Dasar Teori Pemeriksaan mikroskopik koloni kuman/isolat yang tumbuh pada medium untuk membantu identifikasi. Untuk jenis pemeriksaan ini bakteri perlu diwarnai terlebih dahulu. Berbagai teknik pewarnaan dipergunakan untuk identifikasi, seperti pewarnaan Gram yang membedakan bakteri dalam 2 kelompok yaitu positif Gram dan negatif Gram, pewarnaan Ziehl Nielseen untuk bakteri tahan asam, pewarnaan Gins-Burry untuk kapsul, pewarnaan untuk spora dsb. Untuk mempelajari struktur berbagai macam jamur, misalnya Candida sp. digunakan pewarnaan adalah LPCB (Lactophenol Cotton Blue) 0,05 %. Pewarnaan Gram dapat juga digunakan untuk mewarnai sel ragi. Pewarnaan Gram merupakan suatu pewarnaan diferensial, yang membedakan bakteri dalam 2 golongan berdasarkan kemampuannya mempertahankan zat warna pertama (primary stain) yaitu zat warna ungu kristal karbol. Bakteri yang mampu mempertahankan zat warna pertama disebut positif Gram, sedangkan bakteri negatif Gram adalah bakteri yang melepaskan zat warna tersebut dan mengikat zat warna kedua (counter stain) yaitu Safranin. Pewarnaan Gram adalah teknik pewarnaan yang penting karena implikasinya pada pemilihan antibiotika untuk terapi, yaitu antibiotika untuk golongan kuman positif Gram atau negatif Gram.Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna.Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna.Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membrane sel Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.Cirri-ciri gram negative:a.Struktur dinding selnya tipis,sekitar 10-45mm,berlapis tiga atau multi layer.b.Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku,sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.c.Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.d.Tidak resisten terhadap gangguan fisik.Ciri-ciri bakteri gram positif:a.Struktur dindingnya tebal.b.Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal.c.Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin.d.Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal.e.Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit.f.Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Alat dan bahana. Alat :

1.Jarum ose2.Bunsen3.Cawan petri4.Tissue5.Pipet tetes6.Objek glass7.Mikroskop8.Rak pewarnaan

b. Bahan :

1.NaCl 0,1 N2.Aquadest3.Larutan gention violet4.Larutan fuchsin5.Larutan lugol6.Alkohol 96%

Daftar pustaka :Buku Penuntun Praktikum Modul Gastrointestinal Universitas PalangkarayaRepository.usu.ac.ad