de tai tran thi thanh thao vs32

8/6/2019 De Tai Tran Thi Thanh Thao VS32

http://slidepdf.com/reader/full/de-tai-tran-thi-thanh-thao-vs32 1/47

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VIKHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TR ÊN NEM CHUA

Họ và tên sinh viên: TR ẦN THỊ THANH THẢONgành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨMNiên khóa: 2006 - 2010

Tháng 08/2010



ii

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨNLACTIC PHÂN LẬP TR ÊN NEM CHUA

Tác gi ả

TR ẦN THỊ THANH THẢO

Khóa lu ận được đệ tr ình đề để đáp ứng yêu cầucấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo quản chế biến nông sản và vi sinh th ực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:Tiến sĩ Hồ Thị Nguyệt Thu

Tháng 08/2010



- 1 -

LỜI CẢM TẠ

Với tấm lòng tôn s ư trọng đạo, em xin chân thành cảm ơn Qúy Thầy Cô TrườngĐại học Nông Lâm, đặc biệt là các Th ầy Cô Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình

dạy bảo trong những năm vừa qua, truyền đạt những kiến thức quý báu để làm hành

trang cho em bước vào đời.

Xin chân thành c ảm ơn Cô Hồ Thị Nguyệt Thu đã tận tình hướng dẫn, truyền

thụ kinh nghiệm, cũng như tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá tr ìnhhọc tập và thực hiện đề tài.

Xin ghi nh ớ công ơn của Cha Mẹ đã không qu ản mọi gian lao khó nhọc và sự

hy sinh cao c ả để cho con có được ngày hôm nay.

Xin gửi đến những người thân yêu, các anh ch ị và các b ạn lớp DH06VT lời cảm

ơn sâu sắc.

Sinh viên

Tr ần Thị Thanh Thảo



- 2 -

TÓM TẮT

Nem chua là m ột sản phẩm lên men truy ền thống rất phổ biếncủa Việt Nam,được ưa thích bởi vị chua tự nhiên và c ấu tr úc giòn, dai đặc trưng. Tuy nhiên, bên cạnhđó, vấn đề chất lượng vệ sinh đang là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng l ẫnngười sản xuất.

Với nguyện vọng cải thiện hơn nữa chất lượng của sản phẩm về mặt vệ sinh và

định hướng phát triển nem chua thành th ực phẩm chức năng, chúng tôi thực hiện đề tài

“Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập tr ên nem chua” nh ằmtìm ra các ch ủng vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng l ại vi khuẩngây bệnh, ổn định chất lượng sản phẩm.

Chúng tôi ti ến hành nghiên c ứu tr ên các m ẫu nem ở 5 cơ sở khác nhau. Trongđó, 3 cơ sở (Bà Chín, Ninh Hòa và N ăm Thu) sử dụng lên men t ự nhiên trong khi 2 cơ sở còn lại (Vissan và Giáo Thơ) thựchiện lên men có định hướng. pH bột thịt được đolường vào ngày lên men th ứ tư của nem chua. Vi khuẩn lactic trong bột thịt nem ngày

này c ũng được đếm tổng lượng, phân lập, khảo sát các đặc tính sinh hóa và tìm hi ểukhả năng sinh bacteriocin của chúng.

K ếtquả đo lường cho thấy, pH bột thịt ngày thứ 4 ở ba cơ sở lên men t ự nhiên

khác nhau không có ý ngh ĩa (p > 0,05); trong đó, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH

thấp nhất (4,34 0,03). Đối với hai cơ sở lên men có định hướng, phân tích thống k ê

cho th ấy pH bột th ịt ngày 4 c ủa chúng khác nhau một cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05); trong

đó, Vissan có giá trị pH thấp hơn (4,150,03).

Tổng lượng vi khuẩn lactic ngày 4 c ủa các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men t ự nhiên

khác nhau m ột cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05). Nem ngày 4 c ủa cơ sở Năm Thu (1,62.108

CFU/g) cao hơn hai cơ sở còn lại (lần lượt là 1,43.10 8 và 1,29.10 8 CFU/g). Đối với 2cơ sở lên men có định hướng, Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn lactic (lần lượlà 1,15.10 9 và 3,08.10 8 CFU/g) cao hơn rất nhiều so với 3 cơ sở lên men t ự nhiên. Gi ữahai cơ sở lên men định hướng, sự khác biệt về tổng lượng vi khuẩn lactic nem ngày 4

là r ất có ý nghĩa (p ≤ 0,001).Chúng tôi ghi nh ận được 7 dạng vi khuẩn lactic tại 5 cơ sở khảo sát; trong đó,

đa phần có dạng que (chiếm 81,82% cácchủng vi khuẩn kiểm tra).



- 3 -

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic, chúng tôi nhậnthấy có 01 chủng vi khuẩn thuộc dạng VII ở nem Ninh Hòa có kh ả năng kháng lạiStaphylococcus aureus ssp . aureus CIP 20256 và 01 ch ủng dạng I của nem NinhHòa

kháng l ạiSalmonella indiana LMBA.



- 4 -

MỤC LỤC

TrangTrang t ựa........................................................................................................................... i

Lời cảm tạ........................................................................................................................ iiTóm t ắt............................................................................................................................iiiMục lục............................................................................................................................ v

Danh sách ch ữ viết tắt..................................................................................................viii

Danh sác các hình ...........................................................................................................ix

Danh sách các b ảng........................................................................................................ ix

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU.................................................................................................1CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN.........................................................................................32.1 Th ực phẩmlên men và tri ển vọng phát triển.............................................................3

2.2 Nem chua – S ản phẩm thịt lên men c ủa Việt Nam...................................................42.3 Quá trình lên men lactic.............................................................................................5

2.4 Khái quát v ề vi khuẩn lactic......................................................................................5

2.5 M ột số vi khuẩn lactic thường dùng trong th ực phẩm..............................................6

2.5.1 Lactobacillus ....................................................................................................6

2.5.2 Lactococcus ......................................................................................................7

2.5.3 Leuconostoc ......................................................................................................7

2.5.4 Streptococcus ....................................................................................................7

2.5.5 Pediococcus ......................................................................................................82.6 Bacteriocin.................................................................................................................8

2.6.1 Khái ni ệm chung...............................................................................................82.6.2 Phân lo ại...........................................................................................................9

2.6.2.1 L ớp I........................................................................................................92.6.2.2 L ớp II.....................................................................................................10

2.6.2.3 L ớp III....................................................................................................11

2.6.3 Cơ chế hoạt động............................................................................................11

2.6.4 L ợi ích và hạn chế của bacteriocin.................................................................12



- 5 -

2.6.4.1 L ợi íchcủa bacteriocin..........................................................................12

2.6.4.2 H ạn chế của bacteriocin.........................................................................13

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................143.1 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu...........................................................................14

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.......................................................................14

3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích.....................................................................14

3.2.2 Nguyên v ật liệu thí nghiệm............................................................................14

3.3 Nội dung nghiên cứu...............................................................................................15

3.4 Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................153.4.1 Kh ảo sát hệ vi khuẩn lactic tr ên nem ngày b ốn của năm cơ sở khảo sát...............................................................................................................17

3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu............................................................................17

3.4.1.2 Đồng nhất mẫu......................................................................................17

3.4.1.3 K ỹ thuật đo pH......................................................................................17

3.4.1.4 Kh ảo sát hệ vikhuẩn lactic....................................................................17

3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền...............................................................18

3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập......................................................19

3.4.2.1 Nhu ộm Gram.........................................................................................19

3.4.2.2 Ph ản ứng catalase..................................................................................19

3.4.2.3 Kh ảo sát khả năng di động...................................................................19

3.4.2.4 Ki ểm tra kiểu lên men ...........................................................................19

3.4.2.5 Kh ảo sát khả năng sinh acid lactic ........................................................20

3.4.3 Kh ảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩnlactic phân l ập..........................................................................................................20

3.4.3.1 Thu ho ạch dịch ly tâm...........................................................................20

3.4.3.2 Kh ảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin của cácchủng vi khuẩn phân lập....................................................................................20

3.4.3.3 Kh ảo sát khả năng sinh bacter iocin c ủa các chủng

lactic phân l ập bằng phương pháp khuếch tán tr ên thạch.................................213.5 Xử lý thống k ê số liệu thu thập...............................................................................22



- 6 -

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................234.1 Kh ảo sát hệ vi khuẩn lactic củanem chua sau 4 ngày lên men

ở năm cơ sở khảo sát.....................................................................................................23

4.1.1 Giá tr ị pH và tổng lượng vi khuẩnlactic c ủanem chua lên men

ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát........................................................................................23

4.1.2 Ph ần trăm các dạng khuẩn lạc củanem chua lên men

ngày 4 ở 5 sơ sở khảo sát.........................................................................................25

4.2 Tính ch ất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập..........................................31

4.3 Kh ảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân l ập..........................................................................................................................33

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................365.1 K ết luận....................................................................................................................36

5.2 Đề nghị....................................................................................................................37

TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................38PHỤ LỤC.....................................................................................................................41



- 7 -

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

CFU: Colony Forming Unit

LAB: Lactic Acid Bacteria

EMP: Embden - Meyerhof - Parnas pathway

MRS

NB

MRD

TSA



- 8 -

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TrangHình 2.1:Cấu trúc của nisin.........................................................................................10

Hình 3.1:Tiến tr ình th ực hiện các khảo sát..................................................................16

Hình 3.2:Trình t ự pha loãng cho vi ệc đếm vi khuẩn lactic.........................................18

Hình 3.3:Vùng kháng khu ẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri.................................22

Hình 4.1:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng I.............................................26

Hình 4.2:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng II...........................................26

Hình 4.3:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng III..........................................27

Hình 4.4:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng IV..........................................27

Hình 4.5:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng V...........................................28

Hình 4.6:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng VI..........................................28

Hình 4.7:Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạng VII........................................28

Hình 4.8:Sự chuyển màu của dung d ịch trong khảo sát khả năngsinh acid lactic c ủa vi khuẩn..........................................................................................33

Hình 4.9:Vùng kháng khu ẩn của chủng vi khuẩn dạng VII đối vớiStaphylococcus aureus ssp . aureus CIP ........................................................................34

Hình 4.10:Vùng kháng khu ẩn của chủng vi khuẩn dạng I đối vớiSalmonella indiana LMBA ...........................................................................................35

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TrangBảng 4.1:Giá tr ị pH và tổng lượng vi khuẩnlactic c ủanem chua ngày 4 ở năm cơ sở khảo sát.........................................................................................................23

Bảng 4.2:Phần trăm các dạng khuẩn lạc củanem chua ngày 4 ở năm sơ sở khảo sát.........................................................................................................29

Bảng 4.3Tính ch ất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập.......................................................................................................................................32



- 9 -

Chương 1MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua là m ột trong những sản phẩm lên men truy ền thống nổi tiếng của

Việt Nam được làm từ thịt heo, bì và m ột số phụ liệu khác. Ngày nay, nem chua được

sản xuất tại nhiều vùng của đất nước với những thương hiệu nổi tiếng như: nem BìnhDương, nem Thủ Đức, nem Lai Vung… Phần lớn nem chua được sản xuất ở qui mhộ gia đình theo ph ương thức lên men t ự nhiên nên ch ất lượng sản phẩm thườngkhông ổn định. Mặt khác, nem chua là sản phẩm thường được tiêu thụ sống sau 3- 4

ngày lên men mà không qua ch ế biến. Do đó, vấn đề về vệ sinh hiện là mối quan tâmcấp bách của người tiêu dùng l ẫn nhà sản xuất. Ngày nay, vi ệc sử dụng những chấtkháng khu ẩn hóa học trong thực phẩm bị ngườ i tiêu dùng t ừ chối vì những lí do sức

khỏe. Do đó, liệu có thể tìm ra các ch ủng vi sinh vật khởi động vừa có khả năng địnhhướng quá tr ình lên men, đảm bảo tính ổn định và cải thiện chất lượng sản phẩm vừacó khả năng sinh ra những chất có khả năng khánglại các vi khuẩn gây bệnh?

Trước những yêu cầu tr ên, vi khu ẩn lactic (LAB) là nhóm vi khu ẩn được chú ýnhiều nhất. Những vi khuẩn này được sử dụng lâu đời với mục đích acid hóa nguyên

liệu thông qua việc sản sinh các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic; m ặt khác, chúngcòn có kh ả năng sinh ra các hợp chất có khả năng kháng khuẩn quan trọng trong việc

bảo quản thực phẩm như:hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin,

reuterin và reutericyclin (Ouwehand và Vesterlund, 2004) . Trong đó, bacteriocin là

hợp chất kháng khuẩn được quan tâm nhiều nhất. Nhiều công tr ình nghiên c ứu đãchứng minh một vài giống vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh bacteriocin kháng lạicác vi sinh v ật gây hư hỏng trong thực phẩm như: Listeria monocytogenes ,

Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Salmonella …

Đề tài “Kh ảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập tr ênnem chua” được thực hiện nhằm tìm ra các ch ủng vi khuẩn lactic có khả năng đề



- 3 -

kháng v ới các vi sinh vật gây bệnh, tạo tiền đề cho chế biếnnem chua có chất lượngổn định cũng như an toàn về mặt vi sinh.1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng tạo bacteriocin củmột số vi khuẩn lactic hiện diện trong nem chua. Qua đó hi vọng sẽ cải thiện nem chuathành m ột thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe.

Yêu cầuthực hiện:Phân l ập vi khuẩn lactic tr ên 5 lo ại nemlên men ngày 4.

Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic phân lập được.



- 4 -

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 THỰC PHẨM LÊN MEN VÀ TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂNLên men là m ột trong những công nghệ lâu đời nhất được sử dụng để bảo quản

thực phẩm. Trong lịch sử, việc lên men th ực phẩm đã được khởi xướng cách đây ítnhất 6000 năm (Holzapfef, 2000). Bắt nguồn từ các nước đang phát triển, quá tr ình lên

men không ch ỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn góp ph ần đa dạng hóa thực phẩm vớichi phí ph ải chăng đáp ứng cho người tiêu dùng có thu nh ập thấp (Kalui và ctv, 2010).

Hiện nay, nhiều loại thực phẩm lên men được sản xuất tr ên toàn th ế giới ở quimô h ộ gia đình c ũng như ở qui mô công nghiệp. Sự phổ biến rộng r ãi của thực phẩmlên men cho th ấy tầm quan trọng cũng như sự ưa chuộng ngày càng tăng của các sản

phẩm này trên th ế giới. Trong một số vùng, đặc biệt ở châu Phi, những thực phẩm này

còn được sử dụng làm th ực phẩm cai sữa cho trẻ nhỏ (Lei và Jakobsen, 2004; trích d ẫn bởiKalui và ctv, 2010).

Các nghiên c ứu được thực hiện đã cho th ấy những thuộc tính vô giá của sản phẩm lên men. Quá trình lên men t ạo ra các hợp chất chuyển hóa góp phần cải thiệnmùi v ị và chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm. Bên cạnh đó, một số sản phẩm củaquá trình sinh t ổng hợp như acid lactic, ethanol, acetaldehyd, acid pyruvic,… làm thay

đổi pH và giúp ức chế hiệu quả các vi sinh vật gây bệnh. Điều này tăng cường tính antoàn và kéo dài tu ổi thọ cho sản phẩm một cách đáng kể (Motarjemi, 2002). Thêm vào

đó, các enzyme ngoại sinh trong nguyên liệu lên men c ũng gó p phần cải thiện nhữngđặc tính tr ên (Holzapfel, 2000).

Việc sử dụng giống khởi động vào việc sản xuất các sản phẩm lên men ngày

càng được áp dụng rộng r ãi như một phương pháp để rút ngắn thời gian sảnxuất, nângcấp sản phẩm lên men v ề mặt chất lượng, tính ổn định cũng như tuổi thọ cho sản phẩm(Rolle và Satin, 2002). M ột số vi sinh vật có lợi trong quá tr ình lên men được nghiên

cứu như vi khuẩn lactic cho thấy rằng chúng có khả năng sản sinh ra các chất kháng



- 14 -

sinh có l ợi cho sức khỏe, tạo tính an toàn và b ảo quản lâu dài cho s ản phẩm (Kalui và

ctv, 2010).

Thực phẩm lên men ngày nay r ất đa dạng, chế biến từ các dạng nguyên liệukhác nhau như thịt, trái cây, rau quả, ngũ cốc,… Với những tiến bộ hiện nayvề khoahọc kĩ thuật, quá tr ình lên men không còn s ản xuất ở qui mô thủ công và tiến hành tự

nhiên như trước đây nữa mà đã phát tri ển ở qui mô công nghiệp với sự lên men ch ủ

động nhờ việc sử dụng các giống khởi động để đáp ứng không chỉ về chất lượng à

còn về số lượng cho người tiêu dùng (Nguy ễn Đức Lượng, 2006).

2.2 NEM CHUA - SẢN PHẨM THỊT LÊN MEN CỦA VIỆT NAM Nem chua là m ột sản phẩm thịt lên men truy ền thống ở Việt Nam. Tùy theo

từng vùng mi ền sản xuất mà nem chua g ắn với những tên gọi nổi tiếng như nem Th ủ

Đức, nem Lai Vung, nem Bình Dương… Phần lớn sản phẩm được sản xuất thủ công,tùy theo kinh nghi ệm của từng hộ gia đình mà ch ất lượng và khả năng bảo quản nemchua r ất khác nhau. Bản chất của quá tr ình lên men là m ột quá tr ình chuy ển hóa đườngthành acid lactic nh ờ hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus , Pediococcus và

Micrococcus . Trong đó, đóng vai tr ò quan tr ọng là các Lactobacillus (Nguy ễn ĐứcLượng, 2006; Hồ Thị Nguyệt Thu và ctv, 2008).

Theo kinh nghi ệm của các nhà chế biến, thịt dùng trong s ản xuất nem chua phảilà th ịt “nóng”, thịt có từ thú mới vừa giết mổ. Thịt được làm nhuy ễn bằng cách xayhoặc giã; sau đó, trộn với da heo đã được luộc chín và cắt thành sợi nhuyễn, cùng các

chất phụgia và gia v ị. Hỗn hợp thịt sẽ được tạo thành viên có tr ọng lượng khoảng 15-

20 g, k ế tiếp được gói bằng lá vông, lá chùm ru ột hay lá ổi, và được bao phủ bên ngoài

bằng nhiều lớp chuối dày (Nguy ễn Thị Minh Uyên, 2008). Nhìn chung, quá trình lên

men được thực hiện ở nhiệt độ phòng (kho ảng 28- 30 oC) trong th ời gian từ 3- 4 ngày.

Trong th ời gian này, các vi khu ẩn lactic hoạt động mạnh và chuy ển hóa đường thành

acid lactic. Acid lactic được tạo thành sẽ làm giảm pH của bột thịt, làm thay đổi cấutrúc của bộtthịt, bột thịt trở nên chặc hơn, tạo vị chua cần thiết cho sản phẩm và làm

ức chế sự phát triển của những vi sinh vật gây thối. Nem chua được ăn tươi mà khôn

cần nấu hay làm nóng. V ới kiểu sử dụng này, người tiêu dùng t ận hưởng được những



- 15 -

lợi ích cho sứckhỏe do các vi khuẩn lactic còn sống trong sản phẩm mang lại (Nguyenvà ctv, 2010).

Sản phẩm nem được đánh giá là đạt chất lượng khi bề mặt sản phẩm không nhớt hoặc nấm mốc, bột thịt dai, không nhão, có v ị chua ngọt vừa phải. Nem chua cóthời hạn sử dụng ng ắn, tối đa là 3 ngày khi b ảo quản ở nhiệt độ môi trường. Nếu muốnkéo dài th ời hạn sử dụng, sản phẩm cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (khoảngtháng ở nhiệt độ từ 4- 10 oC).

2.3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC

Lên men lactic là quá trình chuy ển hóa đường trong điều kiện kị khí (bắt buộchay tùy nghi) thành acid lactic. Người ta tìm thấy các vi khuẩn (vi khuẩn lactic,

Bacillus ), các t ảo (Chlorella ), một vài loại nấm mốc thủy sinh, các protozoa, cũng nhưcác cơ bắp của động vật đều có khả năng lên men lactic (Vương Thị Việt Hoa, 2006).

Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá tr ình lên men, ng ười ta chia vi khuẩn lacticthành 2 nhóm là lên men đồng hình và lên men d ị hình.

Lên men đồng h ìnhPhân gi ải glucose theo con đường EMP để chuyển thành pyruvat, sau đó khử

tr ực tiếp hầu hết các pyruvat thành lactat nh ờ vào enzyme lactat dehydrogenase.

Sản phẩm chính là acid lactic chi ếm 90%. Ngoài ra còn có các s ản phẩm phụchiếm tỉ lệ không đáng kể như acid acetic, ethanol, glycerin, CO2,…

Các vi khu ẩn tham gia nhưStreptococcus lactis , Lactobacillus bulgaricus , Lb.

delbruikii , Lb. acidophilus ,… (Vương Thị Việt Hoa, 2006).Lên men dị h ình

Các vi khu ẩn lên men lactic d ị hình thi ếu các enzyme chủ yếu của con đườngEMP. Chúng phân gi ải kị khí đường glucose chủ yếu theo con đường pentophosphat

(PP).

Ngoài sản phẩm là acid lactic (40%) còn t ạo ra một lượng lớn các sản phẩmkhác như acid succunic và ethanol (20%), acid acetic (10%), CO2 và H 2 (20%).

Các vi khu ẩn tham gia bao gồm Bacterium pentoaceticum , Lactobacterium

casei , Lb. plantarum , Lb. bifrementans , Leuconostoc casei , Le. cremoris .



- 16 -

2.4 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LACTICVi khu ẩn lactic (LAB) là nhóm vi khu ẩn Gr am (+), có d ạng trực khuẩn, cầu

khuẩn hay cầu trực khuẩn, nhìn chung không di động, không sinh bao tử và các đặctính s inh hóa âm tính khác như catalase, nitrate reductase và cytorome oxydase (Lý

Ngọc Quí, 2006). Chúng có thể hô hấp kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý. Kho ảng nhiệt độthích h ợp cho các vi khuẩn lactic hoạt động khá rộng. Các vi khuẩn lactic ưa ấm cónhiệt độ tối thích từ 25- 37 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 50- 65 oC,

nhóm ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008).

Vi khu ẩn lactic được ứng dụng lâu đời trong nhiều loại thực phẩm lên men cónguồn gốc động hoặc thực vật vì các tác động có lợi của chúng về dinh dưỡng, cảmquan và c ải thiện tuổi thọ sản phẩm.

Vi khu ẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng khuẩn. Trong đó, việcsản sinh acid lactic và acid acetic là quan tr ọng nhất. Tuy nhiên một số chủng vi khuẩnlactic còn được biết đến bởi việc sản sinh các phân tử có hoạt tính sinh học nhưethanol, acid formic, các acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin,

reutericyclin,… Nhi ều giống cũng sản sinh các bacteriocin và những phân tử thể hiệnhoạt tính kháng k huẩn tương tự bacteriocin (De Vuyst và Leroy, 2007).

2.5 MỘT SỐ VI KHUẨN LACTIC THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC PHẨMMột số giống vi khuẩn lactic nồng cốt liên quan đến quá tr ình lên men th ực

phẩm như Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc , Pediococcus và Streptococcus .

2.5.1 Lactobacillus

Lactobacillus là giống lớn nhất trong LAB với hơn 80 loài và phân loài đượccông nh ận (Limsowtin và ctv, 2002) . Đây cũng là nhóm loài r ất hỗn tạp với sự đa dạngvề các đặc tính lý hóa, sinh hóa và kiểu hình nh ưng chủ yếulà dạng que (Axelsson,

2004). Các Lactobacillus là những vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, thỉnh thoảngcặp đôi hoặc tạo thành chu ỗi, không di dộng và catalsae âm tính.

Phân b ố rất nhiều trong tự nhiên và nhi ều loài đã được ứng dụng trong thực phẩm, nhóm vi khu ẩn này được ghi nhận là ch ịu acid cao nhất,có mặt trong cơ thể

người (khoang miệng, đường tiêu hóa,...), và trong m ột số thực phẩm lên men như thịt,sữa, rau quả, ngũ cốc,...(Axelsson, 2004). M ột số loài như Lb. casei , Lb. plantarum ,



- 17 -

Lb. brevis ,… tham gia trong quá trình làm chín phô mai; Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricu s là một trong hai loài vi khu ẩn cho phép sử dụng trong lên men yogurt

(Limsowtin và ctv, 2002).

2.5.2 Lactococcus

Lactococcus có dạng hình cầu hoặc hình tr ứng, thường bắt cặp hoặc thành

chuỗi. Có 5 loài Lactococcus ( Lactococcus lactis , Lc. garvieae , Lc. plantarum , Lc.

piscium và Lc. raffinolactis ) hiện đang được công nhận. Tuy nhiên, ch ỉ có Lc. lactis

subsp. lactis và Lc. lactis subsp. cremoris mới được sử dụng trong quá tr ình lên men

thực phẩm(Limsowtin và ctv, 2002). Lactococcus lactis được phân lập từ sữa và các s ản phẩm chế biến từ sữa. Có

khả năng vi khuẩn này nhi ễm vào sữa trong quá tr ình vắt sữa và cho ăn. Lc.

raffinolactis được phân lập từ sữa chưa tiệt tr ùng, từ đường ruột động vật và từ cácmôi trường trang trại nuôi bò. Lc. garvieae và Lc. piscium gây bệnh ở các loài cá, Lc.

garvieae cũng liên quan t ới bệnh viêm vú bò và nhi ễm tr ùng ở người.Một số chủng Lc. lactis . subsp . lactis có khả năng chuyển hóa citrate, sản sinh

CO 2, diacetyl và các ch ất trung gian khác tạo hương thơm cho sản phẩm (ví dụ như bơ và phô mai Gouda). Nisin, m ột bacteriocin peptide sản sinh bởi các giống Lactococcus

có sẵn trong thương mại được coi như là một phụ gia bền acid, được sử dụng để kdài th ời gian bảo quản thông qua việc ức chế hệ vi sinh vật Gram dương trong thự

phẩm (Limsowtin và ctv, 2002).

2.5.3 Leuconostoc

Leuconostoc có dạng hình cầu xếp chuỗi hoặc bắt cặp, lên men d ị hình. Chúng

thường được tìm thấy tr ên lá, ng ũ cốc, nho và các c ụm hoa. Những vi khuẩn này phát

triển ở 20- 30 oC và không phát tri ển ở 45oC. Leuconostoc (đặc biệt là Ln. lactis và Ln.

mesenteroides ) có vai trò quan tr ọng trong việc lên men s ữa do chúng có khả năngsinh CO 2 và một lượng đáng kể diacetyl từ citrate trong sữa (Axelsson, 2004). Diacetyl

là hợp chất chính tạo hương cho bơ chua, kem chua và phô mai tươi, còn CO 2 thì đóngvai trò quan tr ọng trong việc hình thành m ắt phô mai. Ngoài ra, nhóm vi khu ẩn này

còn đóng vai tr ò chủng khởi động trong việc lên men t ự nhiên của rau quả (ví dụ nhưdưa cải).



- 18 -

2.5.4 Streptococcus

Nhóm vi khu ẩn này có d ạng hình cầu hoặc hình tr ứng, kết đôi hay dạng chuỗi,lên men đồng hình. Hi ện đã có trên 50 loài Streptococus được nhận biết, những vikhuẩn này phân b ố chủ yếu trong xoang miệng và ở đường hô hấp. Một sốStreptococcus như Sp. mutans là tác nhân gây b ệnh sâu răng và viêm màng tim

(Axelsson, 2004).

Về cơ bản, chỉ cóSp. thermophilus là được sử dụng trong sản xuất yogurt (cùng

với Lb. delbrueckii . subsp. bulgaricus ) và phô mai. Vi khu ẩn này được sử dụng như

một tác nhân acid hóa để đông tụ lactic.2.5.5 Pediococcus

Pediococcus có dạng tứ cầu, vi hiếu khí, phát triển từ20 - 30 oC và không phát

triển ở 45oC, ưa acid và lên men đồng hình. Hi ện có 7 loài Pediococcus được nhận biết. Những vi khuẩn này thường được tìm th ấy với một lượng lớn trên lá nho, dưa bắpcải lên men, trái oliu và bia.

Pediococcus quan tr ọng trong thực phẩm về cả hai mặt tiêu cực và tích c ực. Pe.

damnosus là vi sinh v ật gây hư hỏng chính trong sản xuất bia, vì sự sinh trưởng củachúng có th ể dẫn đến việc hình thành diacetyl/acetoin t ạo ra vị bơ. Pe. acidilactici và

Pe. pentosaceus được sử dụng như các chủng khởi động cho việc làm xúc xích lên

men. Pediococcus cũng tham gia vào quá trình làm chín phô mai góp ph ần làm tănghương vị cho phô mai (Axelsson, 2004).

2.6 BACTERIOCIN2.6.1 Khái niệm chung

Bacteriocin là các peptide được sản sinh t ự nhiên bởi một vài vi khu ẩn để ứcchế sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh khác, chúng có phổ kháng khuẩn hẹchủ yếu là ức chế các loài gần với các chủng sản sinh bacteriocin (Parada và ctv,

2007). Nh ững hợp chất này được tìm th ấy tronghầu hết các loại vi khuẩn nhưng chỉ cómột số loài trong chúng được nghiên cứu kĩ. Hiện nay các bacteriocin sản sinh bởiLAB được quan tâm nhiều nhất vì LAB được coi là vi khu ẩn an toàn cho người tiêu

dùng do chúng và các ch ất chuyển hóa của chúng không tạo nên nh ững tác dụng phụkhi được sử dụng trong các thực phẩm lên men (Ruiz-Larrea và ctv, 2005). Các



- 19 -

bacteriocin s ản sinh bởi LAB có những ứng dụng quan trọng trong bảo quản thực phẩm. Những vi khuẩn lactic này tạo ra các protein miễn dịch đặc hiệu để tự bảo vệ,chống lại tác động kháng khuẩn của bacteriocin của chúng (Cintas và ctv, 2001).

Có thể nói nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình

nghiên c ứu của Gratia và ctv vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia

coli (colicin V) (Desriac và ctv, 2010; Ruiz-Larrea và ctv, 2005). Thu ật ngữ bacteriocin không xu ất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầutiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ

hoạt động hẹp bị giớihạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vikhuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus

sp.; Listeria sp. và Staphylococcus sp. Các nghiên c ứu trong những năm 1980 đã cho

thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố tr ên bacteriocin. T ừ thời điểm này

bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu về bacteriocin, định hướng như một chất khángkhuẩn an toàn trong l ĩnh vực công nghệ thực phẩm (Desriac và ctv, 2010).

2.6.2 Phân loại

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phânloại các bacteriocin vẫn chưa được xác định r õ ràng và nó v ẫn đang là vấn đề tranh cãi.

Các bacteriocin thường được phân loại kết hợp với các tiêu chí khác nhau. Nh ững tiêu

chí chính là h ọ vi khuẩn sản xuất, tr ọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình

tự chuỗi amino acid (Desriac và ctv, 2010). M ột cách tổng quát, bacteriocin được chiathành 3 l ớp: lớp I, lớp II và lớp III.2.6.2.1 L ớp I

Bacteriocin l ớp I hay còn được gọi là Lanbiotic là nh ững peptide nh ỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. M ột thành viên n ổi tiếng của nhóm này là

nisin (Parada và ctv, 2007) . Các Lanbiotic được chia thành 2 phân l ớp là Ia và Ib d ựatrên sự tương đồng cấu trúc.

a) Phân lớp IaPhân l ớp Ia gồm các pe ptide dạng thuôn dài, linh ho ạt và tích điện dương,

chúng ho ạt động bằng cách hình thành các l ỗ trong màng tế bào chất của các loài vikhuẩn nhắm đến (Ouwehand và Vesterlund, 2004).



- 20 -

Nisin thu ộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành b ởi 34 amino acid.Có 2 bi ến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z, chúng ch ỉ khác nhau bởiamino acid th ứ 27: histidine trong nisin A được thay thế bởi asparagin trong nisin Z.

Cấu trúc của nisin được thể hiện ở Hình 2.1.

Hình 2.1:Cấu trúc củanisin (Ngu ồn:Ruiz-Larrea và ctv, 2005)

Loại bacteriocin này, được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic , đượcsử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+r ộng, E. coli và các vi khu ẩn Gram (-) khác ch ỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài

của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có ho ạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối vớiStaphylococcus aureus , Listeria monocytogenes , các t ế bào sinh dưỡng của Bacillus

spp. và Clostridium spp. ( Ouwehand và Vesterlund, 2004). Chúng đượ c sử dụng chủyếu trong các thực phẩm đóng hộp và các s ản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phômai, nh ằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium (Deegan và

ctv, 2006; trích d ẫn bởiParada và ctv, 2007). Nisin c ũng được ghi nhậncó hiệu quảchống lại các bệnh viêm vú do vi khu ẩn Gram (+) gây ra (Broadbent và ctv, 1989;

trích d ẫn bởiParada và ctv, 2007).

b) Phân lớp IbPhân l ớp Ibgồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích

điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu với c phân t ử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm (Parada và ctv, 2007).

2.6.2.2 L ớp II Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao g ồm các bacteriocin có trọng lượng

phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không ch ứa lanthionine. Các bacteriocin nhómII có th ể chia thành 3 phân l ớp, bao gồm IIa, IIb và IIc.



- 21 -

a) Lớp IIaLớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria , đại diện đặc

trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 và sakacin P. Các bacteriocin nhóm này h ứa hẹncho nhi ều ứng dụng công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng.Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng Listeria được chú ý nhiều hơn là

bacteriocin l ớp I (nisin) vì chúng không có ph ổ ức chế rộng và vì v ậy, chúng khôngtiêu di ệt các giống khởi động (Ouwehand và Vesterlund, 2004).

b) Lớp IIb

Lớp IIb hình thành b ởi một phức hợp của 2 peptide riêng bi ệt, những peptidenày ít ho ặc không hoạt động. Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcinG, plantaricin EF và plantaricin JK (Parada và ctv, 2007).

c) Lớp IIcLớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng

nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Trong phân l ớp này ch ỉ

tìm th ấy các bacteriocin nhưdivergicin A và acidocin B (Parada và ctv, 2007).

2.6.2.3 L ớp III Lớp này bao g ồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa,

không b ền nhiệt. Nhóm này có th ể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng l ại các vikhuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp IIcho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên c ủa giống Lactobacillus (Ouwehand

và Vesterlund, 2004).

2.6.3 Cơ chế hoạt độngCác bacteriocin thường có hiệu quả chống lại các vi khuẩn Gram (+) như

Bacillus , Listeria monocytogenes , Salmonella typhimurium . Các bacteriocin c ủa LABcó thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram (-) vì màng ngoài c ủa chúng gây trở ngại cho hoạt động của bacteriocin. Những màng này ngăn cản các phân tử như chấtkháng sinh, ch ất tẩy rửa và thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất(De Martinis và ctv,

2001). Tuy nhiên, có m ột vài nghiên c ứu đã công b ố hoạt động của bacteriocin chống

lại các vi khuẩn nhóm này, ví d ụ như plantaricin 35d sản xuất bởi Lactobacillus plantarum chống lại Aeromonas hydrophila (Messi và ctv, 2001), thermophylin s ản



- 22 -

xuất bởiStreptococcus thermophillus hoạt động chống lại E. coli và Yersinia

enterocolitica (Ivanova và ctv, 1998).

Các cơ chếhoạt động khác nhau đã được đề ra cho các bacteriocin như thay đổihoạt động enzyme, ức chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chấtmang anion thông qua s ự hình thành c ủa các lỗ (Abee, 1995).

Các bacteriocin t ừ LAB có thể hoạt động thông qua các cơ chế khác nhau để phát huy tác d ụng kháng khuẩn nhưng màng tế bào thường là đích được nhắm đến. Sựtương tác tĩnh điện ban đầu giữa màng tế bào và peptide c ủa bacteriocin được cho là

động lực cho các chuyển biếntiếp theo (Deegan, 2006)Các bacteriocin có th ể có tính diệt khuẩn hoặc định khuẩn, tác động này ch ịu

ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố như lượng bacteriocin và độ tinh khiết của tình tr ạng sinh lý của các tế bào ch ỉ thị và các điều kiện thí nghiệm (Cintas, 2001)

Có kh ả năng là lớpI và II s ử dụng cùng các cơ chế hoạt động giống nhau. Các peptide liên k ết màng huy ết tương thông qua các tương tác tĩnh điện với các phospholipid tích điện âm. Vì vậy, việc thâm nhập của bacteriocin ngang qua màng tế

bào phụ thuộc vào điện thế màng, được điều khiển bởi pH và phospholipid. Các đơn phân t ử của bacteriocin hình thành các kh ối proteic dẫn đến việc hình thành l ỗ kết quảlà dẫn đến sự thất thoát của các ion (chủ yếu là K và Mg), t ổn thất lượng proton trongtế bào chất, thất thoát ATP và acid amin . Lượng proton trong tế bào chất có vai tr ò cơ

bản trong sự tổng hợp ATP và trong s ự di chuyển của vi khuẩn; vì vậy, việc tổng hợpcủa các phân tử lớn cũng như sản xuất năng lượng bị ức chế, dẫn đến chết tế bào đ(Bruno và Montville, 1993).

Phương thức hoạt động của các bacteriocin nhóm III không được biết đến. Dođó, đòi hỏi phải nghiên cứu nhiều hơn để làm sáng t ỏ nó (Parada và ctv, 2007).

2.6.4 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin2.6.4.1 L ợi ích của bacteriocin

Ngày nay, áp d ụng rộng r ãi các bacteriocin trong l ĩnh vực thực phẩm đã mang

đến những lợi ích nhất định so với việc sử dụng những chất bảo quản hóa học truy

thống như:



- 23 -

Bacteriocin ch ứng minh tính an toàn của chúng trong chuỗi thực phẩmdành cho người. Chúng có ít hạn chế hơn so với những chất bảo quảnhóa học vì là các phân t ử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men

trong th ực phẩm lên men truy ền thống(Ruiz-Larrea, 2005).

Không gây tác động đến môi trường vì chúng b ị thoái biến nhanh chóng.Các bacteriocin được sử dụng như nguồn thức ăn chủ yếu đối với các tácnhân gây b ệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi(Ouwehand

và Vesterlund, 2004).

Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm(Ruiz-Larrea, 2005).

Chúng có ph ổ hoạt động r õ ràng.

Có tác d ụng bổ sung cho các tác nhân kháng khuẩn.2.6.4.2 H ạn chế của bacteriocin

Với những lợi ích trên bacteriocin ngày càng được ứng dụng rộng r ãi trong

công nghi ệp như một loại kháng sinh an toàn. Tuy nhiên, chúng c ũng có một số mặt

bất lợi sau:Ít được biết đến hơn so với các chất bảo quản hóa học.Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein.Chi phí cao trong vi ệc đáp ứng các tính năng kỹ thuật.Ch ỉ có hiệu quả chống lại một số loại vi khuẩn nào đó.

Trên th ực tế, có những r ào cản pháp lý yêu c ầu sựcông nh ận và chấp thuận cụthể đối với việc sử dụng chúng ở dạng tinh khiết và bán tinh khi ết (Ruiz-Larrea, 2005).



- 24 -

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨUĐề tài được thực hiện từ 5/4/2010 đến 10/7/2010 tại phòng thí nghi ệm Vi sinh

và Hóa sinh thu ộc khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nông Lâm, thành ph ố

Hồ Chí Minh.3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích

Môi trườngvà thuốc thử:- Thạch và canh MRS (Merck, pH= 5,7± 0,2) để phân lập, tăng sinh và giữ

giống vi sinh vật.- Môi trường NB (Difco) để tăng sinh và giữ giống vi sinh vật gây bệnh.- Môi trường MRD dùng để pha loãng.

- Môi trường TSA (Difco) dùng để thực hiện thí nghiệm khuếch tán tr ênđĩa thạch.

- Môi trường carbohydrat dùng kh ảo sát khả năng lên men đường của cácchủng vi khuẩn lactic phân lập.

- Thuốc thử Uphenmen dùng kh ảo sát sự hiện diện của acid lactic.- Thuốc thử peroxyde hydrogene 10% để thử phản ứng catalase.- Thuốc nhuộm Gram: gential violet, lugol và fuschine.

Dụng cụ:Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, micropipet, que cấy, đèn cồn…Thiết bị: Máy d ập mẫu (Seward, Anh), máy li tâm (MSE Mistral 1000,

Anh), autoclave (Sanyo, Nh ật), cân điện tử (Ohaus, Mĩ), vortex (Velp, Ý), máy đo pH(Metrohm, Mỹ), tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi,…3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm

Nem kh ảo sát được lấy sau 4 ngày lên men c ủa 5 cơ sở: Bà Chín (Th ủ Đức,tp.

Hồ Chí Minh), Ninh Hòa (Nha Trang, Khánh Hòa), Giáo Th ơ (Lai Vung, Đồng Tháp),



- 25 -

Vissan (tp. H ồ Chí Minh) và Năm Thu (Bình Định). Trong đó, nem Bà Chín, nem

Ninh Hòa và nem N ăm Thu là sản phẩm của quá tr ình lên men t ự nhiên còn quá trình

lên men c ủa nem Giáo Thơ và nem Vissan là có sử dụng giống khởi động. Năm chủng gây bệnh được bảo quản đông lạnh (-20 oC) được sử dụng làm

chủng chỉ thị, bao gồm:Staphylococcus aureus ssp . aureus CIP 20256

E. coli ATCC 25922

Bacillus cereus CIP 6624T

Listeria monocytogenes CIP 82110 T

Salmonella indiana LMBAThuốc kháng sinh Ofloxacin 200 mg được bán tr ên th ị trường được sử dụng

làm m ẫu đối chứng cho thí nghiệm khuếch tán tr ên thạch.3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Chúng tôi đã thực hiện các công việc như sau:Khảo sát hệ vi khuẩn lactic của nem sau 4 ngày lên men c ủa năm cơ sở.Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic.Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phânlập được.

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUCác thao tác ti ến hành nghiên c ứu được tóm lược trong Hình 3.1.



- 23 -

Hình 3.1:Tiến tr ình th ực hiện các khảo sát

Lấy mẫu

Đồng nhất mẫu

Huyền phù mẹĐo pH

Pha loãng m ẫu ở cácnồng độtừ10 -2 đến10 -7

Cấy lên môi trường thạchMRS

Ủ 30oC / 48 gi ờ

- Đếm số lượng khuẩn lạc- Tính ph ần trăm dạng khuẩn lạc- Giữ giống.- Cấy chuyền.

Kiểm tra các phản ứng sinh hóa- Nhuộm Gram- Catalase

- Di động- Kiểu lên men

- Khả năng sinh acid lactic

Khảo sát khả năng kháng khuẩn

Khảo sát sơ bộ

Khuếch tán tr ên thạch



- 24 -

3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên nem ngày bốn của năm cơ sở khảo sát3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Đối với mỗi cơ sở chế biến nem khảo sát, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lặp lại 3lần ở những lô sản xuất khác nhau. Các mẫu nem chua được vận chuyển ngay đế

phòng thí nghi ệm để tiến hành phân tích trong th ời gian sớm nhất.3.4.1.2 Đồng nhất mẫu

Sau khi ti ệttrùng dao k ĩ bằng cồn, dao được hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho bayhết hơi cồn và để nguội. Dùng dao c ắt nhỏ mẫu nem và lấy khoảng 10 g mẫu nem chovào bao PE vô trùng. Sau đó cho thêm dung dịch MRD vào bao theo t ỉ lệ9 MRD:1 nem. Vi ệc đồng nhất mẫu được thực hiện với máy Stomacher trong 2 phút.

Sau khi đồng nhất, thu được dung dịch huyền phù mẹ (S1).3.4.1.3 K ỹ thuật đo pH

Dung d ịch S1 sẽ được đem đi đo pH. Trước khi đo, đầu pH kế được lau sạch;sau đó, được cắm vào dung d ịch mẫu saocho dung d ịch ngập qua đầu dò của pH kế.Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần và giá tr ị pH ghi nhận cho mỗi mẫu là trung bình c ủa 3lần đo lặp lại.3.4.1.4 Kh ảo sát hệ vi khuẩn lactic

Pha loãng mẫu và cấy đĩaTiến hành pha loãng th ập phân dung dịch S1 đến nồng độ 10-7 bằng dung dịch

MRD. Dùng micropipet hút 0,1 mL dung d ịch ở các nồng độ 10-5, 10 -6 và 10 -7 cho vào

đĩa petri. Dùng que c ấy trang đã khử trùng trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi thấy bề mặt thạch khô. Ở mỗi nồng độ pha loãng chúng tôi ti ến hành lặ p lại 2 lần.

Trình t ự các thao tác được tr ình bày qua Hình 3.2.

Hình 3.2:Trình t ự pha loãng cho vi ệc đếm vi khuẩn lactic



- 25 -

Phương pháp ủCác đĩa petri sau khi cấy xong sẽ được ủ kị khí ở 30oC trong 48 gi ờ. Việc ủ kị

khí được tiến hành bằng cách để các đĩa petri vào trong các bình hút ẩm, đặt vào đóngọn đèn cồn đã được thắp sáng, đậy chặt nắp, khi ngọn lửa đèn cồn tắt đồng nghĩavới việc oxy trong bình đã được tiêu thụ hết.3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền

Sau khi ủ ở 30oC trong 48 gi ờ, việc đếm khuẩnlạc được thực hiện trên các đĩacó số lượng khuẩn lạc từ 15 đến 300.

Số lượng khuẩn lạc đếm được trong hai đĩa ở hai nồng độ liên tiếp được tính bởi công thức sau:

).1,0.(. 21 nnd V C N (CFU/g)

Trong đó: N: số tế bào (đơn vị hình thành khu ẩn lạc) vikhuẩn trong 1g mẫu.C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọnn1: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng th ứ 1n2: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng th ứ 2V: th ể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong m ỗi đĩad: nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy.

Số lượng trung bình của khuẩn lạc được đếm cho 3 lần lặp lại của 1 mẫu thínghiệm:

3321 N N N

N (CFU/g)

Với N1, N 2, N 3 là tổng số khuẩn lạc được tính trong lần lặp lại thứ nhất, thứ haivà thứ ba.

Sau khi đếm khuẩn lạc, với quan sát bằng mắt thường, các dạng khuẩn lạc hiệdiện đượcghi nh ận dựa tr ên hình d ạng và kích thước của chúng.

Đối với mỗi dạng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành cấy chuyền và giữ giống bằngcách l ấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf vôtrùng có ch ứa 1 mL canh MRS và ủ ở 37oC trong 24 gi ờ trong tủ ấm. Sau đó, cấy chuyền lên môi trường thạch MRS và ủ ở 37oC trong 48 gi ờ để tiến hành các ph ản ứng sinh hóa tiếp theo. Những ống eppendorf

được bổ sung glycerol tiệt tr ùng hai l ần với thể tích 10% th ể tích dịch khuẩn, sau đóđược bảo quản đông lạnh để giữ giống.



- 26 -

3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập3.4.2.1 Nhu ộm Gram

Sau khi ủ ở 37oC trong 48 gi ờ, các chủng vikhuẩn phân lập, đại diện cho cácdạng khuẩn lạc được nhuộm Gram. Việc quan sát dưới kính hiển vi sau đó cho chúntôi khái ni ệm ban đầu về hình thái t ế bào vi sinh v ật như khả năng bắt màu (Gram (+)

hay Gram (-)); d ạng vi khuẩn (hình que, c ầu hay hình tr ứng) c ũng như cách sắp xếpcủa chúng (xếp chuỗi, bắt cặp hay riêng lẻ).3.4.2.2 Ph ản ứng catalase

Lấy khuẩn lạc cho lên trên mi ếng lame sạch, sau đó nhỏ một giọt H202 10% lên.

Nếu thấy xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là dương tính còn không xu ất hiện bọt tr ắng

thì ph ản ứng là âm tính.3.4.2.3 Kh ảo sát khả năng di động

Dùng que c ấy vô trùng để lấy khuẩn lạc và cấy sâu vào trong ống nghiệm cóchứa 10 mL môi trường thạch mềm MRS (4 g agar/L môi trường) và đem ủ ở 37oC

trong 48 gi ờ trong điều kiện kị khí, tính di động của vi sinh vật được quan sát bởi sự phân tán vi sinh v ật trong môi trường so với đường cấy: nếu vi khuẩn mọc lan ra khỏiđường cấy thì vi khu ẩn có khả năng di động, nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy thì

chúng không có kh ả năng di động.3.4.2.4 Ki ểmtra ki ểu l ên men

Cho khu ẩn lạc vào trong ống nghiệm có chứa môi trường carbohydrat đã thêm

bromocresol tía. Ủ các ống nghiệm này ở 37oC trong 24 gi ờ. Tiến hành ki ểm tra khảnăng sinh khí của vi sinh vật bằng cách dùng que c ấy đã hơ thật nóng tr ên ngọn lửađèn cồn rồi nhúng nhanh vào trong ống nghiệm. Nếu thấy xuất hiện những bọt khí nhỏthì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh khí; ngược lại, vi khuẩn không có khả năngsinh khí.

3.4.2.5 Kh ảo sát khả năng sinh acid lacticMôi trường carbohydrat sau khảo sát k hả năng lên men (ph ần 3.4.2.4) được

trung hòa b ằng dung dịch NaOH 0,1N để môi trường chuyển lại thành màu tím. Thêm

vào 2 mL dung d ịch Uphenmen, sự tồn tại của acid lactic sẽ được thể hiện bởi sựchuyển màu chất chỉ thị từ tía sang vàng.

3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập3.4.3.1 Thu ho ạch dịch ly tâm



- 27 -

Sau khi ti ến hành các ph ản ứng sinh hóa, chúng tôi chọn lọc ra những chủng vikhuẩn được cho là vi khu ẩn lactic để tiến hành các thí nghi ệm tiếp theo.

Dùng que c ấytiệt tr ùng lấy khuẩn lạc cho vào trong ống ly tâm vô tr ùng ch ứa10 mL MRS b ổ sung 2% cao nấm men(Elmoualdi và ctv, 2008). Ủ các ống ly tâm này

ở 37oC trong 16 - 18 gi ờ (Cheikhyoussef và ctv, 2008).

Sau đó, các ống ly tâm này sẽ được đem ly tâm ở 6000 vòng trong 15 phút đểtách c ặn khuẩn. Nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi sự ức chế gây racác acid h ữu cơ có mặt trong môi trường, sau khi ly tâm xong chúng tôi điều chỉnh pHcủa dịch khuẩn bằng dung dịch NaOH 10N để đạt đến pH = 6,5(Poncea và ctv, 2007).

Sau đó lọc lấy phần dịch nổi tr ên bề mặt bằng cách bơm dịch qua màng lọc Minisart

(đường kính lỗ lọc là 0,2 µm) để tách cặn khuẩn còn sót l ại. Phần dịch lỏng thu đượcsẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.3.4.3.2 Kh ảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin c ủa các chủng vi khuẩn phân lập

Tiến hành tăng sinh năm chủng chỉ thị gây bệnh trong 10 mL môi trường NB(37 oC / 24 gi ờ). Sau đó tiến hành pha loãng n ăm chủng chỉ thị đến nồng độ 10-4 bằngdung d ịch MRD.

Dùng micropipet hút 0,5 mL d ịch ly tâm cho vào ống eppendorf vô tr ùng, sau

đó cho tiếp 0,5 mL dịch khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4. Mỗi dịch ly tâm đều được khảosát với năm chủng gây bệnh nghiên cứu.

Ủ các ống eppendorf ở 37oC trong 24 gi ờ. Sau đó so sánh bằng mắt thường độtrong, đục củachúng v ới ống đối chứng (không cho dịch khuẩn). Nếu ống trong và

không có sinh kh ối điều này chứng tỏ dịch ly tâm trong ống có khả năng kháng lạichủng chỉ thị gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng. Ngược lại, nếu ống đục và

có sinh kh ối, điều này đồng ngh ĩa với việc vi khuẩn gây bệnh vẫn tiếp tục phát triểntrong d ịch ly tâm và như vậy, dịch ly tâm không có chứa chất kháng khuẩn.

Việc khảo sát sơ bộ này cho phép chúng tôi tuy ển lược các chủng vi khuẩnlactic có kh ả năng sinh chất kháng khuẩn cho khảosát với phương pháp khuếch tántrên th ạch tiếp theo.3.4.3.3 Kh ảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán tr ên th ạch

Trong kh ảo sát này, chúng tôi c ấy vi khuẩn theo hai cách: tr ên bề mặt thạch vàcấy sâu trong thạch: 0,1 mL dịch canh khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4 được trang đều lên



- 28 -

bề mặt thạch TSA hoặc được trộn đều với 30 mL môi trường TSA và sau đó đổ ra đ petri. Sau khi th ạch khô, đục 6- 7 lỗ, với đường kính lỗ khoảng 8mm tr ên bề mặt đĩathạch (Hata và ctv, 2009). Các l ỗ được đục cách thành đĩa petri khoảng 1cm để có thểquan sát được vòng kháng khu ẩn sau này. K ế đến, nhỏ khoảng một giọt môi trườngTSA vào l ỗ để bịt kín đáy lỗ. Dùng micropipet hút 150 µL d ịch kháng khuẩn cho vào

mỗi lỗ. Bên cạnh đó cũngtiến hành thí nghi ệm với dịch kháng sinh pha loãng ở 10-4 đểlàm m ẫu đối chứng. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở nhiệt độ 2- 4oC trong 2 gi ờ với mụcđích ngăn cản sự phát triển của chủng chỉ thị và tạo điều kiện cho bacteriocin có thờigian th ẩm thấu vào bên trong th ạch. Sau đó, các đĩa petri được ủ ở 37oC.

Việc đọc kết quả được thực hiện sau 16 giờ ủ. Khả năng kháng khuẩn của

khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khu ẩn xung quanh lỗ. Nếuđường kính vùng kháng khu ẩn lớn hơn hoặc bằng 6 mm (Cheikhyoussef và ctv, 2008)

thì được xem là có kh ả năng ức chế tích cực.Đường kính vùng kháng khu ẩn được tính như sau:

dkk = d – d lỗ

Trong đó: dkk : đường kính vùng kháng khu ẩn xung quanh lỗd: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ)dlỗ: đường kính lỗ.

Hình 3.3:Vùng kháng khu ẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri



- 29 -

3.5 XỬ LÝ THỐNG K Ê SỐ LIỆU THU THẬP

Việc tính các giá trị trung bình ( pH , N ), tổng lượng khuẩn lạc và phần trăm

các dạng khuẩn lạc được thựchiện với phần mềm Excel 2003.

Việc tính toán SD, sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm được tính với trắcnghiệm Fisher bằng phần mềm Minitab 12.21.



- 30 -

Chương 4K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN LACTIC CỦA NEM CHUA SAU 4 NGÀY LÊNMENỞ NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT4.1.1 Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩnlactic của nem chua lên men ngày 4ở 5cơ sở khảo sát

K ết quả theo dõi về giá trị pH và tổng lượng vi khuẩnlactic c ủa nem chua sau 4

ngày lên men ở 5 cơ sở khảo sát được tr ình bày ở Bảng 4.1Bảng 4.1:Giá tr ị pH và tổng lượng vi khuẩnlactic c ủa nem chua ngày 4 ở 5 cơ sở

khảo sát

Kiểu lên men Cơ sở Tham số thống kê(n=3)

pH SD N SD (CFU/g)

Lên men tự nhiên

Bà Chín 4,39 0,03 1,43.10 8 7.10 6

Ninh Hòa 4,41 0,03 1,29.108

1,2.107

Năm Thu 4,34 0,03 1,62.10 8 1,5.10 7

Lên men cóđịnh hướng

Vissan 4,15 0,03 1,15.10 9 8,5.10 7

Giáo Thơ 4,23 0,03 3,08.10 8 7.10 6

(n: tổng số mẫu khảo sát, pH : giá tr ị pH trung bình của mẫu, N : số lượng vi khuẩn

trung bình c ủa mẫu, SD: độ lệch chuẩn)

Theo nghiên c ứutrên nem chua lên men ngày 4 ở các cơ sở sản xuất theo kiểulên men t ự nhiên, k ết quả phân tích thống k ê ch ỉ ra rằng không cósự khác biệt có ýngh ĩa giữa pH của các mẫu nem ở 3 cơ sở khảo sátvới độ tin cậy 95% (phụ lục 3).

Qua Bảng 4.1, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH thấp nhất (vào kho ảng 4,34 0,03)

so với 2 cơ sở còn lại là Bà Chín (pH = 4,39 0,03) và Ninh Hòa (pH = 4,41 0,03).

Sự khác biệt này là không đáng kể về mặt thống k ê (p > 0,05). Theo nghiên c ứu củaLý Ng ọc Quí (2006) tr ên sản phẩm nem chua ở cơ sở Út Thẳng, pH của nem chua

trong ngày lên men đầu tiên là 6,33 và ngày th ứ 4 là 3,99. S ở dĩ có sự sụt giảm pH là

do quá trình



- 31 -

chuyển hóa đường trong nguyên liệu thành các acid h ữu cơ, đặc biệt là acid lactic làm

giảm pH của nguyên liệu.Ở các cơ sở sản xuất nem theo kiểu lên men có định hướng, phân tích thốngkê

chỉ ra rằng pH của nem chua ở hai cơ sở Vissan và Giáo Thơ khác biệt nhau có ý nghĩa

(p ≤ 0,05) (phụ lục 3). Giá trị pH của nem chua Giáo Thơ là 4,230,03 cao hơn so với

nem Vissan (pH = 4,15 0,03). Giá tr ị pH ở 2 cơ sở này thấp hơn so với 3 cơ sở lên

men tự nhiên. Điều này có l ẽ là do quá trình lên men nem có định hướng tại các cơ sở này. Ở cơ sở Giáo Thơ người ta sử dụng một phần thịt đã lên men ngày hôm tr ước choviệc sản xuất nem chua ngày hôm sau (80 g b ột thịt ngày 2 và 10 kg b ột thịt ngày hôm

trước được cho thêm vào 40 kg th ịt xay của ngày sản xuất) (Lý Ngọc Quí, 2006). Khilên men có định hướng, vi khuẩn lactic chiếm ưu thế về lượng ngay ở giai đoạn đầ

phát tri ển và sản sinh nhiều aicd hơn so với sản phẩm lên men t ự nhiên (Nguy ễn ThịMinh Uyên, 2008). Trong lên men xúc xích khô, vi ệc sử dụng men vi sinh với nhữngvi khu ẩn phân lập từ chính sản phẩm (men vi sinh nội tại) dẫn đến sự hình thành nhanh

chóng acid lactic ngay t ừ ban đầu của tiến tr ình lên men làm gi ảm nhanh pH của quátrình lên men (Ammor, 2007; trích d ẫn bởi Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008). Bên cạnh đó,

pH của sản phẩm thịt phụ thuộc vào pH ban đầu của bột thịt, vào lượng và loại gia vịvà phụ gia sử dụng, vào hệ vi khuẩn ban đầu và vào nh ững yếu tố có liên quan đến sựtăng trưởng của chúng như nhiệt độ, hoạt tính nước, thế năng oxy hóa- khử... (Hồ Thị

Nguy ệt Thu, 2008).Trong s ản xuất nem chua, các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic, sinh ra trong

quá trình lên men đã làm gi ảm giá trị pH, tạo vị chua tự nhiên cho s ản phẩm và làm

cho cấutrúc th ịt săn chắc, tạo nên k ết cấu dai chắc đặc trưng cho sản phẩm. Bên cạnhđó, pH thấp còn có tác d ụng cản trở sự phát triển của một số vi sinh vật không mongmuốn trong sản phẩm, giúp cho việc bảo quản sản phẩm tốt hơn.

K ết quả xử lý thống k ê về tổng lượng vi khuẩn lactic cho thấy sự khác biệt giữacác m ẫu nem ở 3 cơ sở lên men t ự nhiên là có ý ngh ĩa (p ≤ 0,05). Tổng lượng vi khuẩnlactic c ủa nem Năm Thu 1,62.108 CFU/g là cao nh ất, kế đến là nem cơ sở Bà Chín v ớitổng lượng vi khuẩn lactic là 1,43.10 8 CFU/g (th ấp hơn 1,9.107 CFU/g) và nem Ninh

Hòa có t ổng lượng vi khuẩn thấp nhất (1,29.108 CFU/g th ấp hơn 3,3.107 CFU/g so v ớinem Năm Thu). Điều này phù h ợp với các giá trị pH mà chúng tôi đã đo lường, tổng



- 32 -

lượng vi khuẩn lactic càng nhi ều sẽ sản sinh ra nhiều acid hơn và làm giảm pH sản phẩm. Sự khác nhau về tổng lượng vi khuẩn giữa 3 cơ sở lên men t ự nhiên có th ể là do

hệ vi sinh vật trong bột thịt ban đầu, lá gói, các nguyên phụ liệu, điều kiện môi trườngnhư nhiệt độ, độ ẩm… của các cơ sở khảo sát.

Đốivới 2 cơ sở Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn cao hơn rất nhiều sovới 3 cơ sở lên men t ự nhiên, tổng lượng vi khuẩn lactic của nem Giáo Thơ là 3,08.108

CFU/g và Vissan là 1,15.10 9 CFU/g (l ần lượt cao hơn 1,46.108 CFU/g và 9,88.10 8

CFU/g so v ới Năm Thu). S ự khác biệt này có l ẽ là do các cơ sở Giáo Thơ và Vissan sửdụng phương pháp lên men định hướng, bổ sung vi sinh vật chủ động, bằng cách s

dụng men khô (Vissan) hoặc bột thịt đã được lên men c ủa những ngày trước (GiáoThơ), khiến chúng phát triển chiếm ưu thế, ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác, tạođiều kiện cho chúng phát triển mạnh. Phân tích thống k ê cho th ấy tổng lượng vi khuẩnlactic c ủa 2 cơ sở này khác nhau r ất có ý nghĩa (p ≤ 0,001). Sự khác biệt này có th ể làdo phương pháp định hướng lên men c ủa 2 cơ sở. Cơ sở Vissan sản xuất nem theo quimô công nghi ệp lớn và sử dụng men với các giống thuần, các chủng vi khuẩn lactickhởi động tốt và có kh ả năng phát triển mạnh, làm xúc ti ến nhanh quá tr ình lên men.

4.1.2 Phần trăm các dạng khuẩn lạc củanem chua lên men ngày 4ở năm sơ sở khảo sát

K ết quả ghi nhậnvề các dạng khuẩn lạc hiện diện tr ên nem chua ngày 4 ở nămcơ sở cho thấy tổng cộng có 7 dạng khuẩn lạc được ghi nhận trong các mẫu nem khsát. Vi ệc phân loại các dạng khuẩn lạc được dựavào màu s ắc, hình dạng và kích thướccủa khuẩn lạc. Các dạng khuẩn lạc bao gồm:

Dạng I: khuẩn lạc tr òn, vun nh ẹ, màu tr ắng sữa, có viền sáng xung quanh,rìa gọn, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.

Dạng II: khuẩn lạc tr òn, vun nh ẹ,màu tr ắng sữa, kích thước thay đổi từ 1- 2

mm.

Dạng III: khuẩn lạc tr òn, vun nh ẹ, màu tr ắng sữa, viền sáng, r ìa không g ọn,kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.

Dạng IV: khuẩn lạc tr òn, vun nh ẹ, màu tr ắng đục, trong, kích thước 2 mm.

Dạng V: khuẩn lạc tr òn, vun cao, màu tr ắng sữa, kích thước 1 mm.



Dạng VI: khu

2 mm.

Dạng VII: khu

b) NấmHình 4.1:

a) Khu ẩn lạcHình 4.2:

- 33 -

ẩn lạc tr òn, vun nh ẹ, màu tr ắng đục,

ẩn lạc tr òn, vun cao, màu tr ắng hơi vàng,

a) Khu ẩn lạc dạng I

men c) Tr ực kh Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc

ạng II b) Nấm menDạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc d

ìa sáng, kích th ước

kích thước 2 mm.

uẩnạng I

c) Trực khuẩnạng II



b) Tr ực khHình 4.3:

a) Khu ẩn lạc dHình 4.4:

- 34 -

a) Khu ẩn lạc dạng III

ẩn c) NấmDạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc d

ạng IV b) TrựcDạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc d

menng III

huẩnng IV



a) Khu ẩn lạcHình 4.5:



Phần trăm mỗi dạtrình bày ở Bảng 4.2

- 35 -

ạng V b) Cầu tDạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc d

ạng VI b) Trực k Dạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc d

ng VII b) Tr ực k ạng và hình thái t ế bào của khuẩn lạc dạg khuẩn lạc của các mẫu nem lên men n

ựcng V

huẩnng VI

uẩnng VIIày 4 ở 5 cơ sở được



- 29 -

Bảng 4.2:Phần trăm các dạng khuẩn lạc củanem chua ngày 4 ở 5 sơ sở khảo sát

Kiểu lênmen Cơ sở Σ (%)

Dạng khuẩn lạc(X SD) (%)

I II III IV V VI VII

Lên mentự nhiên(n = 3)

Bà Chín 100 55,08± 6,62 35,99± 8,95 8,93± 7,79

Ninh Hòa 100 28,76± 9,53

11,14± 3,51

2,05± 3,56

47,46± 5,36

10,59± 9,53

Năm Thu 100 32,40± 6,49

16,26± 8,87

51,34± 6,64

Lên men cóđịnh hướng

(n = 3)

Vissan 100 25,19± 9,51

24,08± 2,96

50,73± 6,66

Giáo Thơ 100 63,8± 9,29

36,16± 9,29

(n: tổng số mẫu khảo sát,X : phần trăm khuẩn lạc, SD: độ lệch chuẩn)



- 30 -

Ở cơ sở Bà Chín, có 3 d ạng khuẩn lạc được ghi nhận trong đó, dạng I và II có

tần sốxuất hiện cao hơn nhiều so với dạng VII.Đối với cơ sở nem Ninh Hòa, chúng tôi ghi nh ận được 5 dạng khuẩn lạc, trong

đó dạng IV có tần số xuất hiện cao nhất (47,46%)và k ế đến là dạng I (28,76%).Cơ sở Năm Thu có 3 dạng khuẩn lạc, tần số xuất hiện củadạng V và dạng I là

cao nh ất (lần lượt là 51,34% và 32,40%).

Ở cơ sở Vissan, chúng tôi ghi nhận được 3 dạng khuẩn lạc, trong đó dạng VI ctần số xuất hiện cao nhất (50,73%).

Đối với cơ sở Giáo Thơ có 2 dạng khuẩn lạc được ghi nhận, trong đó dạng I c

tầnsố xuất hiện cao hơn dạng V (lần lượt chiếm tỉ lệ là 63,84% và 36,16%).Trong 7 d ạng khuẩn lạc được ghi nhận, chúng tôi quan sát thấy có 2 dạng giống

với khuẩn lạc được nhận định của Lý Ngọc Quí(2006): Khu ẩn lạc dạng I và dạng IImà chúng tôi ghi nh ận được giống với mô tả khuẩn lạc dạng VI và dạng I.2 trong

nghiên cứu của tác giả này. Theo ghi nh ận của chúng tôi, dạng I xuất hiện ở tất cả cácmẫu nem ở 5 cơ sở với tần số khá cao (25,19%- 63,8%). Còn các d ạng còn lại chỉ xuấthiện ở một số cơ sở, ví dụ như cơ sở Vissan và Giáo Thơ không có dạng II, III và VII;

cơ sở Bà Chín và Ninh Hòa không có d ạng Vvà VI. Riêng d ạng VI chỉ xuất hiện ở cơ sở Vissan.

Sự khác biệt về những dạng khuẩn lạc ở các cơ sở có thể là do h ệ vi sinh vậttrong th ịt ban đầu, các nguyên ph ụ liệu (đường, lá gói,…), các thao tác trong quá tr ình

sản xuất, điều kiện môi trường chế biến, phương pháp lên men… Theo Hồ Thị NguyThu (2008), lá gói c ũng tham gia vào quá trình lên men, do khi kh ảo sát hệ vi khuẩnlactic c ủa lá chùm ru ột tác giả đã ghi nhậncác vi khu ẩn lactic hiện diện với lượngkhông ít. Ngoài ra, đường mía sử dụng cũng bổ sung các khoáng chất, tạo thuận lợcho sự phát triển vi khuẩn lactic của nem chua (Trương Thanh Long, 2004; trích dẫn

bởi Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008)Ở các cơ sở lên men theo ki ểu định hướng, dạng khuẩn lạc có xu hướng ít hơn

so với các cơ sở lên men t ự nhiên do khi lên men định hướng bổ sung các các sinh vậtmong mu ốn làm chúng phát tri ển chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật ngay từ lúc đầu, tạo

điều kiện cho chúng phát tri ển mạnh cạnh tranh với các hệ vi sinh vật khác trong bộtthịt.



- 31 -

4.2 TÍNH CHẤT SINH HÓA CỦA NHỮNG DẠNG KHUẨN LẠC PHÂN LẬPK ết quả nghiên cứu vềcác đặc tính sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập

trên các m ẫu nem ở 5 cơ sở được tr ình bày ở Bảng 4.3.



- 3 2 -

Bảng 4.3Tính ch ất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập.

Lên men tự nhiên (%) Lên men định hướng(%)Tổng

(%)Bà Chín Ninh Hòa Năm Thu Vissan Giáo Thơ

I II VII I II III IV VII I III V I IV VI I V

Vi thể

(n= 132)

Gram(-) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(+) 6,82 6,82 4,55 6,82 6,82 2,27 6,82 4,55 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 100

Hình tháivi khuẩn

Nấm men

(n = 6)0,76 0,76 0 0,76 0 0,76 0 0 0,76 0,76 0 0 0 0 0 0 4,55

Tr ực khuẩn(n= 108)

6,06 6,06 4,55 6,06 6,82 1,52 6,82 4,55 6,06 6,06 0 6,82 6,82 6,82 6,82 0 81,82

Cầu trực (n = 18)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,82 0 0 0 0 6,82 13,63

Phản ứngsinh hóa

(n= 126)

Catalase(-) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100

(+) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Di động(-) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100

(+) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Dạnglên men

Đồng hình 0 6,35 4,76 0 7,14 1,59 7,14 4,76 0 6,35 7,14 0 7,14 0 0 7,14 59,52

Dị hình 6,35 0 0 6,35 0 0 0 0 6,35 0 0 7,14 0 7,14 7,14 0 40,48

Sinhacid lactic

(-) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(+) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100

(n: tổng số mẫu khảo sát)

Nghiên cứu Dạng

khuẩnlạc

Kiểu lên men

Cơ sở



- 36 -

Theo k ết quả được tr ình bày ở Bảng 4.3, trong 132 khuẩn lạc khảo sát về hìnhthái vi khu ẩn, kết quả cho thấy đa số các khuẩn lạc có dạng trực khuẩn (81,82%), kđến là dạng cầu trực (13,63%) tập trung chủ yếu ở dạng V. Chỉ có một số ít là nấmmen (4,55%), v ới tần số xuất hiện thấp ở các dạng I, II và III.

Sau khi ki ểm tra và loại bỏ các chủng vi khuẩn là nấm men, chúng tôi thực hiệncác ph ản ứng sinh hóa với 126 chủng vikhuẩn phân lập để xác định vi khuẩn lactic.K ết quả các phản ứng catalase, khảo sát khả năng di động và sinh acid lactic cho th ấy100% các ch ủng phân lập thỏa mãn yêu c ầu về đặc tính sinh hóa của vi khuẩn lactic.Theo kh ảo sát về dạng lên men, ở các sảnxuất nem chua theo kiểu lên men t ự nhiên,

70% vi khu ẩn kiểm tra có khả năng lên men đồng hình; trong khi ở các cơ sở sản xuấttheo phương pháp lên men có định hướng thì 60% các ch ủng vi khuẩn khảo sát có đặctính lên men d ị hình.

Hình 4.8:Sự chuyển màu của dung dịch trong khảo sát khả năng sinh acid lactic củavi khu ẩn.4.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CÁC CHỦNG VIKHUẨN LACTIC PHÂN LẬP

Khảo sát sơ bộ đối với 126 chủng vi khuẩn, được xem là vi khu ẩn lactic, về khảnăng kháng khuẩn của chúng đối với 5 chủng gây bệnh (Staphylococcus aureus ssp .



- 37 -

aureus CIP 20256, E. coli ATCC 25922, Bacillus cereus CIP 6624T, Listeriamonocytogenes CIP 82110 T và Salmonella indiana LMBA) choth ấy có 28 chủng cókhả năng kháng cả 5 chủng gây bệnh nói trên chi ếm 22,22% tổng số chủng vi khuẩnkhảo sát. Trong đó, có 5 chủng dạng I ở nem Bà Chín, Ninh Hòa (3,97%); 6 ch ủngdạng III ở nem Năm Thu (4,76%); 5 chủng dạng V ở nem Giáo Thơ (3,97%); 5 chủngdạng VI ở nem Vissan (3,97%) và 7 ch ủng dạng VII ở nem Bà Chín và Ninh Hòa

(5,55%).

K ết quả khảo sát bằng phương pháp khuếch tán tr ên thạch của 28 chủng này

cho th ấy chỉ có 01 chủng dạng VII ở nem Ninh Hòa có kh ả năng kháng lạiStaphylococcus aureus ssp . aureus CIP 20256 và 01 ch ủng dạng I của nem Ninh Hòa

kháng l ạiSalmonella indiana LMBA. Điều này có th ể là do các ch ủng vi khuẩn còn lạitạo ra lượng bacteriocin với nồng độ thấp nên không th ể hiện được khả năng khángkhuẩn của chúng.

Đường kính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng VII là 15mm trong khi ở dạng I là 7mm. Như vậy khả năng khángStaphylococcus aureus ssp . aureus CIP củachủng vi khuẩn dạng VII mạnh hơn so với chủng dạng I khángSalmonella indiana

LMBA. Có v ẻ như đối với vi khuẩn lactic, các bacteriocin thường có hiệu quả chốnglại các vi khuẩn Gram (+) nhưng có thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram (-).

Điều này có lẽ là do màng ngoài của vi khuẩn Gram(-) khá dày, gây tr ở ngại cho hoạtđộng của bacteriocin. Những màng này ngăn cản các phân tử như chất kháng sinh,

chất tẩy rửa và thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất(De Martinis và ctv, 2001). Theo

nghiên c ứu của Nguyen (2010) trong 44 chủng vi khuẩn lactic kiểm tra, chỉ có một vài

chủng thể hiện khả năng khángkhuẩn yếu đối vớiStaphylococcus aureus 1976 (Sa

1976) và không có ch ủng nào có kh ả năng kháng lạiSalmonella typhimurium 1826 (St

1826).

Vùng kháng khu ẩn của chủng vi khuẩn lactic dạng VII đối vớiStaphylococcus

aureus ssp . aureus CIP và d ạng I đối vớiSalmonella indiana LMBA được tr ình bày ở Hình 4.9 và Hình 4.10.



- 38 -

Hình 4.9:Vùng kháng khu ẩn của chủng vi khuẩn dạng VII đối vớiStaphylococcus

aureus ssp . aureus CIP.

Hình 4.10:Vùng kháng khu ẩn của chủng vi khuẩn dạng I đối vớiSalmonella indiana

LMBA.



- 39 -

Chương 5K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 K ẾT LUẬNĐối với các mẫu nemngày 4 của 3 cơ sở lên men t ự nhiên, sự khác biệt về

pH sản phẩm làcó ý ngh ĩa với độ tin cậy 95%. Đối với các mẫu nem ở 2 cơ sở lên

men có định hướng, pH của chúng khác nhau có ý nghĩa (p ≤ 0,05) và thấp hơn so vớicác giá tr ị pH của các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men t ự nhiên.Tổng lượng vi khuẩn lacticgiữa các mẫu nem khảo sát ở 3 cơ sở lên men t ự nhiên khác nhau có ý ngh ĩa (p ≤0,05). T ổng lượng vi khuẩn lactic ở cơ sở Năm Thu (1,62.108 CFU/g) cao hơn tổnglượng vi khuẩn của hai cơ sở Bà Chín (1,43.10 8 CFU/g) và Ninh Hòa (1,29.10 8

CFU/g). Đối với 2 cơ sở lên men có định hướng là Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vkhuẩn cao hơn rất nhiều so với 3 cơ sở lên men t ự nhiên. Tổng lượng vi khuẩnlactic ở cơ sở Vissan (1,15.109 CFU/g) cao hơn ở Giáo Thơ (3,08.108 CFU/g) và s ự khác biệtnày là r ất có ý nghĩa về mặt thống k ê (p ≤ 0,001).

Có 7 d ạng khuẩn lạc được ghi nhận tr ong các m ẫu nem ở 5 cơ sở. Kiểm travi thể cho thấy 81,82% vi khuẩn có dạng trực khuẩn, 13,63% vi khuẩn có dạng cầtr ực khuẩn và 4,55% vi khu ẩn có dạng nấm men. Saukhi kiểm tra các phản ứng sinhhóa, có 126 ch ủng vi khuẩn được xem là vi khu ẩn lactic(chiếm95,45 % tổng số chủng

vi khuẩn phân lập).Kiểm tra khả năng kháng khuẩn cho thấy chỉcó 01 ch ủng dạng VII (chiếm

0,79% vi khu ẩn kiểm tra) ở nem Ninh Hòa có kh ả năng kháng lạiStaphylococcus

aureus ssp . aureus CIP 20256 và 01 ch ủng dạng I (chiếm 0,79% vi khu ẩn kiểm tra)của nem Ninh Hòa kháng l ạiSalmonella indiana LMBA. Trong đó, chủng vi khuẩndạng VII có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn.



5.2 ĐỀ NGHỊLặp lại nghiên cứu tr ên các m ẫu nem khác nhau với những thời điểm lên

men khác nhau để tìm các ch ủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin.

Định danh các vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin.Chuẩn hóa và tìm ra các ph ương pháp thích hợp nhằm thu được bacteriocintốt nhất.Ứng dụng các chủng lactic có khả năng sinh bacteriocin vào trong s ản

phẩm nem chua nhằm phát triển nem chua thành th ực phẩm chức năng.

de tai tran thi thanh thao vs32

Documents