Ásia.
Na Turquia, usam-se os tubérculos da Anacamptis morio (L.) R. M. Bateman para
preparação de sorvetes conhecido como salep. No século XIX, pseudobulbos de
Cyrtopodium, mais conhecido como Sumaré, eram utilizados como adesivos
domésticos no Brasil (Arditti, 1992).
Tendo em vista o alto valor comercial e a progressiva procura por
muitas espécies e híbridos de orquídeas, novas tecnologias como a
micropropagação foram utilizadas para obter maior número de plantas em curto
espaço de tempo e com elevado potencial ornamental.
2.2 O GÊNERO Cyrtopodium R. Br.
O gênero Cyrtopodium Rchb.f pertece a subfamília Epidendroidae e a
subtribo Cyrtopodiinae (Pridgeon, 2006). Compreende 50 espécies de origem
neotropical distribuídas do sul da Florida até o norte da Argentina (Romero-
González et al., 2008). Sendo o centro de diversidade do gênero o Cerrado
23
brasileiro, onde ocorrem pelo menos 29 espécies desse grupo (Batista &
Bianchetti, 2005).
Caracterizam-se por serem terrestres, rupícolas ou epífitas, folhas
bastante longas multinervuradas, herbáceas e caducas. A inflorescência pode ser
vigorosa e em grande número, apresenta brácteas em sua base de tamanhos
diferenciados, unduladas e coloridas, algumas até mais vistosas que as próprias
flores (Pridgeon et al., 2006). Os pseudobulbos das espécies de Cyrtopodium
podem ser fusiformes, cilíndrico-fusiformes ou cônico-ovóides e podem variar
consideravelmente em tamanho desde pequenos com alguns centímetros ou
medindo até mais de um metro de altura (Menezes, 2000).
O gênero Cyrtopodium etimologicamente siginifica “pé curvado” uma
denominação que faz alusão ao pequeno arco que estende ao prolongamento basal
da própria coluna. São encontradas em ambientes secos, rochosos, mas também em
solos úmidos (veredas no Cerrado) apresentando hábito epífito, rupícola ou
terrestre.
O gênero Cyrtopodium em muitas regiões tem diferentes
denominações, em Goiás a denominação mais usada é “cola-de-sapateiro” pois, o
sumo extraído dos pseudobulbos de C. brasiliensis era muito usado para colagem
do couro, papel e madeira (Menezes, 2000). Muitas pessoas utilizam Cyrtopodium
punctatum (L.) Lindl. para fins medicinais, para cicatrizar lesões, estancar o sangue
de feridas e cortes, tratamento de coqueluche e tosse (Vieira, 2000).
O gênero é bastante resistente ao estresse hídrico e necessita de alta
luminosidade e grande período de insolação, além de substratos bem aerados para
um bom desenvolvimento (Dressler, 1981). Algumas espécies de hábito terrestre e
principalmente as de hábito rupícula apresentam baixa tolerância ao excesso de
umidade, isso porque a maioria das espécies do gênero passa por um período anual
de estresse hídrico (seis meses em média). Nesse período de estiagem, as espécies
de hábito paludícula permanecem enterradas esperando a próxima chuva para
vegetar, uma vez que elas crescem em substrato permanentemente encharcado
(Dressler, 1990).
2.3 A ESPÉCIE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.
24
Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f é uma espécie epífita típica da
região Centro-Oeste, especialmente distribuída no Planalto Central brasileiro, com
ampla distribuição geográfica no Brasil. Geralmente é encontrada na metade
superior de troncos de palmeiras do gênero Acrocomia (macaúba) formando
grandes touceiras de raízes pneumatóforas que abrigam uma grande diversidade de
organismos (Menezes, 2000). Troncos de palmeiras oferecem boas condições para
a germinação e desenvolvimento dessa espécie e de outras orquídeas epífitas
(Figura 2.1a).
Figura 2.1 Plantas de Cyrtopodium saintlegerianum fixadas em troncos de
palmeira (macaúba) (A). Folhas e raízes pneumatóforas e
pseudobulbos em período chuvoso (B).
Apresenta pseudobulbos fusiformes que podem atingir até 70 cm de
altura (Figura 2.1b). A floração ocorre na estação seca, com início em julho e vai
até o final de agosto. A inflorescência é paniculada, vistosa e ramificada
geralmente maiores que as folhas, as flores tem em média 4,5 cm de diâmetro. As
sépalas são amarelo esverdeadas com manchas fortes de tom marrom
avermelhadas e as pétalas amarelas com pontos minúsculos da mesma cor das
25
sépalas. As cápsulas têm em média 10 a 13 cm e maturam aproximadamente com
onze a doze meses (Menezes, 2000) (Figura 2.2).
O crescimento é simpodial, ou seja, crescem lateralmente de gemas em
sua base, o caule principal cessa seu desenvolvimento no fim de cada estação e
novos pseudobulbos surgem de gemas axilares e crescerão até a maturidade
(Menezes, 2000). Pela beleza e porte de sua inflorescência tornou-se de interesse
em programas de domesticação e melhoramento vegetal.
Figura 2.2 Orquídea Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. epífita, apresentando
inflorescência paniculada e ramificada (A). Flor (B) e cápsula (C).
Barras = 1 cm.
2.4 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ORQUÍDEAS
2.4.1 Cultura de tecidos vegetais
A cultura de tecidos vegetais pode ser definida como a cultura de
células vegetais isoladas in vitro. Pode também ser chamada de multiplicação de
plantas in vitro. Tem início a partir de sementes ou pequenos pedaços de tecidos
26
vegetais, denominados explantes. Após assepsia, os explantes são introduzidos em
recipientes estéreis, sobre um meio sólido ou líquido contendo nutrientes e
reguladores de crescimento, necessários ao estabelecimento, multiplicação,
proliferação e desenvolvimento de brotos. Ao serem retirados do meio in vitro, os
brotos desenvolvidos são aclimatizados em substratos especiais, sob luminosidade
controlada, formando mudas destinadas às condições de cultivo. Esta tecnologia
produz mudas matrizes de alta qualidade, vigor e sanidade (Ferreira et al., 1998;
Souza et al., 2006).
As condições da cultura in vitro são essenciais para que haja um bom
crescimento vegetativo, além de taxa de multiplicação adequada. Os meios
nutritivos são responsáveis por fornecer os sais minerais macro e micronutrientes,
quantidades mínimas de nitrogênio, fontes de carbono (sacarose), vitaminas e
reguladores de crescimento necessários para manter a divisão celular e a
proliferação de explantes (Pasqual, 2001). A associação desses componentes e as
condições ideais da cultura como fotoperíodo e temperatura em um frasco formam
a tecnologia da cultura de tecidos vegetais (Kerbauy, 1995).
Vários meios têm sido testados para diversas finalidades e objetivos,
sendo um meio especifico identificado quanto a composição de sais minerais na
proporção de macro e micronutrientes, vitaminas, reguladores de crescimento e
suplementos orgânicos que variam em concentração (Da Silva, 2003).
No processo histórico de desenvolvimento dos meios de cultura, muitas
substâncias orgânicas foram acrescidas ao meio como água de coco, poupa de
tomate, poupa de batata entre outros complexos. O Brasil foi o primeiro país a
utilizar polpa de banana para a germinação de orquídeas com sucesso, contudo
seus efeitos na cultura são muito discutidos entre vários pesquisadores (Arditti,
2008). O sucesso dessa técnica de cultura de tecidos vegetais foi consolidada como
setor estratégico e crucial do conhecimento científico e tecnológico, contribuindo
para a solução de importantes problemas na agricultura como a produção de muitas
cultivares agronomicamente importantes em larga escala (Fontes, 2000).
A micropropagação é uma das técnicas de cultura de tecidos vegetais
de maior impacto na agricultura. É um meio de desenvolver células, tecidos ou
órgãos vegetais sob condições controladas de temperatura, fotoperíodo e umidade,
27
e tem o potencial de produzir grande número de plantas livres de patógenos em
curto período de tempo (Souza et al., 2006).
A propagação in vitro de plantas tem atraído pesquisadores desde o
inicio do século. Segundo Yam & Arditti (2009) o pesquisador Haberlandt em
1902 foi o primeiro a cultivar células de tecido somático de várias espécies de
plantas em solução nutritiva.
Knudson, por sua vez com seu grande interesse em orquídeas, em 1922
cultivou embriões na ausência de micorriza e observou a importância da sacarose
para o crescimento e desenvolvimento desses embriões in vitro (Torres et
al.,1998).
Morel & Martin em 1952 recuperaram plantas de dália livres de vírus
do mosaico por meio de cultura de ápices caulinares. Em 1960, Morel, repetindo
experimentos com orquídeas, empregou erroneamente o termo “meristema” para se
referir ao ápice caulinar, e por muito tempo pesquisadores empregaram o termo
erroneamente. Importante técnica empregada no melhoramento foi descoberta por
Cocking em 1960. O método consistia no isolamento de protoplastos de plantas por
meio de enzimas de degradação da parede celular, o que permitia a obtenção de
híbridos interespecíficos e intergenéricos, bem como a utilização deste sistema na
engenharia genética (Torres et al., 1998).
2.4.2 Reguladores de Crescimento
Reguladores de crescimento são moléculas sintéticas que em pequenas
concentrações, promovem, inibem ou modificam processos fisiológicos (Raven et
al., 1999). O equivalente natural destas moléculas são os denominados hormônios
vegetais que são biomoléculas produzidas pela planta que, em concentrações muito
baixas, promovem respostas bioquímicas, fisiológicas e/ou morfológicas como:
indução de raízes, brotos, alongamento de entrenós, divisão celular, entre outras
respostas (Cid & Teixeira, 2010). A composição e concentração destes reguladores
no meio de cultura são determinantes no padrão de desenvolvimento na maioria
dos sistemas de cultivo in vitro (Caldas et al., 1998).
2.4.2.1 Auxinas
28
As auxinas foram os primeiros hormônios vegetais a serem
descobertos. No final do século XIX Darwin em seus estudos sobre os movimentos
das plantas contribuíram para a descoberta das auxinas, no estudo da curvatura de
plântulas de gramíneas em resposta a iluminação unilateral fenômeno conhecido
como fototropismo (Mercier, 2004).
O termo foi assim denominado a partir de uma palavra grega que
significa crescer, para descrever compostos naturais e sintéticos que apresentam
uma atividade similar ao ácido indol acético (AIA), o primeiro hormônio natural
isolado de plantas (Cid, 2005).
A auxina natural mais abundante é o AIA. Entretanto, dependendo da
espécie da planta, estação do ano, e as condições sob as quais as plantas se
desenvolvem, outras auxinas naturais são encontradas como um análogo clorado
do AIA, por exemplo o ácido fenilacético e o acido indolil-3-butírico (AIB). As
auxinas sintetizadas em laboratório que causam respostas fisiológicas comuns ao
AIA são: ácido α-naftalacético (ANA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4 D),
ácido 4-amino-3,5,5-tricloropicolínico (picloram) (Mercier, 2004). As
concentrações mais utilizadas nos meios de cultivo in vitro variam de 0,01 a 10 mg
L-1 (Torres et al., 1998).
Auxinas são substâncias essenciais no cultivo de plantas. Promovem
modificações plásticas na parede celular vegetal durante o processo de divisão
celular, permitindo a extensibilidade da célula. Promovem várias respostas
fisiológicas quando utilizadas na indução de raízes, folhas, gemas axilares ou
apicais, embriões e calos. Além de ter papel fundamental nas aplicações comerciais
e agronômicas como a iniciação de raízes em estacas caulinares pelos reguladores
ANA e AIB (Rodrigues & Leite, 2004; Cid, 2005).
O transporte de auxinas é fundamental no desenvolvimento dos
vegetais, agindo como um fator determinante nos movimentos trópicos, na divisão
das células, diferenciação vascular, dominância apical, senescência e abscisão. São
transportadas polarmente, ou seja, unidirecionalmente do ápice a base da planta,
além do transporte apolar através do floema para as demais partes da planta
(Mercier, 2004).
29
Faria et al. citado por Sorace et al. (2007) trabalhando com
aclimatização de Dendrobium nobile observou que a auxina, ácido
naftalenoacético (ANA), proporcionou melhor desenvolvimento de raízes e
crescimento vegetativo do que ácido indol-acético (AIA) e o ácido indol-butírico
(AIB). Assim como na aclimatização de Oncidium baueri o ácido naftalenoacético
na concentração de 200 mg L-1 foi mais eficiente no enraizamento e
desenvolvimento vegetativo das plântulas (Sorace et al., 2007)
Na cultura de tecidos as auxinas são frequentemente utilizadas na
indução de calos a partir de explantes e no enraizamento a partir de brotos.
(Kerbauy, 1984a; 1984b) trabalhando com Oncidium varicosum, conseguiu
regenerar um grande número de plantas a partir de ápices radiciais. Souto et al.
(2010) mostraram que em Cattleya bicolor a ausência de ANA foi significativa na
inibição do alongamento radical e concentrações mais elevadas de ANA (2 mg L-1)
foram importantes para o crescimento desse órgão.
2.4.2.2 Citocininas
A primeira citocinina descoberta foi a chamada cinetina, através de
estudos de Skoog & Miller (1957) sobre as substâncias promotoras da divisão
celular. Os autores constataram que somente a auxina AIA não promovia esse
processo (citado por Cid, 2005). Em 1964, Letham isolou citocinina natural a partir
de endosperma imaturo de sementes do milho, passando depois, a ser chamada de
zeatina (citado por Rodrigues & Leite, 2004) As citocininas têm seu nome
derivado da função em promover a divisão celular ou citocinese e sua origem está
relacionada com a adenina (Peres & Kerbauy, 2004). Entre as citocininas sintéticas
destacam-se a cinetina (6-furfurilaminopurina) e o 6-benzilaminopurina (BAP). O
Thidiazuron (TDZ), derivado da uréia, também pode agir como citocinina na
indução de brotos adventícios (Cid, 2010).
As citocininas tem papel fundamental na etapa de regeneração de calos,
multiplicação de gemas axilares e apicais, podem também ser utilizadas na indução
de brotos, bem como na quebra de dominância apical e indução na formação de
gemas axilares (Peres & Kerbauy, 2004; Rodrigues & Leite, 2004).
30
As citocininas são sintetizadas principalmente nos pontos de
crescimento do sistema radicular, como o BAP que induz a formação de brotações
aumentando a taxa de multiplicação em várias espécies de plantas (Grattapaglia &
Machado, 1998). BAP também é eficiente na multiplicação de partes aéreas e
indução de gemas adventícias. É a citocinina mais aplicada na cultura de tecidos
vegetais seguida pela cinetina (Cid, 2010).
Cid (2000) enfatiza que concentrações altas de citocinina podem
aumentar a ação da citocinina-oxidase, inibindo a divisão celular e logo, impedindo
a indução de brotações. Desse modo, o efeito tóxico caracteriza-se pelo excessivo
ou baixo crescimento da planta, redução no tamanho das folhas, aspecto de
hiperhidricidade dos tecidos levando a sérios problemas na fase de enraizamento
(Leshen et al., 1988).
Conciliar o balanço entre os reguladores de crescimento
auxina/citocinina é de suma importância na indução de caules e raízes para o
desenvolvimento integrado da planta (Peres & Kerbauy, 2004).
2.4.3 Germinação assimbiótica
2.4.3.1 Teste de viabilidade de sementes
A germinação de sementes de orquídeas ocorre quando o embrião
incha, rompe o tegumento e uma esfera esverdeada é formada (Arditti, 1967). No
entanto, o embrião é ainda indiferenciado, havendo muitas vezes interrupção do
desenvolvimento do protocormo, por vários motivos. Não sendo, portanto,
indicador confiável de crescimento e desenvolvimento subsequente (Johnson &
Kane, 2007).
Um método rotineiro para determinar a qualidade das sementes é
germinando-as. Embora útil, esse processo não informa o vigor, longevidade e
emergência em campo (Mcdonald, 1998). Além disso, há necessidade de um prazo
grande de até 28 dias para informar os resultados da germinação, período
considerado longo, para atender aos interesses comerciais dos produtores de
sementes, por exemplo. Em função destas premissas, a agricultura moderna
recomenda testes complementares, confiáveis, reproduzíveis e rápidos. A rapidez
31
na avaliação da qualidade das sementes permite antecipar operações como colheita,
recepção, beneficiamento e comercialização, diminuindo riscos e prejuízos. Por
isto, alguns testes rápidos são justificáveis para a avaliação da qualidade física e
fisiológica das sementes (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,
2009).
O teste de tetrazólio (Tz ou TTC) é rápido e de grande importância
para a avaliação da qualidade das sementes, pois, além da viabilidade, o mesmo
pode informar sobre o vigor e identificar diversos problemas que afetam o
desempenho das sementes (Mcdonald, 1998). O teste reflete a atividade das
enzimas desidrogenases, envolvidas no processo de respiração. Pela hidrogenação
do 2-3-5-trifenil cloreto de tetrazólio é produzida nas células vivas uma substância
vermelha, estável e não difusível, o trifenil formazan (Moore, 1972). Isto torna
possível distinguir as partes vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas que
mantêm a sua cor (Oliveira et al., 2005).
O teste de viabilidade de sementes seguindo a coloração dos embriões
de orquídeas tem finalidade de determinar a percentagem de sementes com
embriões viáveis, sendo esse um importante passo na conservação de orquídeas e
propagação in vitro (Pritchard & Prendergast, 1990). As orquídeas têm sementes
diminutas medindo de 0,250 a 1.2 mm e pesam entre 0,3 a 14 μg, e são
desprovidas de endosperma. Assim, normalmente a durabilidade da semente fora
do fruto é variável ou quase nula (Arditti, 1967). Dessa forma, o tetrazólio é
essencial para testar a viabilidade e o vigor das sementes.
Entretanto, o teste se mostrou muitas vezes inconsistente quanto a sua
eficácia. (Mweetwa et al., 2008) testaram sementes de Phalaenopsis pelo teste de
TTC de cápsulas colhidas aos 90, 105 e 120 dias. Segundo o teste de viabilidade de
sementes da cápsula aos 90 dias, 41% das sementes eram viáveis, da cápsula de
120 dias 65% estavam viáveis, no entanto, a porcentagem de germinação in vitro
foi de 0 e 2,8%, contrariando o teste de tetrazólio.
2.4.3.2 Germinação assimbiótica de orquídeas
O primeiro método para propagação de orquídeas foi descrito por
Moore (1849), que espalhava sementes de orquídeas na base das raízes de
orquídeas adultas. Este método foi uma mudança importante e radical da maneira
32
de germinar sementes de orquídeas que era utilizada há mais de 160 anos (Yan &
Arditti, 2009). Meio século depois da descoberta de Moore, Noel Bernard em 1899
formulou um método em que sementes de orquídeas germinavam pelo método
simbiótico in vitro, foi provavelmente o primeiro método de germinação de plantas
in vitro. Ele também previu que um dia surgiriam muitos produtores e laboratórios
de orquídeas. Sendo esse o caso no presente não apenas para as orquídeas, mas
também para outras plantas (Yan & Arditti, 2009).
Lewis Knudson (1921, 1922) formulou o método de germinação
assimbiótica de sementes de orquídeas e foi o primeiro procedimento prático para a
propagação in vitro de qualquer planta em cultura axênica. Seu método era uma
inovação tecnológica significativa e conceitual que prenunciava a biotecnologia
moderna (Yan & Arditti, 2009).
Em vista da descoberta de Knudson, estudos posteriores possibilitaram
a propagação vegetativa in vitro de orquídeas como Rotor (1949), Morel (1960,
1964, 1969) e Reinert & Mohr (1967) todos exemplos de pesquisadores que
tiveram êxito no cultivo in vitro desse grupo (Yam & Arditti, 2009).
A micropropagação de orquídeas surgiu como alternativa para a
propagação via sementes que, na natureza, é quase nula (Arditti, 1967) e na
propagação vegetativa é muito demorada (Arditti, 1992) . Outras técnicas de
cultura de tecidos in vitro para orquídeas tem sido enpregadas na fisiologia vegetal,
nutrição mineral, criopreservação, propagação clonal e melhoramento genético,
entre outros estudos (Arditti, 2008).
Vários tipos de explantes podem ser utilizados na micropropagação in
vitro de orquídeas, as sementes por sua vez, são utilizadas principalmente por
apresentarem grande potencial regenerativo e morfogenético, tornando-se
fenotipicamente semelhante à matriz a qual foi coletada (Arditti, 1967). Os meios
nutritivos foram empregados na cultura de tecidos vegetais para atender as
exigências das plantas, com modificações para suprir a necessidades especificas in
vitro (Caldas et al., 1998).
Knudson, em 1946 aperfeiçoou o meio de cultura de acordo com as
exigências nutricionais específicas, sendo, portanto o meio mais utilizado na
germinação e desenvolvimento de orquídeas. A partir dele novas modificações nos
33
meios de cultivo foram apresentadas com objetivos e respostas diferentes para
muitos outros gêneros e espécies de orquídeas (Arditti, 1992).
Nas formulações básicas dos meios de cultura mais utilizados como: o
meio KC (Knudson, 1946); MS (Murashige & Skoog, 1962); VW (Vacin & Went,
1949) e White (White, 1943) vários compostos são adicionados para suprir as
necessidades metabólicas, energéticas e estruturais da célula. A maioria dos meios
nutritivos é composta por macro e micronutrientes minerais, vitaminas, açúcares,
reguladores de crescimento, além de compostos orgânicos, tendo em vista que as
constituições químicas são conhecidas e suas concentrações podem ser
previamente determinadas.
Algumas formulações específicas são descritas para a germinação de
espécies do gênero Cyrtopodium. Dutra et al. (2008) relatou que altas porcentagens
de germinação de C. punctatum foram obtidas no meio comercial específico para
orquídeas PhytoTechnology com 20% de sacarose e concentração de mais sais que
o meio Knudson C (1946). Assim como, Nunes (2009) na germinação assimbiótica
de C. eugenii, testou vários meios de cultivo obtendo sucesso apenas no meio MS
com metade da concentração de macronutrientes.
2.5 CITOGENÉTICA DE ORQUÍDEAS
A taxonomia clássica baseia-se, em geral, apenas em características
morfológicas, as quais são fundamentais para analisar a biodiversidade. Contudo,
os dados adquiridos pela citogenética têm contribuído de forma excepcional e
decisiva na reformulação de hipóteses filogenéticas com base nas informações dos
cromossomos, sendo esse um caractere bem conservado nas espécies (Heslop-
Harrison, 2000). Informações citogenéticas também são de fundamental
importância para o melhoramento genético e na caracterização do germoplasmas
(Brasileiro-Vidal e Guerra, 2002).
O estudo da genética por meio da citogenética engloba todo e qualquer
estudo relacionado com o cromossomo, isolado ou em conjunto, condensado ou
distendido, tanto no que diz respeito a sua morfologia, organização, função e
replicação, quanto a sua variação e evolução (Guerra, 1988).
34
A caracterização cromossômica foi baseada por muitos anos em
parâmetros morfológicos, como o tamanho dos braços, posição dos centrômeros e
localização das constrições secundárias. Ao longo do tempo aplicações e técnicas
na citogenética, como o bandeamento, foram implantadas a fim de permitir a
visualização de blocos de coloração diferenciada (bandas) e melhorar a
caracterização cromossômica significativamente (Brasileiro-Vidal e Guerra, 2002).
Novas técnicas em citologia tem sido empregadas possibilitado uma
análise mais detalhada dos cariótipos a partir de dados citomoleculares, como os
bandeamentos com fluorocromos 4’-6’ diamidino-2-fenilindol (DAPI), que destaca
regiões heterocromáticas ricas em bases AT, e acromomicina A3 (CMA3), que tem
afinidade por regiões heterocromáticas ricas em bases GC. A aplicação destes
fluorocromos associada à distamicina-A (DA), que é um contrastante negativo,
favorece a distinção das bandas. Os relatos mais recentes de análise de cromatina
com auxílio de fluorocromos indicam que em diversos grupos vegetais a
heterocromatina constitutiva é rica em AT (Nakamura et al., 2001; Besendorfer et
al., 2002).
Outra técnica empregada na citogenética e relacionada ao
desenvolvimento da biologia molecular foi a hibridização fluorescente in situ ou
FISH (Pedrosa et al., 2002). Esta técnica têm permitido um detalhamento
minucioso dos cariótipos, admitindo o reconhecimento de pequenas variações
cromossômicas, difíceis de serem detectadas com técnicas convencionais.
Chatterji, citado por Than et al. (2011) considera difícil a obtenção de
cariótipo em orquídeas, devido principalmente a morfologia da raiz (coberta por
tecido chamado velame) e frequência de divisões muito baixa. Dessa forma,
observa-se poucos estudos relacionados a dados cromossômicos da grande família
Orchidaceae. Embora, o número cromossômico forneça informações
indispensáveis como a filogenética entre as espécies (Semple et al., 1989). Assim,
a evolução cromossômica dentro dessa família permanece inconclusiva (Daviña et
al., 2009).
Alguns cariótipos de orquídeas já foram descritos e observa-se que
ocorre uma grande variação no número cromossômico. Daviña et al. (2009)
analisaram 43 espécies pertencentes a 28 gêneros de orquídeas argentinas com
grande variação no número cromossômico com 2n = 28 a 2n=108.
35
Pouco se conhece o número cromossômico da subtribo Cyrtopodiinae,
o que tem dificultado a interpretação das relações taxonômicas e filogenéticas entre
diferentes gêneros e entre espécies de grandes gêneros (Félix & Guerra, 2000).
Sobre o gênero Cyrtopodium apenas onze das cinquenta espécies existentes
(Romero-González et al., 2008) foram citologicamente analisadas. Diferentemente
do que apresentam Daviña et al. (2009) pouca variação dos números
cromossômicos, podem ser sugeridos para o gênero Cyrtopodium. Até o momento,
apenas dois números básicos de x=22 e x=23, para as espécies Cyrtopodium
hatschbachii, Cyrtopodium palmifrons, Cyrtopodium blanchetii Rchb. f.,
Cyrtopodium gigas (Vell.) Hoehne, Cyrtopodium inaldianum L.C. Menezes,
Cyrtopodium intermedium Brade, Cyrtopodium. paranaense Schltr., Cyrtopodium
eugenii Rchb. f., Cyrtopodium andessonii e Cyrtopodium. punctatum (Surenciski
et al., 2007). Dados obtidos com a coloração convencional têm permitido um
entendimento de alterações numéricas e estruturais na evolução cariotípica também
no gênero Habenaria (Felix & Guerra, 1998) e no reconhecimento do número
básico na subtribo Oncidinae (Felix & Guerra, 2000).
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43
3 MICROPROPAGAÇÃO DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.
(ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)
RESUMO
O Cerrado é considerado um dos hostspots para conservação da biodiversidade
mundial. Porém, devido a expansão agrícola, muitos organismos tem entrado em declínio e
as orquídeas correspondem a 10% de toda flora predisposta a esse risco. Orquídeas
adaptaram-se aos mais variados ambientes e com peculiaridades singulares como a
germinação que ocorre a partir de um processo simbiótico com fungos micorrízicos. Esse
processo é lento e poucas sementes são germinadas. Assim, devido a alta complexidade em
se obter mudas de orquídeas via sementes ou propagação vegetativa, a cultura de tecidos
vegetais tornou-se importante alternativa para acelerar o desenvolvimento da germinação
produzindo mudas sadias em curto espaço e tempo. O presente trabalho teve como objetivo
estabelecer o cultivo in vitro da espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb.f . Esta
orquídea é típica da região Centro-Oeste, mas apresenta ampla distribuição geográfica no
Brasil. É epífita e de grande interesse ornamental pela grande inflorescência paniculada
com dezenas de flores. Foram testados a viabilidade das sementes obtidas para a
germinação via teste de tetrazólio, protocolos para melhor germinação das sementes, o
efeito dos reguladores de crescimento BAP e ANA no desenvolvimento de protocormos
gerados a partir de sementes e o melhor substrato e adubação na aclimatização de mudas
para os primeiros meses de estabelecimento ex vitro. O material vegetal foi coletado no
município de Mossâmedes, GO. Cápsulas foram previamente desifestadas e testadas em
corante tetrazólio a 1%. Para o cultivo assimbiótico foram testados diferentes meios de
culturas e diferentes concentrações de BAP/ANA, para finalmente avaliar a aclimatização
em substratos combinados e adubados com adubo químico e orgânico. Resultados da
germinação mostraram-se satisfatórios em todos os meios de cultura. As melhores
concentrações para a variável altura foram 0,2 mg L-1 de ANA sem adição de BAP e o
controle sem adição de reguladores. Os melhores meios que induziram grande número de
brotações foram 4 mg L-1 de BAP e 4 mg L-1 de BAP / 0,2 mg L-1 de ANA. O maior
número de folhas foi obtido nas concentrações de BAP sem ANA nas concentrações 1,0;
2,0 e 4,0 mg L-1. Os tratamentos com maior número de raízes foram o controle sem adição
de reguladores de crescimento nas dosagens de 0,2, 0,5, 1,0 mg L-1 de ANA sem adição de
BAP, assim como o comprimento da maior raiz foi favorecido pelos mesmos tratamentos.
O maior número de calos se deu no tratamento com concentrações de 1,0 BAP mg L-1 sem
adição de ANA.
Palavras-chave: orquídeas, germinação assimbiótica, cultura de tecidos
44
ABSTRACT
MICROPROPAGATION OF Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.
(ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)
The Cerrado is considered one of hostspots for global biodiversity conservation
due to agricultural expansion many organisms has gone into decline and orchids account
for 10% of the entire flora prone to this risk. Orchids adapted to the most varied
environments and peculiarities germination as natural occurring aa from a symbiotic
process with mycorrhizal fungi. This process is slow and few seeds are germinated. Thus,
due to the high complexity of obtaining seedlings orchids via seeds or vegetative
propagation using conventional propagation of plants, plant tissue culture is an important
alternative to accelerate the development of healthy seedlings germinating producing short
space and time. This study aimed to establish the in vitro cultivation of the species
Cyrtopodium saintlegerianum Rchb.f. This is a typical orchid of the Midwest but it has
wide distribution in Brazil. It is epiphytic and of great interest for ornamental purpose due
its large paniculate inflorescences with dozens of flowers. We tested the seeds viability
for germination via tetrazolium test, protocols for better seed germination, the effect of
growth regulators BAP and NAA in protocorms developing generated from better seeds
and fertilizer, substrate and the acclimatization sets for seedlings in the first months of
establishment ex vitro. The plant material was collected in municipality of Mossâmedes,
GO. The capsules were then were sterelized of the seeds were separated and tested in a 1%
tetrazolium dye. For cultivation was tested asymbiotic different culture media and then
tested after different concentrations and combinations in treatments BAP 16 / ANA, to
finally evaluate the acclimatization substrates combined and fertilized with chemical
fertilizers and organic. The results of germination was satisfactory in all culture media. For
medium supplemented with auxin / cytokinin combined the best concentrations for
variable height were 0.2, 0.5, 1.0 mg L-1 NAA and BAP without adding control without
addition of regulators. The best means to induce large numbers of shoots were 4 mg L-1
BAP and 4 mg L-1 BAP / 0.2 mg L-1 NAA. The number of leaves was rated best in the
concentrations of BAP without NAA at concentrations of 1.0, 2.0 and 4.0 mg L-1. The
treatments with the highest number of roots were control without added growth regulators
at doses of 0.2, 0.5, 1.0 mg L-1 NAA without addition of BAP, as well as the length of
roots was favored by the same treatments. The largest number occurred in callus treatment
with concentrations of 1.0 mg L-1 BAP without adding ANA.
Key words: orchids, asymbiotic germination, tissue culture
3.1 INTRODUÇÃO
Quanto à fequência e a diversidade da família Orchidaceae, o Cerrado sempre
foi considerado como centro secundário de espécies (Batista & Bianchetti, 2005). Segundo
Barros et al. (2012), o Cerrado tem cerca de 682 espécies de orquídeas (23%) e aparece na
45
terceira posição em relação ao número total de espécies, atrás da Mata Atlântica com 1421
e Amazônia com 765 espécies.
Dentre as espécies de orquídeas encontradas no Cerrado, o gênero
Cyrtopodium Rchb.f compreende 50 espécies de origem neotropical distribuídas do sul da
Florida até o norte da Argentina (Romero-González et al., 2008). O centro de diversidade
do gênero é o Cerrado brasileiro, onde ocorrem pelo menos 28 espécies deste gênero
(Batista & Bianchetti, 2005).
A espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. apresenta grande
inflorescência paniculada e flores de 4,5 cm de diâmetro. Tem ampla distribuição
geográfica no Brasil, sendo uma espécie típica da região Centro-Oeste (Menezes, 2000).
Possui hábito epífito e, em áreas de cerrado, espécies de palmeiras como as do gênero
Acrocomia (macaúba) oferecem boas condições para a germinação e desenvolvimento
desta espécie e de outras orquídeas epífitas.
Nos últimos 50 anos, organismos e ecossistemas tornaram-se cada vez mais
vulneráveis à extinção e orquídeas correspondem a 10% de toda flora predisposta a esse
risco (Koopowitz et al., 2003). Alterações dos ambientes naturais causadas pela ação
antrópica levam ao declínio das poluções de diversas espécies de orquídeas e dos fungos
micorrízicos que são fundamentais para a germinação e desenvolvimento inicial destas
espécies em ambiente natural (Swarts & Dixon, 2009).
Técnicas de cultura de tecidos vegetais são empregadas principalmente na
produção de plantas em larga escala, as quais permitem multiplicar genótipos superiores
isentos de vírus e outros patógenos em curto espaço de tempo (Souza et al., 2006). Tem
sido amplamente aplicada na propagação de orquídeas, garantido a preservação de muitas
espécies e atendendo a demanda do mercado de plantas ornamentais (Faria, et al., 2012).
Alguns pesquisadores têm obtido sucesso em protocolos de germinação e
desenvolvimento de espécies do gênero Cyrtopodium como: C. palmifrons Rchb.f. &
Warm. (Araújo et al., 1999), C. cristatum Lindl. (Caramaschi & Caldas, 1999), C.
paranaensis Schlt. (Rego-Oliveira & Faria, 2005), C. punctatum (L.) Lindl. (Dutra et al.,
2009), C. eugenii Rchb.f. & Warm. (Nunes, 2009) e C. glutiniferum Raddi (Vogel &
Macedo, 2011). Considerando o grande potencial ornamental da espécie C.
saintlegerianum, e visando o início de um processo de domesticação e melhoramento da
espécie, este trabalho teve como objetivos o estabelecimento de protocolos para
46
germinação assimbiótica, desenvolvimento in vitro com a utilização de fitoreguladores,
garantindo mudas de alta qualidade.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais (LCTV) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás.
Em agosto de 2010, frutos de C. saintlegerianum foram coletados de uma população
localizada no município de Mossâmedes, GO (Latitude 16o 07.666' Sul e Longitude 050o
10.044' Oeste). As cápsulas estavam em fase de maturação com aproximadamente onze
meses, apresentando coloração verde amarelado, e textura macia. Em seguida, as cápsulas
foram conduzidas ao LCTV, pesadas e a de maior peso foi selecionada para a retirada de
sementes para a germinação assimbiótica in vitro. Após a seleção, foram lavadas em água
corrente e detergente líquido neutro retirando a primeira camada de sujeira vinda de
campo. Posteriormente, foram desinfestadas por um minuto em solução contendo álcool
70%, em câmara de fluxo laminar, 15 minutos com hipoclorito de sódio comercial (2,5%
de cloro ativo) e lavadas por três vezes consecutivas em água destilada autoclavada.
3.2.1 Teste de viabilidade das sementes
Em câmara de fluxo laminar, a cápsula previamente desinfestada foi cortada
longitudinalmente com bisturi e com auxílio de uma pinça. Uma das metades da cápsula
foi retirada e uma amostra de sementes foi retirada para a realização do teste de viabilidade
das sementes. Esta primeira amostra foi dividida em duas amostras de 0,001 g e
transferidas para tubos de ensaio. A parte restante das sementes foi destinada a germinação
assimbiótica in vitro.
A viabilidade das sementes foi testada utilizando solução a 1% de cloreto de 2,
3, 5 trifenil tetrazólio (TTC) composta por 1,815 g de KH2PO4, 2,275 g de Na2HPO4 e 2 g
de TTC dissolvidos em 200 mL de água destilada (adaptado por Alvarez-Pardo & Ferreira,
2006). As sementes foram imersas em solução de TTC e mantidas na ausência de luz.
O delineamento experimental consistiu em dois tratamentos e quatro
repetições: T1: 0,001 g de sementes imersas em tubos de ensaio na solução TTC 1% por 12
47
horas; T2: 0,001 g de sementes imersas no TTC por 24 horas, os tratamentos foram
mantidos a temperatura de 30º C em banho-maria.
Com auxílio de um microscópio estereoscópico realizou-se a contagem das
sementes, considerando-se viáveis sementes com embriões corados de cores laranja a
vermelho (Lauzer et al., 1994). A porcentagem de sementes viáveis em cada amostra foi
submetida à transformação de arcseno da raiz quadrada. A média dos valores
transformados para cada tratamento foi submetida ao teste t de Student (Zar, 1999).
3.2.2 Germinação assimbiótica in vitro
Os meios de cultura para germinação assimbiótica de sementes de orquídeas
foram avaliados quanto à sua eficácia na promoção da germinação e desenvolvimento
subsequente de protocormos de sementes de C. saintlegerianum. Os meios de cultura
utilizados foram o meio MS completo (Murashige & Skoog, 1962), o MS com redução da
metade da concentração dos macronutrientes (MS½), meio KC (Knudson, 1946) e meio
KC modificado (Arditti et al., 1977) (ANEXO). O pH foi ajustado para 5,7-5,8, a
solidificação dos meios foi feita com 0,6 % de ágar e os meios foram autoclavados à
temperatura de 120º C, por vinte minutos. Após a autoclavagem, em câmara de fluxo
laminar foram distribuídos 20 mL de meio em placas de Petri. Após o resfriamento, todas
as placas foram vedadas com uma camada de filme plástico PVC.
Após a desinfestação da cápsula, e em câmara de fluxo laminar,
aproximadamente 200 a 300 sementes foram retiradas e distribuídas uniformemente com
uma espátula em cada placa. Após a semeadura, as placas permaneceram em sala de
crescimento, em condições de 16 horas de luz, intensidade luminosa de 35 µmol m-2 s-1 e
temperatura de 24°C ± 2°C.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com
quatro tratamentos e dez repetições. O processo de germinação das sementes de orquídeas
teve início com a ruptura do tegumento do embrião e a formação de estruturas esféricas
clorofiladas denominadas protocormos (Arditti, 1967). Aos diferentes estádios de
germinação e desenvolvimento das sementes foram atribuídas uma escala de 0 – 6 (Stewart
et al., 2003) (Tabela 3.1). Foram avaliados a porcentagem de germinação de cada
tratamento, dividindo o número total de sementes inoculadas pelo número de sementes
48
germinadas em todas as repetições por tratamento. A avaliação do número de protocormos
obtidos nos quatro tratamentos foi feita semanalmente, durante 15 semanas.
Os dados referentes ao número de protocormos obtidos por placa e por meio
foram submetidos à análise de variância. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey
a 5 % de significância.
Tabela 3.1 Escala de estádios de diferenciação de plântulas de Cyrtopodium
saintlegerianum germinadas in vitro (Stewart et a., 2003).
Estádio Descrição
0 Tegumento intacto, sem germinação
1 Embrião intumescido (= germinação)
2 Ruptura do tegumento, presença de rizóides
3 Aparecimento do protomeristema
4 Emergência da primeira folha
5 Elongação da primeira folha e desenvolvimento
6 Emergência da segunda folha
3.2.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum
Nessa etapa, objetivou-se avaliar as influências das concentrações de
reguladores de crescimento no desenvolvimento e multiplicação de novas plântulas de C.
saintlegerianum a partir de protocormos na fase 3 a 5 (Figura 3.1). Os protocormos
inoculados tiveram média de tamanho e peso de 2,72 cm e 0,015 g respectivamente.
O meio de cultura utilizado para inoculação dos protocormos foi o KC
modificado (Arditti, 1977) suplementado com reguladores de crescimento. Foram testados
16 tratamentos utilizando como auxina o ácido naftalenacético (ANA) e como citocinina 6-
benzilaminopurina (BAP) combinadas ou não (Tabela 3.2).
A solidificação dos meios foi feita com 0,6 % de ágar, o pH foi ajustado para
5,8±0,1 antes da adição do ágar e distribuídos 20 mL de meio de cultura por tubo de ensaio
e autoclavados à temperatura de 120°C, por vinte minutos. O experimento foi mantido em
sala de crescimento com fotoperiodo de 16 horas de luz, intensidade luminosa de 35 µmol
m-2 s-1 e temperatura de 24°C ± 2°C.
49
Figura 3.1 Protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum nas fases de crescimento 3 a 5
inoculados em meio de multiplicação com diferentes concentrações de ácido
naftalenacético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP) (Ae B).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 16 tratamentos
e 40 repetições. Após 90 dias, foram avaliadas as seguintes variáveis: número de brotações
(NB), número de folhas (NF), número de raízes (NF), comprimento da maior raiz (CR),
altura (A) e número de calos (C). Os dados obtidos foram submetidos à análise de
variância. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de significância.
Tabela 3.2 Concentrações dos reguladores de crescimento ANA (Ácido naftalenoacético) e
BAP (6-Benzilaminopurina) nos tratamentos utilizando o meio KC modificado
(Arditti, 1977) para a diferenciação dos protocormos de Cyrtopodium
saintlegerianum.
Tratamentos ANA (mg L-1) BAP (mg L-1)
T1 0.00 0.00
T2 0.00 1.00
T3 0.00 2.00
T4 0.00 4.00
T5 0.20 0.00
T6 0.20 1.00
T7 0.20 2.00
T8 0.20 4.00
T9 0.50 0.00
T10 0.50 1.00
T11 0.50 2.00
T12 0.50 4.00
T13 1.00 0.00
T14 1.00 1.00
T15 1.00 2.00
T16 1.00 4.00
50
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1 Teste de viabilidade das sementes
A viabilidade das sementes de cada amostra foi 75% para o tratamento T1 e
90% para o tratamento T2. No total, foram avaliadas 445 sementes. Os tratamentos de
coloração para viabilidade não diferiram (t = 1,73; p = 0,133), ou seja, não houve
diferenças significativas na porcentagem média de embriões corados observados entre os
dois tratamentos (Figura 3.2).
O TTC há muito tempo é utilizado para testar a viabilidade das sementes de
orquídeas pela coloração do embrião (sendo viáveis embriões corados de cores laranja a
vermelho) (Pritchard, 1985). No entanto, ocorrem grandes discrepâncias entre a
germinação e viabilidade do embrião em sementes de várias espécies, o qual pode ser
devido a diferenças na permeabilidade do tegumento de cada espécie (Kauth et al., 2011).
Figura 3.2 Sementes de Cyrtopodium saintlegerianum submetidas ao teste de tetrazólio
(TTC). A - sementes no tratamento T1 (12 h imersas no TTC); B - sementes
no tratamento T2 (24 h imersas no TTC).
Jonhson & Kane (2007) testando a viabilidade de sementes de híbridos de
Vanda com TTC, observaram que a taxa de embriões viáveis foi consideravelmente maior
que a de embriões germinados in vitro. (Mweetwa et al., 2008) testaram sementes de
Phalaenopsis pelo teste de TTC de cápsulas colhidas aos 90, 105 e 120 dias. Segundo o
teste de viabilidade de sementes da cápsula de 90 dias, 41% das sementes eram viáveis e
51
para a cápsula de 120 dias, encontraram 65% de viabilidade. No entanto, a porcentagem de
germinação in vitro foi de 0 (cápsula de 90 dias) e 2,8% (cápsula de 120 dias),
contrariando o teste de tetrazólio.
Alguns pesquisadores relatam que os resultados do teste TTC devem ser
interpretados com cautela, pois a viabilidade do embrião é muitas vezes imprecisa, devido
à impermeabilidade do tegumento à solução com TTC para algumas espécies de orquídeas
(Lauzer et al. 1994; Vujanovic et al., 2000). Pode também ser devido a dependência de
reação do tecido a presença de corantes específicos para cada espécie (Pritchard, 1985).
Arditti (1992) afirma que quando as sementes de orquídeas são submetidas diretamente à
solução de tetrazólio, sem pré-condicionamento, ou seja, sem serem tratadas com solução
de sacarose (responsável pela ativação do embrião, pois as sementes não possui
substâncias de reservas, logo a sacarose fornece nutriente e regula o equilíbrio osmótico)
boa parte delas flutuam ou aderem às paredes dos frascos, diminuindo a área de contato
com a solução de tetrazólio pois, dependendo da espécie ocorre a presença de um espaço
de ar interno colorindo as sementes fracamente.
Apesar de alguns autores apresentarem discrepâncias entre o teste e a
germinação das sementes in vitro, o teste TTC é tradicionalmente utilizado para várias
espécies de orquídeas (Alvarez-Pardo & Ferreira, 2006; Hosomi et al., 2012).
3.3.2 Germinação assimbiótica in vitro
O início da germinação in vitro ocorreu 15 dias após a inoculação das sementes
nos meios de cultura. Observou-se o intumescimento dos embriões em todos os
tratamentos e ruptura da testa em 80% das placas. Após 35 dias, todos os tratamentos
apresentaram intumescimento do embrião e presença de rizóides. Elevadas taxas de
germinação ocorreram independentemente do meio de cultura. Não houve diferenças
significativas entre os tratamentos.
A germinação total das sementes de C. saintlegerianum nos tratamentos
ocorreu após 35 dias e variou entre 55 a 62% (Figura 3.3). Embora as porcentagens tenham
sido inferiores ao teste de viabilidade pelo TTC, a taxa de germinação para a espécie foi
alta quando comparada com taxas de germinação de sementes de orquídeas de outros
autores que utilizaram diferentes tratamentos, fotoperíodos, temperaturas e adição de
reguladores de crescimento no meio de cultura, Estas taxas de germinação ficaram abaixo
52
de 60% em C. palmifrons Rchb.f. & Warm. (Araújo et al., 1999); C. punctatum (L.) Lindl.
(Dutra et al., 2009); C. eugenii Rchb.f. & Warm. (Nunes, 2009); C. glutiniferum Raddi
(Vogel & Macedo, 2011). Mello (2000) obteve 60% de germinação em várias espécies do
gênero Cyrtopodium trabalhando com conservação de sementes de orquídeas do Cerrado.
Após 15 semanas foram avaliados o número total de protocormos em cada
estádio de desenvolvimento. Nos primeiros estádios (1 e 2) de intumescimento do embrião
e ruptura do tegumento, os melhores resultados foram observados no meio MS ½.
Protocormos de coloração verde (estádio 3) foram observados em todos os tratamentos
com médias estatisticamente iguais. O meio de cultura com mais protocormos nos estádios
5 e 6 foi o KC modificado (Figura 3.4 e Figura 3.5).
Dutra et al. (2009) também observaram maiores porcentagens de sementes nos
primeiros estádios (1 e 2) no meio de cultura MS ½ dos macronutrientes com Cyrtopodium
punctatum. Híbridos de Vanda também tiveram melhores desenvolvimentos nos estádios
iniciais no meio MS ½ (Jonhson & Kane, 2007).
a
a
a
a
50
52
54
56
58
60
62
64
MS MS 1/2 macro KC KC (modif.)
Figura 3.3 Porcentagem de germinação de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum 35
dias após a inoculação em diferentes tratamentos. MS: meio Murashige &
Skoog (1962) completo; MS ½: meio Murashige & Skoog (1962) com redução
da metade da concentração dos macronutrientes; KC: meio Knudson (1946) e
KC (modif.): meio Knudson modificado (Arditti et al., 1977).
Alguns pesquisadores relataram a influência do fotoperíodo na germinação do
gênero Cyrtopodium. Observaram que tanto a taxa de germinação quanto desenvolvimento
53
nos últimos estádios foram maiores em fotoperíodo de 8/16 luz/escuro para a espécie
epífita Cyrtopodium punctatum (Dutra et al., 2009). Orquídeas epífitas germinam tanto
sob luz quanto no escuro (Arditti, 1967). Diferentemente de Cyrtopodium glutiniferum que
é uma orquídea terrestre, as maiores médias para germinação ocorreram sob luz branca
com maior intensidade luminosa (Vogel & Macedo, 2011). Barros et al. (2003) relatam
que, independentemente do hábito de crescimento ou taxonomia da orquídea, cada espécie
tem exigências diferentes para o sucesso na germinação.
Muitos autores obtiveram sucesso adicionando reguladores de crescimento ao
meio de cultura a fim de obter altos índices na germinação para muitas espécies de
orquídeas (Deb & Pongener, 2011; Vogel & Macedo, 2011; Pedroza-Manrique & Mican-
Gutiérrez, 2006). No entanto, Araújo et al. (1999) não obtiveram sucesso germinando
Cyrtopodium palmifrons em meio de cultura com regulares de crescimento, assim como
Caramaschi (2001) com resultados similares em Cyrtopodium eugenii e Cyrtopodium
cristatum.
Rego-Oliveira & Faria (2005) apresentaram bons resultados utilizando
orquídeas nativas (Catasetum fimbriatum e Cyrtopodium paranaensis) em meios de cultura
tradicionais e formulações com fertilizantes comerciais sem reguladores de crescimento.
Ramos (2005) sugere que formulações mais simples sem adição de hormônios são mais
eficazes na fase de germinação e desenvolvimento inicial de algumas espécies de
Cyrtopodium. O autor coloca que algumas espécies nativas apresentam melhores respostas
com baixas dosagens de reguladores de crescimento e, em outras espécies, a resposta é
nula.
O desenvolvimento posterior de C. saintlegerianum foi melhor observado no
meio KC modificado, após o primeiro subcultivo, pois apresentou maiores comprimentos
da parte aérea, maior número de raízes e até mesmo mais brotações. Portanto, a espécie C.
saintlegerianum germina facilmente em todos os meios apresentados. As maiores médias
de protocormos no estádio 4 foram observadas no meio MS e nos últimos estádios (5 e 6)
mostraram-se melhores os meios KC e KC modificado.
54
Figura 3.4 Efeito comparativo de meios de cultura e estádio de desenvolvimento na
germinação assimbiótica de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum após
15 semanas. Meio MS (T1), meio MS ½ (T2), meio KC (T3), meio KC
modificado (T4). ( Média ± 0,95 Intervalo de confiança). Médias seguidas
pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%
.
55
Figura 3.5 Estádios de desenvolvimento da germinação assimbiótica de Cyrtopodium
santlegerianum após 15 semanas de cultivo. Sementes com embrião
intumescido no meio MS ½ macronutrientes estádio 1 (A); Estádio 2 ruptura
do tegumento sem rizóides no meio MS (B); Estádio 2 e 3, tegumento
rompido e aparecimento de rizóides (C); Estádio 3, protomeristema com
presença de muitos rizóides no meio KC (D); Estádio 4, protocormos
emitindo a primeira folha meio KC modificado (E); Estagio 5,
desenvolvimento e alongamento da primeira folha meio KC modificado (F).
3.3.3 Desenvolvimento de protocormos de Cyrtopodium saintlegerianum
3.3.3.1 Altura
56
Para a variável altura, verificou-se que os tratamentos que proporcionaram
melhor desenvolvimento dos protocormos e consequentemente aumento no comprimento
das plântulas foram o controle (T1) sem adição de reguladores de crescimento e T5 (0,2
mg L-1 ANA/ 0,0 mg L-1 BAP), ou seja, sem a presença de citocininas exógenas (Tabela
3.3). Provavelmente, os níveis endógenos destes dois hormônios nos protocormos em
desenvolvimento já se encontrem em equilíbrio e nas concentrações adequadas para o
crescimento da parte aérea (Peres & Kerbauy, 2004). A adição de reguladores de
crescimento exógenos estaria alterando este equilíbrio prejudicando o desenvolvimento da
plântula (Lemos, 2010).
Tabela 3.3 Efeito das concentrações de ANA e BAP na altura de Cyrtopodium
santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de
cultivo.
Descrição Tratamento Altura
Controle T1 3.2 a
1,0 BAP/ 0 ANA T2 1.87 bcde
2,0 BAP/ 0 ANA T3 1.17 e
4,0 BAP/ 0 ANA T4 1.25 de
0 BAP/ 0,2 ANA T5 3.48 a
1,0 BAP/0,2 ANA T6 2.01 bcd
2,0 BAP/0,2 ANA T7 1.79 bcde
4,0 BAP/0,2 ANA T8 1.09 e
0 BAP/ 0,5 ANA T9 2.25 b
1,0 BAP/0,5 ANA T10 1.51 bcde
2,0 BAP/0,5 ANA T11 1.63 bcde
4,0 BAP/0,5 ANA T12 1.16 e
0 BAP/1,0 ANA T13 2.18 bc
1,0 BAP/1,0 ANA T14 1.64 bcde
2,0 BAP/1,0 ANA T15 1.35 cde
4,0 BAP/1,0 ANA T16 1.29 de Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.
Porém, a presença de citocinina combinada com auxina otimiza o
desenvolvimento vegetal em muitas espécies de orquídeas (Peres & Kerbauy, 2004). Long
et al. (2010) trabalharam com quatro espécies de Paphiopedilum, seus melhores
57
tratamentos em relação ao comprimento da parte aérea foram com auxina associada a
citocinina em maiores concentrações desses reguladores (4 mg L-1 BAP/ 0,5 mg L-1 ANA).
Abraham et al. (2012) observaram maiores comprimentos da parte aérea com citocininas
combinadas com auxina (3 mg L-1 BAP e 0,5 mg L-1 ANA) em protocormos de Coelogyne
nervosa em meio MS cultivados depois de 90 dias. Os melhores resultados para
crescimento também foram obtidos por Hossain et al. (2010) utilizando citocinina
igualmente combinada com auxina (2 mg L-1 BAP e 2 mg L-1 ANA) em PLBs (Protocorm-
like-bodies) de Cymbidium giganteum cultivados em meio Phytamax® após 30 dias.
3.3.3.2 Número de brotos
No período de 90 dias após a inoculação dos protocormos no meio de cultura,
observou-se a interação das concentrações 4 mg L-1 de BAP (T4) e 4 mg L-1 de BAP / 0,2
mg L-1 de ANA (T8) na produção de brotações com as maiores médias 13,17 e 14,05 de
brotos por explante, respectivamente (Tabela 3.4).
Tabela 3.4 Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de brotações de
Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado)
aos 90 dias de cultivo.
Descrição Tratamento Brotos
Controle T1 2.4 f
1,0 BAP/ 0 ANA T2 9.03 bcde
2,0 BAP/ 0 ANA T3 9.72 bc
4,0 BAP/ 0 ANA T4 13.17 a
0 BAP/ 0,2 ANA T5 2.45 f
1,0 BAP/0,2 ANA T6 9.03 bcde
2,0 BAP/0,2 ANA T7 9.32 bcd
4,0 BAP/0,2 ANA T8 14.05 a
0 BAP/ 0,5 ANA T9 2.11 f
1,0 BAP/0,5 ANA T10 6.3 e
2,0 BAP/0,5 ANA T11 7.78 bcde
4,0 BAP/0,5 ANA T12 9.81 b
0 BAP/1,0 ANA T13 2.1 f
1,0 BAP/1,0 ANA T14 6.6 de
2,0 BAP/1,0 ANA T15 6.22 e
4,0 BAP/1,0 ANA T16 6.75 cde Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.
58
Mahendran & Bai (2009) relataram que citocininas sem a presença de auxinas
promovem a proliferação de brotações em Satyrium nepalense, assim como ocorreu com o
tratamento T13. Sabe-se que, em muitas culturas, a indução de brotações e raízes
dependem do balanço entre auxinas/citocininas (Cid, 2005). Contudo, Vogel & Macedo
(2011) testando reguladores de crescimento combinados com thidiazuron (TDZ) e ácido-
indol-acético (AIA) discordaram desta afirmação, pois não obtiveram brotações em
Cyrtopodium glutiniferum.
Muitas vezes a adição exógena de reguladores de crescimento no meio de
cultura desencadeia mudanças do balanço hormonal endógeno dos tecidos de explantes.
Desse modo ao combinar auxina/citocinina exógena no meio pode-se alterar o balanço
interno das citocininas endógenas proporcionando uma resposta de indução a novos brotos
(Lemos, 2010).
De acordo com Da Silva (2003) e Hu & Wang (1983), altos níveis de ANA
inibem a formação de novas brotações. Para a espécie C. saintlegerianum as concentrações
mais altas de ANA também inibiram a formação de novas brotações.
As menores médias para número de brotações foram obtidas nos tratamentos
T1, T5, T9 e T13, exatamente os tratamentos sem a presença da citocinina BAP. Assim, foi
possível observar que tratamentos apenas com BAP são eficientes na indução de brotações
em C.saintlegerianum. Concordando com Vasudevan & Van Staden (2010); Soares et al.
(2010); Giatti & Lima (2007) e Ramos (2005) que maiores concentrações de BAP e outras
citocininas são eficientes para estimular brotações. Porém, é importante lembrar que estas
respostas estão associadas à interação genótipo/citocinina (Suzuki et al., 2004).
No entanto, no presente estudo apesar de ter obtido maiores números de brotos
nos tratamentos T4 e T8, as brotações apresentaram-se bastante agrupadas e com tamanho
reduzido. Fato este que poderia dificultar o desenvolvimento e o crescimento nas próximas
fases. Foi observado também que concentrações mais altas de BAP associadas com ANA
(T16) tiveram efeito inibitório, diminuindo o número de brotos e causando mortalidade de
10,81% dos protocormos recém-inoculados. Logo, há a necessidade de otimizar níveis
exógenos de reguladores de crescimento no meio para cada tipo de genótipo (Soares et al.,
2010). Segundo Cid (2000), altas concentrações de citocinina podem aumentar a ação da
citocinina-oxidase, inibindo a divisão celular e a indução de brotações. Desse modo, o
efeito tóxico caracteriza-se pelo excessivo ou baixo crescimento da planta, redução no
59
tamanho das folhas e aspecto de hiperhidricidade dos tecidos levando a sérios problemas
na fase de enraizamento (Leshen et al., 1988; Cid, 2000).
3.3.3.3 Número de folhas
Analisando a Tabela 3.5 é possível afirmar que o número de folhas foi
influenciado pelas altas concentrações de BAP combinadas com a ausência ou baixas
concentrações de ANA: tratamentos T3, T4, T6, T8 e T12. Maiores concentrações de BAP
sem auxinas foram avaliados também por (Roy et al., 2011) em experimentos com Vanda
coerulea.
Tabela 3.5 Efeito das concentrações de ANA e BAP na produção de folhas Cyrtopodium
santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado) aos 90 dias de
cultivo.
Descrição Tratamento Folhas
Controle T1 6.66 e
1,0 BAP/ 0 ANA T2 13.06 bc
2,0 BAP/ 0 ANA T3 16.18 ab
4,0 BAP/ 0 ANA T4 20.54 a
0 BAP/ 0,2 ANA T5 7.7 de
1,0 BAP/0,2 ANA T6 16.29 ab
2,0 BAP/0,2 ANA T7 13.21 bc
4,0 BAP/0,2 ANA T8 16.96 ab
0 BAP/ 0,5 ANA T9 6,22 e
1,0 BAP/0,5 ANA T10 7,02 e
2,0 BAP/0,5 ANA T11 8.07 cde
4,0 BAP/0,5 ANA T12 17.19 ab
0 BAP/1,0 ANA T13 5.61 e
1,0 BAP/1,0 ANA T14 10.63 cde
2,0 BAP/1,0 ANA T15 12.31 bcd
4,0 BAP/1,0 ANA T16 12.29 bcd Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.
Tratamentos com concentrações crescentes de ANA na ausência de BAP
resultam em um decréscimo no número médio de folhas: tratamentos T5, T9 e T13 (médias
7,7, 6,22, 5,61 respectivamente). Resultados semelhantes foram encontrados em
Phalaenopsis amabilis com o trabalho de (Ori, 2006) em que concentrações mais baixas de
60
ANA promoveram maior número de folhas e concentrações acima de 1 mg L-1 inibiram
essa variável. Souto et al. (2010) apresentaram resultados diferentes com maiores
concentrações de ANA (2 mg L-1) em Cattleya bicolor influenciaram positivamente o
aumento de folhas.
A resposta inconsistente dos reguladores de crescimento exógenos pode variar
de gênero para gênero e até mesmo de espécie para espécie (Arditti 1967). Em C.
saintlegerianum, as maiores médias para concentrações conjugadas de citocinina/auxina
foram os tratamentos T8 (16,96) e T12 (17,19). Porém, estas médias não apresentam
diferenças significativas entre os tratamentos T3 (16,18) e T4 (20,54) que utilizaram
apenas citocinina.
3.3.3.4 Número de raízes e comprimento da maior raiz
A Tabela 3.6 indica que tratamentos com os maiores valores para número e
comprimento de raízes foram o controle (T1) sem adição de reguladores de crescimento,
T5, T9 e T13 que possuem 0,2, 0,5 e 1,0 mg L-1 de ANA sem adição de BAP,
evidenciando o efeito negativo de citocininas na indução de enraizamento em C.
saintlegerianum. Resultados obtidos por Souto et al. (2010) com Cattleya bicolor
mostraram que a ausência de ANA foi significativa na inibição do alongamento radical e
concentrações mais elevadas de ANA (2 mg L-1) foram primordiais para o crescimento
desse órgão.
Resultados similares foram encontrados em Cattleya bicolor em que
concentrações mais altas de 0,5 e 1,0 mg L-1 de ANA promoveram maior número de raízes
(Souto et al., 2010). Zhao et al. (2008), em seu trabalho com Dendrobium candidum
constatou que concentrações acima de 0,5 mg L-1 de ANA reduzia o número de raízes, o
mesmo verificado por Da Silva (2003) com híbridos de orquídeas.
Auxinas são importantes reguladores frequentemente utilizadas no cultivo in
vitro para indução de raízes adventícias (Haissig, 1972; Cid & Teixeira, 2010), nesse caso,
as citocininas conjugadas são omitidas, sendo muitas vezes dispensáveis no meio de
cultura para o enraizamento (Santos-Serejo et al., 2006). Desse modo, tratamentos apenas
com a citocinina BAP (T3 e T4) se mostraram ineficientes inibindo raízes em C.
saintlegerianum, bem como tratamentos conjugados citocinina/auxina com maiores níveis
de BAP (T7, T8 e T11).
61
Tabela 3.6 Efeito das concentrações de ANA e BAP no número de raízes de
Cyrtopodium santlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado)
aos 90 dias de cultivo.
Descrição Tratamento Nº Raiz
Comprimento
da maior raiz
Controle T1 5.3 a 2.48 a
1,0 BAP/ 0 ANA T2 2 b 0.66 b
2,0 BAP/ 0 ANA T3 0 - 0 -
4,0 BAP/ 0 ANA T4 0 - 0 -
0 BAP/ 0,2 ANA T5 5.47 a 3.17 a
1,0 BAP/0,2 ANA T6 1.8 b 0.2 b
2,0 BAP/0,2 ANA T7 0 - 0 -
4,0 BAP/0,2 ANA T8 0 - 0 -
0 BAP/ 0,5 ANA T9 5.34 a 2.94 a
1,0 BAP/0,5 ANA T10 1.8 b 0.4 b
2,0 BAP/0,5 ANA T11 0 - 0 -
4,0 BAP/0,5 ANA T12 1.5 c 0.2 c
0 BAP/1,0 ANA T13 5.33 a 2.69 a
1,0 BAP/1,0 ANA T14 1.66 b 0.16 b
2,0 BAP/1,0 ANA T15 1.85 b 0.14 b
4,0 BAP/1,0 ANA T16 1.33 c 0.1 c Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.
O balanço entre reguladores de crescimento auxina/citocinina é de suma
importância na indução de caules e raízes para o desenvolvimento integrado da planta
(Peres & Kerbauy, 2004). Contudo, os tratamentos: T6, T10, T12, T14, T15 e T16 que
tiveram auxina/citocinina combinada indicaram baixas respostas em relação ao número de
raízes, não tendo, portanto, efeitos favoráveis no incremento desta variável.
O desenvolvimento final da planta depende da interação entre os sistemas
caulinares e radiculares, nos quais a interação auxina/citocinina tem posição primordial
nesse processo, favorecendo o crescimento e desenvolvimento completo desses órgãos que
são essenciais para a sobrevivência do vegetal (Peres & Kerbauy, 2004).
Em muitas situações, quando são abordados os efeitos sinérgicos dos
reguladores de crescimento em relação a algumas espécies vegetais, são comumente
desconhecidas as respostas quanto a capacidade de absorção, transporte e inativação pelo
tecido do regulador de crescimento aplicado. Evidências comprovam que as auxinas,
hormônio associado a indução de raízes, são predominantemente produzidas pelos brotos
62
(Davies, 1995) e as citocininas são produzidas pelas raízes estimulando o crescimento e a
produção de brotações (Pillay & Railton, 1983).
No entanto, há algumas espécies de orquídeas praticamente sem caules que não
se enquadram, de forma plena, neste contexto de desenvolvimento integrado. Assim, a
sobrevivência depende em grande parte da capacidade de realizar simultaneamente as
funções de ambos os sistemas, tornando-se materiais interessantes para estudos de
diferentes aspectos fisiológicos (Peres et al., 1997).
3.3.3.5 Formação de calos
Durante a avaliação dos tratamentos aos 90 dias de cultivo constatou-se a
formação de calos em todos os tratamentos, exceto no tratamento T5 (0,2 mg L-1 de ANA
sem BAP), após essa observação, essa variável foi incluída na avaliação dos tratamentos.
Na Tabela 3.7 é interessante observar que a formação de calos parece ter sido
favorecida em baixas concentrações de citocinina e ausência de auxina (T2, T3 e T4). No
entanto, não foi demonstrada diferença estatística entre a maioria dos tratamentos. A
formação de calos ocorreu até mesmo no tratamento controle (sem adição de regulador de
crescimento). Na Tabela 3.7 é possível observar um decréscimo da taxa de formação de
calos a medida que aumenta as concentrações de ambos reguladores.
A propagação via calo é considerada bastante difícil em comparação com
outras vias de regeneração (Roy et al., 2007). Ng et al. (2011) trabalhando com
protocormos de Paphiopedilum, com o objetivo de induzir a formação de PLBs
(Protocorm-like bodies), sugeriram que diferentes tipos de explantes têm diferentes
requisitos para vários tipos de reguladores de crescimento. Os autores testaram diferentes
citocininas (BAP e Kinetina) para a indução de calos a partir da haste floral de
Paphiopedilum, em meio MS ½ como meio de cultivo básico. Todos os tratamentos
tiveram altas taxas de produção de calos e formação de PLBs.
Sánchez (1988) trabalhando com reguladores de crescimento para regeneração
a partir de raízes de Cyrtopodium punctatum mostrou que altas concentrações de ANA (0,5
e 1,0 mg L-1) aumentaram a proliferação de calos e, em seguida, apresentaram oxidação e
morte dos explantes. Segundo Souza et al. (2006), auxinas em altas dosagens no meio de
cultura resulta na formação de calos e compromete a rizogênese e o crescimento da parte
aérea. Outros trabalhos tiveram as mesmas respostas com o uso da auxina ANA (Pedroza-
Manrique & Mican-Gutiérrez, 2006; Kuo et al., 2005).
63
Tabela 3.7 Efeito das concentrações de ANA e BAP na formação de calos de
Cyrtopodium saintlegerianum cultivadas in vitro em meio KC (modificado)
aos 90 dias de cultivo.
Descrição Tratamento Calos
Controle T1 3.83 c
1,0 BAP/ 0 ANA T2 11.73 a
2,0 BAP/ 0 ANA T3 8.36 b
4,0 BAP/ 0 ANA T4 8.58 b
0 BAP/ 0,2 ANA T5 0 -
1,0 BAP/0,2 ANA T6 6.08 b
2,0 BAP/0,2 ANA T7 7.08 b
4,0 BAP/0,2 ANA T8 7.2 b
0 BAP/ 0,5 ANA T9 3.33 c
1,0 BAP/0,5 ANA T10 6.83 b
2,0 BAP/0,5 ANA T11 2.5 c
4,0 BAP/0,5 ANA T12 6.93 b
0 BAP/1,0 ANA T13 4 bc
1,0 BAP/1,0 ANA T14 4.71 bc
2,0 BAP/1,0 ANA T15 4.6 bc
4,0 BAP/1,0 ANA T16 4.86 bc Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey no nível de 5%.
Tokuhara & Mii (2001) avaliaram o efeito de reguladores de crescimento
combinados na indução de calos em Phalaenopsis a partir de hastes florais. Melhores
resultados ocorreram com concentrações de 2,0 BAP / 0,1 mg L-1 ANA. Concentrações
mais altas de ANA (2,0 mg L-1) tornaram-se tóxicas, prejudicando a de sobrevivência dos
explantes.
3.4 CONCLUSÕES
O teste de tetrazólio é eficaz para verificação da viabilidade de sementes de
Cyrtopodium saintlegerianum
Para a germinação assimbiótica, sementes de Cyrtopodium saintlegerianum não são
exigentes em relação ao tipo de meio de cultura nos primeiros estádios da
germinação. Porém, nas últimas fases de desenvolvimento dos protocormos o meio
nutritivo KC modificado (Arditti, 1977) é o mais indicado.
64
Para o crescimento da parte aérea de plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum
germinadas in vitro não é necessária a adição de reguladores de crescimento ao
meio. Além disso, a adição de citocininas foi prejudicial ao crescimento de novas
folhas e dosagens de auxinas não diferiram do controle.
Para o surgimento de novas brotações, quanto maior a concentração de citocinina
no meio maior o número de novos brotos. A conjugação citocinina/auxina não
resultou em melhores resultados para esta variável.
O enraizamento de plântulas de Cyrtopodium saintlegerianum estabelecidas in vitro
não requer a adição de reguladores de crescimento. Embora tratamentos com
diferentes concentrações de auxina e sem a presença de citocinina tenham
estimulado o número e comprimento das raízes, as médias não foram
estatisticamente diferentes do tratamento controle. O efeito isolado da citocinina
mostrou ser o mais inibitório para o enraizamento.
Observou-se a formação de calos em todos os tratamentos, sem repicagens nem
indução com outros reguladores de crescimento.
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4 CITOGENÉTICA DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f.
(ORCHIDACEAE: Cyrtopodiinae)
RESUMO
O gênero Cyrtopodium Rchb. f. compreende 50 espécies de origem neotropical
distribuídas do sul da Flórida até o norte da Argentina. O centro de diversidade do gênero é
o Cerrado brasileiro, onde ocorrem pelo menos 28 espécies. A espécie Cyrtopodium
saintlegerianum Rchb. f. tem ampla distribuição geográfica no Brasil, sendo uma espécie
típica da região Centro-Oeste e de grande interesse para a domesticação e melhoramento
genético devido a suas características ornamentais. O número cromossômico das espécies
da subtribo Cyrtopodiinae ainda é pouco conhecido, o que tem dificultado a interpretação
das relações taxonômicas e filogenéticas entre diferentes gêneros e entre espécies de
grandes gêneros. Os dados cromossômicos são importantes, pois há a necessidade de se
avaliar maior número de espécies do grupo o que contribuirá de forma significativa para a
delimitação dos táxons infragenéricos e entendimento de suas relações filogenéticas. Além
disso, poderá garantir a preservação das espécies, inserir espécies do gênero em programas
de melhoramento genético, contribuindo para sua preservação. Logo, o presente estudo
consistiu da análise cromossômica mitótica da espécie C. saintlegerianum, sendo esse um
dado inédito para a referida espécie. O material vegetal foi proveniente de plantas
cultivadas in vitro em meio de cultura. Foram testados quatro protocolos, com diferenças
quanto a solução enzimática para o amolecimento das raízes, os corantes, concentração do
anti-mitótico e solução de hidrólise, e o uso de regulador de crescimento para indução de
raízes in vitro. Todos os protocolos tiveram em comum raízes pré-tratadas com anti-
mitótico 8-hidroxiquinoleína (0,002M) em geladeira durante 24 horas. Em seguida nos
protocolos as raízes foram fixadas em Carnoy 3:1 por 18 horas o primeiro e o segundo
protocolo e o terceiro e o quarto por 24 horas em temperatura ambiente. Depois estocados
a -20ºC no próprio fixador, para posterior análise (apenas o quarto protocolo). As raízes
dos protocolos foram coradas com diferentes corantes: hematoxilina, reativo de Schiff,
orceína acética e Giemsa respectivamente. O melhor protocolo avaliado para C.
saintlegerianum foi o quarto protocolo utilizando regulador de crescimento, no qual foi
obtido 42 metáfases, no entanto os cromossomos se encontravam condensados, e o numero
de cromossomos encontrado para a referida espécie foi de 2n=48.
Palavras chaves: Orquídea, Cerrado, cariótipo.
ABSTRACT
CYTOGENETIC OF Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. (ORCHIDACEAE:
Cyrtopodiinae)
71
The genus includes 50 species Cyrtopodium Rchb. f. source neotropical
distributed from southern Florida to northern Argentina. The center of diversity of the
genus is the Brazilian Cerrado, where there are at least 28 species. The species
Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. has a wide geographical distribution in Brazil, is a
typical species of the Midwest and of great interest to the domestication and breeding
because of their ornamental features. The chromosome number of the subtribe
Cyrtopodiinae is still poorly understood which has hindered the interpretation of
taxonomic and phylogenetic relationships between genders and between different species
of large genera. Chromosome data are important because there is a need to evaluate a
greater number of species of the group which will contribute significantly to the
delimitation of taxa and the understanding of their phylogenetic relationships. Besides
ensuring the preservation of the species, insert the genus in breeding programs,
contributing to its preservation. Therefore, the present study consisted of mitotic
chromosome analysis of the specie Cyrtopodium saintlegerianum, as the first report for
that specie. The plant material was derived from plants grown in vitro in culture medium.
We tested four protocols, with differences in enzyme solution for softening the roots, dyes,
anti-mitotic concentration of the solution and hydrolysis, and the use of growth regulators
for root induction in vitro. All protocols were in common roots pretreated with anti-mitotic
8-hydroxyquinoline (0.002 M) in refrigerator for 24 hours. Then protocols roots were fixed
in Carnoy 3:1 for 18 hours the first and second and third and fourth protocol for 24 hours at
room temperature. After stored at -20 º C in the same fixative for further analysis (only the
fourth protocol). The roots of the protocols were stained with different dyes: hematoxylin,
Schiff, acetic orcein and Giemsa respectively. The best protocol evaluated for C.
saintlegerianum was fourth protocol using growth regulator, which was obtained in 42
metaphases, however chromosomes were condensed, and the number of chromosomes
found for that species was 2n = 48.
Key words: orchid, cerrado, karyotype.
4.1 INTRODUÇÃO
A subtribo Cyrtopodiinae inserida na grande tribo CYMBIDIEAE compreende
doze gêneros que caracterizam-se por serem terrestres, rupícolas ou epífitos. Possuem
pseudobulbos bem marcados por anéis, folhas bastante longas multinervuradas e caducas, e
flores cuja coluna apresenta rostelo não saliente e polínias ceróides. Os gêneros brasileiros
mais conhecidos são Cyrtopodium, Galendra e Grobya (Pridgeon et al., 1999).
O gênero Cyrtopodium Rchb.f compreende 50 espécies de origem neotropical
distribuídas do sul da Flórida até o norte da Argentina (Romero-González et al., 2008).
São caracterizados por apresentarem vários nós, e após a floração as gemas axilares se
desenvolvem formando novos brotos (Caramaschi & Caldas, 1999). A inflorescência é
vigorosa e em grande número, apresentam brácteas em sua base de tamanhos
72
diferenciados, unduladas e coloridas algumas até mais vistosas que as próprias flores
(Cribb et al., 2003). O gênero é bastante resistente ao estresse hídrico e necessita de alta
luminosidade e grande período de insolação, além de substratos bem aerados para um bom
desenvolvimento (Dressler, 1981).
A subtribo Cyrtopodiinae quanto ao número cromossômico das espécies ainda é
pouco conhecida, o que tem dificultado a interpretação das relações taxonômicas e
filogenéticas entre diferentes gêneros e entre espécies de grandes gêneros (Félix & Guerra,
2000). Sobre o gênero Cyrtopodium apenas onze das cinquenta espécies existentes
(Romero-González et al., 2008) foram citologicamente analisadas. Tais espécies
apresentam pouca variação dos números cromossômicos com a ploidia variando de 2n = 44
a 2n =46 (Surenciski et al., 2007).
Nesse contexto, em decorrência da escassez de dados cromossômicos faz-se
necessária a avaliação de maior número de espécies vegetais que contribuirá de forma
significativa para a delimitação dos táxons infragenéricos, assim como o entendimento das
relações filogenéticas. Logo, o presente estudo consistiu da análise cromossômica mitótica
da espécie Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f., cujos dados foram comparados com
outras abordagens, de espécies do mesmo gênero disponíveis na literatura.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1 Material Vegetal
O material vegetal utilizado foi proveniente de cápsulas maduras de C.
saintlegerianum coletadas de uma população localizada no município de Mossâmedes, GO
(Latitude 16o 07.666' Sul e Longitude 050o 10.044' Oeste). Os experimentos foram
conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Goiás (LCTV).
As cápsulas foram lavadas em água corrente e detergente líquido neutro retirando a
primeira camada de sujeira vinda de campo. Posteriormente, as cápsulas foram
desinfestadas por um minuto em solução contendo álcool 70%, em câmara de fluxo
laminar, tratadas por quinze minutos com hipoclorito de sódio comercial (2,5% de cloro
ativo) e lavadas por três vezes consecutivas em água destilada autoclavada.
73
4.2.2 Germinação assimbiótica in vitro
O meio de cultura utilizado para a germinação das sementes foi o meio KC
modificado (Arditti et al., 1977). O pH foi ajustado para 5,8, a solidificação dos meios foi
feita com 0,6 % de ágar e autoclavados à temperatura de 120º C, por vinte minutos. Após a
autoclavagem, em câmara de fluxo laminar foram distribuídos 40 mL de meio em frascos
do tipo baby-food. O meio foi resfriado para em seguida ser usado para a inoculação das
sementes.
Em câmara de fluxo laminar a cápsula previamente desinfestada foi cortada
longitudinalmente com bisturi e com auxílio de uma pinça, uma das metades da cápsula foi
retirada. Aproximadamente 200 sementes foram distribuídas com uma espátula e semeadas
uniformemente nos frascos. Após a semeadura, os frascos permaneceram em sala de
crescimento, em condições de 16 horas de luz, intensidade luminosa de 35 µmol m-2 s-1 e
temperatura de 24°C ± 2°C por três meses. Após três meses, foi feita a primeira repicagem
das plântulas provenientes da germinação, em novo meio KC modificado para o
desenvolvimento das plântulas.
4.2.3 Testes para análises cromossômicas
Para obtenção de células mitóticas em C. saintlegerianum raízes de plântulas in
vitro foram submetidas inicialmente a três diferentes protocolos. A diferença entre os
protocolos utilizados foram o uso da solução enzimática celulase/pectinase para obter
raízes mais macias para o esmagamento lâmina-lamínula, testar qual o corante mais
eficiente para a espécie, o tempo de exposição ao anti-mitótico (8-hidroxiquinoleína) e a
concentração da solução de ácido clorídrico para hidrolizar as raízes. Foi testado um quarto
protocolo com dois tratamentos diferenciados para observar se havia diferença na obtenção
de raízes induzidas ou não com regulador de crescimento ácido α-naftalenoacético (ANA).
Nesse protocolo foi utilizado também nitrogênio líquido para acelerar o congelamento do
conjunto lâmina-lamínula na retirada da lamínula e outro tipo de corante, a fim de
melhorar a coloração das células mitóticas. Todos os protocolos foram testados segundo as
recomendações de Guerra e Souza (2002) e Mondin & Neto (2006) para citogenética
vegetal.
74
4.2.3.1 Protocolo de digestão enzimática com celulase/pectinase
Em câmara de fluxo laminar pontas de raízes foram coletadas de plantas in vitro
e seccionadas em cortes de três centímetros em seguida as raízes foram submetidas ao pré-
tratamento com 8-hidroxiquinoleína (0,002M), em geladeira, durante 20 horas. Em
seguida, as raízes foram fixadas em Carnoy 3:1 por 18 horas em temperatura ambiente.
Foram lavadas três vezes em água destilada por cinco minutos, e hidrolisadas em ácido
clorídrico 1N por 20 minutos. Posteriormente, as raízes foram mantidas imersas em
solução enzimática de celulase 2% e pectinase 3% a 37 ºC no banho-maria em tempos
variados de 10 a 30 minutos, até ficarem macias. As pontas das raízes foram transferidas
para uma lâmina limpa, e esmagada com lamínula, em seguida o conjunto lâmina-lamínula
foi congelada no freezer a -20 ºC por 20 minutos para a retirada da lamínula. Deixou-se a
lâmina secar ao ar e em seguida gotejou uma gota de hematoxilina 1% sobre a mancha de
células espalhadas na lâmina, cobriu com uma nova lamínula (a coloração é instantânea)
para ser em seguida examinada.
4.2.3.2 Protocolo usando corante reativo de Schiff seguido de esmagamento
Os primeiros passos foram idênticos ao protocolo anterior. No preparo das
lâminas, as raízes foram lavadas duas vezes em água destilada por cinco minutos,
hidrolisadas em ácido clorídrico 1N por 20 minutos, novamente lavadas em água destilada
por cinco minutos. Em seguida foram imersas no corante reativo de Schiff por trinta
minutos. Após a coloração as raízes foram lavadas gotejando-se água destilada
constantemente por alguns segundos, até a retirada do excesso de corante. Posteriormente,
sob uma lâmina limpa foi pingado uma gota de carmin acético 1% junto com a ponta da
raiz, sendo posteriormente esmagada com auxílio da lamínula para posterior visualização
em microscópio Leica® com sistema de câmera integrada e software Leica®.
4.2.3.3 Protocolo usando corante orceína acética seguido de esmagamento
Em câmara de fluxo laminar raízes de plântulas in vitro foram seccionadas em
cortes de três centímetros e submetidas ao pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína
(0,002M), em geladeira, durante 24 horas. Em seguida, as raízes foram fixadas em Carnoy
75
3:1 por 24 horas em temperatura ambiente e depois estocados a -20 ºC no próprio fixador.
Após serem fixadas, as raízes foram lavadas três vezes em água destilada por cinco
minutos, hidrolisadas em ácido clorídrico 5N por 20 minutos, novamente lavadas em água
destilada por cinco minutos. Em seguida as raízes foram coradas convencionalmente com
orceína acética 2% por 30 minutos, para a coloração convencional das raízes. Após a
coloração, sob uma lâmina limpa as pontas das raízes foram seccionadas deixando apenas
o meristema, e esmagadas com auxílio da lamínula, para posterior visualização em
microscópio óptico.
4.2.3.4 Protocolo usando raízes tratadas com regulador de crescimento
Nesse protocolo inicialmente as plântulas in vitro foram repicadas e divididas
em dois tratamentos a fim de induzir raízes com regulador de crescimento e observar se
havia diferença na visualização dos cromossomos. O primeiro tratamento consistiu em
plântulas repicadas em meio KC modificado (Arditti et al., 1977) com 1,0 mg L-1 de ácido
α-naftalacético (ANA). O segundo tratamento foi utilizado o mesmo meio sem regulador
de crescimento. Foram feitas seis repetições para cada tratamento, sendo mantida em sala
de crescimento por mais trinta dias para indução de novas raízes.
Plântulas nos frascos in vitro foram submetidas a temperatura controlada de
28ºC por dois dias em estufa. Posteriormente, foram realizadas as análises mitóticas dessas
plântulas, nas quais foram utilizadas pontas de raízes em tratamentos separados, sendo T1
– raízes provenientes dos tratamentos com regulador de crescimento e T2 – pontas de
raízes sem regulador de crescimento.
Em câmara de fluxo laminar raízes dos dois tratamentos foram seccionadas em
cortes de três centímetros e submetidas ao pré-tratamento com 8-hidroxiquinoleína
(0,002M), em geladeira, durante 24 horas. Em seguida, os dois tratamentos foram fixados
em Carnoy 3:1 por 24 horas em temperatura ambiente e depois estocados a -20º no próprio
fixador, para posterior análise.
No preparo das lâminas, as raízes dos tratamentos foram lavadas três vezes em
água destilada por cinco minutos, hidrolisadas em ácido clorídrico 5N por 20 minutos,
novamente lavadas em água destilada por cinco minutos. Com auxílio de um microscópio
estereoscópico para melhor visualização do meristema a ponta da raiz foi esmagada em
ácido acético 45% com a lamínula. As lâminas foram congeladas em nitrogênio líquido por
76
alguns segundos, para remoção da lamínula e, em seguida, coradas convencionalmente
com Giemsa 3% Merck® por oito minutos.
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
No primeiro protocolo testado não foi possível fazer coloração convencional
das raízes testadas, pois com o uso da solução enzimática celulase-pectinase em todos os
tempos testados a digestibilidade da parede celular foi severa, ou seja, as raízes ficaram
totalmente amolecidas. A atividade da solução enzimática celulase-pectinase favorece o
preparo das lâminas na citogenética, deixando as raízes mais macias e fáceis de serem
esmagadas com o auxílio da lamínula para posterior coloração. A solução enzimática é
muito utilizada quando as raízes são muito rígidas dificultando seu manuseio,
principalmente em gramíneas (Guerra & Souza, 2002). No entanto, essa técnica não foi
aplicável para raízes de orquídeas in vitro, pois as deixaram totalmente digeridas
impedindo a obtenção de células mitóticas e posterior coloração para serem analisadas.
No segundo protocolo foram obtidas cinco lâminas e oito metáfases pouco
coradas e de difícil visualização (Figura 3.6). As metáfases se encontravam bastante
fechadas dificultando a contagem dos cromossomos. Foi utilizada a coloração
convencional de Feulgen (reativo de Schiff) por um período de trinta minutos.
Segundo Guerra & Souza (2002) a coloração com reativo de Schiff pode variar
de trinta minutos a duas horas para obter células bem coradas. Conforme os mesmos
autores, essa é uma coloração clássica de bons resultados e que dispensa a retirada da
lamínula, contudo a intensidade da coloração, nesse caso, depende muito das condições de
fixação e hidrólise, alem de ser melhor aplicada em espécies com cromossomos maiores,
não sendo o caso das espécies de orquídeas.
Para o terceiro protocolo foram adotadas as recomendações de Guerra & Souza
(2002), utilizando tempo maior do pré-mitótico de 24 horas e maior concentração do ácido
clorídrico 5N para hidrolisar as raízes. No entanto, nesse procedimento, foram obtidas
lâminas com excesso de coloração, impedindo a visualização das células no microscópio.
As lâminas foram observadas apenas em microscópio óptico e não foram fotografadas.
De acordo com os mesmos autores, em cromossomos pequenos devem ser utilizados
corantes como Giemsa e hematoxilina que garantem uma coloração mais intensa e menos
contrastada dos cromossomos.
77
Figura 3.6 Metáfases mitóticas pouco coradas e de difícil visualização utilizando o
protocolo 2 para pontas de raízes de Cyrtopodium saintlegerianum obtidas de
plântulas germinadas e desenvolvidas in vitro. Setas indicam células em
metáfases. Barra = 36 μm.
No quarto protocolo foram obtidas quinze lâminas e 42 metáfases no total com
melhor contraste na coloração e melhor visualização. Entre as 42 metáfases obtidas, 17
eram originadas de raízes de plântulas do tratamento com reguladores (T1) e 25 metáfases
do tratamento sem regulador de crescimento (T2). Os tratamentos analisados de C.
saintlegerianum apresentaram núcleos interfásicos semi-reticulados com cromatina
condensada. Em ambos os tratamentos foram obtidos metáfases, nas quais os cromossomos
se encontravam condensados, e após a contagem de 42 metáfases, o número cromossômico
foi de 2n=48 (Figura 3.7). Em relação à condensação dos cromossomos supõe-se que pode
ter ocorrido aderência entre os cromossomos. Guerra & Sousa (2002) afirmam que o tempo
78
ideal para o pré-tratamento com o anti-mitótico pode variar entre as espécies, além da
temperatura e concentração serem primordiais para o sucesso da análise.
Figura 3.7 Metáfases mitóticas e núcleos interfásicos visualizados após utilização do
protocolo 4 para pontas de raízes de Cyrtopodium saintlegerianum obtidas de
plântulas germinadas e desenvolvidas in vitro. Tratamento (T1) com
regulador de crescimento ANA (A e B); Tratamento (T2) sem regulador de
crescimento (C e D). Barra = 50 μm.
Não houve diferença entre os tratamentos com e sem regulador de crescimento
para na indução de raízes in vitro quanto à visualização das células mitóticas, os dois
tratamentos se mostraram idênticos. Porém, maior número de raízes, principalmente pontas
novas, foi obtido no tratamento com regulador de crescimento ANA. Sabe-se que auxinas
têm o importante papel em promover o alongamento celular e a morfogênese vegetal. É
também determinante na divisão celular em diferentes processos. A auxina aumenta o
conteúdo de cinases dependente de ciclina do tipo (CDK/a) e, nesse contexto, a divisão
consiste em uma série de alternância de fases que são reguladas pela atividade de algumas
proteínas, particularmente as cinases dependentes da ciclina. Assim a célula adquire a
capacidade de passar para a fase seguinte iniciando a síntese de DNA (Mercier, 2004).
79
Os estudos sobre citogenética de orquídeas são considerados insuficientes,
visto que é uma importante ferramenta para o entendimento da evolução, genética e
estabilidade cariotípica das espécies, assim como as lacunas filogenéticas e as tendências
evolutivas da família (Daviña et al., 2009). Até o momento, são conhecidos os números
cromossômicos de poucas espécies do gênero Cyrtopodium (Tabela 3.8).
Tabela 3.8 Lista de espécies do gênero Cyrtopodium com os respectivos números
cromossômicos (2n).
Espécies 2n Referência
Subtribo Cyrtopodiinae
Cyrtopodium hatschbachii Pabst 46 Surenciski et al., 2007
C. palmifrons Rchb. f & Warm. 46 Felix & Guerra, 2000
Cyrtopodium blanchetii Rchb. f 92 Felix & Guerra, 2000
C. gigas (Vell.) Hoehne 46 Felix & Guerra, 2000
C. inaldianum L.C. Menezes 46 Felix & Guerra, 2000
C. intermedium Brade 46 Felix & Guerra, 2000
C. paranaense Schltr. 46 Felix & Guerra, 2000
C. eugenii Rchb. f. 44 Felix & Guerra, 2000
C. andessonii (Lamb. ex Andrews) R. Br. 46 Aoyama, 1989
C. punctatum (L.) Lindl 46 Aoyama, 1989
De acordo com Surenciski et al. (2007) o gênero Cyrtopodium tem dois
números básicos de cromossomos, 2n=44 e 2n=46, pois a maioria das espécies são
diplóides, não apresentando significativa variabilidade em número cromossômico. Os
resultados apresentados para C. santlegerianum, com 2n=48, indicam um novo número
cromossômico para o gênero., com importantes desdobramentos em relação às relações
filogenéticas entre as espécies.
Muitos protocolos são utilizados para melhorar a eficiência do teste. Para
vegetais, a 8-hidroxiquinoleína é um anti-mitótico bastante empregado na concentração de
0,002%, podendo haver variação no tempo do tratamento. No protocolo utilizado por
Surenciski et al. (2007) as raízes de plantas in vitro foram tratadas em solução de 8-
hidroxiquinoleína por cinco horas a 25ºC. Ao contrário de Felix & Guerra (2000) que
utilizaram o mesmo anti-mitótico, porém em tempo e temperatura diferenciadas (24 horas
a 4ºC) em raízes in vivo, seguindo o protocolo de Guerra & Sousa (2002).
Outros procedimentos que podem variar são o fixador e o tempo de exposição,
além dos corantes e suas concentrações. Diferentemente do utilizado nesse trabalho,
80
Surenciski et al. (2007) fixaram as raízes em solução de ácido lático e álcool etílico 5:1 por
12 horas a 4ºC e coraram as lâminas por 8 minutos com reativo de Schiff. Felix & Guerra
(2000) fixaram as raízes em Carnoy 3:1 (acido acético/álcool etílico) por um período que
variou de 3 a 24 horas em temperatura ambiente, e em seguida, foram estocadas no próprio
fixador em temperatura de -20ºC. Apesar dos protocolos serem diferenciados, o resultado
foi satisfatório para todas as espécies testadas (Anexo 1). Assim, é necessário adequar o
protocolo para a espécie estudada, testando reagentes, concentrações, tempo e temperatura
ideais, para obter metáfases de qualidade, visando, além da obtenção do número
cromossômico, a montagem do cariótipo e a classificação dos cromossomos, de acordo
com o tamanho e a posição dos centrômeros.
A subfamília Epidendroideae, na qual está inserida a subtribo Cyrtopodiinae, é
um grupo que compreende 18.000 espécies e 650 gêneros (Cribb & Chase, 2006). Essa
família possui grande diversidade morfológica em cores, tamanhos e formas (Dressler,
1993) além de alta variação cariotípica como Psygmorchis pusilla com número
cromossômico 2n=10 e Epidendrum cinnabarinum com 2n=240. Desse modo, essa ampla
variação em números cromossômicos remete a grande diversidade taxonômica que o grupo
possui. Nesse contexto, grandes heterogeneidades numéricas em populações naturais
estabelecem um eficiente mecanismo de isolamento reprodutivo, com destacado
desempenho na especiação (Levin, 2002). Entretanto, poucos são os registros cariotípicos
do gênero Cyrtopodium, tendo em vista que é um grupo com grande potencial ornamental,
é necessário um conhecimento maior das espécies do gênero para a obtenção de um
cenário concreto sobre a evolução cromossômica para inserí-la em futuros programas de
melhoramento.
4.4 CONCLUSÕES
Dos protocolos utilizados, o mais eficiente para obtenção de células em metáfases
com melhor contraste e coloração foi o protocolo utilizando regulador de
crescimento, no qual foi utilizado o corante Giemsa 3%.
Não houve diferença entre os tratamentos do protocolo utilizado com e sem
regulador de crescimento na visualização das metáfases. Contudo, o tratamento
utilizado para induzir raízes in vitro foi eficaz, promovendo pontas de raízes novas.
81
Foram obtidas metáfases com núcleos interfásicos semi-reticulados e cromatina
condensada. O novo número cromossômico obtido para a espécie Cyrtopodium
saintlegerianum foi 2n=48.
4.5 REFERÊNCIAS
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83
5 CONCLUSÕES GERAIS
Em virtude do grande numero de artigos sobre germinação assimbiótica utilizando
reguladores de crescimento, sugere-se testar o efeito dos reguladores de
crescimento na germinação in vitro de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum.
Para o desenvolvimento de protocormos ou plântulas de Cyrtopodium
saintlegerianum sugere-se testar outros reguladores de crescimento (citocinina e
auxina) conjugados ou não, a fim de induzir, brotações, enraizamento, crescimento
ou regeneração de plantas a partir de calos.
Recomenda-se testar novos protocolos, com tempos diferenciados do anti-mitótico,
temperatura e concentração da solução para a referida espécie. O objetivo é obter
maior contração cromossômica permitindo visualizar melhor as constrições
primárias e secundárias, para definir a morfologia dos cromossomos de C.
saintlegerianum.
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6 ANEXO
Anexo 1 Comparação de metáfases mitóticas de protocolos diferenciados das
espécies: Cyrtopodium intermedium 2n=46 (A), Cyrtopodium inaldianum
(2n = 46) (B), Cyrtopodium gigas (2n = 46) (C) Imagens de Felix & Guerra
(2000); Cyrtopodium hatschbachii (2n=46) (D) imagem de Surenciski et al.
(2007).