DĚLICÍ METODY I. – úvod

Význam DM– výskyt studovaných látek ve směsích

Podmínka studia:

• Získat čistou látku

• Ověřit její čistotu

Historie DM

Alchymisté:

destilace, srážení, extrakce, krystalizace

20.století:

LSC - chemie přírodních látek

PC, IEC – chemie bílkovin

AC – jednostupňová operace → antigeny

Empirie → racionální přístup

Klasifikace DM

Podle vlastností

b.v.- destilace, lyofilizace

Rozpustnost – krystalizace, srážení, extrakce

KD – extrakce, LLC,GLC

KHA, KBOH – IEC

μ – Elfo

V – centrifugace, GPC, dialýza, UF

Podle fází

V jedné fázi – Elfo, dialýza

Mezi dvěma fázemi –

chromatografie, krystalizace,

destilace

Podmínka dělení: rozdíl aspoň v jedné fyzikální či chemické vlastnosti

Volba DM

Šetrnost x účinnost x ekonomika

Dělení není ani teoreticky 100% ← K

Hodnocení dělení:• Stupeň čistoty• Výtěžek [%]

IZOLACE (vydělení) SEPARACE (oddělení)

Organická chemie individuum

Biochemie

skupina látek

DĚLICÍ METODY

Typicky vícestupňový postup čištění proteinu

Stupeň Celkový protein

Objem Celková aktivita

Specifická aktivita

Výtěžek Stupeň vyčištění

mg ml U U/mg %

1. Hrubý extrakt 19 200 372 192 0,01 100 1

2. Precipitace síranem amonným 5 400 74 120 0,02 62 2

3. Chromatografie na DEAE-celulose 340 103 100 0,29 52 29

4. Chromatografie na hydroxyapatitu

50 20 80 1,6 41 160

5.Gelová filtrace na Sephadexu G-100

6 20 60 10,0 30 1000

1. NALEZENÍ ZDROJE

Ekonomické hledisko:

• Co nejlevnější zdroj

• Co největší obsah

2. UVOLNĚNÍ Z TKÁNĚdesintegrace, destrukce

1. MECHANICKY – mlýny, kuchyňský masový mlýnek

2. HOMOGENIZACE – s pufrem, mixer

3. LYSE BUNĚK OSMOTICKÝM TLAKEM

4. CHEMICKY – louh, enzymy: lysozym, celulasa,

5. RŮZNÉ – ultrazvuk„acetonový prášek“

Homogenizátor Pottera a Elvehjema

Metody desintegrace buněk

3. EXTRAKCE

l, s l ()Teorie extrakce → výpočet výtěžku

→ LC – mnohonásobná kontinuální extrakce

Volba rozpouštědla:• Maximální cA

SIMILIA SIMILIBUS SOLVENTUR

ll• Minimální vzájemná rozpustnost kapalin – eluotropická řada εr ,

maximální Δεr

• Maximální D • Maximální Δρ (ne emulze), minimální η, inertnost

3.1. EXTRAKCE Z KAPALINY

Rozdělovací konstanta Rozdělovací koeficient

KD= (aA)org./(aA)H2O D = (cA)org./(cA)H2O

E (výtěžek %) ≈ D, Vorg./VH2O, n

.

.

.

..

100

100

100

org

org

org

orgorg

VV

D

DE

V

V

E

E

c

cD

V

V

c

c

E

E

3.1.1 METODY• Vytřepávání – dělička (3x)• Roztřepávání, protiproudé rozdělování

Protiproudé rozdělování - Craigování

Průmyslové použití

• Rychlé, • Bezodpadové• Malá spotřeba rozpouštědel• Matematické zpracování

↓

optimalizace procesu

antibiotika, cholesterol z lanolinu

Izolace surového methyloxytocinu (SPOFA)

Přístroj:

QUICKFIT & QUARTZ

100 jednotek

0,05% AcOH v sec.BuOH

3.2. EXTRAKCE Z PEVNÉ LÁTKY

Soxhletův extraktor

za horka

kontinuální

Moderní Soxhlet

• SOXTEC Tecator – nepřímé vyhřívání cirkulujícím olejem• ROVNOVÁŽNÝ EXTRAKTOR Tecator – mechanicky pro tepelně a

světelně citlivé látky

•SOXWAVE Prolabo Fokusovaná mikrovlnná technologie

•Automatické•Úspora času,rozpouštědel, nákladů•Šetrné

SOXTEC

4. SRÁŽENÍ s c

4.1.1 VYSOLOVÁNÍ

2

2

1I

II zcI

Rozpustnost cystinu x

vsolování vysolování

IEB

(NH4)2SO4, Na2SO4, Na3PO4

)(Ifx I – iontová síla

Použití vysolování (NH4)2SO4

Výhody

• Vysoká x , nezávislá na T• Malý denaturační vliv• Vysoká dělící schopnost

frakční vysolování• laciné

Použití

• NK (30% (NH4)2SO4)

• BÍLKOVINY (30 – 75%)

př. penicilinasa (60l →2,4kg,

4x specifická aktivita)

• Mastné kyseliny• Sulfonové kyseliny

4.1.2 SRÁŽENÍ ORG. KAPALINOU

Vytěsnění

organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou

Zmenšení solvatačního obalu

Aceton, EtOH, MeOH, py,

pro bílkoviny polyethylenglykol

4.2. SRÁŽENÍ ZMĚNOU pH

• Bílkoviny IEB (kasein z mléka)

• Adenin Ade2S + NaOH

4.3. TVORBOU NEROZPUSTNÝCH KOMPLEXŮ

NK (PO4-) + SEPTONEX

streptomycin sulfát

Denaturace těžkými kovy – Hg2+, Pb2+, Cd2+

4.4. TEPELNÉ SRÁŽENÍPro termostabilní enzymy – př. kvasničná ADH