deconstrução por enzimas 2: celulase. propriedades das enzimas celulolÍticas mecanismo geral :...
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Deconstrução por Enzimas 2:Celulase
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PROPRIEDADES DAS ENZIMAS CELULOLÍTICASPROPRIEDADES DAS ENZIMAS CELULOLÍTICAS
MECANISMO GERAL :
Hidrólise do laço b-1,4-glicosídico por um mecanismo de catálise ácido-base, com retenção ou inversão da configuração do C anomérico
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Mecanismo de reaçãoReaçao de hidrólise via mecanismo ácido-base envolvendo dois resíduos, um catalisador ácido e um nucleófilo.
Asp-201 Asp-201
Glu-555 Glu-555
Catalytic mechanism of C. thermocellum endoglucanase CelD as a paradigm of -glucanase acting(Beguin and Aubert, 1992))
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Resíduos de aminoácidos envolvidos na catálise de celulases e xilanases de T. reesei
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• Cristalinidade da celulose• Área superficial•Tamanho das partículas •Presença de outros componentes (xilana/lignina)• Grau de polimerização• Porosidade do material• Tamanho da partícula
• Adsorção de enzimas• Inibição pelo produto• Sinergismo
O que governa a hidrólise enzimática da celulose?
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Indice de Cristalinidade
Ajuda na diferenciação e classificação dos polímeros celulósicos
Como medir?
Ic = 1 – Iam
I002
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1) Celulose amorfa é hidrolisada preferencialmente?
2) A hidrólise de celulose amorfa produz mais açúcares solúveis?
Fica dificil separar os efeitos (cristalinidade, DP, área superficial, tamanho de partícula)
Cristalinidade aumenta com a hidrolise enzimática
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Area superficial e cristalinidade
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Medida da área superficial da celulose
Simons (1950) - TAPPI
• Coloração diferencial com dois corantes (azul e laranja) para investigar a fibrilação e danos mecânicos de fibras refinadas
Direct Blue 1 (992.82 Da)
Direct Orange 15 (corante polimérico)
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• O corante laranja (HMW) possui maior afinidade pela celulose que o corante azul
• 455 nm é o máximo de absorção do corante laranja, e 624 nm, máximo de absorção do corante azul
• No entanto, o corante laranja só se ligará à celulose se os poros do material forem maiores ou iguais a 5 nm
• A quantidade do corante laranja adsorvido dá informações sobre a celulose acessível
• A combinação da adsorção dos dois corantes dá informações sobre a porosidade do material
Yu et al. (1995) - TAPPI
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Retenção de água e técnica de exclusão de soluto
Ponto de Saturação de Fibra e Valor de Retenção de Água como Parâmetros Indicativos da Reatividade da Celulose
•Em 1944, G. Jayme introduziu a medida do valor de retenção de água (WRV) para mensurar a hornificação de polpas celulósicas
•O cálculo do WRV utiliza os valores em massa da quantidade de água que a fibra consegue reter, sendo que a perda da capacidade de retenção de água é atribuída à ocorrência de hornificação no material.
•Em 1996, Bendzalova e colaboradores observaram que o WRV também é uma boa estimativa do ponto de saturação da fibra, ou seja, permite determinar se um determinado material apresenta ou não maior volume de poros em relação a outro.
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Inace
ssib
le w
ate
r (m
L/g)
Probe size (Å)
Lignina + Hemicelulose
Celulose
agua
Sonda 4 = 5000 Da Sonda 5 = 10000 Da Sonda 6 = 20000 Da Cf(1) < Cf(2) < Cf(3) < Cf(4)
Cf(4) ≈ Cf(5) ≈ Cf(6)
1. A técnica de exclusão de solutos
Stone and Scallan (1968)
Baseada na acessibilidade de diferentes materiais a moleculas de soluto com diferentes massas molares...
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2. Determinação do valor de retenção de água (WRV)
•As amostras imersas em água destilada por 24 h com cerca de 1% (m/m) de teor de sólidos, e então centrifugadas a 4500 rpm por 15 min à 25 ºC.
•secas até peso constante em estufa à 105ºC. Utilizando o valor das massas da amostra úmida e seca em estufa, o WRV foi calculado pela equação 2:
Onde, m0 é a massa de bagaço úmido, e m1 a massa de bagaço seco em estufa
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Determinação do ponto de saturação da fibra (FSP)
• um corpo poroso úmido apresenta seus poros completamente cheios de água.
•quando adicionado a ele uma solução de solutos pequenos, o esperado é que boa parte destes solutos se difunda para dentro dos poros de tamanho maior ou igual ao seu, equilibrando a concentração dentro e fora dos poros e consequentemente acarretando numa redução no valor
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O FSP foi determinado utilizando a equação (Ishizawa et al., 2007):
W é a massa da solução, q é a massa de água na amostra,p é massa seca da amostra, Ci e Cf são as concentrações inicial e final da solução de dextrana, respectivamente.
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Pontos de saturação da fibra (FSP), valores de retenção de água (WRV) e conversões de celulose (CC) de amostras de bagaço in natura e deslignificadas por 1 e 4 horas.
AmostraFSP (mL/g) WRV (%)
CC (%)
In natura 0,91 99,10 12,5
Deslignificado 1h 1,21 140,91 52,6
Deslignificado 4h 2,09 188,84 81,7
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Sinergismo
1. Endo-exo
2. Exo-exo
3. Intramolecular
Artigos:1) Effect of Cellulase Mole Fraction and Cellulose Recalcitrance on Synergism in Cellulose Hydrolysis and BindingTina Jeoh, David B. Wilson,and Larry P. WalkerBiotechnol. Prog. 2006, 22, 270-277
2) Synergism between corn stover protein and cellulaseYeJun Han, HongZhang ChenEnzyme and Microbial Technology 41 (2007) 638–645
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Enzimas de Trichoderma reesei
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Inibição de B-glucosidase
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Modelo de LangmuirC- concentração de celulase livre (mg/ml)
T - celulase adsorvida (mg/g substrato)
Tmax - max celulase adsorvida (mg/g substrato)
K - cte Langmuir (ml/mg enzima)
T max - 54,77 mg/g substrato, K - 4,53 ml/g Kr (coef. Distribuição) = Tmax x K
Adsorção de celulase em EPMS (Biotechnol. Prog. 2007, 23, 398-406)
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Efeito da lignina na dessorção de celulases
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20 FPU de cellucast e 2% Avicel