Planta (Berl.) 91, 96--110 (1970)

Der autoradiographische Nachweis tritiierter wasserlSslicher Substanzen in den SiebrShren

von Cucurbita und Cucumis*

KLAUS S(~HMITZ

Botanisches Institut der Universit~t Bonn

Eingegangen am 29. November 1969

The Autoradiographic Ident i f ica t ion of Tr i t ia ted Water-soluble Material in the Sieve Tubes of Cucurbita and Cucumis

Summary. When D-Glueose-6-T is applied to small areas of the leaf blade of Cucumis or Cucurbita, a translocation of labelled material within the veins and the petiole down to the internodes of the axis can be demonstrated by chemical methods and by histoautoradiography. The translocated material was identified by thin layer and paper chromatography as stachyose, raffinose, and sucrose. A dry mounting autoradiographic technique was elaborated which prevent- ed any secondary diffusion of water soluble substances. In autoradiograms of longitndinal and cross sections of veins, petioles and internodes, tritium can be localized within singIe sieve tubes of exporting bundles. Usually the centre of activity corresponds to the cytoplasmic material or the slime-plugs and to the sieve plates. Since sucrose, stachyose and raffinose are the main labelled translocated substances in these experiments, there is little doubt that with certain precautions such autoradiograms may present a real picture of the long-distance translocation of assimilates.

Einlei tung

E in wichtiger Teilaspekt bei der Fern le i tung der Assimilate ist die genaue Lokalisat ion der Transpor tbahnen . Ringelungsversuche, Trans- por tun te r suchungen mit Fluorescein, Studien an phloemsaugenden Aphiden u n d Unte r suchnngen zur Fe ins t ruk tu r des Phloems ffihrten zu dem SchluB, dab der Transpor t organiseher Subs tanzen in den Sieb- rShren erfolgt.

Die Ergebnisse der ersten autoradiographischen Unte r suchungen waren demgegenfiber recht entt / iuschend, da sic fiber eine grobe histo]o- gische Zuordnung zun~chst n i ch t hinausff ihrten (u.a. Biddulph, 1956; Perkins, Nelson und Gorham, 1959; Mortimer, 1965). Dennoch ergab

* Teil einer Dissertation unter der wissenschaftlichen Leitung yon Prof. Dr. J. Willenbrink.

Naehweis tritiierter Substanzen in Siebr6hren 97

sieh aus solehen Studien, dab der Siebtei l eines Bfindels keineswegs Ms eine funkt ionel le E inhe i t zu be t r aeh ten und in seiner Gesamthe i t Ms T r a n s p o r t b a h n anzuspreehen ist, sondern dag en tweder eine s tgndige Gl iederung in funkt ione l l differenzierte Ph loemgruppen vor l iegt oder eine physiologisehe Steuerung der Transl0or takt iv i t / i t yon Phloem- un te re inhe i ten erfolgen kann (Biddulph und Cory, 1960; BonnemMn, i965/66; Esehrieh, 1967; Tr ip und Gorham, 1967). Dagegen gelang eine eellul~re LokMisa t ion ~4C-markierter Ass imi la te im Phloem bisher n u t ind i rek t (Kol lmann, 1967; Sehmitz und Wil lenbr ink , 1967). Unter - suchungen, in denen die Markierung yon Transpor t subs t anzen du tch App l ika t i on yon T H O durehgeff ihr t wurde, ff ihrten offenbar infolge yon Aus tausehprozessen von Tr i t i um gegen normMen Wassers tof f bisher n ieh t zum gewiinsehten Erfolg (Gage und Aronoff, 1960; Neeraeher , 1965), obwohl Tr i t ium Ms sog. weieher f i -St rahler grundsgtz l ieh eine gute Lokal i s ie rung mark i e r t e r Subs tanz in der Zelle e rwar ten lieg. Besseren Erfolg verspraeh m a n sieh yon der Verwendung t r i t i i e r te r Zueker oder Aminos~uren. I - I i s toautoradiogramme aus solehen Versuchen konn ten al lerdings bisher n ieht endgfil t ig i iberzeugen (Bolli, 1967; Tr ip und Gotham, 1967/68).

Wi r haben daher das P rob lem erneut aufgegriffen und auf auto- r ad iograph i sehem Weg versueht , 3H-markier te Ass imi la te in den Sieb- rShren d i r ek t naehzuweisen.

Methodik

1. P/lanzenmaterial Cucumis sativus. Anzueht auf N~hrlSsung nach v. d. Crone, bei 25 ~ C, 75% rel.

Luftfeuchtigkeit, Bestrahlung mit LeuchtrShren (Philips TLF 65W/34 de Luxe) im Licht-Dunkel-Rhythmus 18:8 Std, ca. 6000 Lux in H6he der Pflanzen.

Cucurbita pepo. Anzueht als Topfpflanzen, bei 25 ~ C, 80% rel. Luftfeuehtigkeit, Beleuehtung mit LeuehtrShren (ACEC 6500 ~ Kelvin, 3500 ~ Kelvin und Warm White de Luxe in Dreiergruppe), Licht-Dunkel-Rhythmus 17 : 7 Std.

Die Versuche wurden nur an Exemplaren durchgeffihrt, deren Sprog 80--100 cm lang war und deren ~ltere Blattspreiten einen Durchmesser yon ca. 20 cm hatten.

2. Die aH-A pplil~ation

Eine w~grige L6sung yon Glucose-6-T (spez. Aktivit~t: 500 oder 2000 mC/mmol; Radiochemical Centre Amersham) wurde fiber die Blattspreiten appliziert. Die beste Aufnahme konnte unter Zugabe yon 5 ppm Bors~ure durch Auftragen der L6sung auf die Unterseite der Blattspreite erzielt werden, wenn der entsprechende Spreitenbereich zuvor mit einem Netzmittel (Natrium-Lauryl-Sulfat 0,8%) be- handelt worden war.

Nach Versuchszeiten zwischen 30 und 180 rain wurde die Transportstrecke (Blattnerven, Blattstiele und Internodien) mit sauberen Rasierklingen rasch in kleine Abschnitte (5--10 mm lang) zerteilt. Diese Gewebeproben wurden meist alternierend der Autoradiographie und der chemischen Aufarbeitung zugeffihrt.

98 K. Schmitz:

3. Trennung und Identi/izierung 3H-marlcierter Transportsubstanzen Die Gewebeproben wurden in 80% Methanol abgetStet, mit Quarzsand zer-

mSrsert und mehrfaeh extrahiert (80% Methanol, 50% Methanol, wenig Wasser). Bestimmung der Radioaktivit~t im Szintillationsspeetrometer (Packard 3320). Szintill~tionsflfissigkeit: Butyl-PBD (6 gr)-Toluol (500 ml)-Methanol (500 ml).

Die aH-Extrakte wurden fiber Ionenaustauseher in eine kationische oder basische Fraktion (Aminosi~uren), eine saure Fraktion (org. S~uren) und eine neutrale Fraktion (Zucker) vorgetrennt (Boardman, 1962). Kationenaustauscher: Dowex 50 (Regeneration mit nHC1): Anionenaustauscher: Dowex 1 (Regeneration mit nttC1); Elution der Aminos~uren mit 0,1 n Ammoninmhydroxyd; Elution der org. S~uren mit 0,1 n HC]. Die weitere Auftrennung der Fraktionen erfolgte papier- und dfinnschichtchromatographiseh. Da kein Chromatogramm-Scanner zur Verffi- gung stand und sich verschiedene Nachweismethoden zur Lagebestimmung der getrennten aI-I-markierten Substanzen als ungeeignet erwiesen, wurde bUS den eindimensionalen Papier- und Dfinnschichtehromatogrammen in Laufrichtung ein 20 mm breiter L~ngsstreifen entnommen und in 5 mm hohe Querstreifen zerteilt. Die Radioaktivitiit dieser Streifen (20• mm) wurde gemessen. Szintillations- lSsung ffir Papierstreifchen: p-Terphenyl (4 gr) - - POPOP 1 (100 rag) - - Toluol (1000 ml); Szintillator ffir die pulvrigen Sorptionsmittel der Dfinnschichtplatten: Butyl-PBD 2 (6 gr) - - T o l u o l (1000 ml) mit 4% Tixcin-Zusatz.

4. Die Histoautoradiographie wasserlSslicher Substanzen a) Fixierung, Ge/riertroc]cnung und Para//inierung. Die Gewebeproben wurden

sofort nach dem Ourchtrennen der Leitgewebe dutch Eintauchen in trockeneis- gekfihlten Petrol~ther fixiert. Die Entw~sserung durch Gefriertrocknung erfolgte in einer Anlage (WKF, Modell L2), die ein Betriebsvakuum yon 2 • 10 -2 Tort erreieht und die M5glichkeit bietet, fiber heizbare Stellfl~chen die Temperatur am Trockem gut zu variieren. W~hrend der dreit~gigen Haupttrocknung herrschte eine Temperaturdifferenz yon 20 ~ C (--50~176 Danach wurde die Temperatur am Trockengut langsam bis auf 25~ erhSht. Die trockenen Gewebeproben wurden sofort mit Xylol fibergossen und unter dem Vakuum einer Wasserstrahlpumpe mit Xylol infiltriert. Nach ausreichender Xyloldurchtriinkung konnte das Material in Paraffin eingebettet werden. Mit einem Rotationsmikrotom wurden 6--8 ~ dieke Schnitte hergestellt und auf einem Stiickchen Teflon in Gruppen yon 20 X 40 mm angeordnet.

b) ,,Montage" der Autoradiogramme. Kleine Rechtecke (55 • 30 ram) des Film- materials (Kodak ,,Autoradiographie Film Plates" AR 10) werden mit der Emulsions- schicht nach oben zur Quellung auf eine saubere Wasseroberfl~ehe gelegt. ~ i t einem Objekttr~ger, dem ein Deckglas (24x 46 mm) adh~riert, wird nun der ge- quollene Film so yore Wasser abgehoben, dal~ er sich dem Deckglas und dem Objekttr~ger glatt und. dicht anlegt. Die befilmten Objekttr~ger werden an der Luft getrocknet und anschlieiiend mit der Emulsionsschicht auf die Paraffinschnitte aufgedrfickt. Dabei bleiben die in Gruppen angeordneten Schnitte an der Film- emulsion haften. Um einen noch besseren Kontakt zwischen Paraffinschnitt und Filmemulsion zu erreichen, legt man die Objekttr~ger kurze Zeit auf einen Streck- tisch bei 40 ~ C.

c) Exposition, Entwic]clung und abschlie/3ende Preparation. Die Exposition erfolgt bei Raumtemperatur fiber CaCI~ ;s ie dauerte in unseren Versuchen je nach Aktivit~t der Probe zwisehen zwei Tagen und drei Wochen. Vor der Entparaffi-

1 POPOP = 1,4-Bis-(5)-phenyloxaxolyl-(2)-benzol (Fluka). 2 Butyl-PBD = 2-(4-ter-Butylphenyl)-5-(4-Biphenylyl)-l,3,4-Oxadiazole (Ciba).

Nachweis tritiierter Substanzen in SiebrShren 99

nierung wurden die Pr~parate nach der Methode yon Branton und Jacobson (1962) mit einem Celluloseacetatfilm fiberzogen, um ein Abschwimmen der Schnitte zu vermeiden. Dazu werden die Pr~parate in eine L5sung yon 250 mg Celluloseacetat (Fluka) in 6 ml Aceton und 45 ml Athylmethylketon eingetaucht und schnell in einen Exsiccator fiberfiihrt. In 3 ~ 4 Std bildet sich ein feiner, klarer Film, der das ganze Pr~parat fiberzieht und die Schnitte w~hrend der Entparaffinierung und Entwicklung in ihrer Lage festh~lt.

Entparaffinierung: Xylol I 60 rain Xylol I I 60 rain Xylol/J~thanol (2:1 v/v) 20 min Xylol/Athanol (1:2 v/v) 15 rain Athanol 94 % l0 rain _~thanol 90% 7 rain _~thanol 70 % 5 rain _4thanol 50 % 3 rain.

Entwicklung: unmittelbar anschlieBend in Kodak D-19b (3 rain); Fixierung: normales Fixierbad ohne Unterbrecherbad (fixiert wird so lange, bis

die Filme klar sind, plus der Hi~Ifte dieser Zeit); Spiilen: Athanol 50% (5--7 rain); anschlieBend spiilt man die PrEparate

nochmals mit J~thanol 50% und schlieBlich mit wenigen Tropfen J~thanol 70% ab, befreit sie vorsichtig yon iiberflfissigen Filmresten und deckt mit einem Deckglas (20 • 40 mm) ab. Film und Schnitte liegen danach zwischen zwei Deckgliisern, die mit schnell erh~rtendem farblosem Lack (Cutex-Nagellack) umrandet werden. Auf diese Weise erhElt man handliche PrEparate, die sowohl vonder Filmseite a]s auch yon der Gewebeschnittseite mikroskopiert werden kSnnen.

Ergebnisse Die Ergebnisse unserer au to rad iograph i schen Unte rsuchungen zur

Loka l i sa t ion 14C-markierter Ass imi la te im Phloem yon Cucumis sativus und Solanum lycopersicum (Schmitz und Wil lenbr ink , 1967) h a t t e n bereits frfiher zu der Vermutung gefiihrt , dM3 allein die Siebr6bren Ms T r a n s p o r t b a h n e n ffir den Ass imi la t f e rn t r anspor t in F rage kommen. Ein sicherer Beweis dieser These, die sich bisher nu t auf ind i rek te Hinweise stf i tzt , i s t nu t yon solchen A u t o r a d i o g r a m m e n zu erwar ten , in denen e inwandfre ie Deckungsgle ichhei t lokMer Schwi~rzungen der F i lmemuls ion m i t einzeinen Siebr6hren oder gar intr~cellul i iren St ruk- tu ren besteht . Diese ]3eweisfiihrung wird s t ichhal t iger sein, wenn die Zuordnung sowohl an Querschni t ten als auch an Li~ngsschnit ten gelingt.

a) Querschnittprdparate. Der Querschni t t durch einen B l a t t n e r v yon Cucurbita pepo (Abb. 1 a) zeigt drei b ikol la te ra le Lei tb i indel , ein grof3es zentra l gelegenes und zwei kleine la te ra l gelegene Biindel. Die fJbersichts- au fnahme dieses A u t o r a d i o g r a m m s l~l~t fiber beiden Phloemte i len der Lei tbf indel Schw~Lrzungen der F i lmemuls ion erkennen. Diese Schw~rzun- gen sind fiber den Siebtei len des mi t t l e ren Lei tb i indels Ms K e t t e n lokaler schwarzer F lecken ausgebi ldet , die das X y l e m kreisbogenf6rmig umgeben.

A b b , 1 a - - c

K. Sehmitz: N~chweis tritiierter Subs~anzen in Siebr6hren 101

Abb. 2. Cucumis 8ativus. Autor~diogramm eines externen Leitbfindelphloems; fiber zwei Siebr6hren (SR) eine feine Schwgrzung der Filmemulsion; mikroskopische

Zwiseheneinstellung

AussehnittsvergrSgerungen des abaxialen Phloems zeigen die Abb. 1 b, e. I m eambiumnahen Teil des Metaphloems liegt eine Kette yon SiebrShren, die dutch die Sehatten der darfiberliegenden Filmsehws besonders deutlieh hervortreten. Ein Vergleieh der Abb. 1 b, e lggt erkennen, dag allein die SiebrShren radioaktive Substanzen enthalten. W~hrend das Autoradiogramm bei einigen SiebrShren eine relativ gleiehmggig intensive Sehw~rzung der Filmemulsion fiber den gesamten Quersehnittsflgehen zeigt, kSnnen tiber der mittleren Siebr6hrengruiope Sehw/trzungszentren untersehieden werden, die dem artifiziell ver~nderten plasmatisehen InhMt der Siebr6hren zuzuordnen sind (Abb. 1 b, Pl).

Die gleiehen Beobaehtungen konnten wit aueh bei Cucumis 8ativus maehen. Unter entspreehenden Versuehszeiten (30--60rain) waren radioaktiv markierte Transportsubstanzen allein in den Siebr6hren der internen und externen Phloeme der Blattstielbfindel naehzuweisen (ein Beispiel mit besonders feiner Filmsehw/~rzung in Abb. 2).

Abb. 1. a Cucurbita pepo. Quersehnitt eines Blattnervs; ~bersiehtsphoto emes aH-Autoradiogramms, b Aussehnigt aus dem abaxialen Siebteil des Hauptleit- bfindels; Gewebeschnittebene. SR Siebr6hre, P1 Plasma der SiebrShre, GZ Geleit-

zelle, X y Xylemelement. c t~ilmebene derselben Pr~par~tstelle

A b b . 3 A b b . 4 a u . b

K. Schmitz: Nachweis tritiierter Substanzen in SiebrShren 103

Nach chromatographiseher Trennung und Identifizierung konnten folgende 3H-markierte Substanzen auf der Transportstrecke (Blatt- nerven, Blattstiele und Internodien der SproBachse) nachgewiesen werden: Stachyose, Raffinose, Saccharose und Fructose; Asparagin- s~ure, Glutaminsi~ure und Alanin sowie Apfelsiiure und Zitronens~ure. Der gr6Bte Anteil der Radioaktivit~tt entfiel auf die Stachyose, ein geringerer Anteil auf Raffinose und Saecharose. Die Radioaktivitiit der iibrigen Fraktionen war gering, reichte aber dennoch zur Identifizierung aus. Neben den oben genannten Substanzen konnten weitere 3H-mar- kierte Substanzen getrennt, jedoch nicht einwandfrei identifiziert werden.

b) Liingsschnittpriiparate. Die Ergebnisse der autoradiographischen Analyse der Phloemquerschnitte lassen sieh auch an Li~ngsschnitten be- sti~tigen (Ubersichtsautoradiogramm eines Phloemliingsschnitts Abb. 3). Die Siebr6hren sind anniihernd parallel zur Liingsachse angeschnitten, so dal~ sie sich tiber mehrere Siebr6hrenglieder verfolgen lassen. Zwischen Xylem und Phloem liegt ein mehrschichtiges fascieul~res Cambium. Deutlich enthalten vorwiegend die SiebrShren des cambiumnahen Metaphloems ~H-markiertc Substanzen. Die Schw/irzungen der Film- emulsion, die einzelnen SiebrShrengliedern recht genau zuzuordnen sind, waren auch in anderen Radioautogrammen keineswegs so ausgebildet, dab sie als Schw~rzungsb~nder einheitlicher Intensit/it mit der gesamten Ls163 der SiebrShren kongruent gewesen ws In der Regel lieBen sich wie in Abb. 3 unregelm/~gige Sehw/~rzungszonen geringerer oder st/~rkerer Intensit/~t unterscheiden; dabei traten h/iufig die Siebplatten als besonders starke Strahlungsquellen in Erseheinung (vgl. Schmitz und Willenbrink, 1968, Abb. 2).

Die Abb. 4 und 5 a, b belegen die Kongruenz der Filmschw~rzungen mit den L/~ngsschnittfl/tehen von SiebrShren bei Cucurbita und Cucumis. Der plasmatisehe Inhalt der SiebrShren ist artifiziell ver/~ndert und 1/~Bt sieh nach der hier gew/~hlten Methodik (Gefrierfixierung, Gefrier- troeknung und Paraffinschnitteehnik) stets in Form feiner F/~den dar- stellen, die zu einem Strang verwoben die Siebr5hrenglieder der L/~nge nach durchziehen. An den Siebplatten 16sen sich die Str/tnge in einzelne F/~den auf, die die Siebporen durehziehen und nach der Passage der Siebplatte wieder in einem Strang zusammenlaufen. Die Schw/~rzungs- bgnder sind mit den SiebrShren weitgehend deckungsgleich (Abb. 4, 5), wenn auch die Verteilung der gadioaktivi t~t innerhalb der Siebr6hren

Abb. 3. Cucumis sativus. (Jbersichtsautoradiogramm eines radialen L~ngsschnitts durch das externe Phloem eines Leitbiindels der SproBachse. K Cambium,

Sp Siebplat, te

Abb. 4. Cucumis sativus. Tritiumautoradiogramm eines Siebr6hrenliingssehnitts. a Gewebeschnittebene; b Filmebene

8 P lan t a (Berl.), Bd. 91

A b b . 5 a u . b

K. Sehmitz: Naehweis tritiierter Substanzen in SiebrShren 105

stark variiert und an den Siebplatten oft abrupt abbrieht. In Abb. 5 b stellt man eine relativ seharfe Begrenzung der Schw~trzung auf der linken Seite lest, wahrend sie auf der reehten Seite ,verschwimmt" . Bei einer genauen Naehpriifung ergab sich ein Zusammenhang zwisehen Sehnitt- riehtung und ,,Fahnenbildung" der Sehwarzung. Die Fahnenbildung erfolgt stets in Sehnittriehtung. Es ist anzunehmen, dab beim Dutch- schneiden der SiebrShre eine rein meehanisehe Verlagerung radioaktiv markierter Substanzen erfolgen kann und so diese Unscharfe verursaeht. Bei einer vergleiehenden Betraehtung der Aufnahmen sollte die zwar minimale Streustrahlung und der m a n g e Grundsehleier dennoeh stets in Betraeht gezogen werden.

Bei der Bespreehung der Autoradiogramme yon SiebrShrenquer- sehnitten war darauf hingewiesen worden, dab sieh in einigen Fallen der plasmatisehe Inhal t der Siebr6hren als intensive Strahlungsquelle erwies. Ein Beispiel ffir diese interessante Aktivit~tsverteilung, die aueh an L/~ngssehnitten zu beobaehten war, zeigt Abb. 6a, b. I m Gewebesehnitt ist ein Siebr6hrenglied zu erkennen, das yon zwei Siebplatten begrenzt und relativ arm an plasmatisehem Inhal t ist. AuBer einem kleinen Plasmarest auf der oberen Siebplatte und dem ,,Sehlauehkopf" fiber der unteren Querwand erseheint das SiebrShrenglied optiseh leer. Ein Vergleieh der Abb. 6a, b maeht deutlieh, daft die kleinen Sehw/~rzungs- bereiehe den Plasmaresten an der oberen Siebplatte, im unteren Drittel des Siebelements und an der unteren Siebplatte zuzuordnen sind. Der radioaktiv markierte Inhal t einer zweiten, parallel verlaufenden Sieb- rShre (reehte Bildhs ist vermutlieh beim Ansehneiden verlagert worden und hat zu einer sehr ditfusen Sehw~rzung der Filmemulsion geffihrt.

Diskussion

Die hier mitgeteilten Befunde best~tigen erneut die l/~ngst erkannte Transportfunktion der SiebrShren und zeigen insbesondere, dab der Ferntransport der Assimilate nur in den Siebr6hren erfolgt. Die Gfiltig- keit dieser Aussage, die sehon dureh die Untersuehungen an phloem- steehenden Aphiden nahelag, ist jedoeh aufs engste mit einer kritischen Analyse der autoradiographisehen Methode verknfipft.

I m Gegensatz zur tIistoautoradiographie wasserunlSslicher Substan- zen bereitet der autoradiographisehe Naehweis markierter wasser- 15slieher Stoffe naeh wie vor erhebliche Sehwierigkeiten. Eine histologi- sehe oder eellul~re Lokalisierung markierter Assimilate auf autoradio-

Abb. 5. a Cucurbita pepo. Gewebeschnittebene eines 3H-Autoradiogramms; Sieb- rShrenglied mit Siebplatten (Sp) und strangf6rmigem plasmatisehem Inhalt (Pl).

b Filmebene mit intensiver Schw~rzung fiber der Siebr6hre

8*

Abb. 6 a u. b

K. Sehmitz: Naehweis tritiierter Substanzen in Siebr6hren 107

graphischem Wege ist n/imlieh nur d~nn sinnvoll, wenn die Pr~tparation des zu untersuehenden Gewebes so erfolgt, dab keine Sekund/~rverlage- rung der hydrophilen Assimilate erfolgen kann. Bisher sind zwar zahlreiehe technische Anleitungen zur sog. troekenen Autoradiographie publiziert worden, einer kritisehen Prfifung k5nnen jedoeh nur wenige standhalten.

Wir arbeiteten naeh einer von Branton und Jaeobson (1961/62) entwiekelten Methode, die eine Verlagerung markier ter wasserl6slieher Substanzen im Gewebe weitgehend aussehliegt und die Vorzfige besitzt, dag die Paraffinsehnitte unmittelbar auf die absolnt troekene Film- emulsion , ,montiert" werden, ein Absehwimmen der Sehnitte beim Entwieklungsprozeg dureh einen diinnen Celluloseaeeta~film verhindert wird, und ein Dauerkontakt zwisehen Sehnitt und Film aufreehterhalten bleibt.

Methodisehe Sehwierigkeiten ergaben sieh zuns aus einer nn- zureiehenden Paraffinierung der gefriergetroekneten Pflanzenproben (vgl. aueh Perkins, Nelson und Gotham, 1959; Gage und Aronoff, 1960). Eigene Versuehe, die Troeknung unter einem Gasstrom bestimmten Feuehtigkeitsgehaltes durehzuffihren, um eine bessere Paraffininfiltration des Gewebes zu erzielen, seheiterten zwar, doeh erreieht man dureh Infil tration des troekenen Pflanzenmaterials mit Xylol eine gnte Paraffineinbettung.

Eine gute AuflSsung der Strahlungsorte ist besonders in der Tritium- Autoradiographie yon einem engen Kon tak t zwisehen ParMfinsehnitt nnd Filmemulsion abh~ngig. Dieser Sehnit t-Film-Kontakt konnte dureh das Andrfieken der Paraffinsehnitte auf die befilmten 0bjekttr/~ger und die kurze Erw/~rmung der Pr/~parate erreieht werden. Einen noeh besseren Kontakt , verbnnden mit einer h6heren Aktivit/~tsausbeute, glaubt Neeraeher (1965) dureh Entparaffinierung vor der Exposition erreiehen zu k6nnen. Eine Entparaffinierung vor der Exposition fiihrt naeh unseren Erfahrungen jedoeh zu ,,unseharfen" Autoradiogrammen. Die hier dargestellte modifizierte Methode der ,,troekenen Autoradiographie" yon Branton und Jaeobson kann durehaus aueh bei Serienuntersuehun- gen noeh reeht 6konomiseh und erfolgverspreehend angewandt werden.

I m Laufe unserer autoradiographisehen Untersuehungen an Cucurbita und Cucumis lieB sieh immer wieder beobaehten, dab keineswegs alle SiebrShren eines Phloems radioaktiv markierte Substanzen enthielten; in der I~egel zeigte die Filmemulsion fiber den eambiumn/tehsten, also

Abb. 6. a Cucumis sativus. Ausschnitt aus dem externen Phloem eines Leitbiindels der SproBachse; Gewebeschnittebene eines Autoradiogramms. b Filmebene der- selben Pr~paratstelle mit lokalen Schws fiber den Plasmaresten (P1)

der Siebr6hre

108 K, Sehmitz:

ontogenetisch iiingsten MetaphloemsiebrShren die intensivste Sehw~r- zung. Dieser sowohl an Quer- wie an L~ngssehnitten gewonnene Befund deutet auf eine besondere Transportaktivit~t der ]ungen Metaphloem- siebrShren hin. Bei Transportuntersuehungen an mehrj~hrigen Zweigen yon Metasequoia (Kollmann, 1965; Willenbrink und Kollmann, 1966) war bereits eine/~hnliche Beobaehtung gemaeht worden.

Die Histoautoradiogramme des Phloems zeigen eine weitgehende Dek- kungsgleiehheit zwisehen Filmsehw/~rzung und SiebrShren, d.h. allein die SiebrShren enthalten 3H-markierte Substanzen, und diese werden vermutlich auch hier transportiert. Daher gilt es als sicher, dab die extrahierten und chromatographiseh getrennten tritiierten Substanzen aussehliel~lieh aus den SiebrShren stammen. Als t taupttransportform der Kohlenhydrate konnten im Gegensatz zu frfiheren Angaben (Sehmitz und Willenbrink, 1968) nieht vornehmlieh Saeeharose, sondern vor allem Stachyose, ferner Raffinose und sehliel~lieh aueh Saccharose naehgewiesen werden. Dieser Befund stimmt weitgehend mit anderen Untersuehungen an Cucurbitaceen fiberein (Pristupa, 1959; Webb und Gorham, 1964; Esehrich und Kating, 1964; Hendrix, 1968).

W~hrend einerseits vor allem die Reste des SiebrShrenplasmas als intensive Strahlungsquelle in Erseheinung traten, zeigte die Film- emulsion fiber der gesamten Sehnittfl~ehe anderer liehtoptiseh leer erseheinender SiebrShren eine Sehws gleiehfSrmiger Intensit/~t (vgl. auch Sehmitz und Willenbrink, 1968). Zur Erkl~rung dieser Unter- sehiede in der Aktivit/~tsverteilung sei daran erinnert, dal~ die Dureh- trennung der Leitgewebe und die Gefrierfixierung sieher einen so massiven Eingriff darstellen, dal~ das stark hydratisierte und unter hohem Irmendruek stehende Plasma der SiebrShren kollabiert und dabei radioaktiv markierte Molekfile mitreil~en kann. Darfiber hinaus konnte vielfaeh beobaehtet werden, dal~ das Plasma beim Durehtrennen des Pbloems zur Anschnittste]le bin verlagert wird. Dabei rei~t die plas- matisehe Verbindung, die normalerweise zwisehen den einzelnen Sieb- rShreng]iedern besteht, vie]faeh an den Siebplatten vS1]ig ab. So kommt es zu einem Aufstau des Plasmas an der folgenden Querwand, und eine besonders intensive Strahlung im Bereieh der Siebplatte ist die Folge. Vielleicht hat auch eine verst~rkte Kallosebildung zu einem Stau der markierten Assimilate geffihrt, wenn nieht sogar Kallose selbst radioaktiv markiert ist und a]s zus/~tzliehe Strahlungsquelle in Erseheinung tritt .

Lawton und Biddulph (1964) konnten Autoradiogramme yon Dioseorea-Siebplatten vorlegen, in denen das Sehw~rzungsmuster der Anordnung der Siebfelder entsprach. Sie diskutierten diesen Befund u.a. im Zusammenhang mit der Hypothese yon Thaine (1962), wonaeh der Transport an ,,transeellular strands" gebunden sein sol], die die Sieb- platten im Bereieh der Siebfelder passieren. Diese Hypothese ist nieht

Nachweis tritiierter Substanzen in Siebr6hren 109

unwidersproohen geblieben (Esau et al., 1963); auch die faserige S t ruk tur

des 8iebrShrenplasmas, wie sic hier dargestelR werden konnte , sell n icht yon vomhere in als , , transcellular s t rands" angesehen werden ; vermut l ich hande l t es sich u m eine artifizielle Vergnderung des Siebr6hrenplasmas duroh das Fixierungsverfahren.

Es wird angestrebt , die Teohnik der Autoradiographie dahingehend auszubauen, dal~ artifizielle Vergnderungen der zu un te r suchenden Gewebe vermieden werden u n d durch optimale Geometrieverhgltnisse (vor allem diinnere 8chni t te und dtinnere Fi lmemll ls ionen) eine Steige- rung des AuflSsungsvermSgens erreicht wird, so dal~ ein nooh genauerer oel]ulgrer oder intracellulgrer Nachweis markier ter hydrophiler Substan- zen m5glich wird.

L i t e r a t u r

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Dr. Klaus Schmitz Botanisches Institut 53 Bonn Meckenheimer Allee 170