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A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL
para as CIÊNCIAS da SAÚDE
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Capítulo III. A Cinética Enzimática
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Catalisadores biológicos
Poder catalítico e especificidade
Reguladas
Nem todas as enzimas são proteínasRibozimas...
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As enzimas podem aumentar a velocidade das reacções pelo menos 1 milhão de vezes... COMO ?
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PROTEÍNAS - Enzimas: cofactores
Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de
cofactores - Metais
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…Metais
Anidrase carbónica humana: requer zinco, que está ligado aos anéis imidazol de 3 resíduos de histidina e a uma molécula de água
Enzimas: cofactores
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Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de
Pequenas moléculas orgânicas - COENZIMAS
Enzimas: cofactores
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… Pequenas moléculas orgânicas (coenzimas)
Fosforilase do glicogénio: envolvida na utilização de glicogénio para produzir
energia, requer a coenzima piridoxal fosfato (PLP)
Enzimas: cofactores
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Enzimas: cofactores
COFACTORES
Iões Metálicos Coenzimas
Iões ActivadoresIões do
local activoCosubstratos
Grupos prostéticos
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Enzimas: classificação
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Depende de interacções precisas com o substrato...
... As interacções com o substrato, envolvem:
• forças de van der Waals• forças electrostáticas• pontes de hidrogénio• interacções hidrofóbicas
Enzimas: funcionamento
Catálise Enzimática
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Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D)
Enzimas: especificidade
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As enzimas não conseguem alterar as leis da termodinâmica → não alteram o equilíbrio de uma reacção química
Uma enzima acelera os dois sentidos da reacção exactamente na mesma proporção
Enzimas: funcionamento
A + B AB
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Formação de um complexo que representa o estado de transição...
E + P ES E + S
Enzimas: funcionamento
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Enzimas: funcionamento
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Facilitam a ocorrência do estado de transição, diminuindo a energia de activação, e consequentemente, aumentando a velocidade da reacção
Enzimas: funcionamento
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O estado de transição existe?O estado de transição existe?
Para uma concentração constante de enzima, a velocidade da reacção aumenta com o aumento da concentração do substrato, até se atingir uma velocidade máxima...
•... todos os centros catalíticos estão preenchidos e, consequentemente, a velocidade da reacção …
Enzimas: funcionamento
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Alterações nas características
espectroscópicas de enzimas quando se
adiciona substrato - complexo enzima
substrato.
A intensidade da fluorescência
da sintetase do triptofano
varia com a adição de serina e
de indol (substratos)
Enzimas: funcionamento
O estado de transição existe?O estado de transição existe?
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Enzimas: local activo
Resolução de estruturas Resolução de estruturas por cristalografia de por cristalografia de
raios-Xraios-X
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LisosimaEnzimas: local
activo
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8-10 aminoácidos no local activo
Preferência por resíduos hidrofóbicos
Nomenclatura dos aminoácidos no local activo P3-P2-P1 – P`1-P`2-P´3
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Asp catalíticos
Protease aspártica
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S3S3
S`3S`3
S2S2
S`2S`2
S1S1
S`1S`1
S`1S`1
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S1 Pepsina : I30, D32, Y75, T77, F111, F117, - , D215, G217, T218
Catepsina D: - , D32, Y75, S77, F112, F117, I120, D215, G217, T218
Cardosina A : - , D32, Y75, T77, F112, F117, I120, D215, G217, T218 S`1 Pepsina : G34, G76, - ,Y189, I213, D215, - , M289, Y291, I300
Catepsina D: G34, G76, - , - , I213, D215, T218, M289, I291, I300
Cardosina A : - , G76, - ,Y189, F213, D215, - , M289, - , I300
Loop Flexível para coordenação com o substrato Pepsina : L71, S, I, T, Y, G76, T, G, S, M, T, G82
Catepsina D: F71, A, I, H, Y, G76, S, G, S, L, S, G82
Cardosina A: G71, A, I, I, Y, G76, T, G, S, I, T, G82 Cardosina B: A71, S, I, Q, Y, G76, T, G, A, I, V, G82
S2 na cardosina e pepsina
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Enzimas: local activo
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...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.
Modelo do encaixe induzido
Enzimas: local activo
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...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.
Enzimas: local activo
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Enzimas: local activo
O que se passa no local activo?
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Enzimas: local activo
Para promover interacções efectivas com o substrato
Ribulose-1,5-bifosfato
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Definida pela estrutura 3D (ou 4D)Enzimas:
especificidade
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Enzimas: Cinética Enzimática
Modelo de Michaelis e MentenModelo de Michaelis e Menten
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Modelo de Michaelis e Menten
VV, varia com a [S] para uma concentração fixa de enzima [E0]
Enzimas: Cinética Enzimática
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Enzimas: Cinética Enzimática
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... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M
KKMM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato é uma medida da afinidade da enzima para o substrato
Enzimas: Cinética Enzimática
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... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M
KKcatcat - “turnover number” - “turnover number”
Enzimas: Cinética Enzimática
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Como medir a eficiência de uma enzima?
...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima)
Perfeição enzimática
Algumas enzimas aproximam-se destes valores...
Enzimas: Cinética Enzimática
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Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o substrato em solução
Enzimas: Cinética Enzimática
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Enzimas: Cinética Enzimática
Influência da temperatura e pH
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Enzimas: Cinética EnzimáticaInfluência da temperatura
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Influência do pH
Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima
Enzimas: Cinética Enzimática
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Enzimas: Cinética Enzimática
Influência do pH – Regula a actividade
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Substratos múltiplos
Reacções com transferência de grupos funcionais de um substrato para o outro...
...nas reacções de oxidação redução, são transferidos electrões
Reacções que envolvem substratos múltiplos, classificam-se em duas classes:
• Deslocamento sequencial• Deslocamento duplo
Enzimas: Cinética Enzimática
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Deslocamento sequencial
Todos os substratos têm que estar ligados antes da libertação de qualquer produto
Dividem-se em duas subclasses:• Sequencial ordenado• Sequencial aleatório
Enzimas: Cinética EnzimáticaSubstratos múltiplos
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Enzimas: Substratos múltiplos
Enzimas: Cinética Enzimática
• Deslocamento sequencial
• Deslocamento duplo
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Deslocamento sequencial
Num mecanismo sequencial ordenado, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto é importante
Enzimas: Cinética EnzimáticaSubstratos múltiplos
Forma-se um complexo ternário
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Enzimas: Substratos múltiplos
Deslocamento sequencial
Num mecanismo sequencial aleatório, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto não é importante
Enzimas: Cinética Enzimática
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Substratos múltiplos
Deslocamento duplo
Também designadas de reacções “ping pong”
Um dos produtos é libertado antes de todos os substratos estarem ligados
Neste tipo de reacções, forma-se um complexo enzima - substituída
1. Um grupo funcional é transferido do primeiro substrato para a enzima
2. O primeiro produto é libertado3. Liga-se o segundo substrato e o grupo funcional ligado à
enzima é transferido para ele
Enzimas: Cinética Enzimática
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Substratos múltiplos
Deslocamento duplo
Catalisa a transferência de um grupo amina do aspartato para o -Cetoglutarato
Enzimas: Cinética Enzimática
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Deslocamento duplo
Enzimas: Cinética Enzimática
Deslocamento sequencialordenado
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Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
A actividade de diversas enzimas pode ser inibida pela ligação de pequenas moléculas específicas e de iões
Algumas drogas e agentes tóxicos podem inibir o funcionamento de certas enzimas
A inibição pode ser reversível ou irreversível
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O complexo enzima – inibidor dissocia-se rapidamente
Dois tipos de inibição:1. Competitiva2. Não competitiva
Inibição reversível
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
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Inibição reversível: Competitiva
Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
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Inibição reversível: Não - Competitiva
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
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Inibição reversível
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
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Inibição reversível: Mista
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
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Gly76
Inibidor
Gly76
Inibidor
C-terminal
Loop flexível
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Inibição irreversível
Desenho Racional de Fármacos
Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente aos resíduos dos locais activos
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
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Inibidor
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Existem três classe de inibidores irreversíveis:
Específicos de grupos
Ligam-se a cadeias laterais específicas
Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
Inibição irreversível
Proteases tiólicas
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Marcadores de afinidade
Moléculas estruturalmente semelhantes ao substrato e que modificam covalentemente o local activo
Mais selectivos que os específicos de grupos
O TPCK é um marcador de afinidade para a quimotripsina – DIAGNÓSTICO?
Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
Inibição irreversível
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Inibidores suicidas
São substratos modificados e são os mais específicos para marcar o local activo
Ligam-se como se fossem substrato e o mecanismo catalítico normal é activado, produzindo uma espécie reactiva que posteriormente se liga covalentemente à enzima
Enzimas: Cinética Enzimática
Regulação e Inibidores
Inibição irreversível
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Desenho Racional de Fármacos -
Inibidores para o
estado de transição
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
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Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores
Moléculas que imitam o estado de transição do substrato, são inibidores potentes
Biblioteca de péptidos
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Desenho Racional de Fármacos -
Inibidores para o estado de transição
Como são feitos os estudos?
PROPOSTA PELOS ALUNOS
Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores