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GC-MSScientia Chromatographica 2011; 3(1):25-49Instituto Internacional de CromatografiaDOI: 10.4322/sc.2011.003

ISSN 1984-4433

Preparación de la muestra: un paso crucial para análisis por GC-MS

Elena E. Stashenko*, Jairo René MartínezLaboratorio de Cromatografía, Centro de Investigación de Excelencia, CENIVAM,

Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, UIS, Bucaramanga, Colombiae-mail: [email protected]

ResumoSe destaca la importancia de la preparación de la muestra en los análisis GC y GC-MS. Se ilustrancon ejemplos las consecuencias de algunos errores en la preparación de la muestra, sobre los perlescromatográcos de los extractos resultantes. Se describen las etapas principales de la cadena de eventosque conducen a un extracto que permita determinar cromatográcamente los analitos de interés enuna muestra. Se incluye una breve revisión de los métodos de extracción más comunes, sus alcances ycampos de aplicación. El uso de blancos positivos y negativos, sustancias sucedáneas de los analitos yotras recomendaciones para la prevención de la contaminación cruzada, la mejora de la recuperacióny la obtención de extractos con pocas inter erencias, se presentan junto con explicaciones sobre suconveniencia y e ectos en el resultado nal del análisis GC-MS.

Palavras-chaveGC; GC-MS; preparación de la muestra; técnicas de extracción.

Sample preparation: a crucial step in GC-MS analysis Abstract

Te importance o sample preparation in GC and GC-MS analyses is highlighted. Examples ochromatographic proles are used to illustrate the consequences o certain sample preparation mistakes.Te main steps o the chain o events that leads to a suitable extract are described, in the context othe chromatographic determination o target analytes. A brie revision is made o the most commonextraction methods, their scope and application elds. Te use o positive and negative blanks, as wellas surrogate substances and other recommendations or recovery improvement, the prevention o crosscontamination, and the achievement o extracts containing ew inter erences, are presented together withexplanations about their convenience and effects on the nal analytical results.

KeywordsGC; GC-MS; sample preparation; extraction techniques.


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Stashenko EE, Martínez JR Preparación de la muestra para el análisis por GC-MS

26 Scientia Chromatographi ca 2011; 3(1):25-49

Profesor: El cromatograma obtenido por GC-MS no se ve bien, ya que presenta muchos picosdeformados, asimétricos, con deriva de la línea base y un ruido excesivo; además en losespectros de masas se registran señales intrusas, que no son propias de las sustancias-target presentes en el extracto.

Estudiante: Sí, profesor, efectivamente, son la columna y el equipo que usé; ambos fallan; toca llamar altécnico, para que venga urgentemente y los revise.

Profesor: No, señor, no creo que la causa sea el equipo. La columna se ha instalado recientemente, esnueva; el septum y el liner también se han cambiado hace poco, la cámara de ionización selimpió un par de días atrás y el electromultiplicador es nuevo. El problema serán sus manos.

Estudiante: ¡Mis manos, profesor! ¿Qué quiere decir con ello?

Profesor: Sencillamente, la preparación de la muestra falló, es decir, que fue deciente y pocoesmerada; hay muchas interferencias y contaminantes presentes en los extractos que inyectó,se encuentran en éstos sustancias que no son compatibles con el sistema GC-MS. Hay querepetir la extracción, hacer limpieza del extracto y concentrarlo. Primero, debemos buscarla falla en nosotros mismos y luego, compañero, echemos la culpa al equipo analítico. Comose dice en un refrán “Garbage in, garbage out”. A trabajar entonces, manos a la obra.

1 Introducción

La nalidad de muchas propuestas de

investigación es buscar ondos para adquirir unequipo analítico nuevo y de alta tecnología. Entrelas máquinas “obligatorias” en un laboratorioinstrumental siempre gura uncromatógrafo de gases (GC) acoplado a unespectrómetro de masas (MS), GC-MS. En este instrumento, se unen dospoderosas técnicas, la de separación (GC) y laespectroscópica (espectrometría de masas, MS),que se usan no sólo para detectar y cuanticar losanalitos de un extracto multicomponente sinopara identicarlos1-4. La técnica GC-MS, a pesarde sus grandes avances y desarrollos, multi un-cionalidad, sensibilidad y reproducibilidad alta,así como la acilidad de manejo y robustez, poseeuna limitacióninherente , que reduce el númerode sustancias que puede analizar, porque notodos los compuestos pueden ingresar al sistemaGC-MS, sin que se empeore su uncionamientoo la detección sensible. Esta limitación está rela-

cionada con la volatilidad, la termoestabilidad, lapolaridad y el peso molecular alto de los analitosde interés. En otras palabras, para su análisis porGC-MS, los analitos-target deben ser estableshasta temperaturas de 300-350 °C, volátiles o volatilizables,i.e., existir en la ase gaseosa, sinexperimentar ninguna modicación química, y,por lo general, su peso molecular no debe supe-rar 500-550 Da. ípicamente, por GC-MS seanalizan moléculas no polares y medianamentepolares con masas moleculares de hasta 400-450Da. odo ello implica que menos del 10% detodas las moléculas existentes pueden ser anali-zadas por GC-MS. En términos del número totalde sustancias existentes en el planeta o sinteti-zadas en el laboratorio -y que son aptas para elanálisis por GC-MS-, esta ci ra es alta, pero si sereere a la racción porcentual que representande todas las especies moleculares existentes, este valor es relativamente bajo. Por ende, la opera-ción de un equipo GC-MS en el laboratorio debeser acompañada de una in raestructura de pre-


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paración de la muestra necesaria para garantizarel ingreso al aparato de sólo aquellas sustanciasque son estrictamente compatibles con las técni-cas GC o GC-MS. Suena obvio y trivial, pero, en

la práctica, este hecho a menudo se menospreciay ello crea problemas analíticos, ya que puedeempeorar los resultados obtenidos por la téc-nica GC-MS, generando a menudo los llamados falsos negativos (no se detectan los analitos pre-sentes, no hubo previa concentración y limpiezadel extracto) o falsos positivos (se presenta unacon usión con las señales de inter erencias que setoman por las del analito).

Las limitaciones en cuanto a la naturalezaquímica de las sustancias “compatibles” con latécnica GC-MS, involucran la necesidad de suaislamiento previo (extracción) a partir de lamuestra (matriz)real . En la mezcla multicompo-nente, se encuentran generalmente tanto los ana-litos “amenos” al sistema instrumental GC-MS,como los no aptos para este análisis. A menudo,los componentes de interés se encuentran en

concentraciones a nivel detrazas y se necesita unprocedimiento de enriquecimiento (concentra-ción y limpieza) del extracto, para poder detec-tarlos. El tipo y la diversidad de mezclas complejas -que se procesan-, es muy amplio e incluyemuestras ambientales (aire, aguas, suelos), deorigenbiológico (especies vegetales, tejidos, célu-las, uidos siológicos, etc.),alimentos ybebidas, productos de química combinatoria , artículos deuso personal , drogas y evidencias forenses (resi-duos de incendios, explosivos, pinturas, etc.),entre muchos otros.

Entre los compuestos analizables porGC-MS guran los de interés ambiental5,6, aro-mas y ragancias7,8, drogas y sus metabolitos9-11,pesticidas12, solventes, acelerantes de incendiosmaliciosos13, explosivos14,15, aditivos de bajo ymediano peso molecular presentes en distintosproductos nales,e.g., en polímeros16 o alimen-

tos17,18, semioquímicos ( eromonas)19 y produc-tos naturales20,21, entre otros. El sistema GC-MSpuede ser acoplado a di erentes dispositivos adi-cionales,e.g., muestrador de espacio de cabeza

(Headspace Sampler , HS)22,23, equipo de purgay trampa (P& ), un pirolizador, un horno paradesorción térmica (Termal desorption , D), etc.

El mundo que nos rodea -y cuyas pequeñas“ racciones” o procesos son objetos de numero-sos estudios analíticos-, es unamezcla complejade miles a millones de sustancias de naturalezaquímica muy diversa. Por ejemplo, tan sólo elaroma de café puede contener más de 800 sustan-

cias químicas di erentes, prácticamente, de todaslas clases de compuestos orgánicos y con diversasuncionalidades,e.g., hidrocarburos, alcoholes,aldehídos, ácidos, éteres, ésteres, heterociclos,etc.24. Las fragancias orales, extractos frutales yaceites esenciales pueden estar compuestos porcentenares de sustancias25,26; el petróleo consti-tuye otro ejemplo de una mezcla complejísima,que posee 105-106 sustancias, desde un simple

metano hasta agregados macromoleculares dealto peso molecular (as altenos, resinas) de muycomplicada caracterización química27. Hay másde 100 mil proteínas en el cuerpo humano. Entrediversos productos naturales, se han caracteri-zado miles de terpenos y terpenoides28,29, derivados enólicos y alcaloides30. Los ejemplos sepueden continuar, pero la idea principal es clara:en un laboratorio analítico se manejan -casi sin

excepción-mezclas, a menudo muy complejas,aunque en su interior, de interés analítico, puedengurar sólo alguno(s) compuesto(s) o analitos-target (e.g., plaguicidas, ármacos o sus metabo-litos, sustancias responsables por unoff-avour ,etc.) o sus homólogos y derivados. ípicamente,se requiere determinar su presencia e identi-carlos (análisis cualitativo), pero recuentementetambién hallar su respectiva cantidad (análisiscuantitativo). El análisis cualitativo se lleva a


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cabo por GC-MS operado en modo de barridocompleto ( full scan), mientras que la cuantica-ción del analito se hace, por lo general, en modode monitoreo de ion(es) seleccionado(s) (SIM,

Selected Ion Monitoring , por sus siglas en inglés)o, en el caso de la conguración MStándem , porejemplo, con analizadores de triple cuadrupolo,QqQ, a través del monitoreo de reacción múlti-ple (MRM, Multiple Reaction Monitoring , por sussiglas en inglés).

No existe una técnica analítica instrumen-tal completamenteuniversal (es decir, que sirvapara todas las matrices) para separar, detectar,

cuanticar o identicar inequívocamente todoslos analitos-target presentes en una mezcla com-pleja. ampoco existe una técnica instrumentalcapaz de hacerlo directamente, sin tratamientoprevio (aunque mínimo) de la muestra,i.e., sinllevar a cabo los procesos de extracción, con-centración, raccionamiento o la limpieza delextracto. Por ejemplo, antes de someterlos alanálisis por GC-MS del aroma de una carne rita,

los compuestos volátiles deben ser aislados de lamatriz, ya que a la columna cromatográca capi-lar no deben ingresar proteínas, triglicéridos oácidos grasos. Cuando se necesita, por ejemplo,determinar los residuos de drogas o sus meta-bolitos en una muestra de orina, una alícuota deésta no se introduce directamente al equipo GCo GC-MS, porque ni agua, ni sales presentes enla orina son compatibles con este instrumento

y deben ser excluidas del extracto, antes de suinyección. El agua, las sales orgánicas e inorgá-nicas, las sustancias termolábiles o de alto pesomolecular (e.g., proteínas, sacáridos, glicéridos,glucósidos, ceras, etc.), compuestos muy polares(azúcares, poli enoles, aminoácidos, etc.) no sonaptos para el análisis por GC-MS y, si eventual-mente resultan ingresando al equipo, a ectan suresolución, sensibilidad e imposibilitan la identi-cación de analitos; la calidad del análisis puede

empeorar irreversiblemente, mientras que eluncionamiento del mismo equipo se compro-mete severamente (y no es la “culpa” del equipo,como en muchos casos se suele suponer)31.

Lo expuesto anteriormente conduce a laconclusión de que la muestra -para su análisispor GC-MS-, inevitablemente debe “adecuarse”.Este proceso se llama “ preparación de la mues-tra” (Sample Preparation ) y con orma uno delos pasos más importantes en todacadena ana-lítica. La etapa de preparación de la muestra enla cadena analítica puede ocupar del 60 al 85%del tiempo total de análisis. Del éxito de esta

etapa dependerán parámetros analíticos tanimportantes como laeciencia de recuperación de analitos, lareproducibilidad y la robustez dela técnica, así como lasensibilidad y selectividad de todo el método, eltiempo requerido para elanálisis y sucosto, etc. La robustez de lacadenaanalítica depende, por lo general, de la ortalezade su eslabón más débil, que en muchos casos,precisamente lo con orma la ase de preparación

de la muestra,i.e., la obtención de un extractoenriquecido con analito(s)-target e “idealmente”libre de otros componentes de la matriz o inter e-rencias incompatibles con el equipo GC-MS.

En la gran mayoría de currículos académicosuniversitarios en el mundo, in ortunadamente, simás bien se dictan di erentes cursos de AnálisisInstrumental (Cromatogra ía, Espectroscopia,Espectrometría de Masas, Resonancia Magnética

Nuclear, Di racción de Rayos X, etc., AnálisisForense, Ambiental, de Alimentos, etc.) y delas estrategias deIdenticación de CompuestosOrgánicos, la asignaturaPreparación de Muestras ,rara vez aparece como obligatoria. No obstante,la calidad de un análisis instrumental, el uncio-namiento y el tiempo de vida útil de un equipoanalítico (e.g., GC-MS), la recuencia de su man-tenimiento preventivo y correctivo son paráme-tros derivados directamente de la “calidad” de la


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muestra (extracto) introducida,verbigracia, desu cantidad, grado de limpieza y concentraciónde analitos, es decir, de su “adecuación” previaal análisis. En este caso, la pirámide de errores

o posibles allas en la cadena del análisis instru-mental tendrá en su base la competencia (know-how) del operador y la preparación adecuada dela muestra (Figura 1). La mayoría de las allas quese presentan en el uncionamiento del equipoanalítico (descartando, por supuesto, aquellas“genéticas” provenientes de su abricación) sederivan típicamente de: 1) su operación correcta,i.e., mantenimiento preventivo, cumplimiento

de recomendaciones para su uso, estabilidad dela corriente eléctrica, etc., y, undamentalmente2) el tipo de la muestra (preparación, concentra-ción y limpieza adecuada del extracto), que seintroduce al sistema GC-MS.

Cualquier muestra a procesar se puede con-cebir como unsistema dinámico (Figura 2), endonde interactúan tres “es eras” correspondien-tes a sus “bloques” principales, a saber: 1) lamatriz , 2) lasinterferencias y 3) losanalitos-tar-

get . El aislamiento cuantitativo de los últimoses el objetivo principal de la preparación de lamuestra. La meta es separar los analitoscuanti-tativamente , sin alterarlos o modicarlos quími-

camente, de manera predecible y reproducible,dejando el extracto nal libre de los componen-tes de la matriz y de las inter erencias. La canti-dad de analitos separados con respecto a su can-tidad original en la muestra reeja laeciencia de su extracción. El aislamiento cuantitativo delos analitos-target se hace más ácil y ecientecuando sus propiedades ísico-químicas (e.g.,temperatura de ebullición, polaridad, etc.) son

muy di erentes de las de otros componentes de lamatriz; por ejemplo, es más ácil aislar un hidro-carburo del agua que un enol presente en ésta.

A pesar de que recuentemente se logranseparar, con alta eciencia, los analitos de lamatriz donde se encuentran (e.g., aire, agua,suelo, alimento, uido biológico, tejido, etc.), enel extracto nal , empero, pueden “sobrevivir” lasinterferencias , verbigracia, aquellas sustancias“oportunistas” que poseen una anidad dual,

Figura 1 Las causas y la magnitud de los posibles errores o fallas que puedan surgir en una cadena analítica,representado alegóricamente como una pirámide, que culmina con el respectivo análisis instrumental ( e.g. ,GC-MS) del extracto obtenido.


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tanto por la matriz (e.g., agua, grasa), como porel medio extractivo (e.g., disolvente, adsorbente).En este caso, el análisis por GC-MS puede a ec-tarse por su presencia, porque las inter erencias

pueden disminuir la resolución, la selectividad

y, undamentalmente, la sensibilidad del equipoGC-MS, ya que generan la contaminación pro-gresiva del sistema analítico, dejan en él la“memoria” (e ectocarry-over ) o simplemente se

superponen a las señales generadas por el ana-lito-target , imposibilitando su identicación ocuanticación.

En la Figura 3 se reejan, de una maneramuy simplicada, los posibles resultados de laextracción de una muestra compleja (Figura 2),representados así: a) La separación de analitos esdeciente, con bajo porcentaje de recuperacióny sin la debida limpieza (clean-up) del extracto

(es decir, sin eliminación de otros componentesde la matriz e inter erencias que a ectarán nega-tivamente el análisis por GC-MS); b) La ecien-cia de extracción es mucho más alta, aunque serequiere una limpieza adicional del extracto, yaque aún perduran en éste las inter erencias; c) Laextracción es casi per ecta: se observa una altaeciencia (porcentaje de recuperación de ana-litos) y muy buena limpieza del extracto. Si el

Figura 2 La “estructura” típica de una muestra: matriz,analitos-target e interferencias. Las interferenciasdurante el proceso de extracción de analitos-targetrevelan su naturaleza dual, ya que pueden tener anidadtanto por la matriz, como por el medio extractivo ( e.g. ,por un disolvente, un adsorbente, gas de purga, etc.).

Figura 3 Representación esquemática de los resultados posibles de una técnica de extracción. a) Extraccióndeciente con recuperación de analitos-target baja y limpieza del extracto deciente. b) Extracto caracterizadopor una buena recuperación de analitos-target, pero requiere una mejor limpieza (aislamiento de componentesde la matriz e interferencias). c) Extracción adecuada, con una eciencia de recuperación de analitos alta y unalimpieza del extracto muy buena.


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extracto obtenido (Figura 3c) está con ormadopor analitos de bajo peso molecular (


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la muestra (agua, suelo, alimento, tejido vegetalo animal, uido siológico, etc.), existen di eren-tes protocolos y normas (acorde con las agenciasreguladoras, EPA, AS M, AOAC, etc.) para su

conservación adecuada, el tipo de recipiente ausar, la temperatura, humedad y luz o la necesidadde la adición de algunas sustancias (conservantes,antioxidantes) o realización de procedimientosadicionales (agregación de sales o solventes, cam-bio de pH, temperaturas muy bajas, etc.), queimpiden el deterioro de la muestra,e.g., su oxida-ción, hidrólisis o la ormación de arte actos.

La muestra, incorrectamente guardada,

puede experimentar cambios en su composi-ción y producir pérdidas de algunos analitos deinterés. Esto puede acontecer a razón de algu-nos cambios físicos (evaporación, precipitación,di usión, percolación, adsorción, etc.) yquímicos

(oxidación, reducción, hidrólisis, degradaciónmicrobiana, otólisis, etc.) y conducir a los falsosnegativos (por ejemplo, la conversión de enoles,inicialmente presentes en la muestra, a ácidos)

o a los falsos positivos ( ormación de arte actos,e.g., “aparición” de algunas sustanciascontrola-das, que no estaban presentes inicialmente enla muestra y se ormaron durante su almace-namiento, por ejemplo, hidrocarburos aromá-ticos → enoles). El material del empaque, losrecipientes y las tapas pueden retener algunosanalitos (por ejemplo, adsorción de hidrocarbu-ros poliaromáticos en la supercie de vidrio) o,

al contrario, “aportar” al extracto sustancias (adi-tivos, colorantes, alatos, etc.), que no estabanpresentes inicialmente en la muestraoriginal .

Un ejemplo curioso aparece registrado en laFigura 6. Hace unos años, en nuestro laboratorio,

Figura 6 Cromatograma del extracto de las tapas de tubos de ensayo, obtenido por extracción con hexanocaliente y su posterior concentración con ujo de N 2. Se observan compuestos traza presentes en el disolventehexano “concentrado” y los compuestos que estuvieron en contacto con las tapas durante la manipulación oalmacenamiento de muestras. Las tapas pueden revelar la “historia” química del laboratorio y de los analitos queen él se manejaban. GC-MS (EI, 70 eV). Columna DB-5 (60 m). Inyección (1 µL) en el modo split (1:30).


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donde se llevaban a cabo varios trabajos de grado,se usaban y se re-usaban tubos de ensayo con susrespectivas tapas. Los sellos decaucho de estastapas se sometieron a la extracción con hexano

caliente y el extracto obtenido, que se concentrócasi a sequedad con un ujo de nitrógeno seco, seinyectó al equipo GC-MS. En el cromatogramaresultante es posible leer la “historia” del labora-torio, a través de las sustancias impregnadas enla tapas plásticas y extraídas de ellas. Las hexano-nas, hexanoles y ciclohexanol ueron impurezasdel hexano y “aparecieron” cuanto este solventese concentró varias veces (se hizo blanco del

disolvente concentrado); los terpenoides (lina-lool, carioleno, ledol, otros) provenían de variostrabajos realizados en el área de toquímica,los clorobencenos provenían de los estudios deaceites dieléctricos (PCBs) y el benzotiazol y ladi enilamina ueron, respectivamente, el agentederivatizante y el patrón interno, usados en losestudios de antioxidantes y para la cuantica-ción de ármacos. Para los servicios analíticos es

menester, para evitar la contaminación cruzaday los e ectos decarry-over , usar el material (e.g.,tapas) desechable. Esto, por supuesto, eleva bas-tante el costo de los análisis.

Igualmente, es muy importante tener pre-caución cuando se guardan los extractos -yaobtenidos-, en rascos (viales), para su posterioranálisis por GC o GC-MS. El almacenamientoprolongado del extracto en disolvente,e.g., diclo-

rometano, puede conducir a que a éste pasenlos compuestos, productos de la degradacióndel septum de la tapa, y en el cromatograma delextracto se observan entonces los picosintrusos ,cuya presencia puede no permitir la cuantica-ción correcta de analitos o generará la superpo-sición de las señales. En la Figura 7, se observaotro ejemplo, en el cual se comparan las raccio-nes volátiles de una bebida tipoCola, obtenidaspor dos técnicas de extracción, unasolventless,

micro-extracción en ase sólida en modoheads- pace, HS-SPME, y la otra, extracción líquido-líquido, LLE, por lotes, usando diclorometano.La última, además de resultar menos sensible ycontaminante, presentó problemas deco-extrac-ción de productos de degradación de unseptum de silicona de la tapa del rasco donde se alma-cenó el extracto, antes de su inyección al GC-MS.

Uno de los procedimientos undamenta-

les en la cadena analítica y de preparación de lamuestra es el análisis deblancos. Éstos se divi-den en blancos positivos (cuando se utiliza lamuestra “simulada” enriquecida con el analitode interés, añadido a la matriz en cantidad cono-cida), yblancos negativos [una muestra (matriz)desprovista de analito-target ]. Losblancos posi-tivos demuestran que el método de extracciónunciona y es reproducible y cuantitativo. Losblancos negativos son obligatorios para demos-

Figura 7 Cromatogramas de: 1) la fracción volátilobtenida por HS-SPME (bra PDMS/DVB, 65 µm) dela bebida tipo Cola (línea verde) y 2) el extracto dela misma bebida obtenido por el método LLE porlotes, con diclorometano (línea negra). En el extractoLLE aparecen (resaltadas con un círculo) sustancias“intrusas” (productos de degradación de la silicona delseptum de la tapa, co-extraídos por el CH 2Cl2 duranteel almacenamiento de la muestra). Se observa, que laextracción de los analitos volátiles de la bebida por LLEfue bastante deciente, en comparación con el métodoHS-SPME. GC-MS (EI, 70 eV). Columna DB-5 (60 m).


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trar que el procedimiento empleado es limpio,libre de la posible contaminación cruzada prove-niente de material de vidrio, manos, tapas, man-gueras, jeringas, disolventes,viales, septa u otras

partes del instrumento analítico (GC, GC-MS),e.g., inyector, línea de trans erencia, cámarade ionización, columna, etc., que están involu-crados en el análisis y están en contacto con lamuestra. Para demostrar que el equipo GC-MSno posee e ectos de memoria (carry-over ), entrelos extractos -que se analizan-, se intercalan losdisolventes puros, cada 3-5 muestras o más re-cuentemente, si el análisis es detrazas y cuando

es particularmente crítico el resultado obtenido(análisis ambiental, orense, etc.).

El principal propósito de la preparación dela muestra es el aislamiento conalta eciencia (recuperación) de los analitos de interés. Pero,¿cómo se sabe que el proceso de extracción eseciente, cuantitativo y reproducible? Para ello,se utilizan di erentes estrategias, pero, muy amenudo, se emplea untestigo, una sustancia

surrogate, es decir, un compuesto sucedáneo concaracterísticas ísico-químicas similares a las delos componentes-target a extraer. Elsurrogate debe ser una sustancia pura (material de re eren-cia certicado), estructuralmente similar al com-puesto o compuestos a aislar y cuanticar, nodebe estar presente en la muestra, ni reaccionarcon ninguno de sus componentes. Es una sus-tancia similar a un patrón interno , pero se agrega

a la muestra antes de someterla a la extracción.Desde el punto de vista químico y analítico, losmejores surrogates son análogos deuterados delos analitos-target , aunque no siempre es posi-ble conseguirlos. La ventaja de un análisis porGC-MS de un extracto enriquecido con la sus-tancia surrogate (análogo deuterado), es que elsurrogate y el (los) analito(s)-target pueden seranalizados y cuanticados simultáneamente y sinla necesidad de que sus picos cromatográcos se

separen en la columna (de hecho, co-eluyen). Porejemplo, para cuanticar na aleno (P.M. 128) enuna muestra, se puede usar comosurrogate sudeuteroanálogo (P.M. 136). El análisis cuantita-

tivo del na aleno se basa en las mediciones de lascorrientes iónicas parciales de iones molecularesde na aleno (M+., m/z 128) y de su análogo deu-terado (Md10+., m/z 136). El cálculo del porcen-taje de recuperación con base en las cantidadesdel surrogate añadido (Cteor) y extraído (Cexp), sehace como se ilustra en la Figura 8. Sin embargo,es importante tener en cuenta que la incorpora-ción de la sustanciasurrogate en la muestrareal

no siempre reeja la misma manera en la cual losanalitos-target ueron incorporados en la matriz;por ello, los porcentajes de recuperación de lassustancia(s)-surrogate pueden ser más altos quelos de los analitos-target , sobre todo, cuando lamatriz es heterogénea y muy compleja (suelo,lodo, tejido vegetal, roca, etc.).

La cuanticación de analitos-target se basaen la curva de calibración, que puede ser obte-nida tanto por el método deestandarización

Figura 8 Proceso esquemático de la adición de unasustancia-surrogate a la muestra (matriz), que luegose somete al proceso de extracción. La cantidad desurrogate extraída, con respecto a la añadida, permitecalcular el porcentaje de recuperación de analito(s)-target, estructuralmente similar(es) a la molécula delsurrogate.


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externa, como interna , usando un compuestoestándar (Istd,Internal Standard ), que se agregaal extracto nal concentrado, para cuanticartanto a los analitos-target , como a la sustancia-

surrogate recuperada, para hallar el porcentaje derecuperación delsurrogate y, por consiguiente,de los analitos.

Entre los principales problemas comunes,que acompañan a di erentes métodos de pre-paración de la muestra, guran el tiempo muyprolongado que requiere esta etapa (60-85% deltiempo total), su elevado costo (materiales, disolventes, patrones, personal, etc.), la eciencia de

recuperación de analitos de la matriz, a menudo,muy pobre y una baja reproducibilidad, así comola probabilidad decontaminación cruzada y erro-res en la interpretación de resultados. Las uentesmás recuentes de la contaminación cruzada sonlos reactivos, agentes derivatizantes, disolventes,material de vidrio, tapas, mangueras, pipetas,manos (sic!), atmós era del laboratorio, entreotras. El respectivoblanco del procedimiento

permite garantizar que el proceso de preparaciónde la muestra está libre de la contaminación cru-zada. Para ello, se lleva a cabo la preparación dela muestra,i.e., extracción, a partir de la matrizsimulada sin analito(s)-target . Por ejemplo, serealiza el análisis de disolvente concentrado, quepermite vislumbrar tanto sus impurezas, comolos posibles arte actos provenientes del materialde vidrio, pipetas, columnas de limpieza, etc.;para las técnicas de extracción en ase vapor(headspace) es importante obtener el blanco de laatmós era del laboratorio, así como realizar unaadquisición de datos en el equipo GC-MS, perosin inyectar ninguna muestra, para descartar lose ectoscarry-over del aparato.

Se puede concluir, resumiendo, que entrelos puntosclave de la preparación de la muestraguran la eciencia de extracción, la calibracióncon patrones para la cuanticación correcta de

analitos, los análisis de blancos de procedi-miento (tanto positivos, como negativos), el usodel material certicado de re erencia, el análisisde duplicados, la vericación sistemática de la

curva de calibración, la debida calicación deloperador y técnico del laboratorio, la bitácora yel registro minucioso de todo el acontecimientoanalítico, entre otros aspectos.

3 Métodos de extracción más comunesen la preparación de la muestrapara el análisis por GC-MS

En los últimos años el desarrollo de di eren-tes técnicas de extracción y de preparación de lamuestra ha experimentado un incremento excep-cional, gracias a su importancia para el análisisinstrumental. En la Figura 9 se puede observareste crecimiento, sobre todo, en la última década.Las revistas donde más se publican los resultadosde investigación que involucran distintas técni-cas de extracción son, en su orden decreciente,

las siguientes: Journal of Chromatography A, Analytica Chimica Acta, Analytical Chemistry , Journal of Agricultural and Food Chemistry , entreotras. Es interesante anotar, que las áreas dondemás se desarrollan y aplican las di erentes téc-nicas extractivas son química, bioquímica, aná-lisis biológico, agrícola y ambiental, entre otras(Véase Figura 10).

La escogencia correcta de la técnica de

extracción depende de muchos actores. Entreéstos, guran: 1) la naturaleza de lamatriz (ori-gen, estado de agregación, homogeneidad, esta-bilidad y representatividad) y delanalito a aislar(su volatilidad, polaridad, reactividad y termoes-tabilidad, en qué concentración se encuentra ycómo está distribuido en la matriz); 2) el propó-sito mismo del análisis,i.e., cualitativo o cuan-titativo ; 3) la necesidad de la conrmación dela estructura química del analito (identicación


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Figura 9 Desarrollo cronológico de publicaciones cientícas sobre los métodos de extracción para análisisinstrumental. Las principales revistas donde se publica sobre este tópico. Base de datos: Scopus (Elsevier, 2011).Período de observación: 1980-2010. Palabras-clave: “Extraction techniques” OR “Analytical method”. Fecha de

consulta: 19 de enero de 2011.

por técnicas espectroscópicas); 4) la premura delanálisis, es decir, qué tan urgente es el resultado(por ejemplo, para determinar el tipo de venenoo sustancia tóxica en el jugo gástrico, para apli-carle rápido un antídoto correcto a un pacienteintoxicado); 5) las implicacioneslegales que pue-den representar los resultados de análisis obteni-dos (por ejemplo, en campos orense, ambiental,control de doping ) y, por último, 6) es impor-tante saber si el método de extracción es cono-cido, regulado o debe ser establecido, optimizadoy validado. Para los análisis de extractos porGC-MS, lo más importante es tener el extracto“limpio” (sin componentes no compatibles conesta técnica) y sucientemente concentrado,para que los analitos se encuentren en él en la

concentración conmensurable con los nivelesmínimos de detección/cuanticación del sistemaGC-MS respectivo.

Los métodos de extracción de los analitos-target pueden dividirse grosso modo en tres gru-pos grandes, a saber: I. Métodos Destilativos. II. Métodos Extractivos. III. Métodos de Headspace.Algunas técnicassui generis pueden combinardos métodos de di erentes grupos, por ejemplo,destilación-extracción simultánea con solvente50 (SDE,Simultaneous Distillation-Extraction , porsus siglas en inglés). Las técnicas de destilaciónestán basadas en las di erencias (deben ser gran-des) de las propiedades ísico-químicas de losanalitos a aislar y de la matriz; concretamente,sus temperaturas de ebullición (volatilidades o


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presiones de vapor). La racción de interés podríaser tanto la que se destila (volátil), como el rema-nente ( ondo de destilación). Para el análisis porGC o GC-MS se utiliza comúnmente la racción volátil. Las destilaciones pueden llevarse a cabode di erentes maneras: 1) Arrastre con vapor(SD,Steam Distilllation, pos sus siglas en inglés);2) Hidrodestilación (HD,Hydrodistillation , porsus siglas en inglés) o 3) Destilación con agua-

vapor. Véase la Figura 11 para di erenciar lostres métodos que se utilizan undamentalmentepara la destilación del material vegetal yobten-ción de aceites esenciales o, en algunas aplicacio-nes, para el aislamiento de racciones volátilesde productos nales (jabones, champús, algunasbebidas, cremas dentí ricas, etc.). Los extractoso racciones volátiles destilados por SD, HD oSDE presentan mezclas per ectas para su análi-sis por GC-MS. Sólo pueden requerir un secado,

e.g., con sul ato de sodio anhidro, previo a lainyección del extracto al cromatógra o. Algunosprocesos de destilación suceden a presión redu-cida (vacío), en columnas especiales (destilaciónmolecular); muchos se realizan a escala indus-trial; pero, en general, no son aptos para estudiary aislar compuestos a nivel de trazas.

Con miras a aumentar la eciencia deextracción y reducir sustancialmente el tiempode destilación, en los últimos 25 años se empleaactivamente la radiación de microondas comouente de calentamiento51-53, tanto del agua(hidrodestilación asistida por microondas,MWHD, Microwave-Assisted Hydrodistillation,por sus siglas en inglés), como de disolvente o dela muestra, según las constantes dieléctricas, ε,del uno o del otro (para que la sustancia absorbala radiación de microondas, debe poseer ε alta,

Figura 10 Principales áreas de aplicación de diferentes técnicas de extracción empleadas previamente alanálisis instrumental. Base de datos: Scopus (Elsevier, 2011). Período de observación: 1980-2010. Palabras-clave: “Extraction techniques” OR “Analytical method”. Fecha de consulta: 19 de enero de 2011.


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Figura 11 Obtención de aceites esenciales por arrastre con vapor (fuente externa de vapor, e.g. , caldera);

destilación con agua-vapor (vapor húmedo obtenido por calentamiento del agua hasta su vigorosa ebullición)e hidrodestilación (calentamiento del agua con el material vegetal sumergido, generalmente muy delicado, porejemplo, ores).

i.e., momento dipolar), ormando un grupode métodos de extracción asistida por radia-ción de microondas (MAE, Microwave-AssistedExtraction , por sus siglas en inglés). El métodoMAE se utiliza más que todo para la extracción

de muestras sólidas (material vegetal, suelo, teji-dos, etc.) con agua o con un disolvente orgá-nico53,54.

La segunda amilia de técnicas, comprendediversos métodos extractivos, en los cuales elaislamiento de analitos está basado en di eren-cias de sus solubilidades en disolvente(s) o desu capacidad de adsorción o absorción sobre unsorbente (carbón activado, gel de sílice, alúmina,

tamiz molecular, etc.) o en un polímero poroso(PDMS, enax, Porapak, Chromosorb, resinassintéticas, etc.). Entre los métodos extractivos“clásicos” guran, laextracción líquido-líquido ,LLE (Liquid –Liquid Extraction , por sus siglas eninglés), en modo continuo o por lotes (batch).La selectividad de extracción se logra con unaescogencia correcta del disolvente (polaridad,temperatura de ebullición, constante dieléctrica,capacidad de ormar puentes de hidrógeno, dis-

ponibilidad, accesibilidad, costo, etc.); a menudo,el extracto obtenido debe someterse a los proce-sos de limpieza y concentración. A pesar de unaserie de problemas que acarea la técnica de LLE,entre otros, la ormación de emulsiones, alto

costo, tiempos prolongados de extracción, di-cultad de automatización, disposición de disolventes tóxicos, posibilidad de contaminacióncruzada, etc., en la última década, se observaun número creciente de trabajos publicados queinvolucran el uso de LLE (Figura 12).

Como una alternativa a la LLE, desde haceca. 40 años, se ha implementada laextracción en fase sólida, SPE (Solid-Phase Extraction, por sus

siglas en inglés)55,56

, que permite reducir sustan-cialmente el uso de disolventes y combinar en unsolo paso la extracción, limpieza y concentraciónde analitos-target ; además; el método incluyela posibilidad de la automatización, implemen-tada en varios equipos comerciales con conexiónen línea al cromatógra o. Los datos estadísticosmuestran el crecimiento de la aplicación de estemétodo de preparación de la muestra en di eren-tes áreas de investigación (Figura 12).


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Figura 12 Crecimiento en función del tiempo de publicaciones cientícas que involucran la utilización detécnicas extractivas de preparación de la muestra, i.e., extracción líquido-líquido (LLE) y en fase sólida (SPE). Basede datos: Scopus (Elsevier, 2011). Período de observación: 1980-2010. Palabras-clave: “Liquid-Liquid Extraction”y “Solid-Phase Extraction”, respectivamente. Fecha de consulta: 19 de enero de 2011.

La extracción con uido supercrítico, SFE(Supercritical Fluid Extraction , por sus siglas eninglés), a pesar del costo alto en comparación con

otras técnicas, en los últimos diez años ha expe-rimentado un intenso crecimiento (Figura 13).SFE se ha usado en las áreas de productos natu-rales, ambiental, alimentos, orense y en muchasaplicaciones industriales. La selectividad delmétodo SFE se alcanza variando los parámetrosoperacionales, undamentalmente, de la densi-dad de uido supercrítico (presión y tempera-tura), así como usando modicadores57-60. Parael análisis por GC-MS, a menudo, se requiere la

limpieza adicional del extracto SFE, para elimi-nar grasas o pigmentos, ceras u otros compues-tos de alto peso molecular, según la naturaleza de

la matriz que se usó.Entre los métodos extractivos más antiguos

(centenario, sic!), pero tal vez, menos selectivos y más “sucios” -en cuanto al extracto quese obtiene-, gura laExtracción Soxhlet , que seusa en los análisis de suelos, polímeros, pro-ductos naturales, etc., en áreas de bioquímica,ciencias agrícolas, biológicas, ambientales, etc.(Figura 14), pero no presenta el crecimiento tan


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rápido que ostentan otros métodos,e.g., MAE,SFE, SPME, entre otros, y que se reemplaza re-cuentemente, hoy en día, por el método más e-ciente, de laExtracción con Solvente Acelerada,ASE ( Accelerated-Solvent Extraction, por sussiglas en inglés)61,62, donde la mayor selectividad,rapidez y la considerable reducción del tiempo yde la cantidad de disolvente se logran en un solopaso de extracción, concentración y limpieza, enmodo automático y con posibilidad de acopla-miento en línea con GC-MS.

Si se habla de una verdadera “revolución verde” en las técnicas de preparación de la mues-tra, esta será la Microextracción en Fase Sólida,SPME, que en los últimosca. 20 años, logró tenerun crecimiento sin parangón (Figura 15), gober-nar las áreas de análisis de volátiles de origen bio-

lógico, estudios ambientales, orenses (aceleran-tes de incendios, residuos de explosivos, análisisde drogas en uidos y tejidos), alimentos, moni-toreo de di erentes procesosin vitro ein vivo (aná-lisis de aliento, procesos de ermentación, cam-bios microbiológicos, armacocinética, etc.)63-66.La SPME combina la extracción y concentraciónde analitos-target y puede usarse en tres modos:1) en headspace, 2) por sumergimiento directode la bra en la muestra y 3) usando una mem-brana protectora. Es una técnica amena al análi-sis de compuestos por GC-MS, más aún que enel mercado existen los dispositivos que permitenrealizar este proceso de modo automático y aco-plado en línea con el cromatógra o (Figura 16).La selectividad del método SPME se logra:1) variando las condiciones operacionales (tem-

Figura 13 Desarrollo cronológico de publicaciones cientícas sobre el método de extracción con uidosupercrítico, SFE. Las principales revistas donde se publica sobre este método. Base de datos: Scopus (Elsevier,2011). Período de observación: 1980-2010. Palabras-clave: “Supercritical Fluid Extraction”. Fecha de consulta:19 de enero de 2011.


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D e s a r r o

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2 0 1 1

.


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Figura 15 a) Desarrollo cronológico de publicaciones cientícas que incluyen el método de extracción SPME.b) Las principales áreas de investigación donde se usa SPME. c) Revistas principales donde más se han publicadotrabajos que emplean SPME. Base de datos: Scopus (Elsevier, 2011). Período de observación: 1980-2010.Palabras-clave: “SPME”. Fecha de consulta: 19 de enero de 2011.


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peratura, salting-out , modo de exposición de labra, agitación y el tipo de recubrimiento de labra, entre otros; 2) usando sistemas de detec-ción cromatográca selectivos (ECD, FPD, NPD,MS-SIM, etc.) y 3) aprovechando la derivaciónde los analitos-target en matriz o directamentesobre la bra67,68. Una de la aplicaciones másinteresantes de SPME es la extracción de anali-

tos-target acompañada de su derivación 1) enla matriz; 2) en la bra saturada con un agentederivatizante67 (Figura 17) o 3) directamente enel puerto de inyección del cromatógra o.

Los métodos de muestreo de espacio decabeza (Headspace) en sus versiones “clásicas”se dividen en: (1)Headspace estático (S-HS) y(2) Headspace dinámico. Las racciones volátilesrecogidas son aptas para el análisis GC-MS, ya

que la ase vapor no contendrá los componen-tes de matriz e inter erencias no volátiles, muypolares (iónicas) o de alto peso molecular. ElS-HS se aplica a las muestras con analitos-target en concentraciones relativamente altas y queno requieren la pre-concentración. Son análisispor GC-FID de B EX (benceno, tolueno, etil-benceno y xilenos) en agua, la cuanticaciónde trihalometanos en agua potable, alcoholemia(alcohol en sangre), compuestos volátiles en pin-

turas, polímeros y determinación de disolventesresiduales en ármacos, hidrocarburos en sue-los, análisis de bebidas y per umes, entre otrasmuchas aplicaciones69. Cuando la concentra-

ción de analitos-target es muy baja en la mues-tra (ppt, ppb), se requiere su enriquecimiento(pre-concentración) y el muestreo se hace enmodo de Headspace dinámico. Básicamente,los analitos se recogen, al purgar la ase vaporcon un gas inerte, en un solvente, o se “conge-lan” (crio-atrapamiento) o, se ad(b)sorben en unsorbente (método de purga y trampa, P& ), delcual se recuperan por la acción de temperatura

( ermodesorción , D)70

o se eluyen con solvente.El uso de la ase vapor por encima de la

muestra (headspace) como medio para realizarlos procesos extractivos tiene grandes venta- jas desde el punto de vista analítico, porque seeliminan muchas inter erencias. En el estudiode productos naturales, el muestreoheadspace directo ha permitido el estudioin vivo de la rac-ción volátil alrededor de plantas completas, o

sus partes71

. radicionalmente, se distinguen losmétodos estático y dinámico de muestreo, aun-que las técnicas de sorpción de gran capacidaddesarrolladas en la última década involucranambos aspectos72. El gran desarrollo de la técnicade SPME ha servido para identicar, en sus múl-tiples aplicaciones, algunos aspectos que puedenmejorarse. Esto ha generado una colección denuevos métodos de muestreo a micro-escala, que

logran una mayor capacidad de concentraciónde los analitos de interés y tal como la SPME, sonsusceptibles de automatización. In varios casos, selogra una capacidad de concentración superior ala de SPME porque se emplea un volumen mayorde ase sorbente (polimérica, normalmente).En la técnica de trampa de adsorción dentrode la jeringa (INCA , Inside Needle Capillary Adsorption rap por sus siglas en inglés), unacapa de polímero recubre el interior de la aguja

Figura 16 Cromatógrafo de gases acoplado aun sistema de preparación de muestras con SPMEautomatizado.


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Figura 17 a) Modo de derivación directa de los analito-target sobre la bra SPME, previamente saturada con unagente derivatizante (tomado de ref. 67). b) Análisis de sustancias carbonílicas volátiles en el humo de cigarrillo:extracción selectiva por la bra de SPME saturada con PFPH (pentaúorfenilhidracina) y detección de hidrazonasformadas in situ por GC-ECD.

de una jeringa, o el interior se rellena con carbónactivado73. Se denomina HS-SPDE (HeadspaceSolid-Phase Dynamic Extraction por sus siglas en

inglés) a la técnica de muestreo en la que la agujade una jeringa hermética para muestreo de gasesse recubre con polímero absorbente (PDMS), en


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de la matriz que los contiene, para seleccionar latécnica de muestreo apropiada. Se han logradograndes avances en miniaturización, integración,selectividad, eciencia, reproducibilidad, reduc-

ción de costos y robustez de las técnicas de mues-treo, extracción y concentración, pero siguensiendo indispensables ciertas prácticas de ase-guramiento de la calidad de la cadena analítica,tales como el uso de blancos, sustancias testigo,etapas de limpieza y réplicas.

5 Agradecimientos

Los autores agradecen la colaboración enel análisis cienciométrico a Martha Cervantes,Química, M.Sc.

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el que se depositan los analitos cuando la jeringase acciona repetidamente sobre la muestra74. Elnúmero de ciclos de succión y expulsión del airedetermina la cantidad de analitos que se acumu-

lan. Éstos son desorbidos posteriormente en elpuerto de inyección del cromatógra o, tal comose practica con SPME.

Otros ejemplos de técnicas de muestreoderivadas de SPME que usan mayor volumen dease absorbente son SBSE (Stir Bar Solid-PhaseExtraction ) y S E (Sorption ape Extraction ).En la primera, la barra magnética de agitaciónse recubre con polímero absorbente. Luego de su

exposición a la solución que contiene los analitosde interés, la barra de agitación se somete a ter-modesorción para la trans erencia de los analitosal cromatógra o75. En S E, una cinta delgada dePDMS se coloca por un tiempo jo directamenteen contacto con la supercie de la planta, la pielo el objeto que se muestrea. Los analitos se trans-eren posteriormente al cromatógra o por ter-modesorción76.

En la microextracción en ase líquida(LPME) los analitos se disuelven en una películade disolvente que se orma en el interior de laaguja de una jeringa, o en su extremo, ormandouna gota77. El tipo de solvente, y el tamaño o elnúmero de ciclos de uso de la jeringa, son losprincipales parámetros que se modican paraoptimizar la extracción. La revisión hecha porKoning, Janssen y Brinkmann44, contiene tablasque presentan re erencias representativas del usode muchas de estas técnicas modernas de prepa-ración de muestras para análisis GC o GC-MS.

4 Conclusiones

El éxito del análisis cromatográco dependeuertemente de una preparación esmerada dela muestra. El analista debe tener en cuenta lanaturaleza química de los analitos de interés y


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deber clase iii

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