de la génomique aux outils de diagnostic rapides : applications industrielles etat des travaux du...
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De la génomique aux outils de diagnostic rapides :
Applications industrielles
Etat des travaux du projet BOARDBacilles thermorésistants: des Outils
d’Analyses au Recensement des Dangers
Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected]
ADRIA, centre de transfert
technologique
Modélisation– Formulation, durée de vie, process– Microbiologie prévisionnelle
Qualité & sécurité de l’aliment au long de sa durée de vie
Hygiène de production, maîtrise des flores d’intérêt
Outils de diagnostic– Détection, identification, traçabilité– Microbiologie, moléculaire
Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected]
ADRIA, centre de transfert
technologqiue
Modélisation– Formulation, durée de vie, process– Microbiologie prévisionnelle
Réponse à des attentes : développement de produit,
i.e. expertises, outils, transfert
Outils de diagnostic– Détection, identification, traçabilité– Microbiologie, moléculaire
Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected]
(Re) émergence de bactéries
…Bactéries sporulées
…Un bref état des lieux!Travaux en coursPerspectives & discussion
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Productions primaires
C. perfringens dans les élevages
1 Craven SE et al. 2001, Avian dis 45:887-896 2 Tansuphasiri et al. 2005, Southeast Asia J Trop Med Public Health 36:954-961
3 Van Immerseel F et al. 2004, Avian pathol 33:537-549
- colonisation du tractus intestinal de volaille, porc
- contamination des environnements primaires
- augmentation de l’antibiorésistance des isolats2
- augmentation de l’incidence d’entérite nécrotique chez les volailles suite à l’arrêt des antibiotiques comme facteurs de croissance3
les phénomènes de colonisation du tractus intestinal et de synthèse de toxines restent encore mal connus
Contamination des viandes…plats cuisinés et Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collectiverestauration collective33!!
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Productions secondaires
Bacillus Hautement Thermorésistant dans le lait UHT (HRS)
- Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans 1,2
Lait UHT
Homologie des empreintes génétiques
Lait cruHétérogénéité des empreintes génétiques
1 Scheldeman P et al. 2006, J Appl Microbiol 101:542-555 2 Olivier Guillaume-Gentil et al. 2004, Appl. Env. Microbiol 68:4216-4224
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Productions secondaires
Bactéries HRS dans les produits appertisés
- Moorella …-…Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans, Paenibacillus
Bactéries HRS et acidophiles dans les pectines de fruit
- Alicyclobacillus
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Productions secondaires
Bacillus psychrotrophes dans les produits pasteurisés, conservés au froid
- groupe groupe B. cereusB. cereus émétique émétique : B. weihenstephanensis 1
+ 45 % entre 1999 et 2005 des
produits réfrigérés prêts à l’emploi
1Thorsen L et al. 2006, Appl Environ Microbiol 72:5118-51212 Hoffmaster AR et al, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101:8449-54.
- à noter : transfert du plasmide de B. anthracis vers B. cereus 2
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Altérations!
Adaptation ou sélection par le process ?Etude de prévalence et analyse des dangers
Bactéries sporulées, sélectionnées par les process ou adaptées aux process…
– ovoproduits– poudre de lait– produits pasteurisés conservés au froid– produits UHT– produits appertisés– …etc
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Prévalence et analyse des dangers
Quand la microbiologie fait défaut…
– dénombrements des spores après traitement thermique– dénombrement de B. cereus– dénombrement de C. perfringens Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus,
Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Morella, Paenibacillus…
Biodiversité de genres, d’espèces et de caractéristiques physiologiques, et donc de génomes!
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(Re) émergence de bactéries
…Bactéries sporulées
…Un bref état des lieux!BOARDPerspectives & Discussion
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Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers
Filières impliquées
DRAFDIRECTION REGIONALEDE L’AGRICULTURE ET DE LA FORET
MINISTERE DE L’AGRICULTURE
ET DE LA PECHE
DRAFDIRECTION REGIONALEDE L’AGRICULTURE ET DE LA FORET
DRAFDIRECTION REGIONALEDE L’AGRICULTURE ET DE LA FORET
MINISTERE DE L’AGRICULTURE
ET DE LA PECHE
MINISTERE DE L’AGRICULTURE
ET DE LA PECHE
BOARD
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BBA (Bretagne Biotechnologies Alimentaires) animé par le Pôle Agronomique OuestADRO Ouest animé par le Pôle Agronomique Ouest
Sociétés des produits de la mer et produits appertisés
Partenaires
Partenaires industriels
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Partenaires industriels
PME
Centres R&D
Partenaires
Sylvie HallierPatrice ChablainStéphane Bonilla
Danièle SohierFlorence Postollec
Ivan Leguérinel
Florence Baron
Michel GauthierSophie Jan
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Développement d’un outil de diagnostic moléculaireDéveloppement d’un outil de diagnostic moléculaire
détection &détection &
identificationidentification
alimentaliment
BOARD : Objectifs
- la détermination de leur prévalence en IAA pour une meilleure analyse des risques et évaluation des meilleure analyse des risques et évaluation des
dangersdangers
permettant, à partir de matrice alimentaire ou ingrédient, - la détection & identification de
bactéries sporulées
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Programme R&D
Cahier des charges Sélection des genres, espèces cibles
Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus, Moorella, Paenibacillus B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. sporothermodurans, B. weihenstephanensis, B. laterosporus
Seuil de détection > 10/g et résultats à J1
Enrichissement over-night
Outil multi-cibles, avec des contraintes de coûts
PCR multi-multicilbes plutôt qu’une biopuce….GeneDisc!
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Objectif Objectif
détecter une contamination
< 10 spores/g
Échantillon (10mL)
2-Kit d’extraction
1-GeneExtract
Extrait d’ADN(300µL)
Échantillon (10mL)
2-Kit d’extraction
1-GeneExtract
Échantillon (10mL)
2-Kit d’extraction
1-GeneExtract
Extrait d’ADN(300µL)
Protocole d’extraction
ExtraitMix réactionnel
GeneDisc Cycler
détection du gène cible
ExtraitMix réactionnel
GeneDisc Cycler
ExtraitMix réactionnel
GeneDisc Cycler
détection du gène cible
Protocole d’amplificationExtraction
PCR temps réel
25g aliment + diluant
Enrichissement 20h, 37°C
Extraction
Protocole
Programme R&D
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Programme R&D
GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes
– Exploiter et séquencer !
Recherche de séquences cibles dans les bases de données & séquençage complémentaire
Valider l’identification de la collection pour les tests de spécificité Valider les conditions d’enrichissement / Phylogénie Séquences cibles…
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Arbre phylogénétique
C. perfringens
Brevibacillus laterosporus
Paenibacillus
B. cereus
Alicyclobacillus acidoterrestris
Moorella thermoacetica
Anoxybacillus flavithermus
Geobacillus stearothermophilus
B. subtilis
B. pumilus B. licheniformis
B. circulans
B. weihenstephanensis
30°Caérobie
37°C+/- aérobie
37°CANaérobie
55°CANaérobie
55°Caérobie
Programme R&D
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25g matrice
+ 100ml RCM
Inoculation aux concentrations désirées
20h à 37°Cananaeaerobiose
20h à 55°Cananaerobiose
20h à 55°Caerobiose
20h à 30°Caerobiose
Extraction
Détection & identification par PCR en temps réel
Programme R&D
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Programme R&D
GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes
– Analyses et alignement des séquences Sélection de sondes oligonucléotidiques Optimisation des mélanges réactionnels
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Deux GeneDisc
Bacillus Paenibacillus, Anoxybacillus Geobacillus
GeneDisc1: Genres
Clostridium Moorella contrôles
Programme R&D
B. cereus B. mycoides B. pumilus B. subtilis contrôles
B. laterosporus Bacillus
GeneDisc2: Bacillus spp.
B. licheniformis B. thuringiensis B. sporothermodurans B. weihenstephanensis
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Programme R&D
Validation de la méthode
– Inclusivité et exclusivité
– Niveau de détection
– Exactitude Matrices artificiellement contaminées
Matrices naturellement contaminées : dénombrement des spores et identification par séquençage
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(Re) émergence de bactéries
…Bactéries sporulées
…Un bref état des lieux!Travaux en coursPerspectives & discussion
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Perspectives & discussion
Prévalence des flores sporulées et analyse des dangers Evolution des GeneDisc en fonction de l’état des connaissances : description des espèces et acquisition de séquences BOARD : exemple concret de la génomique aux applications industrielles !…ANR MEMOSPORE
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Horror vacui…
Bactéries sporulées : vers une adaptation aux process de production et de conservation ?– « La nature a horreur du vide.
Mais d’autant qu’il ne saurait y avoir d’espace vide en aucun endroit de l’univers, et que les parties de la matière, étant rondes, ne sauraient se rejoindre si étroitement ensemble, qu’elles ne laissent plusieurs petits intervalles au recoin entre elles : il faut que ces recoins soient remplis de quelques autres parties de cette matière. »
Descartes, Principa philosophiae, 1644
Merci pour votre attention!
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