descoloraÇÃo e detoxificaÇÃo do azo corante … · que compreendeu minha paixão pela...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DESCOLORAÇÃO E DETOXIFICAÇÃO DO AZO CORANTE ALARANJADO II POR Geobacillus
stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P.
fluorescens ISOLADOS E EM CULTURA MISTA
NORMA SUELY EVANGELISTA BARRETO
Recife
Maio, 2006
NORMA SUELY EVANGELISTA BARRETO
DESCOLORAÇÃO E DETOXIFICAÇÃO DO AZO CORANTE ALARANJADO II POR Geobacillus stearothermophilus,
Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens ISOLADOS E EM CULTURA MISTA
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pernambuco, como
parte dos requisitos, para obtenção do título
de Doutor em Ciências Biológicas, na área de
Microbiologia.
Orientadores: Profa. Dra. GALBA MARIA DE CAMPOS-TAKAKI Profa. Dra. REGINE HELENA S. DOS FERNANDES VIEIRA
Recife
Maio/2006
“A sabedoria é a meta da alma humana;
Mas a pessoa, à medida que em seus conhecimentos avança,
Vê o horizonte do desconhecido cada vez mais longe”.
(Heráclito)
"Isto foi para mim,
entre todas as maravilhas
que descobri na natureza,
a mais maravilhosa de todas;
Preciso dizer que,
para mim, visão mais agradável
jamais veio ante meus olhos
que aquelas milhares
de criaturas viventes,
vistas numa gotinha de água..."
Anton van Leeuwenhoek
Agradeço e dedico este trabalho
Ao meu amado Leo,
que compreendeu minha paixão pela Microbiologia,
e me incentivou a ir mais além,
suportando bravamente a saudade e a distância,
Aos meus pais e irmãos,
(Marcos e Neusa, Marcos Aurélio, João Paulo e Evandro)
que mesmo tão distantes e as vezes sem entenderem o que faço,
sempre torcem por mim.
Agradecimentos
- A Deus, luz que me conduz incessantemente nesta estrada e me ampara nos
momentos de fraqueza;
- A toda minha família, compreensivos com a minha ausência constante e em
particular a minha tia Mariana, pelo apoio e carinho em todos os momentos. Aos
meus sogros, amigos queridos e incentivadores. Aos pequenos Marcos Vinicius e
Gabriel, sobrinhos amados;
- Ao Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Prof. Dr. Pe Rubens
Ferreira Oliveira, S.J. pelo acesso e utilização das instalações no Núcleo de
Pesquisa em Ciências Ambientais (NPCIAMB);
- Á Profa. Regine Vieira, pela amizade e por ter sido a responsável de despertar
em mim o amor pela microbiologia e a pesquisa;
- Ao Prof. Dr. Nelson Duran e Livia Cordi (UNICAMP), pelas análises de
toxicidade;
- À Profa. Clarissa Albuquerque (UNICAP), pelas análises estatísticas e
sugestões na elaboração dos planejamentos;
- A Profa. Dra. Aline do Nascimento (UNICAP) e ao colega Marcos Lima pelo
auxílio com as fotomicrografias;
- Ao Prof. Sergio C. Paiva (UNICAP), pelo apoio e auxílio nas análises de DQO;
- Aos professores do Doutorado em Ciências Biológicas pela amizade e
conhecimentos transmitidos durante o curso contribuindo na minha formação, em
especial à Coordenadora do curso Profa. Dra. Suely Lins Galdino pela atenção e
excelente trabalho desenvolvido;
- A grande amiga Mabel Calina, sempre tão prestativa nos momentos de
“socorro”, me compreendendo e confortando nos momentos de intensa saudade
de casa;
- As minhas amigas do LABOMAR-UFC-CE, amigas de todas as horas e sempre
na torcida (Gleire, Cris, Osca, Bel, Anahy, Janisi, Claudia, Edirsana, Carol e
Rosa);
- Aos meus amigos do CCB, pelo companheirismo em sala de aula e aos amigos
do NPCIAMB - Luciana Franco e Thayza Stamford (amigas queridas), Marcos
Morais, Daniela, Marta, Raquel e Carol (que com paciência me ajudaram na
confecção de alguns gráficos), Petrusk, Luiza, Patrícia, Adriana, Fabíola, Thayze,
Juliana, Charles e Aline pela oportunidade de convivência e a amizade;
- A Sônia Maria de Souza, secretária do núcleo e os técnicos do NPCIAMB
Severino Humberto e Salatiel Joaquim, por tornarem o ambiente do laboratório
mais acolhedor;
- A Secretária do CCB, Adenilda Eugenia sempre tão prestativa e eficiente, além
da amizade e;
- Aos professores do NCIAMB, Dra. Leonie Sarubbo, Dra. Alexandra Salgueiro,
Dr. Carlos Alberto, Dra. Kaoru Okada, Dr. Ricardo Kenji e Dra. Arminda Saconi,
pelo convívio diário;
- Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), pela concessão
da bolsa, CNPq/CTPETRO/PRONEX, pelo financiamento dos experimentos
realizados;
- À banca examinadora pelas valiosas sugestões;
- A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho; que um dia foi um sonho.
Agradecimento Especial
À minha orientadora e segunda mãe científica Profa. Dra. Galba Maria de
Campos Takaki a quem admiro muito. Agradeço pela confiança e por ter me
aceito em seu grupo de pesquisa. Que apesar de seu jeito rígido, procura nos
direcionar no desenvolvimento da tese, na profissão e acima de tudo para a vida.
Âncora do NPCIAMB, eu serei eternamente grata por sua paciência,
ensinamentos e por um dia ter sido uma “galbete”.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS i
LISTA DE TABELAS iii
LISTA DE ABREVIATURAS v
RESUMO vi
ABSTRACT vii
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5
2.1. Corantes 5
2.1.1. Considerações Gerais 5
2.1.2. Estrutura e Classificação 8
2.2. Indústria Têxtil 13
2.2.1. Beneficiamento Têxtil 13
2.2.2. Perfil Ambiental 16
2.2.3. Problemas Toxicológicos Associados aos Corantes 20
2.3. Tratamento dos Efluentes 22
2.3.1. Métodos Químicos 24
2.3.2. Métodos Físicos 26
2.3.3. Métodos Biológicos 27
2.3.3.1. Biodegradação dos Corantes por Bactérias 29
2.3.3.2. Biosorção pela Biomassa Microbiana 36
2.4. Geobacillus stearothermophilus 39
2.5. Pseudomonas aeruginosa 41
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44
PRIMEIRO ARTIGO
Descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus
stearothermophilus (UCP 986) sob condições de co-metabolismo 62
Resumo 63
Introdução 64
Material e Métodos 66
Resultados e Discussão 69
Conclusões 76
Agradecimentos 76
Referências 76
Tabelas 81
Figuras 82
SEGUNDO ARTIGO
Biorremediação do azo corante têxtil Alaranjado II por Pseudomonas
aeruginosa UCP 992 sob condições aeróbicas 86
Resumo 87
Introdução 88
Material e Métodos 90
Resultados e Discussão 94
Conclusões 101
Agradecimentos 102
Referências 102
Tabelas 107
Figuras 108
TERCEIRO ARTIGO
Potencial aplicação do consórcio de Geobacillus stearothermophilus UCP 986 e Pseudomonas aeruginosa UCP 992 no processo de
113
descoloração do Alaranjado II Resumo 114
Introdução 115
Material e Métodos 116
Resultados e Discussão 120
Agradecimentos 126
Referências 126
Tabelas 131
Figuras 133
QUARTO ARTIGO
Processo de descoloração e detoxificação de um efluente têxtil por Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P.
fluorescens, isolados e em cultura mista
135
Resumo 136
Introdução 137
Material e Métodos 139
Resultados e discussão 143
Conclusões 149
Agradecimentos 150
Referências 150
Tabelas 155
Figuras 160
CONCLUSÕES GERAIS 161
ANEXOS 163
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Figura 1. Produção de corantes no Brasil (Abiquim, 2005a). 7
Figura 2. Estrutura molecular característica de um corante têxtil (A) onde
o grupo cromóforo é da família azo (B). 9
Figura 3. Modelo de interação dos corantes reativos com a fibra têxtil (Hao
et al., 2000). 15
Figura 4. Mecanismo proposto para a redução dos azo corantes pelas
células bacterianas (Pearce et al., 2003). 33
PRIMEIRO ARTIGO
Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II. 82
Figura 2. Efeitos padronizados com diferentes fatores testados no
experimento de descoloração do azo corante Alaranjado II por
Geobacillus stearothermophilus UCP 986, após 24 h de cultivo A 50ºC. (1)
Tamanho do inóculo, (2) meios de cultura, (3) concentração do corante e
(4) tipo de agitação.
82
Figura 3. Percentual de descoloração, crescimento celular, consumo de
glicose e pH durante o processo de remoção do azo corante Alaranjado II
usando Geobacillus stearothermophilus, por 48 h a 50ºC. (A) Ensaio 9, (B)
Ensaio 10, (C) Ensaio 13 e (D) Ensaio 14.
83
Figura 4. Avaliação da toxicidade dos metabólitos formados durante o
processo de descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus
stearothermophilus, após 48 h de cultivo a 50ºC, usando Artemia salina.
84
SEGUNDO ARTIGO
Figura 1. Diagrama de Pareto mostrando os efeitos principais e
interações das variáveis independentes no processo de descoloração do
Alaranjado II por Pseudomonas aeruginosa UCP 992, após 24 h de cultivo
a 40ºC. (1) Tamanho do inóculo, (2) Concentração do corante, (3) Faixa
de agitação.
108
Figura 2. Percentual de descoloração, crescimento celular, consumo de
glicose e pH durante o processo de remoção do azo corante Alaranjado II
por Pseudomonas aeruginosa.
109
Figura 3. Eletromicrografia de Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) após
o processo de descoloração do azo corante Alaranjado II, por microscopia
eletrônica de varredura.
110
Figura 4. Avaliação da toxicidade dos metabólitos formados durante o
processo de descoloração do Alaranjado II, por Pseudomonas aeruginosa
(UCP 992), após 48 h de cultivo a 40ºC, usando Artemia salina.
111
TERCEIRO ARTIGO
Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II. 133
Figura 2. Biomassa, pH, consumo de glicose e descoloração do azo
corante Alaranjado II usando um consórcio bacteriano, por 48 h a 40ºC. 133
QUARTO ARTIGO
Figura 1. Descoloração do efluente têxtil por Geobacillus
stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens,
durante 72 h de cultivo. a = efluente com nutrientes, b= efluente sem nutrientes. BI = Geobacillus stearothermophilus, BII = Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII = consórcio com os três microrganismos.
160
LISTA DE TABELAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Tabela 1. Classificação dos corantes e pigmentos segundo a utilização do
substrato
10
Tabela 2. Estimativa do grau de fixação de diferentes corantes nas fibras
e as perdas para o efluente, permitidos pela Sociedade de Corantes e
Colorações
14
PRIMEIRO ARTIGO
Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 24 em relação à
resposta de descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus
stearothermophilus UCP 986, após 24 h de cultivo a 50ºC
81
SEGUNDO ARTIGO Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 23 em relação à
resposta de descoloração do Alaranjado II e pH por Pseudomonas
aeruginosa UCP 992, após 24 h de cultivo a 40ºC
107
TERCEIRO ARTIGO
Tabela 1. Concentração de proteína total e atividade enzimática, do
líquido metabólico livre de células no cultivo de Geobacillus
stearothermophilus e Pseudomonas aeruginosa, durante o processo de
descoloração do Alaranjado II, por 48 h a 40ºC
131
Tabela 2. Inibição no crescimento da alga Selenastrum capricornutum
pelo líquido metabólico provenientes do processo de descoloração do azo
corante Alaranjado II usando um consórcio microbiano, por 48 h a 40ºC
132
QUARTO ARTIGO
Tabela 1. Características físico-químicas do efluente têxtil proveniente de
uma indústria de tingimento de poliéster 155
Tabela 2. Remoção do carbono orgânico total (COT), demanda química
de oxigênio (DQO) e pH durante a descoloração do efluente têxtil 156
Tabela 3. Análise de variância da descoloração do efluente têxtil sob as
condições: tipo de bioensaio (sem consórcio, consórcio 1 e consórcio 2) e
tipo de efluente (com e sem nutrientes)
157
Tabela 4. Inibição e CL50 no crescimento da alga Selenastrum
capricornutum em contato com as amostras provenientes do processo de
descoloração do efluente têxtil, usando diferentes tratamentos
158
Tabela 5. Avaliação da toxicidade por Artemia salina em contato com as
amostras provenientes do processo de descoloração do efluente têxtil 159
LISTA DE ABREVIATURAS
mg dm3 - Miligrama por Decímetro Cúbico
ETAD - Ecological and Toxicological Association of the Dyestuff
Manufacturing Industry
EEA - European Environmental Agency
UNEP - United Nations Environment Programme
DL50 - Dose Letal para 50% dos Hospedeiros
CL50 - Concentração Letal para 50% dos Hospedeiros
POAs - Processos Oxidativos Avançados
ATP - Trifosfato Adenosina
LB - Luria Bertani
YP - Levedura-Peptona
DQO - Demanda Química de Oxigênio
APHA - American Public Health Association
UFC - Unidade Formadora de Colônia
NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzido
TCA - Ciclo do Ácido Tricarboxílico
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
USBR - Reator Anaeróbico de Manta de Lodo
SBR - Reator de Fluxo Contínuo
RESUMO
As indústrias têxteis são responsáveis pelo descarte inadequado de diversos
corantes nos efluentes industriais, causando sérios danos ao ambiente. A
aplicação de tratamentos biológicos tem demonstrado que as bactérias são
consideradas como microrganismos capazes de descolorir efluentes altamente
coloridos. Neste sentido, estudos foram realizados para a remoção do azo corante
Alaranjado II usando Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e
P. fluorescens, isolados e em cultura mista, crescidos em diferentes substratos
(meios de cultura e efluente têxtil). A adição de glicose como co-substrato, sob
agitação contínua, promoveu de forma eficiente a descoloração do Alaranjado II,
usando G. stearothermophilus, enquanto P. aeruginosa foi fortemente inibida pela
agitação elevada. A presença de ácido sulfanílico, um metabólito formado durante
o processo de biodegradação do Alaranjado II não foi encontrado no cultivo
contendo G. stearothermophilus, ao contrário do cultivo contendo P. aeruginosa.
O consórcio usando G. stearothermophilus e P. aeruginosa numa seqüência
agitação-repouso-agitação, removeu totalmente o azo corante, não apresentando
metabólitos mais tóxicos. A descoloração de um efluente têxtil contendo o
Alaranjado II e usando os três microrganismos, isolados e em associação,
demonstrou que a descoloração do efluente está relacionada à adição de
nutrientes no cultivo, sugerindo que a ausência de nutrientes como fonte de
energia inicial, afeta o processo de descoloração. Ainda nestas condições, se
observou que a utilização de consórcios promove total remoção da cor do
corante, além da redução total ou parcial na toxicidade dos metabólitos formados.
Baseado nisso, os microrganismos G. stearothermophilus, P. aeruginosa e P.
fluorescens são capazes de descolorir efetivamente o azo corante Alaranjado II,
não formando compostos mais tóxicos, apresentando dessa maneira, grande
potencial na descoloração de corantes têxteis.
Palavras chave: Biodegradação; Descoloração; Alaranjado II; Efluente têxtil.
ABSTRACT
The textile industries are responsible for the inadequate discarding of diverse dyes
in the industrials effluents, causing serious damages to the environment. The
application of biological treatments has been demonstrated that the bacteria are
considered as microorganisms capable to discolor effluents highly colorful. In this
direction, studies had been carried out with removal of azo dye Orange II using
Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa and P. fluorescens,
isolated and in mixed culture, grown in different substrates (culture medium and
textile effluent). The addition of the glucose as co-substratum, under continuous
agitation, promoted in an efficient way the discoloration of the Orange II, using G.
stearothermophilus, while P. aeruginosa was inhibited strongly by the high
agitation. The presence of sulphanilic acid, a metabolite formed during the process
of biodegradação of the Orange II was not found in the cultivation containing G.
stearothermophilus, unlike the cultivation containing P. aeruginosa. The
consortium using G. stearothermophilus and P. aeruginosa in a sequence
agitation-repose-agitation, it totally removed the coloring occasion, not presenting
more poisonous metabolites. The discoloration of a textile effluent containing the
Orange II and using the three microorganisms, isolated and in association, it
demonstrated that the discoloration of the effluent is related to the addition of
nutrients in the cultivation, suggesting that the absence of nutrients as initial
source of energy, affects the discoloration process. Still in these conditions, it was
observed that use of consortia promotes total removal of the color, besides the
reduction total or partial in the toxicity of the formed metabolites. Based on that,
the microorganisms G. stearothermophilus, P. aeruginosa and P. fluorescens are
capable to discolor the Orange coloring occasion indeed II, not forming more
toxics compounds, presenting than great potential in the discoloration of dyes
textile.
Key words: Biodegradation; Discoloration; Orange II; Effluent textile.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
1
1. INTRODUÇÃO
Com o aumento da população urbana nas últimas décadas e o amplo
desenvolvimento do setor industrial, novos compostos foram sintetizados e
continuamente lançados no meio ambiente, contribuindo, dessa maneira, para o
aumento da poluição ambiental. Os resíduos poluentes descartados pelas
indústrias podem permanecer no meio ambiente por grandes períodos, sendo a
água e o solo, um dos recursos mais afetados na natureza (GOMES et al., 1998).
Dentre os vários setores industriais responsáveis pela poluição, o setor de
acabamento têxtil merece destaque, devido ao grande consumo de água e
produtos químicos usados durante o processo de tingimento de seus tecidos,
produzindo desta maneira, efluentes altamente coloridos. Por outro lado, os
compostos formados a partir desses processos apresentam elevada carga
orgânica, aliada ao elevado teor de sais inorgânicos (DUENSER, 1992; BANAT et
al., 1996).
No Brasil, devido as características climáticas, o setor têxtil baseia-se
predominantemente no algodão, com cerca de 75% de suas indústrias,
localizadas na região sul (Santa Catarina), sudeste (São Paulo e Minas Gerais) e
nordeste (Bahia, Pernambuco e Ceará) (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Os corantes e pigmentos são compostos extensamente usados nas
indústrias têxteis, de alimento, papel, farmacêutica e de cosméticos, dentre outras
(McMULLAN et al., 2001; DONMEZ, 2002; BEYDILLI & PAVLOSTATHIS, 2005).
Com isso, a remoção desses poluentes nos efluentes têxteis tem recebido
considerável atenção nas pesquisas do meio ambiente. Durante a síntese e uso
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
2
dos azo corantes, acredita-se que pelo menos 4% da sua produção seja perdida
para o meio ambiente a cada ano; enquanto outros pesquisadores calculam
perdas tão altas quanto 10 a 15% (COUGHLIN et al., 2003; FORGACS et al.,
2004).
Segundo Robinson et al. (2002) a liberação dos corantes no ambiente é tida
como poluição da água, uma vez que, os corantes são visíveis em quantidades
mínimas, devido ao seu alto brilho. Recentemente, as indústrias têxteis da União
Européia foram pressionadas a reduzir o teor químico de seus efluentes em
atendimento a legislação vigente (AZMI et al., 1998; O'NEILL et al., 1999). Nos
Estados Unidos, as agências estaduais e federais têm requisitado baixos índices
colorimétricos (< 200 unidades) em seus efluentes industriais (McCURDY et al.,
1992).
Os corantes são difíceis de serem tratados por causa de sua origem sintética
e, principalmente, devido suas estruturas moleculares aromáticas complexas,
visto que tais estruturas são constituídas para resistir à exposição ao sabão,
água, luz, agentes oxidantes e suor, sendo por isso mais estáveis e menos
biodegradáveis (BANAT et al., 1996; AKSU & DONMEZ, 2003; SENAN et al.,
2003; ADEDAYO et al. 2004). Por outro lado, a presença de rejeitos coloridos
contribui na menor penetração da luz solar, afetando a atividade fotossintética;
bem como alterando a solubilidade dos gases, causando danos às guelras e
brânquias dos organismos aquáticos. Segundo Zanoni & Carneiro (2001) acredita-
se que esses compostos podem permanecer por cerca de 50 anos nos ambientes
aquáticos, pondo em risco a estabilidade dos ecossistemas e a vida ao seu redor.
A liberação destes poluentes, normalmente tóxicos, representa um dos
maiores problemas ambientais, uma vez que estas substâncias apresentam alta
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
3
recalcitrância (WANG & YU, 1998), além de uma cinética de degradação muito
lenta para os processos biológicos convencionais (BROMBERG & DURAN, 2000).
Assim, diferentes tratamentos físico-químicos têm sido aplicados no tratamento
dos efluentes, como por exemplo, adsorção com carvão ativado, ultrafiltração,
osmose reversa, coagulação-floculação, troca iônica, etc. (GALINDO et al., 2001;
KONSTANTINOU & ALBANIS, 2004) e embora, muitos deles apresentem
eficiente remoção, principalmente com relação aos corantes reativos, o alto custo
inicial e operacional constitui a principal desvantagem para as indústrias de
tingimento e acabamento (AKSU & DONMEZ, 2003, VERMA & MADAMWAR,
2005). Desta maneira, a descoloração de corantes sintéticos usando diferentes
microrganismos tem sido vista como uma tecnologia bastante promissora,
podendo representar um tratamento relativamente barato na remoção destes
poluentes (MOREIRA et al., 2000; VAN DER ZEE & VILAVERDE, 2005).
Os microrganismos são particularmente úteis na degradação dos corantes,
porque apresentam elevada capacidade de clivagem redutiva nas ligações azo,
fato este, geralmente associado às enzimas azoredutases (KUNZ et al., 2002). No
ambiente, a molécula do azo corante pode ser transformada ou degradada por
diversos microrganismos, incluindo as bactérias, fungos, leveduras, actinomicetos
e algas (CHEN et al., 2003; VERMA & MADAMWAR, 2005). Com exceção dos
actinomicetos, o isolamento de bactérias capazes de descoloração aeróbica,
especialmente dos azo corantes sulfurados, tem sido difícil (McMULLAN et al.,
2001).
Considerando que uma das rotas a ser explorada é o uso de microrganismos
termotolerantes e termofílicos em sistemas de descoloração, uma vez que o
processo de tingimento ocorre em elevadas temperaturas (50o - 60oC); bem como
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
4
a utilização de consórcios microbianos, este trabalho foi realizado utilizando um
isolado selvagem de Geobacillus stearothermophilus (UCP 986), Pseudomonas
aeruginosa (UCP 992) e P. fluorescens (CCT 4056) visando atender às seguintes
etapas:
1. Avaliar o potencial de descoloração do azo corante reativo Alaranjado II,
utilizando Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) sob condições de co-
metabolismo;
2. Avaliar o potencial de crescimento e biodegradação de Pseudomonas
aeruginosa, em meio contendo o azo corante reativo Alaranjado II;
3. Investigar a biodegradação do azo corante reativo Alaranjado II, utilizando
um consórcio microbiano;
4. Investigar a toxicidade dos produtos intermediários formados durante o
processo de biodegradação do azo corante reativo Alaranjado II;
5. Avaliar o potencial biotecnológico dos microrganismos na descoloração de
um efluente têxtil.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
5
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Corantes
2.1.1. Considerações Gerais
O homem utiliza as cores há mais de 20 mil anos, sendo o Negro-de-Fumo
(Carbon Black) o primeiro corante a ser conhecido pela humanidade. Por volta de
3.000 a.C., foram produzidos alguns corantes inorgânicos sintéticos, como por
exemplo, o Azul Egípcio (ABIQUIM, 2005).
Durante séculos, e até a metade do século 19, só existiam pigmentos
naturais, provenientes de vegetais, insetos, moluscos e minerais. Entretanto,
muitos corantes naturais utilizados na Antigüidade ainda são empregados em
larga escala, como é o caso do índigo, um pigmento azul, extraído da Indigofera
tinctoria L.; alizarina, extraído da raiz de Rubia tinctorium L. e henna, extraído de
Lawsonia inermis, utilizada na indústria de cosméticos (ZANONI & CARNEIRO,
2001; QMCWEB, 2004).
O primeiro corante sintético foi descoberto na Inglaterra, em 1856, pelo
químico Willian H. Perkin (1838-1929), que o obteve como produto da oxidação
da anilina (C6 H7N) com o dicromato de potássio (K2Cr2O7), como um precipitado
de coloração avermelhada, denominado de Malva. No fim do século 19, os
fabricantes dos corantes sintéticos, estabeleceram-se na Alemanha, Inglaterra,
França e Suíça, suprindo as necessidades das indústrias que, na época,
fabricavam tecidos, couro e papel (ZANONI & CARNEIRO, 2001; ABIQUIM,
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
6
2005). Até a Segunda Guerra Mundial, a Alemanha manteve o monopólio sobre a
produção de corantes sintéticos, sendo hoje a indústria dos Estados Unidos, a
maior fonte exportadora destes produtos, colocando no mercado
aproximadamente dois mil diferentes tipos de corantes sintéticos (GUARATINI &
ZANONI, 2000).
Com o fim da Segunda Guerra Mundial a manufatura e comercialização dos
corantes se tornou intensa e, atualmente o Colour Index, um catálogo usado para
classificação internacional dos corantes, criado pela Sociedade de Corantes e
Colorações, fundada em 1924, registra mais de oito mil corantes orgânicos
sintéticos associados à indústria têxtil (O’NEILL et al., 1999; ZANONI &
CARNEIRO, 2001). Por causa do seu baixo custo de síntese, estabilidade e
variedade de cores quando comparado aos corantes naturais, os corantes
sintéticos têm sido extensamente usados na indústria têxtil, de papel, borracha,
plásticos, cosméticos, farmacêutica e de alimentos (CHAGAS & DURRANT, 2001;
GONG et al., 2005).
Visando atender à grande demanda comercial, o setor industrial tem
investido no desenvolvimento de corantes econômicos, com propriedades
específicas, a fim de obter boa fixação da coloração nos tecidos e elevada
resistência aos agentes de desbotamento (CORREIA et al., 1994). Dessa
maneira, nos últimos 100 anos, mais de 100 mil corantes comerciais têm sido
sintetizados, com uma produção anual em torno de um milhão de toneladas
(SELVAM et al., 2003; ADEDAYO et al., 2004), sendo 54.000 toneladas somente
no Brasil (ABIQUIM, 2005a) (Figura 1).
No Brasil, até 1985 o algodão e as fibras naturais detinham 70% do
consumo interno. Atualmente, as fibras químicas avançam com rapidez,
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
7
representando um percentual de 40% do consumo (TEIXEIRA, 2003). De acordo
com a Associação Brasileira de Produtores de Fibras Artificiais e Sintéticas
(Abrafas), a fabricação nacional de fibras químicas em 2002 era de 366 mil
toneladas, versus um consumo no mesmo período de 464 mil toneladas, números
não muito diferentes dos estimados para 2003 (SANT’ANNA, 2004).
Figura 1. Produção de corantes no Brasil (Abiquim, 2005a).
A utilização de corantes têxteis no país se concentra, principalmente, nos
corantes reativos para fibras celulósicas, que hoje respondem por 57% do
mercado, seguido pelos corantes dispersos, com 35%; poliamida, com 3% e
acrílico, com 2% (ABIQUIM, 2005).
O consumo de fibra têxtil per capita no Brasil até 1990 era estimado em 7,7
kg/habitante, passando para 11,2 kg em 2000. Hoje, o consumo mundial oscila
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
8
entre 14 Kg/habitante/ano, um índice que quase chega a 8,5 kg/habitante/ano no
Brasil (TEIXEIRA, 2003).
Atualmente, o setor têxtil/confeccionista brasileiro é importante no mercado
global, porque movimenta cerca de US$ 22 bilhões ao ano, produzindo 7,2
bilhões de peças anualmente em mais de 30 mil empresas, além de empregar 1,4
milhões de trabalhadores (INFORMATIVO ABIT, 2005). Dessa maneira, o Brasil é
o terceiro produtor mundial de tecidos de malha, o quinto em peças
confeccionadas e o sétimo em fios e filamentos, ou seja, encontra-se em sétimo
lugar na produção têxtil mundial (COSTA, 2005).
Devido a uma tendência mundial, a indústria de corantes no Brasil, tem se
esforçado para atender às regras de proteção ambiental, embora a aplicação
destes corantes no processo de tinturaria constitua efetivamente um sério
problema, uma vez que um grande número destas indústrias é de pequenas
empresas, tornando difícil a atividade de fiscalização (GUARATINI & ZANONI,
2000).
1.1.2. Estrutura e Classificação
Estruturalmente, a molécula do corante utilizada para o tingimento da fibra
têxtil se divide em duas partes distintas, um grupo cromóforo, também conhecido
como azo, antraquinona, nitro, etc., que é responsável pela cor, e grupos
auxiliares, ou seja, grupos aromáticos que propiciam sua afinidade pela fibra têxtil
natural ou sintética (CORREIA et al., 1994; KUNZ et al., 2002; ZANONI &
CARNEIRO, 2003), além da propriedade de absorver luz na região visível
(BANAT et al., 1996) (Figura 2).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
9
Diversos corantes são de difícil descoloração devido à sua estrutura
complexa e origem sintética (SESHADRI et al., 1994; ROBINSON et al., 2001).
Segundo Nigam et al. (1996) compostos azo com um grupo hidroxila ou um grupo
amina são mais fáceis de serem degradados do que compostos com grupos metil,
sulfo ou nitro.
Figura 2. Estrutura molecular característica de um corante têxtil (A) onde o
grupo cromóforo é da família azo (B).
De acordo com o Colour Index (CI) os corantes e pigmentos podem ser
classificados em 26 tipos, segundo os critérios da classe química e em 20 tipos,
além de algumas subdivisões, do ponto de vista de aplicações (Tabela 1)
(ABIQUIM, 2005). Essa diversidade ocorre principalmente porque cada tipo de
fibra a ser colorida requer corantes com características próprias e bem definidas
(GUARATINI & ZANONI, 2000).
A B
Ácido Alaranjado 7
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
10
Com relação à estrutura química, o corante é conhecido através de um
número CI que lhe é atribuído; onde a primeira palavra corresponde à
classificação do corante e a segunda palavra, corresponde à sua coloração ou
tonalidade, como por exemplo, o corante ácido Amarelo 36 (CI 13065) (HAO et
al., 2000).
Tabela 1. Classificação dos corantes e pigmentos segundo a utilização por
substrato
Classe Principais campos de aplicação
Branqueadores
ópticos
Detergentes, fibras naturais, fibras artificiais, fibras
sintéticas, óleos, plásticos, sabões, tintas e papel
Corantes
À Cuba Sulfurados Fibras naturais e fibras artificiais
À Tina Fibras naturais
Ácidos Alimentos, couro, fibras naturais, fibras sintéticas, lã e
papel
Ao Enxofre Fibras naturais
Azóicos Fibras naturais e fibras sintéticas
Básicos Couro, fibras sintéticas, lã, madeira e papel
Diretos Couro, fibras naturais, fibras artificiais e papel
Dispersos Fibras artificiais e fibras sintéticas
Mordentes Alumínio, lã, fibras naturais e fibras sintéticas
Reativos Couro, fibras naturais, fibras artificiais e papel
Solventes Ceras, cosméticos, gasolina, madeira, plásticos, solventes
orgânicos, tintas de escrever e vernizes
Pigmentos Orgânicos Tintas gráficas, tintas e vernizes, estamparia têxtil e
plásticos
Pigmentos
Inorgânicos
Tintas gráficas, tintas e vernizes, estamparia têxtil e
plásticos Fonte: ABIQUIM (2005)
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
11
Os corantes ácidos são corantes aniônicos solúveis em água com diferentes
grupos cromóforos e grupos funcionais como nitro-, carboxil- e ácido sulfanílico;
quando adicionado um grupo sulfanílico, a molécula insolúvel em água se torna
solúvel. Os corantes básicos são do tipo catiônico com o grupo cromóforo
tipicamente apresentando grupos aminas. Os corantes diretos são sais altamente
solúveis em água, enquanto os corantes de dispersão são moléculas não-
aniônicas, altamente insolúveis em água quando aplicadas às fibras hidrofóbicas
(HAO et al., 2000).
Com relação à fixação dos corantes, o grupo mais representativo e
amplamente empregado pertence à família azo, que representa cerca de 60-80%
(TUNUSSI & SOBRINHO, 2002; RISMAYANI et al., 2004; SILVA et al., 2004) dos
mais de dez mil corantes aplicados nas indústrias de processamento têxtil
(SPONZA e ISIK, 2004), seguido pelo grupo antraquinona (KONSTANTINOU &
ALBANIS, 2004). Por outro lado, o grupo azo pode ser dividido em monoazo,
diazo e triazo, de acordo com a presença de uma ou mais ligações nitrogênio-
nitrogênio (–N=N–) ligados a sistemas aromáticos (MANU & CHAUDHARI, 2003),
podendo também apresentar grupos do ácido sulfanílico (CHAGAS & DURRANT,
2001).
Os corantes reativos diferem de todas as outras classes de corantes porque
se ligam às fibras têxteis, como o algodão, por ligações covalentes (AKSU &
DONMEZ, 2003; BEYDILLI & PAVLOSTATHIS, 2005). Eles também formam
ligações com grupos amino, hidróxila e tióis nas fibras protéicas e também com
grupos amino dos poliamidas. Nos diferentes corantes reativos existentes, os
principais contêm a função azo e antraquinona como grupos cromóforos e os
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
12
grupos clorotriazinila e sulfatoctilsulfonila como grupos reativos (GUARATINI &
ZANONI, 2000).
Semelhantes aos corantes diretos, estes corantes também são corantes
aniônicos altamente solúveis em água (HAO et al., 2000), no entanto, apresentam
características favoráveis como cor luminosa, fácil aplicação, com baixo custo e
consumo de energia (KUNZ, et al., 2002; AKSU & DONMEZ, 2003) e alta
estabilidade quando molhados (PEARCE et al., 2003; BEYDILLI &
PAVLOSTATHIS, 2005).
Os corantes básicos apresentam alto brilho e intensidade de cor, tornando-
os mais difíceis de descolorir. Os corantes complexados com base em metal e
cromo são compostos carcinogênicos, enquanto os demais corantes dispersivos
demonstram tendência de bioacumulação. Íons de metais pesados presentes nos
efluentes têxteis, têm sido reportados em altas concentrações na água e plantas
(BANAT et al., 1996).
Dessa maneira, a recalcitrância dos azo corantes foi atribuída à presença de
grupos sulfurados e ligações azo, duas características consideradas geralmente
xenobióticas. A ligação azo na molécula do corante, entretanto, é vulnerável a
clivagem redutiva (KUDLICH et al., 1996; PINHEIRO et al., 2004). Por outro lado,
os corantes baseados em antraquinonas são altamente resistentes à degradação,
devido suas estruturas aromáticas fundidas (DONG et al., 2003).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
13
2.2. Indústria Têxtil
2.2.1. Beneficiamento Têxtil
Os corantes apresentam estruturas moleculares complexas que podem
envolver, durante seu processo de síntese, até 500 reações intermediárias
(ZANONI & CARNEIRO, 2001). A forma de fixação da molécula do corante nas
fibras têxteis geralmente ocorre em solução aquosa, podendo envolver
basicamente quatro tipos de interações: ligações iônicas, ligações de hidrogênio,
ligações de Van der Waals e ligações covalentes (GUARATINI & ZANONI, 2000).
O volume de água usado durante o processamento é muito grande, variando
de 120 a 380 litros por metro de tecido processado (BALAN, 2005). Durante o
banho de tingimento, os corantes são hidrolisados, geralmente em altas
temperaturas (50 a 135oC), com concentrações que variam de 10 mg L-1 a 1000
mg L-1, dependendo do poder de reação do corante e do processo de tingimento
utilizado, como por exemplo, intensidade da cor (TUNUSSI & ALEM SOBRINHO,
2002).
Devido à competição entre a celulose (CellO-) e íons OH- nos banhos
contendo corantes reativos em condições típicas de tingimento, ou seja, pH ≥ 10 e
concentração de sais variando de 60 a 100 g L-1, calcula-se perdas dos corantes
de 20 a 50%, devido à não fixação na forma hidrolisada (Tabela 2). Esta falta de
afinidade pela fibra têxtil resulta, conseqüentemente, no efluente colorido
(TUNUSSI & ALEM SOBRINHO, 2002; BEYDILLI & PAVLOSTATHIS, 2005). Os
corantes hidrolisados ocorrem quando a molécula do corante reage com a água
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
14
no lugar da hidróxila de celulose, devido sua alta solubilidade na água e as
características de brilho dos corantes (PEARCE et al., 2003) (Figura 3).
Tabela 2. Estimativa do grau de fixação dos diferentes corantes nas fibras têxteis
e perdas para o efluente, permitidos pela Sociedade de Corantes e Colorações
Grau de fixação Perda para o efluente Classe de aplicação dos corantes Fibras (%) (%)
Ácidos Poliamida 89-95 5-20
Básicos Acrílico 95-100 0-5
Diretos Celulose 70-95 5-30
Dispersos Poliéster 90-100 0-10
Complexados com metal Lã 90-98 2-10
Reativos Celulose 50-90 10-50
Sulfurados Celulose 60-90 10-40
Vat Celulose 80-95 5-20
Fonte: O’NEILL et al. (1999)
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
15
Figura 3. Modelo de interação dos corantes reativos com a fibra têxtil
(Hao et al., 2000).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
16
2.2.2. Perfil Ambiental
Em decorrência das tendências da moda e demanda do consumidor, o setor
industrial tem cada vez mais desenvolvido novos reagentes, novos processos,
maquinaria e técnicas para a confecção de seus produtos, colocando o ambiente
em contato com diversos tipos de poluentes; interrompendo assim o equilíbrio
natural, devido à recalcitrância de grande parte destes compostos (BALAN, 2005).
Embora, o destino dos poluentes no ambiente natural, seja largamente afetado
por processos abióticos, como foto-oxidação e atividade metabólica dos
microrganismos, estes processos são bastante lentos, podendo causar sérios
transtornos ecológicos (KNACKMUSS, 1996).
Os efluentes industriais são freqüentemente misturados com esgotos
sanitários antes de sua chegada à planta de tratamento do esgoto municipal, com
muitos municípios confiando predominantemente no processo de lodo ativado,
para a desintoxicação e mineralização do efluente, antes do mesmo ser lançado
no ambiente (COUGHLIN et al., 2003). O aporte de esgotos e rejeitos industriais
promove alterações significativas nas características físico-químicas dos
ambientes aquáticos (ANDRADE et al., 1998). Dessa maneira, inúmeros trabalhos
empregados na degradação dos corantes diz respeito à descoloração dos azo
corantes, que na sua grande maioria, são mais resistentes ao processo de
degradação (WALKER & WEARTHERLEY, 2000).
Do ponto de vista ambiental, as indústrias têxteis consomem grandes
volumes de água e substâncias químicas no processo de tingimento de seus
tecidos (ROBINSON et al., 2001). O impacto ambiental proveniente destas
indústrias ocorre principalmente, devido a sua descarga altamente colorida em
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
17
águas receptoras, que afeta principalmente a atividade de fotossíntese, devido à
baixa penetração da luz (DONMEZ, 2002, GEORGIOU et al., 2004).
Os efluentes das indústrias têxteis também apresentam altas concentrações
de compostos orgânicos, como amido, dextrinas, gomas, graxas, pectinas,
álcoois, ácido acético, sabões e detergentes; compostos inorgânicos como,
hidróxido de sódio, carbonato, sulfato e cloreto, além de corantes que contêm
metais pesados (CORREIA et al., 1994; ANDRADE et al., 1998, BALAN, 2005).
Em grandes concentrações, os metais pesados apresentam ação tóxica sobre os
microrganismos responsáveis pela decomposição da matéria orgânica, reduzindo
assim, a capacidade auto-depurativa dos corpos aquáticos (CID et al., 1995). Por
outro lado, a presença de alcalóides ou ácidos no processo de branqueamento,
engomagem e demais etapas na lavagem, resulta em um elevado pH e elevado
teor de sais (BUITRON et al., 2004).
Embora, o volume de corante produzido por uma indústria têxtil, a princípio,
possa parecer pequeno, o alto potencial de coloração destes compostos não pode
ser esquecido. A percepção pública da qualidade da água é fortemente
influenciada pela cor. Assim, a presença de cor não natural é esteticamente
desagradável e tende a ser associada com contaminação (NIGAM et al., 1996;
PEARCE et al., 2003; GONG et al., 2005). Alguns pesquisadores têm relatado
quantidades de 1,56 mg dm-3 do corante como sendo detectada nos cursos
d’água, embora concentrações tão baixas quanto 0,005 mg dm-3 sejam visíveis
em águas claras de rios (BANAT et al., 1996; O'NEILL et al., 1999)
particularmente nas regiões do espectro entre o vermelho e o púrpura (PIERCE,
1994).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
18
Alguns requisitos importantes a serem observados pela indústria na escolha
do corante a ser utilizado diz respeito à estabilidade estrutural e a diversidade das
cores (CORREIA et al., 1994). Todavia, a quantidade do corante perdido é
dependente do tipo de corante, rota de aplicação e intensidade da tonalidade
requerida (PEARCE et al., 2003). Tal necessidade gera produtos que são de difícil
degradação biológica por causa da presença dos substituintes, como grupos
halógenos, sulfo, azo ou nitro (PAGGA & BROWN, 1986; NIGAM et al., 1996).
Segundo Kudlich et al. (1996) em algumas plantas convencionais de esgoto os
compostos aromáticos que apresentam grupos SO3H como substituintes,
freqüentemente resistem à biodegradação ou são degradados somente
parcialmente.
Por conseqüência, a remoção econômica destes poluentes é um problema
de grande importância, particularmente para os novos regulamentos da
comunidade européia, onde o tratamento dos efluentes industriais é obrigatório
(NIGAM et al., 1996; TRUNG et al., 2003). De acordo com sua nova legislação foi
restringido o uso de colorantes que não podem ser convertidos sob nenhuma
condição. Recentemente, o governo alemão proibiu a importação de produtos
têxteis, como por exemplo, couro e outros artigos coloridos, contendo azo
corantes, baseados em aminas carcinogênicas (PADMAVATHY et al., 2003;
VIJAYA & SANDHYA, 2003).
Segundo Castro (2003) a diretriz 2002/G1/CE do Parlamento Europeu, listou
2.500 substâncias azóicas em suspensão, embora apenas 100 delas tenham
apresentado uma das 22 aminas com propriedade carcinogênicas já conhecidas.
Com relação aos padrões de cor em diferentes estados, os mesmos podem
variar de localidade para localidade, baseado inicialmente na qualidade da água
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
19
de recepção (HAO et al., 2000). No Reino Unido, desde setembro de 1997,
concentração “zero” foi imposta para os compostos sintéticos liberados no
ambiente marinho. A execução desta lei assegurará que as indústrias têxteis
tratem seus efluentes coloridos a fim de mantê-los dentro do padrão exigido
(ROBINSON et al., 2001). Atualmente, o órgão regulador que aplica os padrões
governamentais, monitorando a poluição nos rios e administrando os recursos
d’água é a Agência Ambiental (PEARCE et al., 2003).
No Brasil, embora a legislação vigente não apresente restrição de cor para
padrões de lançamentos dos efluentes, existe um limite de cor nos corpos d’água
receptores de despejos, sendo que para a maioria deles, esse limite é de 75 mg-
Pt L-1 (TUNUSSI & ALEM SOBRINHO, 2002). E, embora as indústrias têxteis
tenham procurado tratar seus rejeitos no fim do processo de tinturaria, para
atender aos padrões estabelecidos; o contínuo processo de degradação do
ambiente é prova de que essa abordagem contém graves erros, sobretudo ao
supor que o ambiente pode tolerar determinado grau de poluição. Infelizmente,
esse tipo de atitude não reconhece que muitas vezes a poluição não pode ser
controlada e que a ênfase deve ser dada à prevenção (ZANONI & CARNEIRO,
2001).
No Brasil, a classe de corantes reativos tem sido motivo de grande
preocupação, devido sua intensa utilização na tinturaria do algodão,
principalmente, porque os resíduos deste corante podem ser altamente nocivos
quando presentes em qualquer organismo vivo. Estudos têm demonstrado que
estes compostos na forma não hidrolisada apresentam alta estabilidade em meio
neutro, permitindo um tempo de vida de até 50 anos em ambientes aquáticos
(GUARATINI & ZANONI, 2000).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
20
2.2.3. Problemas Toxicológicos Associados aos Corantes
Apesar do grande percentual de resíduos gerados pelas indústrias ao redor
do mundo, informações disponíveis sobre a toxicidade causada pelo impacto
desses rejeitos nos ecossistemas aquáticos ainda são pouco difundidas. A
poluição dos corpos aquáticos a partir destes compostos, provoca alterações nos
ciclos biológicos, podendo causar toxicidade aguda e crônica às comunidades ali
presentes (BANAT et al., 1996).
Desta maneira, o Ecological and Toxicological Association of the Dyestuff
Manufacturing Industry (ETAD), um órgão internacional criado em 1974, tem
tentado minimizar os possíveis danos causados ao homem e ao meio ambiente,
através da fiscalização, durante a fabricação e aplicação dos corantes sintéticos
(ZANONI & CARNEIRO, 2001).
É importante ressaltar que os riscos crônicos dos corantes estão
relacionados principalmente às etapas de biotransformação, ou seja, a rota de
metabolismo dos organismos, que catalisados por enzimas específicas, podem
gerar compostos com propriedades carcinogênicas e mutagênicas, como por
exemplo, aminas aromáticas, toluidinas, benzidinas e radicais ativos, dentre
outros (KUDLICH et al., 1999; ZANONI & CARNEIRO, 2001).
No que diz respeito à saúde humana, os principais riscos toxicológicos dos
corantes sintéticos relacionados à saúde, estão intrinsecamente relacionados à
aplicação e tempo de exposição, ou seja, ingestão oral, sensibilidade da pele e
das vias respiratórias, etc. (GUARATINI & ZANONI, 2000). De acordo com alguns
órgãos existentes, como o EEA (European Environmental Agency) e UNEP
(United Nations Environment Programme), tem sido ressaltado que a maioria dos
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
21
mais de mil produtos químicos manufaturados e usados, não disponibilizam dados
de toxicidade e eco-toxicidade que avaliem seus riscos (PINHEIRO et al., 2004).
Dentre as diversas classes dos corantes, os compostos azo, em particular,
segue um metabolismo voltado para os processo de redução, envolvendo entre
outros, reações de hidroxilação e formação de aminas aromáticas incolores, como
principal produto da clivagem da ligação azo (BANAT et al., 1996; CHAGAS &
DURRANT, 2001; ONG et al., 2005). Entretanto, a redução da ligação azo
formando aminas aromáticas foi demonstrada em várias condições ecológicas,
inclusive no trato digestivo de mamíferos (CHUNG & CERNIGLIAB, 1992;
PINHEIRO et al., 2004).
Segundo Platzek et al. (1999) a formação de aminas carcinogênicas
formadas pela quebra do corante direto Azul 14 por bactérias isoladas da pele foi
observada. Por outro lado, a presença de 1-amino-2-naftol, produzido pela
clivagem redutiva do ácido Alaranjado 7, foi relatado como induzindo tumores de
bexiga (MENDEZ-PAZ et al., 2005a).
Os primeiros estudos com interesse nas aminas aromáticas carcinogênicas
expostas ao homem foram levantados ainda no século 19 na indústria de
manufaturamento de corantes (GUARATINI & ZANONI, 2000). Entretanto, ainda
hoje pouco se conhece sobre algumas aminas hidrofílicas, resultantes da
clivagem redutiva dos corantes (PINHEIRO et al., 2004).
Segundo a Agência Internacional em pesquisa de câncer tem sido incluído
alguns corantes baseados em benzidina, encontrados na categoria do grupo A e
oito corantes encontrados na categoria do grupo 2B, sendo alguns corantes azo
(PINHEIRO et al., 2004). A análise do grau de toxicidade oral dos corantes é
medida através da dose letal (DL50), ou seja, dose responsável por inibir 50% do
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
22
organismo teste. Desta maneira, estudos biocinéticos têm apresentado evidências
de que os azo corantes solúveis em água, se oralmente ingeridos são
metabolizados na microflora intestinal e excretados mais rapidamente do que os
compostos menos solúveis (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Atualmente, a inibição da respiração bacteriana tem sido um dos métodos
aplicados para medir a toxicidade dos corantes (JARDIM et al., 1997). Outros
testes, no entanto, também podem ser aplicados, usando algas, células animais,
mamíferos e zooplâncton (KONSTANTINOU & ALBANIS, 2004). Segundo Chen
(2002) a toxicidade dos azo corantes e produtos intermediários parece estar
relacionada com a natureza degradadora do organismo. Para Donlon et al. (1997)
o azo corante mordente Alaranjado 1 foi redutivamente clivado em aminas
aromáticas menos tóxicas, durante um processo de metanogênese.
A biodegradação de compostos tóxicos inclui várias rotas de metabolismo,
tais como mineralização, hidrólise e co-metabolismo. Acredita-se que somente
10% dos microrganismos dentre o grupo de microrganismos que promovem a
degradação, conseguem completa mineralização dos produtos químicos (DONG
et al., 2003).
2.3. Tratamento dos Efluentes
Nas tinturarias têxteis, com tingimento e estamparia, os efluentes líquidos
apresentam altas cargas poluídoras, especialmente nos processos de
desengomagem e tingimento, apresentando altas cargas orgânicas, corantes e
demais produtos inorgânicos auxiliares (TUNUSSI & ALEM SOBRINHO, 2002).
Os efluentes do tingimento têxtil têm como características, pH elevado ou baixo,
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
23
elevada temperatura, alta concentração de material colorido (DANESHVAR et al.,
2003), elevada DQO (demanda química de oxigênio) (LIN & CHEN, 1997) e
elevada salinidade (LIN & LIN, 1993; SENAN et al., 2003). Os sólidos totais
variam de 1000 - 1600 mg L-1, enquanto o teor de sólidos em suspensão varia de
30 a 50 mg L-1 (BALAN, 2005).
O tratamento dos efluentes contendo corantes pode ser fundamentado em
dois processos básicos: remoção por técnicas que permitam eliminar os
compostos por transferência, a partir de suportes adequados, sem, no entanto
degradar os compostos coloridos, ou a degradação parcial ou completa, até
mineralização do corante (SLOKAR & Le MARECHAL, 1998).
Os processos de tratamentos adotados pelas indústrias têxteis que operam
por meio de sistemas físico-químico, seguido do tratamento biológico via lodo
ativado, embora apresente eficiência relativamente alta na remoção da cor (cerca
de 80%), apresenta como principal desvantagem à geração de lodo, considerado
crítico do ponto de vista ambiental, visto o percentual de corantes adsorvidos
(KUNZ et al., 2002; MAAS & CHAUDHARI, 2005), criando um problema de
disposição (GALINDO et al., 2001; ROBINSON et al., 2001).
Dentre os tratamentos físico-químicos, normalmente aplicados podemos
citar a coagulação e floculação (GOLOB et al., 2005), eletro-coagulação
(DANESHVAR et al., 2003), filtração por membrana (CIARDELLI et al., 2000),
destruição eletroquímica (LIN & CHEN, 1997), oxidação ou ozonização
(MUTHUKUMAR et al., 2005; MUTHUKUMAR et al., 2005a) radiação e adsorção
(AZMI et al., 1998), dentre outros. No entanto, esses métodos apresentam
algumas desvantagens, como por exemplo, a presença em excesso de produtos
químicos e o alto custo operacional (LIN & PENG, 1994; BANAT et al., 1996;
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
24
DANESHVAR et al., 2003). Por outro lado, os corantes reativos e ácidos solúveis
em água são os mais problemáticos, porque tendem a passar através dos
sistemas de tratamentos convencionais (AKSU, 2005).
Dessa maneira, um monitoramento cuidadoso é requerido antes que o
efluente tratado seja lançado nas vias fluviais (ROBINSON et al., 2001) e a
presença de possíveis aminas formadas se submetam a diluições cada vez
maiores, fazendo com que sua detecção e quantificação se torne cada vez mais
difícil (ALONSO & BARCELÓ, 2000; PINHEIRO et al., 2004).
2.3.1. Métodos Químicos
Os tratamentos químicos para os efluentes coloridos geralmente são
simples, sendo a oxidação o método mais comum. Em geral, o agente oxidante é
o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o método, varia basicamente de acordo com a
forma com que este é ativado (SLOKAR & Le MARECHAL, 1998; ARSLAN-
ALATON & FERRY, 2002; MUTHUKUMAR et al., 2005).
A degradação oxidativa pelo cloro e ozônio são os processos químicos mais
comuns na remoção da cor, no entanto, a cloração tem a desvantagem de
produzir sub-produtos organoclorados (SARASA et al., 1998). Os processos de
oxidação avançados (POAs) podem atacar os compostos orgânicos de 106 - 109
vezes mais rapidamente do que os agentes de oxidação como o ozônio e o
peróxido de hidrogênio. No entanto, a ozonização catalítica é um POA com baixo
consumo de ozônio que descolore e mineraliza rapidamente corantes reativos de
efluentes têxteis coloridos (ARSLAN-ALATON et al., 2002; MENDEZ-PAZ et al.,
2005).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
25
A ozonização não é um tratamento eficaz para os corantes de dispersão,
sendo eficaz somente em pH elevado. Por outro lado, o reagente Fenton’s que é
um processo bastante eficaz dentro de uma estreita faixa de pH (< 3,5), é
bastante útil na descoloração dos corantes de dispersão (HAO et al., 2000).
O método fotoquímico tem se mostrado importante como etapa primária na
degradação de alguns corantes, uma vez que os corantes sintéticos apresentam
alta estabilidade quando submetidos à luz visível ou ultravioleta (GUARATINI &
ZANONI, 2000). Neste processo, a degradação é causada pela produção de altas
concentrações de radicais hidróxilas. A vantagem desse tipo de tratamento em
efluentes coloridos, é que não há produção de lodo e odores fétidos são
geralmente reduzidos (ROBINSON et al., 2001). A aplicação do fotocatalisador
TiO2 tem sido utilizada na destruição de compostos orgânicos desde a década
passada (JARDIM et al., 1997), tendo sido largamente usado, devido sua
disponibilidade, baixo custo e não toxicidade (KONSTANTINOU & ALBANIS,
2004). No entanto, os processos fotocatalíticos são limitados às unidades de
tratamentos, devido à baixa penetração de irradiação UV nos efluentes altamente
coloridos (VANDEVIVERE et al., 1998).
Outra medida alternativa também utilizada no processo de descoloração é o
processo de eletrólise do corante. Neste sistema, a degradação da molécula é
dissociada eletroquimicamente através de potencial ou corrente controlada, ou
através de reagentes secundários gerados eletroquimicamente. Todavia, o alto
custo com a energia utilizada, além da produção de reações paralelas, tais como
cloro, radicais hidróxila e outras reações indesejáveis, têm reduzido a sua
aplicação (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
26
2.3.2. Métodos Físicos
A adsorção encontra-se entre os processos físicos mais utilizados (HUANG
& SHU, 1995; OZDEMIR et al., 2004). Esta técnica se baseia na remoção do
corante através da passagem da amostra em carvão ativado, sílica gel, bauxita,
resinas de trocas-iônica, etc. (GUARATINI & ZANONI, 2000). No entanto, o custo
com a recuperação destes adsorbentes são caros; e por isso, muitos
pesquisadores têm buscado a aplicação de materiais alternativos mais
econômicos e eficientes tais como, talo de girrassol (SUN & XU, 1997), casca de
eucalipto (SALIBA et al., 2002), bagaço de cana-de-açúcar (CHANDRAN et al.,
2002), quitosana (UZUN, 2006) e quitina (LONGHINOTTI et al., 1998), dentre
outros.
O carvão ativado é o sorbente mais popular e extensamente usado no
tratamento de efluentes têxteis, devido a sua estrutura porosa (AKSU, 2005).
Embora seja uma técnica extremamente efetiva na remoção da cor,
principalmente em volumes de pequena escala, é um método lento, com custo
relativamente alto (AZMI et al., 1998; GUARATINI & ZANONI, 2000; GONG et al.,
2005). A aplicação de membranas especiais, tais como nanofiltração e osmose
reversa, também tem sido proposta. Esta técnica permite o tratamento de grandes
volumes, de modo rápido e satisfatório, porém o elevado custo e a limpeza das
membranas tem se mostrado como a principal desvantagem (GUARATINI &
ZANONI, 2000).
Com relação à coagulação e floculação, sua aplicação tem permitido uma
remoção satisfatória da cor em grandes volumes de efluentes (AZMI et al., 1998;
GOLOB, et al., 2005). Esta técnica, quando associada a polieletrólitos e/ou
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
27
floculantes inorgânicos, como sais de ferro e alumínio, apresenta resultados
satisfatórios, como tratamento terciário no efluente têxtil. Entretanto, para se obter
uma alta eficiência, normalmente se utiliza polieletrólitos (Al2(SO4)3) e amônia em
excesso, que por sua vez acarreta a presença de resíduos tóxicos ao efluente
(COPPER, 1993).
2.3.3. Métodos Biológicos
Dentre as opções mais econômicas e viáveis para o tratamento dos
efluentes coloridos, os sistemas biológicos se apresentam como os mais práticos
e de baixo custo (MENDEZ-PAZ et al., 2005). Entretanto, os mecanismos
biológicos podem ser bastante complexos (FORGACS et al., 2004).
Inicialmente foi bem relatado que a descoloração dos corantes normalmente
ocorre pela redução ou clivagem da ligação azo anaerobicamente, resultando em
compostos incolores ou aminas aromáticas (KODAM et al., 2005). As aminas
aromáticas por sua vez, são bastante estáveis em ambientes anaeróbicos e sua
completa mineralização ocorre apenas sob condições aeróbicas (MENDEZ-PAZ
et al., 2005a).
Assim, para superar a problemática da recalcitrância dos azo corantes sob
condições anôxicas, alguns pesquisadores tem utilizado duas fases durante o
processo de descoloração (O’NEILL et al., 2000). Neste processo, a remoção do
grupo azo ocorre sob condições anaeróbicas, enquanto os compostos aminados
resultantes são bons substratos para a degradação aeróbica (PEARCE et al.,
2003). Segundo Kudlich et al. (1997) a completa mineralização do azo corante
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
28
sulfurado mordente Amarelo 3 foi alcançada usando Sphingomonas sp. BN6, co-
imobilizadas em contas de alginato.
O uso de processos exclusivamente aeróbicos na descoloração dos azo
corantes não é comum, sendo assim, pouco se conhece dos microrganismos
quanto a sua habilidade de clivagem redutiva nas ligações azo, sendo as reações
extremamente de substrato específico (BLUMEL et al., 1998; COUGHLIN et al.,
2003). Segundo He et al. (2004) culturas mistas têm se mostrado eficientes na
descoloração de alguns corantes azo. Para Nigam et al. (1996) a utilização de
uma cultura bacteriana mista foi responsável por aproximadamente 80% da
remoção da cor em amostras de efluentes contendo misturas de corantes reativos
azo e diazo.
Segundo Forgacs et al. (2004) a utilização de consórcios microbianos
oferece consideráveis vantagens quando comparadas ao uso de culturas puras,
visto que as espécies individuais podem atacar a molécula do corante em
diferentes posições ou podem ainda, usar os produtos de degradação produzidos
por uma dada espécie, numa degradação adicional.
Por outro lado, uma rota a ser explorada diz respeito aos microrganismos
termotolerantes e/ou termofílicos em sistemas de descoloração, uma vez que
diversos efluentes têxteis são produzidos em altas temperaturas (50 - 60oC),
mesmo após refrigeração. Assim, a aplicação de microrganismos termotolerantes
pode reduzir custos significativos, como a remoção de resfriadores,
proporcionando tratamento imediato (BANAT et al., 1996).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
29
2.3.3.1. Biodegradação dos Corantes por Bactérias
O metabolismo de compostos aromáticos por bactérias tem sido bem
documentado. Entre os gêneros mais comumente observados, pode-se citar
Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Beijerinckia,
Corynebacterium, Flavobacterium, Moraxella, Mycobacterium, Nocardia,
Pseudomonas, Vibrio e Xantobacter (BARBIERI, 1997).
Devido à recalcitrância dos compostos aromáticos no ambiente, seu
desaparecimento pode ocorrer por diversos processos abióticos. A biodegradação
representa a principal rota pela qual esses compostos são removidos do ambiente
e sua eficiência encontra-se, sobretudo, no número de anéis aromáticos da
molécula (BARBIERI, 1997) e grupos heterocíclicos (OZDEMIR et al., 2004).
Ainda que, diversos grupos de pesquisadores tenham demonstrado a
habilidade de alguns fungos, principalmente os fungos da podridão branca, na
descoloração e degradação dos corantes têxteis, o longo ciclo de crescimento e
moderadas taxas de descoloração limitam o desempenho desses microrganismos
(BANAT et al., 1996; McMULLAN et al., 2001). Por outro lado, a descoloração
bacteriana geralmente ocorre mais rápida, com elevadas taxas de descoloração
(HAUG et al., 1991).
Os processos de biodegradação podem ser anaeróbicos, aeróbicos ou
envolver uma combinação dos dois (PEARCE et al., 2003). Entretanto, o completo
mecanismo que envolve a descoloração dos azo corantes pelos microrganismos
ainda é pouco conhecido (MAAS & CHAUDHARI, 2005). Acredita-se que pelo
menos dois mecanismos estejam envolvidos. O primeiro seria a transferência
direta de elétrons para os azo corantes como aceptor final de elétrons via rota
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
30
enzimática, durante o catabolismo bacteriano, ligado a geração de ATP
(conservação de energia) e o segundo seria uma redução gratuíta na molécula do
azo corante por produtos terminais do catabolismo bacteriano, não ligado à
geração de ATP (PEARCE et al., 2003). Outro possível mecanismo de remoção
envolveria a redução das ligações azo, pela redução de compostos inorgânicos,
como Fe2+ ou H2S, formados como produtos finais de certas reações anaeróbicas
nos metabólitos bacterianos (KUDLICH et al., 1997).
Para Stolz (2001) estas reações espontâneas permitem que vários
processos não específicos de redução, orientados principalmente por potenciais
redox ou mediadores redox e compostos azo ocorram durante a degradação da
molécula do corante. Isto ocorre, principalmente, porque é improvável que altas
cargas do corante contendo enxofre e alto peso molecular, possam atravessar a
membrana celular (KECK et al., 1997; RUSS et al., 2000). Assim, a atividade
redutora pode não ser dependente da captação intracelular do corante (PEARCE
et al., 2003).
Segundo Kudlich et al. (1997) a adição de quinonas em um sistema
contendo azo corantes e Sphingomonas xenophaga BN6 agiram como
mediadores redox, sendo então reduzidas enzimaticamente por S. xenophaga
BN6, enquanto as hidroquinonas formadas, reduziram os azo corantes no
sobrenadante da cultura numa reação redox puramente química.
Com relação à descoloração anaeróbica, a redução bacteriana é
relativamente não específica com relação aos compostos azo envolvidos, sendo
assim de maior aplicação na remoção da cor dos azo corantes presentes nos
efluentes coloridos. Por outro lado, em processos aeróbicos, após um período de
adaptação, as bactérias sintetizam azoredutases específicas, que sob condições
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
31
controladas reduzem e quebram os grupos azo na presença do oxigênio (STOLZ,
2001). Isto foi observado por Wong & Yuen (1996) quando relataram à
descoloração e biodegradação do azo corante Vermelho de Metila sob condições
aeróbicas usando Klebsiella pneumoniae. Sarnaik & Kanekar (1999) também
descreveram a mineralização aeróbica dos corantes Trifenilmetano e Metil Violeta
por Pseudomonas mendocina MCM-402.
A descoloração anaeróbica envolve uma reação de oxido-redução com
hidrogênio no lugar do oxigênio molecular livre nos sistemas aeróbicos
(ROBINSON et al., 2001). Tipicamente, a quebra da molécula forma metano e
sulfeto de hidrogênio. Os azo corantes atuam como agentes oxidantes na redução
de flavina nucleotídeo na cadeia transportadora de elétrons microbiana, sendo
então reduzidos e descoloridos simultaneamente. Para que esta redução ocorra,
carbono adicional é requerido e então convertido a metano e gás carbônico,
liberando assim os elétrons. Estes elétrons ao entrarem na cadeia respiratória,
requerem um aceptor final de elétrons, que neste caso, é o azo corante reativo.
Quando os elétrons reagem com o corante, reduz a ligação azo, causando a
descoloração (CARLIELL et al., 1996).
Para que este mecanismo de redução ocorra, as bactérias têm que
estabelecer uma ligação entre o seu sistema de transporte de elétrons intracelular
e a molécula do corante de alto peso molecular. Para que esta ligação seja
estabelecida, os componentes transportadores de elétrons devem estar
localizados na membrana exterior das células bacterianas; no caso de bactérias
Gram-negativas, elas podem estabelecer contato direto com o substrato contendo
o azo corante ou um mediador redox através de sua superfície celular (MYERS &
MYERS, 1992). Por outro lado, o baixo peso molecular do mediador redox pode
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
32
agir como transportador de elétron entre o azo corante e as azoredutases
dependentes de NADH, situadas na membrana exterior (PEARCE et al., 2003).
Keck et al. (1997) demonstraram que certos compostos baseados em
quinonas formados durante o metabolismo de substratos específicos, se
comportaram como mediadores redox entre a molécula do corante e a membrana
bacteriana. A adição de mediadores redox sintéticos, como por exemplo,
antraquinonas sulfuradas, mesmo em baixas concentrações, facilita a redução
não enzimática dos azo corantes dentro do ambiente extracelular (YOO et al.,
2001). Entretanto, se este ambiente for aeróbico, este mecanismo de redução
pode ser inibido pelo oxigênio, devido à oxidação preferencial de redução do
mediador redox pelo oxigênio no lugar do azo corante (PEARCE et al., 2003).
Para Kudlich et al. (1997) a atividade azoredutase ligada à membrana e
mediada pelo composto redox, é diferente das azoredutases solúveis no
citoplasma, responsáveis pela redução do corante não sulfurado, que penetra na
membrana da célula. Assim, as azoredutases ligadas à membrana e as
azoredutases citoplasmáticas são dois sistemas enzimáticos diferentes.
A Figura 3 mostra um mecanismo proposto para a redução dos azo corantes
através de mediadores redox dependentes, em células bacterianas quando
incubadas sob condições anaeróbicas. Embora, a redução final do azo corante
nas células do sobrenadante seja uma reação química redox dominante, os
mediadores redox dependem de enzimas redutoras citoplasmáticas para prover
elétrons. Também, é possível que esta reação química redox trabalhe em
conjunto com reações enzimáticas envolvendo as azoredutases, que podem ser
enzimas desidrogenases, sintetizadas ao longo do citoplasma e segregadas sem
acúmulo dentro da célula (PEARCE et al., 2003).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
33
Com relação à descoloração aeróbica, durante os últimos anos, diversas
espécies bacterianas têm sido citadas como responsáveis por mecanismos de
redução, contribuindo assim para a descoloração de alguns corantes. A
habilidade das bactérias em crescer na presença de simples compostos azo
carboxilados como única fonte de carbono e energia, foi primeiramente
demonstrada por Overney em 1979, ao isolar Flavobacterium sp. que crescia
aerobicamente na presença de 4,4’dicarboxiazobenzeno (STOZ, 2001).
Solução colorida contendo aminas
Figura 4. Mecanismo proposto para a redução dos azo corantes pelas
células bacterianas (Pearce et al., 2003).
Solução incolor
Contendo aminas Solução colorida
Contendo o corante
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
34
O metabolismo aeróbico redutor dos azo corantes requer enzimas
específicas, chamadas de azoredutases aeróbicas, que catalisam estas reações
na presença do oxigênio molecular. Segundo Zimmermann et al. (1982) as
azoredutases aeróbicas que clivaram o composto carboxil Alaranjado II,
produzidas pelas espécies K22 e KF46, foram caracterizadas e comparadas a
outras enzimas.
Durante o processo de descoloração, a disponibilidade de uma fonte
adicional de energia é sugerida como uma ferramenta que pode facilitar a
degradação dos corantes (KAPDAN et al., 2000). Tais transformações,
denominadas co-metabólicas, envolvem a clivagem da molécula xenobiótica,
seguida de reações espontâneas que levam a mineralização do composto
(KNACKMUSS et al., 1996; STOLZ, 2001). Isto foi observado em uma espécie
bacteriana não identificada e o corante ácido Alaranjado 7 (COUGHLIN et al.,
1997). Pseudomonas sp., também foi capaz de utilizar o mesmo composto, como
única fonte de carbono e energia para seu crescimento (ZIMMERMANN et al.,
1982; HAO et al., 2000).
Segundo Sumathi & Manju (2000) dentre as fontes de carbono mais
utilizadas, a glicose é um monossacarídeo capaz de promover expressiva
descoloração. Carliell et al. (1996) observaram que a descoloração sob condições
anaeróbicas de alguns azo corantes reativos solúveis em água era alcançada
usando a glicose como fonte de carbono. Wong & Yuen (1996) também relataram
a degradação do azo corante Vermelho Metil, utilizando K. pneumoniae RS-13, na
presença de 0,5-5,0 g L-1 de glicose.
Como forma alternativa e possível minimização dos custos de produção,
outras fontes de energia têm sido testadas no processo de descoloração dos
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
35
corantes. Dentre elas, podemos citar o amido de tapioca, que realçou a remoção
de três diferentes corantes sintéticos (CHINEWITVANICH et al., 2000) e um meio
contendo melaço e Candida tropicalis que descoloriu os corantes têxteis Azul
remazol, Preto e Vermelho reativo (Donmez, 2002).
A reação de sinergismo de um consórcio bacteriano contendo Pseudomonas
sp. e um fungo da podridão branca, usando o azo corante direto Fast Scarlet 4BS
como única fonte de carbono, alcançou descoloração de quase 100% logo nas
primeiras 24 horas de incubação (HE et al., 2004). A atividade catabólica dos
microrganismos em consórcios mistos serve de complemento para a outra cultura
e assim, interações sintróficas presentes nas comunidades mistas, podem
conduzir à completa mineralização dos azo corantes (KNACKMUSS, 1996;
PEARCE et al., 2003).
Um outro fato a ser considerado na degradação dos azo corantes diz
respeito a configuração da molécula. Zimmermann et al. (1982) relataram uma
taxa decrescente de redução da cor, quando um sistema de enzimas correu com
um substrato, estabilizado na forma hidrazona via ligação de hidrogênio,
sugerindo que a configuração da molécula do substrato é importante para a
reação enzimática. De acordo com Kudlich et al. (1999) derivados naftalenos
mono e disulfurados com um grupo hidroxi na posição “ortho” do grupo amino,
são os produtos de redução de uma ampla escala de azo corantes.
Segundo Hao et al. (2000) a posição “para” do corante ácido Alaranjado 20 é
facilmente descolorido por Pseudomonas sp., quando comparado com a posição
“ortho” do corante ácido Alaranjado 7. Por outro lado, inúmeras aminas formadas
durante a redução anaeróbica dos azo corantes (normalmente encontradas na
posição ortho-aminohidroxinaftaleno) são menos estáveis sob condições
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
36
aeróbicas, se submetendo facilmente a reação de auto-oxidação e assim, não
sendo completamente mineralizadas (STOLZ, 2001).
2.3.3.2. Biosorção pela Biomassa Microbiana
A sorção é considerada o primeiro mecanismo de remoção de muitos
corantes nos sistemas de tratamentos biológicos aeróbicos (BASIBUYUK &
FORSTER, 2003). O termo “biosorção” é usado para indicar um número de
processos independentes do metabolismo (adsorção física e química, interações
eletrostáticas, troca de íons, complexação, quelação e microprecipitação) que
ocorre essencialmente na parede celular (ROBINSON et al., 2001; AKSU, 2005).
A biosorção tende a ocorrer em um intervalo razoavelmente rápido, ou seja,
alguns minutos para as algas e algumas horas para as bactérias (HU, 1996).
A parede celular das bactérias consiste essencialmente de vários compostos
orgânicos, incluindo quitina, polissacarídeos acidificados, lipídeos, aminoácidos e
outros componentes celulares que mantêm a capacidade de adsorção dos
poluentes orgânicos (AKSU & YENER, 1998).
Nos últimos anos, a biomassa das bactérias, leveduras e fungos tanto
inativada como viva, tem sido usada com a finalidade de descolorir os efluentes
coloridos. O fato dos corantes têxteis apresentarem diversas variações em sua
estrutura química, bem como diferentes interações com os microrganismos,
depende basicamente da química, em particular do corante, química específica da
biomassa microbiana e condições ambientais (POLMAN & BRECKENRIDGE,
1996; AKSU, 2005). Por outro lado, certos corantes específicos apresentam
particular afinidade em suas ligações com as espécies microbianas (ROBINSON
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
37
et al., 2001). Isso foi observado com a superfície bacteriana carregada
negativamente, que pode adsorver cátions de metal em solução (WIGTMAN &
FEIN, 2004).
Segundo Chu & Chen (2002), a adsorção de corantes básicos através da
biomassa de lodo ativado, demonstrou que a biomassa não apresentava
nenhuma afinidade com os corantes aniônicos e não-aniônicos selecionados
(direto Alaranjado 39 e direto Vermelho 83, disperso Violeta 8 e disperso Amarelo
54). Entretanto, a biomassa pôde interagir com os corantes catiônicos sob as
mesmas condições.
A capacidade de adsorção máxima indica uma correlação entre a estrutura
química e o comportamento do adsorbente, ou seja, a basicidade e o peso
molecular. Basibuyuk & Forster (2003) citaram que a principal razão para a baixa
capacidade de adsorção dos corantes ácidos aniônicos é a carga elétrica negativa
do lodo ativado em pH normal, condicionando a repulsão entre os íons
carregados negativamente do sorbante (corante) e a superfície carregada
negativamente do sorbente (biomassa), bem como o número de grupos sulfos
presentes no corante ácido que também reduz a adsorção do corante.
Com relação à capacidade de remoção da biomassa, o uso de células
microbianas inativadas no processo de biosorção é mais vantajoso no tratamento
da água, porque a biomassa microbiana não é afetada pela toxicidade do corante,
não requer fonte contínua de nutrientes e pode ser regenerada e reutilizada por
vários ciclos (ROBINSON et al., 2001). Estas células apresentam ainda melhor
remoção, quando comparadas às células vivas, devido ao aumento da área de
superfície.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
38
As bactérias Gram-negativas apresentam maior capacidade de adsorção
quando comparadas as bactérias Gram-positivas, visto o elevado índice de
lipídeos em sua parede celular (AKSU, 2005). Um outro componente também
importante nas células Gram-positivas é a presença dos ácidos teicoicos e ácidos
associados à parede celular, cujos grupos fosfato são componentes chave na
remoção dos metais (COSTA & DUTA, 2001).
Hu (1996) estudando a biosorção de alguns corantes com biomassa de
Aeromonas sp., observou adsorção máxima de 114-146 mg g-1 quando a
concentração inicial do corante era 200 mg g-1. Polman & Breckenridge (1996),
testando 30 espécies de fungos, leveduras e bactérias na remoção de alguns
corantes reativos e sulfurados, com biomassa viva e morta, observaram que 71%
dos microrganismos foram mais eficientes em se ligar na forma inativada do que
na forma viva. Resultados semelhantes foram observados por Evangelista-Barreto
et al. (2005), ao estudarem a descoloração do azo corante Alaranjado II com
biomassa de Phanerochaete chrysosporium (UCP 593). É provável que isto tenha
ocorrido devido ao aumento da área de superfície, causada pela ruptura da célula
no momento da inativação.
Vale salientar ainda que, no caso da biomassa viva, a biosorção pode ser
um pré-requesito para a biotransformação, pois a passagem do corante para o
interior da célula pode ser uma condição necessária para o processo de
metabolização intracelular. Desta maneira, pode ocorrer interferência na taxa de
descoloração devido à barreira causada pela superfície celular (MAAS &
CHAUDHARI, 2005).
Aksu & Tezer (2000), estudando a biomassa seca de Rhizopus arrhizus na
remoção do corante reativo aniônico Preto B em solução aquosa, propuseram que
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
39
a biosorção resulta da interação entre os grupos ativos na superfície das células
do fungo e o corante.
Desta maneira, a biomassa bacteriana poderia ser usada como um
adsorbente de origem biológica na remoção de baixas concentrações de
compostos orgânicos perigosos nos efluentes, uma vez que os poluentes
hidrofóbicos apresentam maior tendência de acúmulo nas células microbianas ou
lodo ativado (SUMATHI & MANJU, 2000; AKSU, 2005).
2.4. Geobacillus stearothermophilus
Microrganismos adaptados para crescer em elevadas temperaturas (60 -
108°C) têm sido isolados de habitat’s terrestres e marinhos (BERTOLDO &
ANTRANIKIAN, 2002). A família Bacillaceae é constituída por diversos
microrganismos formadores de esporos, destacando-se entre eles o gênero
Bacillus. Este gênero compreende bastonetes Gram-positivos ou variáveis,
formadores de endosporos que podem estar localizados na posição central,
terminal e sub-terminal. A parede celular destes microrganismos é constituída por
peptideoglicano com características antifagocitárias, no qual muitos estudos
consideram uma das principais chaves de sua virulência (MYRVIK & WEISER,
1988).
A família Bacillaceae é constituída por gêneros como Alicyclobacillus,
Paenibacillus, Brevibacillus, Salibacillus, Aneurinibacillus, Gracilibacillus,
Ureibacillus, e mais recentemente, Geobacillus. O gênero Geobacillus apresenta
características de microrganismos extremófilos com temperatura ótima de
crescimento em torno de 60ºC e 80ºC (BERTOLDO & ANTRANIKIAN, 2002),
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
40
aeróbios ou anaeróbios facultativos, podendo ser encontrado em ambientes bem
diversificados, apresentando ainda grande potencial no tratamento de ambientes
contaminados por resíduos recalcitrantes (MARCHANT et al., 2003).
De acordo com a temperatura de crescimento e alterações ambientais, os
bacilos podem se apresentar como microrganismos mesófilos e termofilicos
(MYRVIK & WEISER, 1988). Bacillus subtilis e Bacillus sthearothermophilus
(atualmente classificado como Geobacillus) são bastante conhecidos por servirem
de controle de qualidade em testes de esterilização com óxido de etileno e vapor.
Neste gênero, os microrganismos são capazes de sobreviver em condições
bastante adversas, como dessecação, temperatura, pH, etc., devido a sua
capacidade de produzir esporos resistentes e crescerem em temperaturas
elevadas (40 - 70ºC) (NG & SCHAFFNER, 1997). Estes microrganismos se
apresentam ainda como sendo fenotipicamente heterogêneo, com seus membros
exibindo uma escala extremamente ampla com relação ao requerimento
nutricional, condições de crescimento e diversidade metabólica (SOUZA &
MARTINS, 2001).
Com relação à atividade enzimática dos microrganismos termofílicos e
hipertermofílicos, eles além de representar fontes ideais de muitas enzimas
(MORANA et al., 2002), apresentam grande importância quanto às enzimas
mesofílicas, devido à correlação entre a termoestabilidade e o aumento da
resistência à desnaturação (EWIS et al., 2004). Bertoldo & Antranikian (2002)
relataram que enzimas que hidrolisam o amido são abundantes nos
microrganismos extremófilos, sugerindo que as mesmas exercem um importante
papel em seu metabolismo. As enzimas termoestáveis que hidrolisam o amido
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
41
tais como amilase, pululanases e glicoamilases são de grande importância na
indústria de alimentos, química e farmacêutica.
De acordo com a literatura, G. stearothermophilus tem sido citado como
responsável pela produção de diversas enzimas termoestáveis. Ben Ali et al.
(1999) realizando um estudo com α-amilase isolada de G. stearothermophilus na
hidrólise do amido, encontraram como os principais produtos formados,
maltohexose e maltopentose. Ewis et al. (2004), também trabalhando com este
microrganismo, isolaram e caracterizaram duas esterases termoestáveis,
designadas de Est55 e Est30.
Uma outra característica de G. stearothermophilus que evidência seu
potencial biotecnológico, é que este microrganismo contém pelo menos três
oxidases terminais em sua cadeia respiratória, ou seja, citocromo oxidase c tipo
caa3, oxidase quinol tipo-bd e citocromo oxidase c-551 tipo-b(o/a3 (SONE et al.,
1999).
2.5. Pseudomonas aeruginosa
O gênero Pseudomonas compreende um grande número de espécies (em
torno de 100) de bacilos Gram-negativos, normalmente diferenciados por meio de
provas bioquímicas, testes de sensibilidade a antibióticos, formação de pigmento,
número e localização dos flagelos (TOLEDO & TRABULSI, 1999). Os membros
deste gênero são os microrganismos freqüentemente mais isolados em corpos
aquáticos. Entretanto, sua presença não necessariamente indica possível risco à
saúde pública. No entanto, P. aeruginosa tem sido utilizada na análise de águas
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
42
recreacionais, devido sua resistência à desinfecção química (TORANZOS &
McFETERS, 1996).
Pseudomonas aeruginosa é um dos microrganismos mais ubiquitários, ou
seja, é encontrada no solo, na água, em vegetais, animais, alimentos e nos mais
diversos ambientes hospitalares. Considerada como patógeno oportunista, é um
dos mais importantes agentes de infecção hospitalar (LINCOPAN & TRABULSI,
2004).
Taxonomicamente, P. aeruginosa pertence à família Pseudomonadaceae,
classificada no grupo de homologia rRNA I, especificamente no grupo
fluorescente. Microscopicamente a bactéria é definida como um bacilo Gram-
negativo reto, de 0,5-0,7 µm de espessura por 1,5-3,0 µm de comprimento, não
esporulado, móvel por um único flagelo polar (LINCOPAN & TRABULSI, 2004).
De acordo com sua fisiologia, é classificada como uma bactéria aeróbica,
podendo crescer anaerobicamente na presença de nitrato, sendo então usado
como aceptor final de elétron. Embora a espécie seja quimiorganotrófica, a
obtenção de energia a partir de carboidratos implica num metabolismo oxidativo
(dependente de O2), não fermentador. Como alternativa, pode usar outras fontes
de carbono como, por exemplo, o acetato. Esta versatilidade no requerimento
nutricional e energético lhe permite crescer rapidamente em diferentes meios de
cultura e numa ampla faixa de temperatura (4 - 42oC) (LINCOPAN & TRABULSI,
2004), sendo potencialmente capaz de degradar mais de 100 compostos
orgânicos diferentes (BARBOSA & TORRES, 1998).
Uma das características mais destacadas dessa espécie é a sua capacidade
em produzir pigmentos hidrossolúveis, um de cor azul, denominado piocianina
(TOLEDO & TRABULSI, 1999) e outro esverdeado, denominado pioverdina
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
43
(LINCOPAN & TRABULSI, 2004). Outros pigmentos também podem ser
observados com menor freqüência, como piomelanina (castanho) e piorrubina
(vermelho). Esta observação, assim como a produção de odor característico de
frutas, produto da aminoacetofenona liberada pelo microrganismo, é uma
característica de grande importância na sua identificação. Outra característica
destacável é a formação, em meios de cultura líquido e sólido, de uma camada de
aspecto mucóide denominada “slime”, importante na formação de biofilmes
(LINCOPAN & TRABULSI, 2004).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
44
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABIQUIM. Associação Brasileira da Indústria Química. Corantes e pigmentos.
2005. Disponivel em: <http://www.abiquim.org.br/canais.asp?id=15> Acesso em: 11 jan 2005.
ABIQUIM. Associação Brasileira da Indústria Química. Corantes e pigmentos.
2005a. Disponivel em: <http://www.abiquim.org.br/corantes/cor_industria.asp>
Acesso em 01 nov. 2005.
ADEDAYO, O. et al. Decolourization and detoxification of methyl red by aerobic
bacteria from a wastewater treatment plant. World J. Microbiol. Biotechnol., Oxford, v.20, n.6, p.545-550, aug. 2004.
AKSU, Z. Application of biosorption for the removal of organic pullutants: a review.
Process Biochem., London, v.40, n.3-4, p.997-1026, mar. 2005.
AKSU, Z.; DONMEZ, G. A comparative study on the biosorption characteristics of
some yeasts for Remazol Blue reactive dye. Chemosphere, Oxford, v.50, n.8,
p.1075-1083, mar. 2003.
AKSU, Z.; YENER, J. Investigation of the biosorption of phenol and
monochlorinated phenols on the dried activated sludge. Process Biochem., London, v.33, n.6, p.649-655, aug. 1998.
AKSU, Z.; TEZER, S. Equilibrium and kinetic modelling of biosorption of Remazol
Black B by R. arrhyzus in a batch system: effect of temperature. Process Biochem., London, v.36, n.5, p.431-439, dec. 2000.
ALONSO, M.C.; BARCELÓ, D. Stability of sulfonated derivatives of benzene and
naphthalene on disposable solid-phase extraction pre-columns and in an aqueous
matrix. J. Chromatografy A, Amsterdam, v.889, n.1-2, p.231-244, aug. 2000.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
45
ANDRADE, R.C.B.; SOUZA, M.P.L.; COUTO, E.C.G. Influência de efluentes
têxteis e alimentícios sobre o metabolismo e propriedades físicas e químicas do
Rio Piautinga (Sergipe). Química Nova, São Paulo, v.21, n.4, p. 424-427, jul.-ago.
1998.
ARSLAN-ALATON, I.; AKMEHMET. I.; BAHNEMANN, D.W. Advanced oxidation
of reactive dyebath effluent: comparison of O3, H2O2/UV-C and TiO2/UV-A
processes. Water Res., New York, v.36, p.1143-1154, mar. 2002.
ARSLAN-ALATON, I.; FERRY, J.L. Application of polyoxotungstates as
environmental catalysts: wet air oxidation of acid dye orange II. Dyes Pigm., Oxford, v.54, n.1, p.25-36, jul. 2002.
AZMI, W.; SANI, R.J.; BANERJEE, U.C. Biodegradation of triphenylmethane dyes.
Enzyme Microb. Technol., New York, v.22, n.3, p.185-191, feb. 1998.
BALAN, D.S.L. Biodegradação e toxicidade de efluentes têxteis. Revista Brasileira de Técnicos Têxteis - ABTT. Ano 1, n.1, p. 16-18, 2005. Disponível
em: < http://abtt.org.br/revistas.htm>. Acesso em: 01 out 2005.
BANAT, I.M. et al. Microbial descolorization of textile-dye-containing effluents: a
review. Bioresour. Technol., Oxford, v.58, n.3, p.217-227, dec. 1996.
BARBOSA, H.R.; TORRES, B.B. Nutrição. In: Microbiologia Básica. São Paulo:
Atheneu. Cap.4, 1998. p.89-102.
BARBIERI, S.M. Biodegradação de compostos aromáticos. In: MELO, I.S.;
AZEVEDO, J.L. (eds.). Microbiologia ambiental, São Paulo:Embrapa-CNPMA.
Cap.10, 1997. p.211-242.
BASIBUYUK, M.; FORSTER, C.F. An examination of the adsorption
characteristics of a basic dye (Maxilon Red BL-N) on to live activated sludge
system. Process Biochem., London, v.38, n.9, p.1311-1316, apr. 2003.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
46
BEN ALI, M.; MEZGHANI, M.; BEJAR, S.A. Thermostable α-amylase producing
maltohexaose from a new isolated Bacillus sp. US100: study of activity and
molecular cloning of the corresponding gene. Enzyme Microb. Technol., New
York, v.24, n.8-9, p.584-589, jun. 1999.
BERTOLDO, C.; ANTRANIKIAN, G. Starch-hydrolyzing anzymes from
thermophilic archaea and bacteria. Curr. Opin. Chem. Biol., London, v.6, n.2,
p.151-160, apr. 2002.
BEYDILLI, M.I.; PAVLOSTATHIS, S.G. Decolorization kinetics of the azo dye
Reactive Red 2 under methanogenic conditions: effect of long-term culture
acclimation. Biodegradation, New York, v.16, n.2, p.135-146, mar. 2005.
BLUMEL, S. et al. Isolation of a bacterial strain with the to utilize the sulfonated
azo compound 4-carboxy-4’-sulfoazobenzene as sole source of carbon and
energy. Appl. Environ. Microbiol., Washington, v.64, n.6, p.2315-2317, jun.
1998.
BROMBERG, N., DURÁN, N. Biodescoloração da violaceína: um modelo para
tratamento de efluente têxtil. In: Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental,
07, 2000, Recife. Anais... Recife, 2000. p.62.
BUITRON, G.; QUEZADA, M.; MORENO, G. Aerobic degradation of the azo dye
acid red 151 in a sequencing batch biofilter. Bioresourc. Technol., Oxford, v.92,
n.2, p.143-149, apr. 2004.
CARLIELL, C.M.; BARCLAY, S.J.; BUCKLEY, C.A. Treatment of exhausted
reactive dyebath effluent using anaerobic digeston: laboratory and full-scale trials. Water SA, Pretoria, v.22, n.3, p.225-233, jul. 1996.
CASTRO, F. Curtumes aderem à onda ecológica. Rev. Química e Derivados.
n.420, outubro, 2003. Disponível em:
< http://www.quimica.com.br/revista/qd420/couro1.htm> Acesso em: 20 jan. 2005.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
47
CHAGAS, E.P.; DURRANT, L.R. Decolorization of azo dyes by Phanerochaete
chrysosporium and Pleurotus sajorcaju. Enzyme Microb. Technol., New York,
v.29, n.8-9, p.473-477, nov. 2001.
CHANDRAN, C.B.; SINGH, D.; NIGAM, P. Remediation of textile effluent using
agricultural residues. Appl. Biochem. Biotechnol., Clifton, v.102, n. 1-6, p.207-
212, jul-dez., 2002.
CHEN, B.-Y. Understanding decolorization characteristics of reactive azo dyes by
Pseudomonas luteola: toxicity and kinetics. Process Biochem., London, v. 38,
n.3, p.437-446, nov. 2002.
CHEN, K.-C. et al. Decolorization of the textile dyes by newly isolated bacterial
strains. J. Biotechnol., Amsterdam, v.101, n.1, p.57-68, feb. 2003.
CHINWEKITVANICH, S.; TUNTOOLVEST, M.; PANSWAD, T. Anaerobic
decolorization of reactive dyebath affluents by a two-stage UASB system with
tapioca as a co-substrate. Water Res., New York, v.34, n.8, p.2223-2232, jun.
2000.
CHU, H.C.; CHEN, K.M. Reuse of activated sludge biomass: I. Removal of basic
dyes from wastewater by biomass. Process Biochem., London, v.37, n.6, p.595-
600, jan. 2002.
CHUNG, K.-T.; CERNIGLIAB, C.E. Mutagenicity of azo dyes: structure-activity
relationships. Mutat. Res., Amsterdam, v.277, n.3, p.201-220, sep. 1992.
CIARDELLI, G.; CORSI, L.; MARCUCCI, M. Membrane separation for
wasterwater reuse in the textile industry. Resources Conserv. Rec., Amsterdam,
v. 31, n., p.189-197, feb. 2000
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
48
CID, A. et al. Copper toxicity on the marine microalga phaeodactylum-tricornutum -
effects on photosynthesis and related parameters. Aquat. Toxicol., Amsterdam,
v.31, n.2, p.165-174, feb. 1995.
COOPER, P. Removing color from dyehouse waste-waters – a critical review of
techniques available. J. Soc. Dyers Colour, Bradford, v.109, n.3, p.97-100, mar.
1993.
CORREIA, V.M.; STEPHENSON, T.; JUDD, S. Characterization of textile
wastewaters - a review. Environ. Technol., London, v.15, n.10, p.917-929, oct.
1994.
COSTA, F.P.B.S. O diferencial para a exportação de produtos têxteis. EAN BRASIL, Associação Brasileira de Automação. 03/10/2005. <Disponível em:
http://www.eanbrasil.org.br/servlet/ServletContent?requestId=31&id:press=1081&i
d:classificationpress=42> Acesso em: 01/ nov. 2005.
COSTA, A.C.A.; DUTA, F.P. Bioaccumulation of copper, zinc, cadmium and lead
by Bacillus sp., Bacillus sphaericus and Bacillus subtilis. Braz. J. Microbiol., São
Paulo, v.32, n.1, p.1-5, jan-mar. 2001.
COUGHLIN, M.F. et al. Characterization of aerobic azo dye-degrading bacteria
and their activity in biofilms. Water Sci. Technol., Oxford, v.36, n.1, p.215-220,
1997.
COUGHLIN, M.F.; KINKLE, B.K.; BISHOP, P.L. High performance degradation of
azo dye acid orange 7 and sulfanilic acid in a laboratory scale reactor after
seeding with cultured bacterial strains, Water Res., New York, v.37, n.11, p.2757-
2763, jun. 2003.
DANESHVAR, N.; ASHASSI-SORKHABI, H.; TIZPAR, A. R. Decolorization of
orange II by electrocoagulation method. Sep. Purif. Technol., Amsterdam, v.31,
n.2, p.153-162, may. 2003.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
49
DONG, X.L.; ZHOU, J.T.; LIU, Y. Peptone-induced biodecolorization of reactive
brilliant Blue (KN-R) by Rhodocyclus gelatinosus XL-1. Process Biochem., London, v.39, n.1, p. 89-94, sep. 2003.
DONLON, B. et al. Detoxification and partial mineralization of the azo dye mordan
orange 1 in a continuous upflow anaerobic sludge-blanket reactor. Appl. Microbiol. Biotechnol., Berlin, v.47, n.1, p.83-90, jan. 1997.
DONMEZ, G. Bioaccumulation of the reactive textile dyes by Candida tropicalis
growing in molasses medium. Enzyme Microb. Technol., New York, v.30, n.3,
p.363-366, mar. 2002.
DUENSER, H. Textile wastewater treatment. Indian Textile J., v.102, p.80-96,
1992.
EVANGELISTA-BARRETO, N.S. et al. In: Workshop Internacional de
Microbiologia Ambiental, 09, 2005, Campinas. Anais... Campinas, 2005.
EWIS, H.E.; ABDELAL, A.T.; LU, C.-D. Molecular cloning and characterization of
two thermostable carboxyl esterases from Geobacillus stearothermophilus. Gene,
Amsterdam, v.329, p.187-195, mar. 2004.
FORGACS, E.; CSERHÁTI, T.; OROS, G. Removal of synthetic dyes from
wasterwaters: a review. Environ. Int., New York, v.30, n.7, p.953-971, sep. 2004.
GALINDO, C.; JACQUES, P.; KALT, A. Photooxidation of the phenylazonaphthol
AO20 on TIO2: kinetic and mechanistics investigations. Chemosphere, Oxford,
v.45, n.6-7, p.997-1005, nov. 2001.
GEORGIOU, D. et al. Decolorization of azo-reactive dyes and cotton-textile
wastewater using anaerobic digestion and acetate-consuming bacteria. Biochem. Eng. J., Amsterdam, v.19, n.1, p.75-79, Jul. 2004.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
50
GOLOB, V.; VINDER, A.; SIMONIC, M. Efficiency of the coagulation/flocculation
method for the treatment of dyebath effluents. Dyes Pigm., Oxford, v.67, n2, p.93-
97, nov. 2005.
GOMES, N.C.M., MENDONÇA-HAGLER, L.C.S., SAVAIDIS, I. Metal
bioremediation by microorganisms. Rev. Microbiol., São Paulo, v.29, n.2, p.85-
92, Apr../Jun., 1998.
GONG, R. et al. Utilization of powdered peanut hull as biosorbent for removal of
anionic dyes from aqueous solution. Dyes Pigm., London, v.64, n.3, p.187-192,
mar. 2005.
GUARATINI, C.C.I.; ZANONI, M.V.B. Corantes têxteis. Química Nova, São
Paulo, v.23, n.1, p.71-78, fev. 2000.
HAO, J.O.; KIM, H.; CHIANG, P.-C. Decolorization of wastewater. Crit. Rev. Environ. Sci. Technol., Boca Raton, v.30, n.4, p.449-505, 2000.
HAUG, W. et al. Mineralization of the sulfonated azo dye mordant yellow 3 by 6-
aminonaphthalene-2-sulfonate-degrading bacterial consortium. Appl. Environ. Microb., Washington, v.57, n.11, p.3144-3149, nov. 1991.
HE, F.; HU, W.; LI, Y. Biodegradation mechanisms and kinetics of azo dye 4BS by
a microbial consortium. Chemosphere, Oxford, v.57, n.4, p.293-301, oct. 2004.
HU, T.-L. Removal of reactive dyes from aqueous solution by different bacterial
genera. Water Sci. Technol., Oxford, v.34, n.10, p.89-95, 1996.
HUANG, C.R.; SHU, H.Y. The reaction kinetics: decomposition pathways and
intermediate formation of phenol in ozonation, UV/O3 and UV/H2O2 processes. J. Hazard. Mater., Amsterdam, v.41, n.1, p.47-64, apr. 1995.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
51
INFORMATIVO ABIT. Setor têxtil e de confecção: imagem de um Brasil moderno.
Revista Brasileira de Técnicos Têxteis - ABTT, ano 1, n. 1, p. 8-9, 2005.
Disponível em: < http://www.abtt.org.br/revistas.htm> Acesso em: 01 nov. 2005.
JARDIM, W.F.; MORAES, S.G.; TAKIYAMA, M.M.K. Photocatalytic degradation of
aromatic chlorinated compounds using TiO2: toxicity of intermediates. Water Res., New York, v.31, n.7, p.1728-1732, jul. 1997.
KAPDAN, I.K. et al. Effect of environmental conditions on biological of textile dye
by Coriolus versicolor. Enzyme Microb. Technol., New York, v.26, n.5-6, p.381-
387, mar. 2000.
KECK, A. et al. Reduction of azo dyes by redox mediators originating in the
naphthalenesulfonic acid degradation pathway of Sphingomonas sp. Strain BN6.
Appl. Environ. Microbiol., Washington, v.63, n.9, p.3684-3690, sep. 1997.
KNACKMUSS, H.-J. Basic knowledge and perspectives of bioelimination of
xenobiotic compounds. J. Biotechnol., Amsterdam, v.51, n.3, p.287-295, nov.
1996.
KODAM, K.M. et al. Microbial decolorization of reactive azo dyes under aerobic
conditions. World J. Microbiol. Biotechnol., Oxford, v.21, n. 3, p.367-370, apr.
2005.
KONSTANTINOU, I.K.; ALBANIS, T.A. TiO2-assisted photocatalytic degradation of
azo dyes in aqueous solution: kinetic and mechanistic investigations - a review.
Appl. Catal. B: Environ., Amsterdam, v.49, n.1, p.1-14, apr. 2004.
KUDLICH, M. et al. Simultaneous anaerobic and aerobic degradation of the
sulfonated azo dye Mordant Yellow 3 by immobilized cells from a
naphthalenesulfonate-degrading mixed culture. Appl. Microbiol. Biotechnol., Berlin, v.46, n.5-6, p.597-603, dec. 1996.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
52
KUDLICH, M. et al. Localization of the enzyme system involved in anaerobic
reduction of azo dyes by Sphingomonas sp. strain BN6 and effect of artificial redox
mediators on the rate of azo dye reduction. Appl. Environ. Microbiol., Washington, v.63, n.9, p.3691-3694, sep. 1997.
KUDLICH, M. et al. Autoxidation reactions of different aromatic o-
aminohydroxynaph-thalenes that are formed during the anaerobic reduction of
sulfonated azo dyes. Environ. Sci. Technol., Washington, v.33, n.6, p.896-901,
mar. 1999.
KUNZ, A. et al. Novas tendências no tratamento de efluentes têxteis. Química Nova, São Paulo, v.25, p.73-82, jan.-feb. 2002.
LIN, S.H.; LIN, C.M. Treatment of textile waste effluents by ozonation and
chemical coagulation. Water Res., New York, v.27, n.12, p.1743-1748, dec. 1993.
LIN, S.H.; PENG, F.C. Treatment of textile wastewater by electrochemical method.
Water Res., New York, v.28, n.2, p.277-282, feb. 1994.
LIN, S.H.; CHEN, M.L. Treatment of textile wastewater by chemical methods for
reuse. Water Res., New York, v.31, n.4, p.868-876, apr. 1997.
LINCOPAN, N.; TRABULSI, L.R. Pseudomonas aeruginosa. In: LUIZ RICHARDI
TRABULSI et al. (Eds). Microbiologia. 4.ed., São Paulo: Atheneu. Cap. 49, 2004.
p.359-368.
LONGHINOTTI, E. et al. Adsorption of anionic dyes on the biopolymer chitin. J. Braz. Chem. Soc., São Paulo, v.9, n.5, p.435-440, sep.-oct. 1998.
MAAS, R.; CHAUDHARI, S. Adsorption and biological decolourization of azo dye
Reactive Red 2 in semicontinuous anaerobic reactors. Process Biochem., London, v.40, n.2, p.699-705, feb. 2005,
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
53
MANU, B.; CHAUDHARI, S. Decolorization of indigo and azo dyes in
semicontinuous reactors with long hydraulic retention time. Process Biochem., London, v.38, n.8, p.1213-1221, mar. 2003.
MARCHANT, R.; SHARKEY, F.H.; BANAT, I.M. Thermophilic soil bacteria as
agent of natural attenuation of hydrocarbon contamination. Congress of Bioremediation. Greece. 2003.
McCURDY, M.W., et al. Chemical reduction and oxidation combined with
biodegradation for the treatment of textile dye. In: Proc. Purdue Industrial Waste Conf. Lewis Publishers. Cap.46, 1992. p.229-234.
McMULLAN, G., et al. Microbial decolourisation and degradation of textile dyes.
Appl. Microbiol. Biotechnol., Berlin, v.56, n.1-2, p.81-87, jul. 2001.
MENDEZ-PAZ, D.; OMIL, F.; LEMA, J.M. Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under batch conditions. Enzyme Microb. Technol., New York , v.36, n.
2-3, p.264-272, feb. 2005.
MENDEZ-PAZ, D.; OMIL, F.; LEMA, J.M. Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under fed-batch and continuous conditions. Water Res., New York,
v.39, n. 5, p. 771-778, mar. 2005a.
MORANA, A., et al. A carboxylesterase from the hyperthermophilic archaeon
Sulfolobus solfataricus: cloning of the gene, characterization of the protein. Gene,
Amsterdam, v.283, n.1-2, p.107-115, jan. 2002.
MOREIRA, M.T.; MIELGO, I.; FEIJOO LENA, J.M. Evaluation of different fungal
strains in decolorization of synthetic dyes. Biotechnol. Lett., Dordrecht, v.22,
n.18, p.1499-1503, 2000.
MUTHUKUMAR, M.; SARGUNAMANI, D.; SELVAKUMAR, N. Statistical analysis
of the effect of aromatic, azo and sulphonic acid groups on decolouration of acid
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
54
dye effluents using advanced oxidation processes. Dyes Pigm., London, v.65, n.2,
p.151-158, may. 2005.
MUTHUKUMAR, M., et al. Studies on decolouration, toxicity and the possibility for
recycling of acid dye effluents using ozone treatment. Dyes Pigm., London, v.64,
n.1, p.39-44, jan. 2005a.
MYERS, C.R.; MYERS, J.M. Localization of cytochromes to the outer membrane
of anaerobically grown Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol., Washington,
v.174, n.11, p.3429-3438, jun. 1992.
MYRVIK, Q.N.; WEISER, R.S. Fundamentals of medical bacteriology and mycology. 2th.ed. Lea and Febiger: Philadelphia.1988. p.251-257.
NG, T.M.; SCHAFFNER, D.W. Mathematical models for the effects of pH,
temperature and sodium chloride on the growth of Bacillus stearothermophilus in
salty carrots. Appl. Environ. Microbiol., Washington, v.63, n.4, p.1237-1243, apr.
1997.
NIGAM, P., et al. Microbial process for the decolorization of textile effluent
containing azo, diazo and reactive dyes. Process Biochem., London, v.31, n.5,
p.435-442, jun. 1996.
ONG, S.-A. et al. Decolorization of azo dye (Orange II) in a sequential UASB-SBR
system. Sep. Purif. Technol., Amsterdam, v.42, n. 3, p.297-302, apr. 2005.
O’NEILL, C., et al. Colour in textile effluents-sources, measurement, discharge
consents and simulation: a review. J. Chem. Technol. Biotechnol., Oxford, v.74,
n.11, p.1009-1018, nov. 1999.
O’NEILL, C., et al. Anaerobic-aerobic biotreatment of simulated textile effluent
containing varied ratios of starch and azo dye. Water Res., New York, v.34, n.8,
p.2355-2361, jun. 2000.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
55
OZDEMIR, O., et al. Comparison of the adsorption characteristics of azo-reactive
dyes on mezoporous minerals. Dyes Pigm., London, v.62, n.1, p.49-60, jul. 2004.
PADMAVATHY, S., et al. Aerobic decolorization of reactive azo dyes in presence
of various cosubstrates. Chem. Biochem. Eng. Quart., Croatia, v.17, n.2, p.147-
151, jun. 2003.
PAGGA, U.; BROWN, D. The degradation of dye stuffs. Part II. Behaviour of
dyestuffs in aerobic biodegradation tests. Chemosphere, Oxford, v.15, n.4, p.479-
491, jan. 1986.
PEARCE, C.I.; LLOYD, J.R.; GUTHRIE, J.T. The removal of colour from textile
wastewater using whole bacterial cells: a review. Dyes Pigm., London, v.58, n.3,
p.179-196, sep. 2003.
PIERCE, J. Color in textile effluents – the origins of the problem. J. Soc. Dyers Colour., Bradford v.110, n.4, p.131-133, apr., 1994.
PINHEIRO, H.M.; TOURAUD, E.; THOMAS, O. Aromatic amines from azo dye
reduction: status review with amphasis on direct UV spectrophotometric detection
in textile industry wastewaters. Dyes Pigm., London, v.61, n.2, p.121-139, may.
2004.
PLATZEK, T., et al. Formation of a carcinogenic aromatic amine from an azo dye
by human skin bacteria in vitro. Hum. Exp. Toxicol., Hampshire, v.18, n.9, p.552-
559, sep. 1999.
POLMAN, J.K; BRECKENRIDGE, C.R. Biomass-mediated binding and recovery of
textile dyes from waste effluents. Text. Chem. Colour, Research Triangle Park,
v.28, n.4, p.31-35, apr. 1996.
QMCWEB. Corantes: A química nas cores. Revista eletrônica de química. Ano
4:
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
56
Disponível em: <http://quark.qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/dye/corantes.html>
Acesso em: 10 jan. 2005.
RISMAYANI, S. et al. Decolorization of orange II by catalytic oxidation using iron
(III) phthalocyanine-tetrasulfonic acid. J. Hazard. Mater., Amsterdam, v.114, n.1-
3, 175-181, oct. 2004.
ROBINSON, T., et al. Remediation of dyes in textile effluent: a critical review on
current treatment technologies with a proposed alternative. Bioresour. Technol., Essex, v.77, n.3, p.247-255, may. 2001.
ROBINSON, T., et al. Studies on the removal of dyes from a synthetic textile
effluent using barley husk in static-batch mode and in a continuous flow, packed-
bed, reactor. Bioresour. Technol., Essex, v.85, n.1, p.43-49, oct. 2002.
RUSS, R.; RAU, J.; STOLZ, A. The function of cytoplasmic flavin reductases in the
reduction of azo dyes by bacteria. Appl. Environ. Microbiol., Washington, v.66,
n.4, p.1429-1434, apr. 2000.
SALIBA, R., et al. The use of eucalyptus barks for the adsorption of heavy metal
ions and dyes. Adsorp. Sci. Technol., Essex, v.20, n.2, p.119-129, mar. 2002.
SANT’ANNA, J.P. Têxtil. Química e Derivados. Disponível em:
<http://www.quimica.com.br/revista/qd423/textil1.htm>. Acesso em 12 jan. 2005.
SARASA, J., et al. Treatment of a wastewater resulting from dyes manufacturing
with ozone and chemical coagulation. Water Res., New York, v.32, n. 9, p.2721-
2727, sep. 1998.
SARNAIK, S.; KANEKAR, P. Biodegradation of methyl Violet by Pseudomonas
mendocina MCM B-402. Appl. Microbiol. Biotechnol., New York, v.52, n.2,
p.251-254, aug. 1999.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
57
SELVAM, K.; SWAMINATHAN, K.; CHAE, K.S. Microbial decolorization of azo
dyes and dye industry by Fomes lividus. World J. Microbiol. Biotechnol., Oxford,
v.19, n.6, p.591-593, aug. 2003.
SENAN, R.C., et al. Aerobic degradation of a mixture of azo dyes in a packed bed
reactor having bacteria-coated laterite pebbles. Biotechnol. Prog., New York,
v.19, n.2, p.647-651, mar.-apr. 2003.
SESHADRI, S.; BISHOP, P.L.; AGHA, A.M. Anaerobic/aerobic treatment of
selected azo dyes in wastewater. Waste Manag., Oxford, v.14, n.2, p.127-137, jul.
1994.
SILVA, J.P., et al. Adsorption of acid orange 7 dye in aqueous solutions by spent
brewery grains. Separ. Purif. Technol., Amsterdam, v.40, n.3, p.309-315, dec.
2004.
SLOKAR, Y.M.; Le MARECHAL, M. Methods of decoloration of textile
wasterwaters. Dyes Pigm., Oxford, v.37, n.4, p.335-356, may. 1998.
SONE, N.; TSUKITA, S.; SAKAMOTO, J. Direct correlationship between proton
translocation and growth yield: an analysis of the respiratory chain of Bacillus
stearothermophilus, J. Biosci. Bioeng., Osaka, v.87, n.4, p.495-499, jul. 1999.
SOUZA, A.N.; MARTINS, M.L.L. Isolation, properties and kinetics of growth of a
thermophilic Bacillus. Braz. J. Microbiol., São Paulo, v.32, n.4, p.271-275, oct.-
dec. 2001.
SPONZA, D.T.; ISIK, M. Decolorization and inhibition kinetic of Direct Black 38 azo
dye with granulated anaerobic sludge. Enzyme Microb. Technol., New York,
v.34, n.2, p.147-158, feb. 2004.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
58
STOLZ, A.; Basic and applied aspects in the microbial degradation of azo dyes.
Appl. Microbiol. Biotechnol., New York, v.56, n.1-2, p.69-80, jul. 2001.
SUMATHI, S.; MANJU, B.S. Uptake of reactive textile dyes by Aspergillus
foetidus. Enz. Microb. Technol., New York, v.27, n.6, p.347-352, sep. 2000.
SUN, G.; XU, X. Sunflower stalks as adsorbents for colour removal. Ind. Eng. Chem. Res., Washington, v.36, n.3, p.808-812, mar. 1997.
TEIXEIRA, J. Têxtil. Química e Derivados, v. 412, fev. 2003. Disponível em:
< http://www.quimica.com.br/indice2003.htm >. Acesso em 22 de abril de 2005.
TOLEDO, M.R.F.; TRABULSI, L.R. Pseudomonas. In: LUIZ RICHAD TRABULSI
et al. (Eds.). Microbiologia. 3 ed., São Paulo: Atheneu, 1999. Cap. 36, p.269-271.
TORANZOS, G.A.; McFETERS, G.A. Detection of indicator microorganisms in
envirionmental freshwaters and drinking waters. In: CHRISTON J. HURST et al.
(Eds.). Manual of Environmental Microbiology. American Society for
Microbiology: Washington. 1996, Cap. 19, p. 184-194.
TRUNG, T.S.; NG, C.-H.; STEVENS, W.F. Characterization of decrystallized
chitosan and application in biosorption of textile dyes. Biotechnol. Lett., Dondrecht, v.25, n.14, p.1185-1190, jul. 2003.
TUNUSSI, J.L.; ALEM SOBRINHO, P. Remoção de cor e nitrificação de efluentes
de tinturaria têxtil através de processos biológicos anaeróbio-aeróbio. In: XXVIII
Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental da AIDIS.
Anais... Cancun: México. 2002.
UZUN, I. Kinetics of the adsorption of reactive dyes by chitosan. Dyes Pigm., Oxford, v.70, n.2, p.76-83, jun. 2006.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
59
VAN DER ZEE, F.P.; VILLAVERDE, S. Combined anaerobic-aerobic treatment of
azo dyes - a short review of bioreactor studies. Water Res., New York, v.39, n. 8,
p.1425-1440, apr. 2005.
VANDEVIVERE, P.C.; BIANCHI, R.; VERSTRAETE, W. Treatment and reuse of
wastewater from the textile wet processing industry: review of emerging
technologies. J. Chem. Technol. Biotechnol., Oxford, v.72, n. 4, p.289-302, aug.
1998.
VERMA, P.; MADAMWAR, D. Decolorization of azo dyes using Basidiomycete
strain PV 002. World J. Microbiol. Biotechnol., Oxford, v.21, n. 4, p.481-485,
jun. 2005.
VIJAYA, P.P.; SANDHYA, S. Decolorization and complete degradation of methy
red by a mixed culture. The Environmententalist, Hampshire, v.23, n.2, p.145-
149, jun. 2003.
WALKER, G.M.; WEATHERLEY, L.R. Biodegradation and biosorption of acid
anthraquinone dye. Environ. Pollut., Barking, v.108, n.2, p.219-223, may. 2000.
WANG, Y.; YU, J. Asorption and degradation os synthetic dyes on the mycelium of
trametes versicolor. Water Sci. Technol., Oxford, v.38, p.233-238, 1998.
WIGTMAN, P.G.; FEIN, J.B. The effect of bacterial cell wall adsorption on mineral
solubilities. Chem. Geol., Amsterdam, v.212, n.3-4, p.247-254, dec. 2004.
WONG, P.K.; YUEN, P.Y. Decolorization and biodegradation of methyl red by
Klebsiella pneumoniae RS 13. Water Res., New York, v.30, n.7, p.1736-1744, jul.
1996.
YOO, E.S.; LIBRA, J.; ADRIAN, L. Mechanism of decolorization of azo dyes in
anaerobic mixed culture. J. Environ. Eng., New York, v.127, n.9, p.844-849, sep.
2001.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
60
ZANONI, M.V.B., CARNEIRO, P.A. O descarte dos corantes têxteis. Ciência Hoje, São Paulo, v.29, n.174, p.61-64, ago. 2001.
ZIMMERMANN, T.; KULLA, H.G.; LEISINGER, T. Properties of purified orange II
azoreductase, the enzyme initiating azo dye degradation by Pseudomonas KF46.
Eur. J. Biochem., Berlin, v.129, n.1, p.197-203, mar. 1982.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
61
PRIMEIRO ARTIGO
Descoloração do Azo Corante Alaranjado II por Geobacillus
stearothermophilus (UCP 986) sob Condições de Co-metabolismo
Manuscrito a ser submetido para publicação no periódico
International Biodeterioration and Biodegradation
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
62
Descoloração do Azo Corante Alaranjado II por Geobacillus
stearothermophilus (UCP 986) sob Condições de Co-metabolismo
Norma S. Evangelista-Barretoa, Clarissa D. Albuquerqueb, Regine Helena
S.F. Vieirac, G.M. Campos-Takakid*
aPrograma de Pós-graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco, Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, 50.670-901
Recife, PE, Brasil e Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, Universidade
Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50.050-590,
Recife, PE, Brasil. E-mail: [email protected]
bDepartamento de Estatística e Informática e Núcleo de Pesquisa em Ciências
Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa
Vista. 50.050-590, Recife, PE, Brasil. E-mail: [email protected]
cDepartamento de Engenharia de Pesca e Instituto de Ciências do Mar-
LABOMAR, Universidade Federal do Ceará, Av. Abolição, 3207, Meireles, 60.165-
081, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail: [email protected] *dDepartamento de Química e Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais,
Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista.
50.050-590, Recife, PE, Brasil. Tel.: +55-81-2119.4017 Fax: +55-81-2119.4043.
E-mail: [email protected]
Parte dos resultados foram publicados no livro de resumos do 2nd International
Symposium in Biochemistry of Macromolecules and Biotechnology-SBBq. UFPE-
Recife-PE (17-19/11/2004)
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
63
RESUMO
A descoloração do azo corante Alaranjado II usando Geobacillus
stearothermophilus (UCP 986), foi realizada sob diferentes condições de cultivo,
de acordo com um planejamento fatorial 24, que teve como variáveis
independentes, a agitação, concentração do corante, tamanho do inóculo e meio
de cultura, e como variável resposta, a descoloração do corante. O experimento
foi realizado por 24 h a 50ºC. Nestas condições, observou-se que o meio Luria
Bertani (LB) e a agitação aumentaram a eficiência de descoloração, com remoção
da cor de 96-98%, quando comparado ao meio extrato de levedura-peptona (YP)
(43-61%). A eficiência do meio LB na redução da cor se deve ao processo de co-
metabolismo, pela presença da glicose, que foi consumida com 15 h de cultivo. O
pH do meio variou de 5,0 a 6,5. Ácido sulfanílico, uma amina formada durante a
clivagem do azo corante, não foi encontrada. Bioensaios usando Artemia salina
mostraram que metabólitos mais tóxicos que o composto pai, não foram
formados, com exceção do ensaio 13 (meio LB, corante 0,050 mM, inóculo 1 mL e
agitação 150 rpm), que apresentou uma CL50 de 49,28% v.v-1. Os resultados
obtidos demonstram que as variáveis meio e agitação são significativas no
processo de descoloração do Alaranjado II e que G. stearothermophilus (UCP
986) apresenta grande potencial biotecnológico na descoloração de corantes
têxteis, em condições de co-metabolismo.
Palavras-chave: Geobacillus stearothermophilus, biodegradação, corante têxtil,
toxicidade, co-metabolismo.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
64
Introdução
Os azo corantes são extensamente usados na indústria de acabamento têxtil,
constituindo aproximadamente 50% dos corantes produzidos e assim, tendo
grande interesse no tratamento de efluentes aquáticos (Manu & Chaudhari, 2003;
Sponza & Isik, 2004). A elevada solubilidade destes compostos resulta em baixa
fixação da cor durante o processo de tingimento, lançando alta descarga colorida
diretamente no ambiente (Oxpring et al., 1996; Panswad & Luangdilok, 2000).
Devido à natureza sintética dos corantes e sua estrutura química complexa, as
moléculas dos corantes permanecem por longos períodos na natureza. Os azo
corantes constituem a maior classe de corantes sintéticos, sendo caracterizados
por sua típica ligação -N=N- (Manu & Chaudhari, 2003). Estes compostos
recalcitrantes podem causar sérios problemas ambientais, devido à formação de
compostos carcinogênicos ou mutagênicos.
No ambiente natural, os azo corantes podem ser transformados ou degradados
por uma variedade de microrganismos, incluindo bactérias e fungos aeróbios e
anaeróbios (Banat et al., 1996; Chang & Kuo, 2000), sob condições mesófilas
(Chen, 2002) ou termofílicas (Banat et al., 1997). Os microrganismos são
particularmente úteis na degradação dos corantes, porque apresentam
capacidade de clivagem redutiva nas ligações azo, fato este geralmente
associado às enzimas azoredutases (Kunz et al., 2002). As bactérias têm sido
citadas como uma aplicação promissora no tratamento de efluentes têxteis,
devido aos custos de investimento que são de cinco a vinte vezes menores que
em alguns processos de tratamentos químicos, como por exemplo, o ozônio ou
peróxido de hidrogênio (Marco & Esplugas, 1997).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
65
O tratamento anaeróbico geralmente apresenta bons resultados na remoção da
cor (Santos et al., 2003), no entanto, estes microrganismos não conseguem
completa mineralização dos compostos (Field et al., 1995). Sob condições
aeróbicas, baixa remoção da cor é alcançada porque o oxigênio é um aceptor de
elétrons mais eficiente, conseqüentemente, tem maior afinidade por parte dos
elétrons do que os corantes (Stolz, 2001). No entanto, a descoloração aeróbica
tem sido relatada por diversos pesquisadores (Jian & Bishop, 1994; Padmavathy
et al., 2003; Kodam et al., 2005).
Por outro lado, nos últimos anos, diversos trabalhos publicados relataram
alguns fatores que podem afetar a remoção dos corantes sintéticos durante o
processo de descoloração microbiana. Dentre eles, os fatores nutricionais (fontes
de carbono e nitrogênio) e fatores físicos (temperatura, agitação e pH, dentre
outros) podem influenciar na degradação dos azo corantes (Chang & Kuo, 2000,
Mielgo et al., 2001).
Considerando que a descoloração dos azo corantes pode ser influenciada por
diversos fatores com variados graus de importância, neste trabalho utilizou-se um
planejamento fatorial para realizar uma triagem dos vários fatores potencialmente
importantes usando o termofílico Geobacillus stearothermophilus (UCP 986). O
corante escolhido foi o ácido Alaranjado 7 (AO7) também conhecido como
Alaranjado II, que é intensamente usado no tingimento têxtil, alimentos e
cosméticos, estando presente nos efluentes de manufaturamento (Mendez-Paz et
al., 2005).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
66
Material e Métodos
Microrganismo: Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) isolado de efluente
de lodo têxtil na indústria Suape Têxtil, Pernambuco, faz parte do Banco de
Culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais da UNICAP (Recife-
PE, Brasil). A manutenção era realizada em meio Agar nutriente, com repiques
mensais e mantida sob refrigeração a 5ºC.
Corante: corante do tipo azo reativo, Alaranjado II (C.I. 15510) (Figura 1) foi
adquirido da Sigma (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA). Uma
solução estoque do corante (3 mM) foi preparada dissolvendo o corante em água
deionizada esterilizada. Esta solução foi previamente filtrada em filtro de vidro
com membrana Millipore (0,22 µm).
Meios de cultivo: o microrganismo foi crescido em meio Luria Bertani (LB)
(Chang et al., 2001a), com a seguinte composição (g L-1): triptona 10, extrato de
levedura 5, NaCl 10. Para o cultivo das amostras, foi utilizado LB suplementado
com glicose (5 g L-1) (Konishi et al., 1997) e caldo YP com a seguinte composição
(g L-1): extrato de levedura 10, peptona 10, NaCl 2 (Ikeuchi et al., 2003). Ambos
com pH 7,0 ± 0,2.
Métodos microbiológicos
Condições de cultivo: Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) foi cultivado
em 100 mL de caldo LB em frasco Erlenmeyer de 250 mL de capacidade,
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
67
incubado por 12 h sob agitação orbital a 150 rpm, resultando em uma cultura 106
UFC mL-1, que serviu como pré-inóculo. Em seguida, 1 e 4 mL foram transferidos
para frascos Erlenmeyers com capacidade de 500 mL, contendo 150 mL do meio
de cultura e o corante, de acordo com as combinações descrita no planejamento
fatorial (Tabela 1). O experimento foi realizado por 24 h a temperatura de 50ºC.
Viabilidade celular: foi realizada através da técnica “pour plate”, usando como
meio inoculante Agar nutriente. A contagem era realizada com o auxílio de um
contador de colônias após incubação a cada 24 h.
Procedimentos analíticos
Determinação do consumo de glicose e pH: a determinação do pH e o
consumo de glicose foram determinados no líquido metabólico livre de células. O
consumo de glicose foi determinado através do método enzimático colorimétrico
glicose-oxidase kit Labtest®, utilizando uma solução de glicose (100 mg dL-1)
como padrão e medido espectrofotometricamente a 505 nm.
Descoloração do azo corante: para determinação da descoloração, as amostras
foram submetidas à centrifugação de 10.000 g por 8 minutos, para separação das
células do líquido metabólico. A concentração do meio contendo o corante foi
avaliada pela diminuição da absorbância, empregando espectrofotômetro UV-VIS
(Espectronic Gênesis modelo 2). O comprimento de onda era fixado pela
absorção máxima do corante na região do visível, a 485 nm. A concentração do
corante foi calculada pela seguinte fórmula:
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
68
Remoção da cor (%) = (A) – (B) x 100
(A)
onde, (A) indica a absorbância do caldo não inoculado e (B) indica a absorbância
residual do caldo.
Análise dos produtos de degradação: após o período de descoloração, o
sobrenadante foi separado da biomassa por centrifugação (4500 rpm 15 min/4ºC)
e submetido à extração com acetato de etila (3 vezes de 130 mL). O extrato
obtido foi seco com Na2SO4 anidro e concentrado em rotaevaporador (Cha et al.,
2001). Os produtos concentrados foram analisados por cromatografia líquida de
alta performance (HPLC) (Varian, USA) utilizando uma coluna de fase reversa
(4,6 mm x 150 mm, Microsorb-MVTM C18, Creek, CA USA). A eluição foi realizada
em sistema de solvente isocrático composto por metanol e água (30:70), com
fluxo de 0,5 mL min-1 (Mendez-Paz et al., 2005). Os produtos foram monitorados a
254 nm com detector UV-VIS. A presença do ácido sulfanílico foi detectada a
partir do padrão (F-Maia, Brasil). Os reagentes analíticos usados apresentavam
grau cromatográfico (Sigma-Aldrich Chemical, USA).
Efeito da toxicidade pelos metabólitos do corante
Os testes de toxicidade foram realizados nos ensaios 9, 10, 13 e 14 após a
descoloração do Alaranjado II, usando o bioindicador Artemia salina. O bioensaio
foi baseado apenas na porcentagem de morte dos organismos em relação ao seu
número total (10 larvas), na presença de diferentes concentrações das amostras
(17, 33, 67 e 83%), diluídas em 5 mL de uma solução aquosa de sal marinho
sintético (30 g L-1) por 24 h. Neste método o volume máximo da amostra teste
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
69
deve ser de 1,5 mL (McLaughlin et al. (1985). Em seguida, foi realizada a
contagem dos organismos sobreviventes, determinando-se a dose limite do
poluente (CL50). Os testes foram realizadas em triplicata.
Planejamento fatorial: realizou-se um planejamento fatorial completo 24 sem
ponto central (Tabela 1), para analisar os efeitos e interações das variáveis
independentes: tamanho do inóculo, tipo de meio (co-substrato), concentração do
corante e agitação, sobre a descoloração do Alaranjado II. A estimativa do erro foi
calculada pelas quatro repetições. Todos os resultados foram analisados
utilizando o programa STATISTICA versão 5.0 da Statsoft, USA.
Resultados e Discussão
Condições de cultivo
A descoloração usando G. stearothermophilus (UCP 986) foi realizada durante
24 h em diferentes condições de cultivo, de acordo com as combinações
determinadas pelo planejamento fatorial 24. O planejamento foi utilizado para
avaliar os efeitos principais e interações das quatro variáveis escolhidas (tipo de
meio, concentração do corante, tamanho do inóculo e faixa de agitação), sobre a
variável resposta, porcentagem de descoloração do Alaranjado II. Os níveis
inferior e superior do planejamento foram escolhidos de acordo com estudos que
investigaram condições que favorecem o processo de descoloração dos corantes
sintéticos usando diferentes microrganismos (Padmavathy et al., 2003, Ambrósio
& Campos-Takaki, 2004, Fang et al., 2004).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
70
Dos vinte ensaios realizados, a maior porcentagem de descoloração foi
observada nos ensaios 9, 10, 13 e 14, que se encontravam no nível -1 para o tipo
de meio e nível +1 para a faixa de agitação. Nestas condições, a taxa de
descoloração alcançada foi de 96-98% (Tabela 1), sugerindo a clivagem redutiva
do corante.
De acordo com o Diagrama de Pareto (Figura 2), cálculo dos efeitos principais
e de interações entre os fatores investigados, se observa que dentre as variáveis
independentes utilizadas, o tipo de meio e a agitação são estatisticamente
significativos no processo de descoloração do azo corante, para um nível de 95%
de confiança. O efeito negativo do meio indica que esta variável deve ser utilizada
em seu nível inferior (-1), enquanto, a passagem da agitação do nível -1 para o
nível +1, exerceu um efeito positivo no processo de descoloração do corante.
As demais variáveis (concentração do corante e tamanho do inóculo), embora
tenham exercido um efeito positivo no processo de descoloração, devendo ser
usadas em seu nível superior (+1), não foram estatisticamente significativas,
sugerindo que G. stearothermophilus pode ser testado numa faixa de
concentração do corante maior. Com relação às interações das variáveis,
observa-se que somente as interações meio-agitação e inóculo-agitação
apresentaram significado estatístico, embora com efeito negativo (Figura 2).
Segundo Padmavathy et al. (2003) é importante conhecer se os
microrganismos que descolorem os azo corantes podem suportar elevadas
concentrações desses compostos, visto que, a concentração de corantes em um
típico efluente industrial varia em torno de 10-50 mg L-1.
Neste trabalho verificou-se que a utilização do LB foi o principal responsável
pelo aumento na taxa de descoloração do Alaranjado II. Observou-se ainda, que
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
71
nessas condições, o processo de descoloração foi influenciado principalmente,
pela agitação, mostrando que a remoção da cor pelo microrganismo depende do
ambiente rico em oxigênio e do co-substrato utilizado. Estes resultados são
semelhantes aos observados por Fang et al. (2004) ao estudarem a descoloração
do azo corante Direto Fast Scarlet (4BS) usando uma cultura de um fungo da
podridão branca (fungos 8-4) e observaram que a presença do oxigênio através
da agitação, aumentou a taxa de remoção do corante.
A utilização de co-substratos atua inicialmente como doador de elétrons, sendo
importante não somente para melhorar a taxa de remoção da cor, mas também
fornecer a manutenção dos microrganismos termofílicos (Santos et al., 2004).
Para Padmavathy et al. (2003) a descoloração dos azo corantes reativos
Vermelho RB e Vermelho Remazol usando glicose como co-substrato, contribuiu
para uma descoloração de 91-94%.
A cultura de G. stearothermophilus quando regulada no nível inferior (-1), para
meio e agitação, (ensaios 1, 2, 5 e 6) a descoloração visivelmente diminuiu (55-
61%). Nos ensaios contendo o meio YP como co-substrato em ambos os níveis, a
taxa de descoloração do corante foi menor (33-61%) (Tabela 1).
A ausência de glicose no meio YP contribuiu para que a taxa de descoloração
do corante visivelmente diminuísse. Segundo Santos et al. (2004), a atividade
metabólica de um inóculo termofílico induziu a redução do azo corante reativo
Vermelho 2, indicando domínio do processo biótico. Por outro lado, devido a
temperatura elevada do efluente (40 a 60oC), a utilização de microrganismos
termofílicos torna-se um método apropriado ao sistema de biotransformação.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
72
Cinética de crescimento de G. stearothermophilus
A partir dos melhores resultados obtidos no planejamento fatorial (ensaios 9,
10, 13 e 14), realizou-se outro experimento a fim de observar a cinética de
crescimento de G. stearothermophilus. Nestes ensaios, remoção da cor, pH,
consumo de glicose e crescimento celular, foram observados nos intervalos de 4,
8, 15, 20, 24, 28, 32 e 48 h.
A melhor taxa de descoloração (99%) foi observada no ensaio 13 com 15 h de
cultivo. Nestas condições, o inóculo era menor (1 mL) e a concentração do
corante maior (0,050 mM). Nos ensaios 10 e 13 re-coloração do meio foi
observada (Figura 3).
A re-coloração do meio pode ser justificada pelo processo de dessorção ou
ego-polimerização da molécula do corante. Ambrósio & Campos-Takaki (2005)
estudando a descoloração de uma mistura de corantes por Cunninghamella
elegans (UCP 542), também observaram um processo de re-coloração do meio
após 96 h de cultivo. Segundo os autores, este fato ocorreu devido à degradação
dos corantes adsorvidos, desde que se observou deslocamento espectral
significativo nas regiões de 500 para 400 nm.
O crescimento de G. stearothermophilus, apresentou uma fase lag nas
primeiras 8 h de cultivo, seguido de uma fase estacionária (8-48 h) e uma fase de
declínio após 48 h (ensaios 10 e 13) (Figura 3). As maiores taxas de descoloração
foram observadas durante a fase estacionária. Nesses ensaios, a velocidade
média específica de crescimento foi de (µmax) 0,62 h-1 e o tempo de geração (TG)
1,13 h. Segundo Chen (2002), a descoloração não é associada ao crescimento
celular, mas ainda assim é dependente da atividade metabólica.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
73
O catabolismo da glicose aumentou a eficiência de remoção do azo corante.
Isto foi observado no ensaio 14, que com 8 h de cultivo, já havia metabolizado
mais de 70% da glicose, com remoção da cor de 73% (Figuras 3). Resultados
semelhantes foram obtidos por Buitron et al. (2004), ao citarem que a ocorrência
do catabolismo microbiano em condições aeróbicas promoveu a biodegradação
do Ácido Vermelho 151, pela clivagem bioquímica nas ligações azo, através de
seus metabólitos secundários produzidos.
Embora, os metabólitos formados durante o processo de remoção da cor não
descolore diretamente os azo corantes, os mesmos podem agir como mediador
redox, aumentando a eficiência de descoloração dos compostos azo (Keck et al.,
1997). A presença de mediadores redox (metabolicamente formados) na redução
eficaz dos azo corantes foi demonstrada por Haug et al. (1991) quando
observaram que uma linhagem de Sphingomonas sp. BN6 era capaz de
metabolizar pequenas quantidades de glicose sob condições anaeróbicas,
formando metabólitos com habilidade redox.
Assim, é provável que o Alaranjado II foi descolorido por reação redutiva,
através de co-metabolismo, resultando na clivagem da ligação azo. Biosorção
inicial também foi observada, uma vez que a biomassa do microrganismo se
apresentou colorida. Tais interações ocorrem devido às diferenças de cargas na
parede celular do microrganismo e corante.
A biosorção pode ser atribuída ao pH ácido (5,2) (Figura 4). A diminuição do pH
inicial se deve a formação de ácidos orgânicos, provenientes do metabolismo da
glicose. Segundo Ong et al. (2005) à adsorção pela biomassa microbiana
aumentou a remoção do Alaranjado II usando um reator anaeróbico de manta de
lodo (USBR) e reator de fluxo contínuo (SBR).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
74
Chang et al. (2001b) relataram que embora o efeito de adsorção exerça um
importante papel na dinâmica de descoloração durante a fase inicial,
transformação enzimática dos microrganismos pode dominar e conduzir a
completa remoção da cor. Para Walker & Weatherley (2000) a remoção da cor
pelo processo de biosorção usando biomassa de Bacillus sp. foi responsável por
19% da descoloração do corante Ácido Antraquinona.
Durante todo o cultivo, o pH variou entre 5,0 - 6,5. Os ensaios 9, 10 e 13
apresentaram um pH ao redor de 5,0, enquanto o ensaio 14, apresentou pH 6,5
(Figura 3).
Produtos da degradação
A análise por HPLC quanto à formação de metabólitos intermediários durante
a descoloração do Alaranjado II foi investigado nas amostras 9, 10, 13 e 14, após
extração com acetato de etila. O pico correspondente ao ácido sulfanílico (tempo
de retenção de 3,5 min, no padrão), não foi detectado, indicando a completa
remoção desta amina. A presença de 1-amino-2-naftol, outra amina gerada, não
pôde ser observada. Resultados semelhantes também foram encontrados por Hu
(1994) ao relatar a ausência de ácido sulfanílico, na descoloração dos azo
corantes Vermelho G, RP2B e V2RP, usando Pseudomonas luteola, sob
condições de agitação e repouso.
Efeito da toxicidade dos metabólitos do corante
O ensaio de letalidade permite a avaliação da toxicidade geral e, portanto, é
considerado essencial como bioensaio preliminar no estudo de compostos com
potencial atividade biológica (Cavalcante et al., 2000).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
75
Após o período de descoloração, teste de toxicidade foi realizado nos ensaios
9, 10, 13 e 14, utilizando o bioindicador A. salina. A Figura 4 mostra a
porcentagem de mortalidade para A. salina, após exposição com as amostras
descoloridas por 24 h e comparadas ao controle (contendo apenas água do mar).
O ensaio 13 (meio LB, corante 0,050 mM, inóculo 1 mL e agitação 150 rpm),
responsável pela maior descoloração com 15 h, apresentou maior toxicidade, com
mortalidade de 67 a 100%. Os demais ensaios apresentaram baixas taxas de
mortalidade (< 10%). Somente o ensaio 10 apresentou uma mortalidade de 37%,
na concentração da amostra de 67%.
O valor da CL50 (concentração que causa 50% de mortalidade) foi calculada
pelo método de Trimmed Spearman-Karber (Youn-Joo, 2006). No entanto,
apenas a amostra 13 pôde ter a CL50 calculada segundo este método, uma vez
que as demais amostras apresentaram baixo percentual de mortalidade. A CL50
da amostra 13 foi de 49,28% (v.v-1), com uma faixa de variação de 43,13 e
56,30%, para um intervalo de confiança 95%. O teste controle, indicou que as
larvas não foram afetadas. Amostras não tratadas também foram testadas,
apresentando uma mortalidade inferior a 10%.
Segundo Ambrósio & Campos-Takaki (2004) inibição em mais de 60% foi
observada na respiração de Escherichia coli durante a descoloração do azo
corante Alaranjado II usando C. elegans. Kundu et al. (1989) estudando a
toxicidade de corantes diluídos de efluentes industriais usando o lagostim
Paraopenaopsis sculptilis, observaram que a natureza físico-química do efluente
causava uma mortalidade de 100%, na concentração de 1%.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
76
Conclusões
A aplicação do planejamento fatorial demonstra que das quatro variáveis
utilizadas, somente duas (meio mais glicose e agitação), parecem afetar
significantemente o processo de descoloração do Alaranjado II usando G.
stearothermophilus. A presença da glicose como co-substrato aumenta a
eficiência de descoloração do corante em mais de 35%. A ausência de ácido
sulfanílico, uma amina gerada durante a clivagem da molécula não foi encontrada,
sugerindo a degradação do Alaranjado II. A descoloração do azo corante por G.
stearothermophilus não forma metabólitos tóxicos.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Prof. Dr. Nelson Duran e Lívia Cordi (Laboratório de
Química Biológica, UNICAMP, SP) pelos testes de toxicidade. Ao Dr. Ricardo
Kenji Shiosaki (NPCIAMB, UNICAP, PE) pelas análises de HPLC. Agradecemos
também a agência financiadora CNPq e FINEP/CTPETRO e FACEPE pelo
suporte financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.
Referências Ambrósio, S.T., Campos-Takaki, G.M., 2004. Decolorization of reactive azo dyes
by Cunninghamella elegans UCP 542 under co-metabolic conditions. Bioresource
Technology 91, 69-75.
Banat, I.M., Nigam, P., Singh, D., Marchant, R., 1996. Microbial descolorization of
textile-dye-containing effluents: a review. Bioresource Technology 58, 217-227.
Banat, I.M., Nigam, P., McMullan, G., Marchant, R., 1997. The isolation of
thermophilic bacterial cultures capable of textile dyes decolorization. Environment
International 23, 547-551.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
77
Buitron, G., Quezada, M., Moreno, G., 2004. Aerobic degradation of the azo dye
acid red 151 in a sequencing batch biofilter. Bioresource Technology 92, 143-149.
Cavalcante, M.F., Oliveira, M.C.C., Velandia, J.R., Echevarria, A., 2000. Síntese
de 1,3,5-triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente a Artemina salina
Leach. Química Nova 23, 20-22.
Cha, C.J., Doerge, D.R., Cerniglia, C.E., 2001. Biotransformation of malachite
green by fungus Cunninghamella elegans. Applied and Environmental
Microbiology 67, 4358-4360.
Chang, J.-S., Kuo, T.-S., 2000. Kinetics of bacterial decolorization of azo dye with
Escherichia coli NO3. Bioresource Technology 75, 107-111.
Chang, J-S., Chou, C., Lin, Y-C., Lin, P-J., Ho, J-Y., Hu, T-L., 2001a. Kinetic
characteristics of bacterial azo-dye decolorization by Pseudomonas luteola. Water
Research 35, 2481-2850.
Chang, J.-S., Chien, C., Chen, S.-Y., 2001b. Decolorization of azo dyes with
immobilized Pseudomonas luteola. Process Biochemistry 36, 757-763.
Chen, B.-Y., 2002. Understanding decolorization characteristics of reactive azo
dyes by Pseudomonas luteola: toxicity and kinetics. Process Biochemistry 38,
437-446.
Fang, H., Werong, H., Yuezhong, L., 2004. Investigation of isolation and
immobilization of a microbial consortium for decoloring of azo dye 4BS. Water
Research 38, 3596-3604.
Field, J.A., Stams, A.J.M., Kato, M., Schraa, G., 1995. Enhanced biodegradation
of aromatic pollutants in co-cultures of anaerobic and aerobic bacterial consortia.
Antonie van Leeuwenhoek 67, 47-77.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
78
Haug, W., Schmidt, A., Nortemann, B., Hempel, D.C., Stolz, A., Knackmuss, H.-J.,
1991. Mineralization of the sulfonated azo dye mordant yellow 3 by 6-
aminonaphthalene-2-sulfonate-degrading bacterial consortium. Applied and
Environmental Microbiology 57, 3144-3149.
Hu, T.L., 1994. Decolourization of reactive azo dyes by transformation with
Pseudomonas luteola. Bioresouce Technology 49, 47-51.
Ikeuchi, T., Ishida, A., Tajiri, M., Nagata, S., 2003. Induction of salt tolerance in
Bacillus subtilis IFO 3025. Journal of Bioscience and Bioengineering 96, 184-186.
Jian, H., Bishop, P.L., 1994. Aerobic biodegradation of azo dyes in biofilms. Water
Science Technology 29, 525-530.
Keck, A., Klein, J., Kudlich, M., Stolz, A., Knackmuss, H.-J., Mattes, R.A., 1997.
Reduction od azo dyes by redox mediadors originating in the naphthalenesulfonic
acid degradation pathway of Sphingomonas sp. strain BN6. Applied and
Environmental Microbiology 63, 3684-3690.
Kodam, K.M., Soojhawon, I., Lokhande, P.D., Gawai, K.R., Microbial
decolorization of reactive azo dyes under aerobic conditions. World Journal of
Microbiology and Biotechnology 21 (2005), 367-370.
Konishi, J., Ishi, Y., Onaka, T., Okumura, K., Suzuki, M., 1997. Thermophilic
carbon-sulphur-bond-targeted biodesulfurization. Applied and Environmental
Microbiology 63, 3164-3169.
Kundu, R., Prasad, V.V.S., Mansuri, A.P. 1989. Toxicity of diluted dyeing and
printing industry effluent to a penaied prawn Parapenaopsis soulptilis. Acta
Hydrochimica Hydrobiologica 17, 87-93.
Kunz, A., Peralta-Zamora, P., Moraes, S.G., Durán, N., 2002. Novas tendências
no tratamento de efluentes têxteis. Química Nova 25, 73-82.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
79
McLaughlin, J.L., Saizarbitoria, T.C., Anderson, J.E., 1985. Tres biosensayos
simples para químicos de produtos naturales. Revista de la Sociedad Venezolana
de Química 18, 13-18.
Manu, B., Chaudhari, S., 2003. Decolorization of indigo and azo dyes in
semicontinuous reactors with long hydraulic retention time. Process Biochemistry
38, 1212-1221.
Marco, A., Esplugas, S., Saum, G., 1997. Howand why combine chemical and
biological processes for wastewater treatment. Water Science Technology 35,
321-327.
Mendez-Paz, D., Omil, F., Lema, J.M., 2005. Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under fed-batch and continuous conditions. Water Research 39, 771-
778.
Mielgo, I., Moreira, M.T., Feijoo, G., Lema, J.M., 2001. A packed-bed fungal
bioreactor for the continuous decolourisation of azo-dyes (Orange II). Journal of
Biotechnology 89, 99-106.
Ong, S., Toorisaka, E., Hirata, M., Hano, T., 2005. Decolorization of azo dye
(Orange II) in a sequential UASB-SBR system. Separation and Purification
Technology 42, 297-302.
Oxspring, D.A., McMullan, G., Franklyn, W., Merchant, R., 1996. Decolourisation
and metabolism of the reactive textile dye, remazol Black B, by an immobilized
microbial consortium. Bioctechnology Letters 18, 527-530.
Padmavathy, S., Sandhya, S., Swaminathan, K., Subrahmanyam, Y.V.,
Chakrabarti, T., Kaul, S.N., 2003. Aerobic decolorization of reactive azo dyes in
presence of various cosubstrates. Chemical and Biochemical Engineering
Quarterly 17, 147-151.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
80
Panswad, T., Luangdilok, W., 2000. Decolorization of reactive dyes with different
molecular structures under different environmental condition. Water Research 34,
4177-4184.
Santos, A.B., Cervantes, F.J., Yaya-Beas, R.E., Van Lier, J.B., 2003. Effect of
mediator AQDS, on the decolourisation of a reactive azo dye containing triazine
group in a thermophilic anaerobic EGSB reactor. Enzyme Microbiology
Technology 33, 942-951.
Santos, A.B., Cervantes, F.J., Van Lier, J.B., 2004. Azo dye reduction by
thermophilic anaerobic granular sludge, and the impact of the redox mediator
anthaquinone-2,6-disulfonate (AQDS) on the reductive biochemical
transformation. Applied and Microbiology Biotechnology 64, 62-69.
Sponza, D.T., Isik, M., 2004. Decolorization and inhibition kinetic of Direct Black
38 azo dye with granulated anaerobic sludge. Enzyme Microbial Technology 34,
147-158.
Stolz, A., 2001. Basic and applied aspects in the microbial degradation of azo
dyes. Applied Microbiology and Biotechnology 56, 69-80.
Walker, G.M., Weatherley, L.R., 2000. Biodegradation and biosorption of acid
anthraquinone dye. Environmental Pollution 108, 219-223.
Youn-Joo, A., 2006. Assessment of comparative to toxicities of lead and copper
using plant assay. Chemosphere, 62, 1359-1365.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
81
Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 24 em relação à resposta de
descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus stearothermophilus
UCP 986, após 24 horas de cultivo a 50ºC
Níveis dos fatoresa Ensaio
Inóculo Meio Corante Agitação
Descoloração (%)b
1 -1 -1 -1 -1 55 2 +1 -1 -1 -1 61 3 -1 +1 -1 -1 33 4 +1 +1 -1 -1 45 5 -1 -1 +1 -1 59 6 +1 -1 +1 -1 60 7 -1 +1 +1 -1 40 8 +1 +1 +1 -1 55 9 -1 -1 -1 +1 96 10 +1 -1 -1 +1 97 11 -1 +1 -1 +1 59 12 +1 +1 -1 +1 42 13 -1 -1 +1 +1 98 14 +1 -1 +1 +1 98 15 -1 +1 +1 +1 61 16 +1 +1 +1 +1 49 17c -1 -1 -1 -1 54 18c +1 +1 +1 +1 50 19c -1 -1 -1 -1 54 20c +1 +1 +1 +1 53
aNíveis dos fatores, codificados como valores de -1 e +1 na tabela, como segue: Inóculo (105): 1 mL para o nível -1; (106) 4 mL nível +1; Concentração do corante: 0,025 mM para o nível -1; 0,050 mM nível +1; Tipo de meio: LB para nível -1; YP para nível +1; Agitação: 0 rpm para nível -1; 150 rpm nível +1. bResposta obtida com cada ensaio referente a descoloração do Alaranjado II por G. stearothermophilus UCP 986. cEnsaios repetidos.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
82
Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: COR
4 factors at two levels; MS Residual=,0020455
DV: COR
Effect Estimate (Absolute Value)
,1686509
,3397808
-,411087
-,527034
1,212178
1,876181
-3,54167
-6,67225
11,33095
-14,1969
p=,05
1by3
(1)INÓCULO
3by4
1by2
2by3
(3)CORANTE
1by4
2by4
(4)AGITAÇÃO
(2)MEIO
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Figura 2. Efeitos padronizados com diferentes fatores testados no experimento de
descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus stearothermophilus UCP
986, após 24 h de cultivo a 50ºC. (1) Tamanho do inóculo, (2) meios de cultura, (3)
concentração do corante e (4) tipo de agitação.
N = N
OH
NaO3S
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
83
Figura 3. Percentual de descoloração, Crescimento celular, consumo de glicose e pH durante o processo de
remoção do azo corante Alaranjado II usando Geobacillus stearothermophilus, por 48 h a 50ºC. (A) Ensaio 9,
(B) Ensaio 10, (C) Ensaio 13 e (D) Ensaio 14.
B
C D
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 15 20 24 28 32 48
Tempo (h)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
Glic
ose
(g L
-1)
co rante cresc. celular pH Glicose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 15 20 24 28 32 48
Tempo (h)
% D
esco
lora
ção
Ln
(UFC
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
Glic
ose
(g L
-1)
co rante cresc. celular pH Glicose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 15 20 24 28 32 48
Tempo (h)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
Glic
ose
(g L
-1)
co rante cresc. celular pH Glicose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 15 20 24 28 32 48
Tempo (h)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
Glic
ose
(g L
-1)
corante cresc. celular pH glicose
A
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
84
0102030405060708090
100110
17 33 67 83
Concentração (%)
% M
orta
lidad
e
Ensaio 9 Ensaio 10 Ensaio 13 Ensaio 14
Figura 4. Avaliação da toxicidade dos metabólitos formados durante o
processo de descoloração do azo corante Alaranjado II por
Geobacillus stearothermophilus, após 48 h de cultivo a 50ºC, usando
Artemia salina.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
85
SEGUNDO ARTIGO
Biorremediação do Azo Corante Têxtil Alaranjado II por
Pseudomonas aeruginosa UCP 992 sob Condições Aeróbicas
Manuscrito a ser submetido para publicação no periódico
Dyes and Pigments
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
86
Biorremediação do Azo Corante Têxtil Alaranjado II por
Pseudomonas aeruginosa UCP 992 sob Condições Aeróbicas
Norma Suely Evangelista-Barreto1,2, Clarissa D. Albuquerque2, Marcos A. B. Lima1,2, Aline E. do Nascimento2, Regine Helena S. F. Vieira3 e Galba Maria
de Campos-Takaki1,24*
1Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, UFPE, Recife, PE, Brasil;
2Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, NPCIAMB, UNICAP, Recife, PE, Brasil;
3Instituto de Ciências do Mar-LABOMAR, UFC, Fortaleza, Ceará, Brasil; 5Departamento
de Química, UNICAP, Recife, Pernambuco, Brasil.
Parte dos resultados foram publicados no livro de resumos do XXIII Congresso
Brasileiro de Microbiologia. Santos-SP. 22-25/12/2005.
*Correspondência do autor: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química, Núcleo
de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes
Machado, 42, Boa Vista. 50050-590, Recife - Pe, Brasil. Tel. +00-55-81-2119.4017; Fax: +00-55-
81-2119.4043. E-mail: [email protected].
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
87
Resumo
A biodegradação do azo corante Alaranjado II usado em indústrias têxteis foi
investigada usando Pseudomonas aeruginosa (UCP 992), sob diferentes
condições de cultivo, usando um planejamento fatorial 23, que teve como
variáveis independentes, a agitação, concentração do corante e tamanho do
inóculo, e como variável resposta, a descoloração do corante. De acordo com os
resultados P. aeruginosa promoveu uma descoloração de 85-94% do corante, sob
condições de repouso, 60% sob agitação de 75 rpm e apenas 19% sob agitação
de 150 rpm. Nos frascos mantidos em repouso, o pH do meio variou de 6,8 a 8,5
e a glicose, usada como co-substrato, não influenciou no processo de
descoloração. A presença de ácido sulfanílico, um metabólito da redução do
Alaranjado II, analisada por HPLC, sugere que a descoloração do azo corante
ocorreu pela clivagem da ligação azo. O bioensaio usando Artemia salina
apresentou mortalidade de 80-97%, quando comparada ao controle, indicando a
recalcitrância do composto. Os resultados obtidos demonstram que das três
variáveis usadas, apenas a agitação é significativa no processo de remoção do
Alaranjado II e que a descoloração por P. aeruginosa é fortemente afetada pela
aeração, demonstrando que o oxigênio inibe a atividade azoredutase, necessária
ao processo de descoloração deste composto.
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, descoloração, azo corante
Alaranjado II, toxicidade.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
88
1. Introdução
Cerca de um milhão de toneladas de corantes são produzidos anualmente no
mundo [1]. Os azo corantes, caracterizados pela ligação azo (R1-N=N-R2),
representam aproximadamente 70% da produção [2], sendo amplamente usados
como corantes têxteis, de alimentos e cosméticos [3]. Os azo corantes reativos,
ou seja, corantes com grupos reativos que formam ligações covalentes com OH-,
NH- ou grupos SH-, são extensivamente usados na indústria têxtil, embora,
apresentem baixo grau de fixação às fibras (10-50%) [4].
A elevada solubilidade na água, faz com que os azo corantes não sejam
degradados por plantas convencionais de tratamentos de esgotos [5, 6]. Deste
modo, efluentes coloridos contendo azo corantes reativos têm causado sérios
problemas ambientais, principalmente, porque estes compostos, quando
presentes na água são altamente visíveis, afetando a transparência e estética do
corpo aquático [7].
Dessa maneira, é importante que se investigue linhagens microbianas que
apresentem elevado potencial de descoloração, através da clivagem redutiva do
grupo azo na molécula dos corantes têxteis. Nos últimos anos, diversos
pesquisadores têm demonstrado a habilidade de vários microrganismos em
transformar compostos azo em produtos não coloridos, bem como, realizar
completa mineralização, sob determinadas condições ambientais [8]. Os azo
corantes podem ser degradados sob condições aeróbicas [9] ou anaeróbicas [10].
A degradação bacteriana é geralmente iniciada pela redução anaeróbica na
ligação azo, que, no entanto, apresenta como principal desvantagem a produção
de aminas aromáticas potencialmente tóxicas e carcinogênicas [11]. Os produtos
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
89
dessa redução (aminas) podem ser tratados posteriormente numa etapa aeróbica
[12]. Compostos azo também podem ser reduzidos a aminas por co-metabolismo
[13].
A biotransformação aeróbica dos azo corantes por fungos e bactérias tem sido
bastante relatada. Segundo Abraham et al. [14] o tratamento aeróbico é mais
atrativo, como método de biodegradação destes compostos. Neste processo, o
metabolismo redutivo aeróbico requer enzimas específicas (azoredutases
aeróbicas) que catalisam a redução do composto azo através de NAD-
dependentes [8]. As azoredutases aeróbicas (flavinas monoméricas) isoladas de
Pseudomonas K22 e KF46 utilizam NADPH e NADH como cofatores na redução
de diversos corantes sulfurados [15].
Por outro lado, os modelos fatoriais têm sido usados como uma importante
ferramenta tanto para a realização de pesquisas, como para trabalhos aplicados
[16, 17]. Neste sentido, devem ser considerados parâmetros significativos para
um determinado processo, assim como, a interação entre eles, permitindo que
processos de otimização nos processos de descoloração sejam alcançados.
Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de descoloração por
Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) usando o azo corante Alaranjado II, sob
diferentes condições de cultivo, usando um planejamento fatorial completo 23.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
90
2. Material e Métodos
2.1. Microrganismo
Pseudomonas aeruginosa UCP 992 utilizada nos experimentos de
biodegradação foi gentilmente cedida do Banco de Culturas do Núcleo de
Pesquisa em Ciências Ambientais NPCIAMB, UNICAP, Recife, Brasil, sendo
mantida no meio Ágar nutriente e armazenado a 4ºC. Repiques bimestrais eram
realizados em Ágar nutriente e mantidos sob refrigeração a 5ºC.
2.2 Corante
O corante utilizado foi o azo reativo Alaranjado II (C.I. 15510) obtido da Sigma
(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA).
2.1. Ensaios Microbiológicos
2.1.1.Condições de cultivo
Pseudomonas aeruginosa foi previamente cultivada em 100 mL de caldo Luria
Bertani (LB) [18] (g L-1: triptona 10, extrato de levedura 5, NaCl 10, adicionado de
glicose 5) distribuído em frasco Erlenmeyer de 250 mL e incubada por 12 h sob
agitação de 150 rpm a 40ºC, resultando em uma cultura de 108 UFC/mL. Em
seguida, inóculos de 1, 2,5 e 4 mL foram transferidos para frascos Erlenmeyers
de 500 mL de capacidade, contendo 150 mL do meio LB adicionado de glicose,
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
91
pH 7,0 ± 0,2. Os ensaios foram realizados de acordo com o planejamento fatorial
23, por 48 h à 40ºC.
2.1.2.Contagem de células
A contagem das células foi realizada através da técnica “pour plate”, usando
como meio inoculante Agar nutriente. A contagem foi realizada com o auxilio de
um contador de colônias após 24 h de incubação.
2.2. Métodos Analíticos
2.2.1. Determinação do consumo de glicose e pH
A determinação do consumo de glicose foi analisada no líquido metabólico
livre de células através do método enzimático colorimétrico glicose-oxidase, kit
Labtest®, medido espectrofotometricamente a 505 nm. O pH do meio livre de
células foi medido utilizado um pHmetro Orion, modelo 310.
2.2.2. Remoção do corante
A concentração do corante no meio foi avaliada pela diminuição da absorção,
após remoção das células por centrifugação (10.000 x g, 8 min.), empregando
espectrofotômetro UV-VIS (Espectronic Gênesis modelo 2). O comprimento de
onda foi fixado pela absorção máxima do corante na região do visível, a 485 nm.
2.2.3. Análise dos produtos da degradação
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
92
Os componentes da degradação do corante no sobrenadante foram extraídos
com acetato de etila (3 vezes de 100 mL), seco com Na2SO4 anidro e concentrado
em rota evaporador (Quimis, Mod. Q-219) [19]. As amostras foram analisadas por
cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Varian, USA) utilizando uma
coluna de fase reversa (4,6 mm x 150 mm, Microsorb-MVTM C18, Creek, CA
USA). A eluição foi realizada em sistema de solvente isocrático composto por
metanol e água (30:70), com fluxo de 0,5 mL min-1 [20]. Os produtos foram
monitorados a 254 nm com detector UV-VIS. A presença do ácido sulfanílico foi
observada a partir do tempo de retenção do padrão (F-Maia, Brasil) e comparada
com as amostras. Os reagentes analíticos usados apresentavam grau
cromatográfico (Sigma-Aldrich Chemical, USA).
2.3. Características morfológicas
As amostras coletadas após a descoloração foram lavadas em PBS, pH 7,2
por duas vezes, durante 10 min. Em seguida, fixadas com glutaraldeido 2,5% em
tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, durante 1h, a temperatura ambiente. Após a etapa
de fixação, todas as amostras foram novamente lavadas com tampão fosfato,
duas vezes, durante 10 min. Seguindo-se a pós-fixação com tetróxido de ósmio
1%, em tampão fosfato, durante 1 h a temperatura ambiente, em condições de
escuridão. Em seguida, as amostras foram mais uma vez lavadas com tampão
fosfato 0,1M, sendo posteriormente submetidas ao processo de desidratação.
Para a desidratação das amostras foi utilizado álcool etílico, em proporções de 50,
70 e 90% (5 min. para cada troca) até a proporção de 100% (três vezes, 10 min.
cada troca). Após esta etapa, as amostras foram submetidas ao ponto critico para
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
93
eliminação total da fase líquida, seguindo-se a montagem em suportes de
alumínio e posterior metalização. Preparadas as amostras, as mesmas foram
analisadas e fotografadas ao microscópio eletrônico de varredura (JEOL LSM
5.600 LV), operando a 20 kv.
2.4. Ensaios de toxicidade
O ensaio biológico foi realizado utilizando a metodologia de McLauglin et al.
[21] nos ensaios 1, 2, 3 e 4 (maior descoloração). Cerca de 10 larvas de Artemia
salina foram transferidas para frascos contendo a amostra teste (material
descolorido) com diferentes concentrações (17, 33, 67 e 83%), diluídas em 5 mL
de água artificial do mar. Teste controle foi realizado contendo somente água do
mar. Os testes foram realizados em triplicata. A contagem dos animais mortos e
vivos foi realizada após 24 h de exposição. Para obtenção das CL50 e respectivos
intervalos de confiança, utilizou-se o método de análise Trimmed Spearman-
Karber [22].
2.5. Construção do planejamento fatorial
Para construir a matriz de planejamento, os níveis inferior e superior foram
substituídos por -1 e +1, respectivamente, o que torna os valores dos níveis no
ponto central todos iguais a zero. Decidiu-se realizar 16 ensaios (mais o ponto
central), e para isso escolheu-se o planejamento fatorial completo 23 (Tabela 1),
para analisar os efeitos e interações das variáveis independentes: volume do
inóculo, concentração do corante e agitação, sobre a variável resposta, percentual
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
94
de descoloração após 48 h. Todos os resultados foram analisados utilizando o
programa STATISTICA versão 5.0 da Statsoft, USA.
3. Resultados e Discussão
3.1. Descoloração do azo corante
A descoloração dos azo corantes tem como reação inicial a clivagem redutiva
do grupo azo. Contudo, sob condições anaeróbicas estas reações podem ser
catalisadas por diversos sistemas biológicos, conduzindo ao acúmulo de aminas
aromáticas [23]. Nos últimos anos, diversos trabalhos têm relatado alguns fatores
que podem afetar a remoção dos corantes sintéticos durante o processo de
descoloração microbiana. Dentre eles, os fatores nutricionais (fontes de carbono e
nitrogênio) e fatores físicos (temperatura, agitação e pH, dentre outros) podem
influenciar na degradação dos compostos azo (7, 24, 25).
Neste sentido, experimentos foram realizados com P. aeruginosa (UCP 992)
durante 48 h, usando diferentes combinações das três variáveis escolhidas
(agitação, concentração do corante e tamanho do inóculo) de acordo com o
planejamento fatorial 23. Dessa forma, observou-se que a melhor taxa de
descoloração do corante foi obtida quando todas as variáveis independentes
encontravam-se reguladas em seu nível inferior (ensaio 1), promovendo uma
descoloração de 94% e sugerindo a clivagem do grupo azo do corante (Tabela 1).
Quando as variáveis independentes se encontravam em seu nível superior
(ensaio 8), a taxa de descoloração visivelmente diminuiu, sendo de apenas 11%.
No entanto, quando os frascos foram submetidos à agitação moderada (75 rpm),
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
95
a taxa de descoloração foi maior (60%) (Tabela 1). Nos ensaios com maior
descoloração, se observou um aumento no pH do meio, sugerindo a presença de
aminas, provenientes da clivagem do corante e reconhecidas pela alcalinidade
(Tabela 1).
A cor dos corantes Vermelho Congo e DB 38 foi removida em até 98 e 72%,
respectivamente, por Escherichia coli sob condições anaeróbicas e nenhuma
descoloração ocorreu durante a incubação aeróbica [26]. Segundo Chang et al.
[27] a presença do oxigênio não inibe diretamente a atividade azoredutase, sendo
esta inibição, provavelmente, um evento dependente do metabolismo microbiano.
Assim, microrganismos viáveis são definitivamente requeridos para uma maior
descoloração nos processos biológicos, significando que a descoloração biológica
é possível [28]. Devido à recalcitrância das aminas aromáticas normalmente
observadas na fase anaeróbica, a agitação suave deve ser vantajosa no processo
de descoloração. Adicionalmente, Bromley-Challenor et al. [29] relataram que
agitação suave ocasional promove uniformidade do corante, diminuindo as
limitações de difusão.
Por outro lado, a agitação das células contribui para que parte da energia seja
oxidada via glicólise e ciclo TCA, gerando desta maneira nucleotídeos reduzidos.
Quando os nucleotídeos são reoxidados via sistema de transporte de elétrons
produzem alta energia, ou seja, ATP, proporcionando crescimento e manutenção
celular [30]. No entanto, o consumo do NADH na fosforilação oxidativa resulta em
um efeito negativo na etapa de descoloração [26]. Entretanto, Zimmermann et al.
[23], isolaram e purificaram uma azoredutase insensível ao oxigênio, a partir da
degradação aeróbica do azo corante Alaranjado II por Pseudomonas KF46.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
96
De acordo com o diagrama de Pareto (Figura 1), observa-se que para um nível
de confiança de 95%, as variáveis independentes (concentração do corante e
agitação) exerceram um efeito negativo no processo de descoloração do corante,
contudo, somente a agitação apresentou efeito estatisticamente significativo,
sugerindo que esta variável é um parâmetro de grande importância no processo
de descoloração do Alaranjado II por P. aeruginosa. Quando analisando as
interações das variáveis estudadas, podemos observar ainda na Figura 1, que
embora nenhuma delas tenha apresentado efeito estatístico significante, apenas a
interação inóculo-agitação apresentou um efeito negativo no processo de
descoloração.
Chang & Kuo [25] ao estudar a descoloração do corante reativo Vermelho 22,
usando Escherichia coli, sob condições anóxicas e aeróbicas, também
observaram que o nível de oxigênio dissolvido inibiu significantemente a remoção
da cor. Segundo Isik & Sponza [26] a descoloração dos azo corantes Vermelho
Congo e Preto Reativo 38 em culturas de Pseudomonas sp. foi 100 e 83%,
respectivamente, após cinco dias de incubação anaeróbica. Contudo, sob
condições microaerofílicas, apenas descoloração de 76 e 74%, respectivamente,
foi observada. Nenhuma descoloração ocorreu sob condições aeróbicas.
Entretanto, descoloração aeróbica do corante Navitan Fast Blue S5R por P.
aeruginosa foi relatada Nachiyar & Rajakumar [19]
Baseado na literatura sabe-se que o oxigênio reprime a expressão
azoredutase intracelular e assim, a descoloração é temporariamente inibida em
culturas sob agitação. Porém, sob condições estáticas, apenas parte do oxigênio
é transferida da superfície do meio e as células que se encontram no fundo do
frasco exercem uma descoloração anaeróbica [30].
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
97
3.2. Perfil de crescimento de P. aeruginosa
A partir dos ensaios 1, 2, 3 e 4 (Tabela 1) que apresentaram melhor taxa de
descoloração, novos experimentos foram realizados, a fim de observar o perfil de
crescimento de P. aeruginosa.
Nestas condições, a descoloração do Alaranjado II apresentou uma remoção
de 96%, nos ensaios 1 e 2, que apresentavam menor concentração do corante.
Com 12 h de cultivo, todos os ensaios, com exceção do ensaio 1, apresentaram
uma remoção do Alaranjado II em torno de 30%, alcançando 95% com 24 h
(Figura 2). Nestes ensaios, biosorção também ocorreu, visto que a biomassa se
apresentava colorida.
O crescimento de P. aeruginosa, apresentou uma fase lag de 4 h, seguida da
fase estacionária até 48 h (Figura 2). Em todos os ensaios, observou-se um
período de diaexia, provavelmente, em decorrência dos metabólitos formados
durante a degradação do corante. Este fato foi menos evidenciado no ensaio 1,
que apresentou um maior número de células (108 UFC mL-1). Nestas condições, a
concentração do corante era mínima, o que se supõe que P. aeruginosa não
tolere maiores concentrações do corante. A velocidade específica (µ) de
crescimento de P. aeruginosa nos ensaios 1, 2, 3 e 4 foi de 0,48 h-1, 0,18 h-1, 0,57
h-1 e 0,27 h-1, respectivamente, e o tempo de geração (TG) 1,44 h, 3,85 h, 1,2 h e
2,57 h, respectivamente.
Baseado nestes resultados é coerente afirmar que a descoloração não parece
ser dependente da concentração da biomassa, mas ainda assim, é correlacionada
ao nível de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Segundo Chang & Lin [31] a
ausência de crescimento celular foi observado no cultivo contendo P. luteola e o
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
98
corante reativo Vermelho 22, sem aeração. Hu [32] também relatou que o cultivo
estático não rendeu bom crescimento nas células de P. luteola, no entanto, foi
responsável por 23-76% da remoção da cor dos azo corantes direto Vermelho G e
V2RP, respectivamente.
O pH do meio ao longo do cultivo tendeu a faixa alcalina (8,5) (Figura 2). Este
fato pode ser explicado pela produção de metabólitos intermediários (aminas
aromáticas), a partir da biodegradação do composto. Segundo Chang & Kuo [25]
valores de pH neutro e básico parecem ser mais favoráveis na descoloração dos
azo corantes. O mesmo foi citado por Bin et al. [33], ao relatar que o efeito do pH
na atividade azoredutase, numa faixa de 5,0 a 9,0, apresentou melhor atividade
em pH 8,0.
A adição da glicose, eficiente na descoloração do Alaranjado II por G.
stearothermophilus [34], não afetou a descoloração do Alaranjado II por P.
aeruginosa, uma vez que, com 24 h de cultivo e descoloração máxima, o
consumo da glicose foi de apenas 15% nos ensaios 1 e 2, e de 35% nos ensaios
3 e 4 (Figura 2). Estes resultados são opostos aos encontrados por Carliell et al.
[2] que observaram metabolização da glicose como fonte de carbono,
aumentando a redução dos azo corantes. Segundo Haug et al. [13] a capacidade
de Sphingomonas sp. BN6 em metabolizar pequenas quantidades de glicose sob
condições anaeróbicas, formando equivalentes redutores, aumentou a eficiência
de descoloração.
Embora a glicose seja citada como uma importante fonte de carbono e
obtenção de energia, o metabolismo do extrato de levedura como fonte de
nitrogênio é considerado essencial na regeneração do NADH, que age como um
doador de elétron na redução das ligações azo [35]. Para Chang et al. [27] a
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
99
adição de glicose no caldo LB diminuiu em quase 70% a descoloração do corante
reativo Vermelho 22, enquanto a presença de triptona e extrato de levedura foram
requeridos como sendo necessários para ativar as vias metabólicas e produzir
coenzimas necessárias à atividade azoredutase, importantes no processo de
descoloração.
3.3. Caracterização morfológica
Ao final da descoloração, se observou principalmente nos frascos em repouso,
a formação de um biofilme na superfície e paredes dos frascos. O gênero
Pseudomonas é conhecido por produzir uma camada de aspecto mucóide
denominada slime, importante na formação de biofilmes [36]. O biofilme formado
provavelmente contribui para estabelecer um ambiente anaeróbico. Quando a
cultura foi observada por microscopia eletrônica de varredura, foi possível
visualizar as células formando agregados celulares (Figura 3). A produção de um
pigmento esverdeado, provavelmente pioverdina, também foi observada durante o
cultivo de P. aeruginosa (UCP 992).
3.4. Metabólitos formados durante a biodegradação do Alaranjado II
O passo inicial para a biodegradação de compostos azo é a clivagem redutiva
do grupo azo, que sob condições anaeróbicas é catalisada por vários sistemas
biológicos [32].
A identificação do ácido sulfanílico, um precursor do processo de síntese do
Alaranjado II, foi identificada no sobrenadante do meio usando HPLC. Em todos
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
100
os ensaios analisados (1, 2, 3 e 4) a presença do ácido sulfanílico foi observada,
apresentando um tempo de retenção de 3,5 min. Estes resultados indicam que a
presença desta amina no meio, caracteriza a natureza recalcitrante do corante.
Por outro lado, este fato indica que o processo de descoloração do Alaranjado II
ocorreu pela redução da ligação azo e que o ambiente semi-anaeróbico não
promove a mineralização das aminas aromáticas formadas.
A presença de ácido sulfanílico também foi relatada por Brás et al. [37] ao
investigarem a descoloração do Alaranjado II usando atividade metanogênica
num reator anaeróbico de manta de lodo (UASB).
3.5. Toxicidade
Ensaios de toxicidade usando A. salina nas amostras descoloridas (ensaios 1,
2, 3 e 4), foram realizados afim de determinar a toxicidade aguda do corante após
o tratamento com P. aeruginosa.
Os resultados obtidos nos testes de toxicidade são mostrados na Figura 3. A
porcentagem de mortalidade foi comparada com o controle, que não apresentava
nenhuma substância tóxica. Dentre as amostras testadas, o ensaio 4 apresentou
menor toxicidade (23%). Os demais ensaios apresentaram mortalidade elevada
(>80%) apenas na maior concentração (83%), com exceção do ensaio 2, que
apresentou mortalidade de 50% na concentração de 67% da amostra. Segundo
Kudlich et al. (12) a mortalidade observada pode ser sugerida pela presença de
grupos SO3H, que freqüentemente resistem a biodegradação ou são degradados
somente parcialmente.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
101
A CL50 das amostras (concentração que causa 50% de mortalidade) com seus
respectivos coeficientes de confiança mínimo e máximo foram calculados pelo
método Trimmed Spearman-Karber [22]. A maior CL50 foi apresentada para o
ensaio 3 (67,98% v.v-1), seguido do ensaio 2 (60,18% v.v-1) e ensaio 1 (59,77%
v.v-1). O ensaio 4 não pôde ter a CL50 calculada pelo presente método.
Assim, pôde-se observar que a degradação do corante formou metabólitos,
que se apresentaram tóxicos para A. salina. A presença de ácido sulfanílico,
presente no meio pode ter contribuído para a toxicidade apresentada. Segundo
Isik & Sponza [38] testes de toxicidade usando D. magna mostraram que o
tratamento aeróbico de um efluente têxtil não removeu a DQO e que a parcela
não degradável do corante era responsável pela toxicidade.
4. Conclusões
Dentre as variáveis de partida, ficou constatado que somente uma (agitação)
parece afetar significantemente o processo de descoloração do Alaranjado II,
demonstrando que a agitação elevada inibe o processo de descoloração.
Conhecendo agora qual o fator mais significativo, torna-se possível introduzir
novas variáveis, ou alterar os níveis dos fatores já estudados, em busca de obter
melhores respostas. Como os resultados mostraram que a agitação é um fator
promissor, sugere-se a realização de mais ensaios na mesma região, estudando
melhor a influencia do tempo de cultivo, que é um fator de grande importância
para a viabilidade econômica no processo industrial.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
102
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Prof. Dr. Nelson Duran e Lívia Cordi (Laboratório de
Química Biológica, UNICAMP, SP) pelos testes de toxicidade. Ao Dr. Ricardo
Kenji (NPCIAMB, UNICAP, PE) pelas análises de HPLC. Agradecemos também a
agência financiadora CNPq e FINEP/CTPETRO e FACEPE pelo suporte
financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.
Referências
[1] Cao JS, Wei LP, Huang QG, Wang SL, Han SK. Reducing degradations of azo
dye by zero-valent iron in aqueous solution. Chemosphere, 1999;38:565-571.
[2] Carliell CM, Barclay SJ, Naidoo N, Buckley CA, Mulholland DA, Senior E.
Microbial decolourisation of a reactive azo dye under anaerobic conditions.
Water SA, 1995;21:61-69.
[3] Rau J, Knackmuss H-J, Stolz, A. Effects of different quinoid redox mediators on
the anaerobic reduction of azo dyes by bacteria. Environmental Science &
Technology 2002;36:1497-1504.
[4] Santos AB, Cervantes FJ, Yaya-Beas RE, Van Lier JB. Effect of mediator
AQDS, on the decolourisation of a reactive azo dye containing triazine group in
a thermophilic anaerobic EGSB reactor. Enzyme and Microbial Technology
2003;33:942-95.
[5] Pagga U, Brown D. The degradation of dye stuffs. Part II. Behaviour of
dyestuffs in aerobic biodegradation tests. Chemosphere 1986;15:479-491.
[6] Kudlich M, Hetheridge MJ, Knackmuss HJ, Stolz A. Autoxidation reactions of
different aromatic o-aminohydroxynaphthalenes that are formed during the
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
103
anaerobic reduction of sulfonated azo dyes. Environmental Science &
Technology 1999;33:896-901.
[7] Supaka N, Juntongjin K, Damronglerd S, Delia M-L, Strehaiano P. Microbial
decolorization of reactive azo dyes in a sequential anaerobic-aerobic system.
Chemical Engineering Journal 2004;99:169-176.
[8] Blumel S, Knackmuss H-J, Stolz A. Molecular cloning and characterization of
the gene coding for the aerobic azoreductase from Xenophilus azovorans
KF46F. Applied and Environmental Microbiology 2002;68:3948-3955.
[9] Wong PK, Yuen PY. Decolorization and biodegradation of methyl red by
Klebsiella pneumoniae RS 13. Water Research 1996;30:1736-1744.
[10] Keharia H, Patel H, Madamwar D. Decolorization screening of synthetic dyes
by anaerobic methanogenic sludge using a batch decolorization assay. World
Journal of Microbiology and Biotechnology 2004;20:365-370.
[11] Heiss GS, Gowan B, Dabbs ER. Cloning of DNA from a Rhodococcus strain
conferring the ability to decolorize sulfonated azo dyes. FEMS Microbiology
Letters 1992;99:221-226.
[12] Kudlich M, Bishop PL, Knackmuss H-J, Stolz A. Simultaneous anaerobic and
aerobic degradation of the sulfonated azo dye Mordant Yellow 3 by
immobilized cells from a naphthalenesulfonate-degrading mixed culture.
Applied Microbiology and Biotechnology 1996;45:597-603.
[13] Haug W, Schmidt A, Nortemann B, Hempel DC, Stolz A, Knachmuss H-J.
Mineralization of the sulfonated azo dye mordant yellow 3 by 6-
aminonaphthalene-2-sulfonate-degrading bacterial consortium. Applied and
Environmental and Microbiology 1991;57:3144-3149.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
104
[14] Abraham TE, Senan RC, Shaffiqu TS, Roy JJ, Poulose TP, Thomas PP.
Bioremediation of textile azo dyes by an anaerobic bacterial consortium using
a rotating biological contactor. Biotechnology Progress 2003;19:1372-1376.
[15] Zimmermann T, Gasser F, Kulla HG, Leisinger T. Comparison of two bacterial
azoreductases acquired during adaptation to growth on azo dyes. Archives of
Microbiology 1984;138:37-43.
[16] Chen K, Yao YL. Process optimization in pulsed laser micromaching with
applications in medical device manufacturing. International Journal Advances
Manufacturing Technology 2000;16:243-249.
[17] Andrade VS, Barros Neto B, Fukushima K, Campos-Takaki GM. Effect of
medium components and time of cultivation on chitin production by Mucor
circinelloides (Mucor javanicus IFO 4570) - a factorial study. Revista
Iberoamericana de Micolologia 2003;20:149-153.
[18] Konishi J, Ishi Y, Onaka T, Okumura K, Suzuki M. Thermophilic carbon-
sulphur-bond-targeted biodesulfurization. Applied and Environmental
Microbiology 1997;63:3164-3169.
[19] Nachiyar CV, Rajakumar GS. Mechanism of Navitan Fast Blue S5R
degradation by Pseudomnas aeruginosa. Chemosphere 2004;57:165-169.
[20] Mendez-Paz D, Omil F, Lema JM. Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under fed-batch and continuous conditions. Water Research
2005;39:771-778.
[21] McLauglin JL, Saizarbitoria TC, Anderson JE. Três bioensayos simples para
químicos de productos naturales. Revista Sociedad Venezolana de Química,
1995;18:13-18.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
105
[22] Youn-Joo A. Assessment of comparative toxicities of lead and copper using
plant assay. Chemosphere 2006;62:1359-1365.
[23] Zimmermann T, Kulla HG, Leisinger T. Properties of purified orange II
azoreductase, the enzyme initiating azo dye degradation by Pseudomonas
KF46. European Journal of Biochemistry 1982;129:197-203.
[24] Mielgo I, Moreira MT, Feijoo G, Lema JM. A packed-bed fungal bioreactor for
the continuous decolourisation of azo-dyes (Orange II). Journal of
Biotechnology 2001;89:99-106.
[25] Chang J-S, Kuo T-S. Kinetics of bacterial decolorization of azo dye with
Escherichia coli NO3. Bioresource Technology 2000;75:107-111.
[26] Isik M, Sponza DT. Effect of oxygen on decolorization of dyes by Escherichia
coli and Pseudomonas sp. and fate of aromatic amines. Process
Biochemistry 2003;38:1183-1192.
[27] Chang J-S, Chou C, Lin Y-C, Lin P-J, Ho J-Y, Hu T-L. Kinetic characteristics
of bacterial azo-dye decolorization by Pseudomonas luteola. Water
Research 2001a;35:2481-2850.
[28] Chang J-S, Chien C, Chen S-Y. Decolorization of azo dyes with immobilized
Pseudomonas luteola. Process Biochemistry 2001b;36:757-763.
[29] Bromley-Challenor KCA, Knapp JS, Zhang Z, Gray NCC, Hetheridge MJ,
Evans MR. Decolorization of an azo dye by unacclimated activated sludge
under anaerobic conditions. Water Research 2000;34:4410-4418.
[30] Chen B-Y. Understanding decolorization characteristics of reactive azo dyes
by Pseudomonas luteola: toxicity and kinetics. Process Biochemistry
2002;38:437-446.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
106
[31] Chang J-S, Lin Y-C. Fed-batch bioreactor strategies for microbial
decolorization of azo dye using a Pseudomonas luteola strain. Biotechnology
Progress 2000;16:979-985.
[32] Hu TL. Decolourization of reactive azo dyes by transformation with
Pseudomonas luteola. Bioresource Technology 1994;49:47-51.
[33] Bin Y, Jiti Z, Jing W, Cuihong D, Hongman H, Zhiyong S, Yongming B.
Expression and characteristics of the gene encoding azoreductase from
Rhodobacter sphaeroides ASI.1737. FEMS Microbiology Letters
2004;236:129-136.
[34] Evangelista-Barreto NS, Franco L, Vieira RHSF, Campos-Takaki G. Cinética
de crescimento do Geobacillus stearothermophilus frente ao azo corante
Alaranjado II. In: Resumos... IX Encontro Nacional de Microbiologia
Ambiental, Curitiba, 2004.
[35] Chen K-T, Wu J-Y, Liou D-J, Hwang S-CJ. Decolorization of the textile dyes
by newly isolated bacterial strains. Journal of Biotechnology 2003;101:57-68.
[36] Lincopan N, Trabulsi LR. Pseudomonas aeruginosa. in: Richardi Trabulsi et
al. Luiz (Eds), Microbiologia. 4 ed., São Paulo: Atheneu, 2004. 718p.
[37] Brás AG, Ferra MIA, Pinheiro HM, Gonçalves IC. Monoazo and diazo dye
decolourisation studies in a methanogenic UASB. Journal of Biotechnology
2005;115:57-66.
[38] Isik M, Sponza DT. Monitoring of toxicity and intermediates of C.I. Direct Black
38 azo dye through decolorization in an anaerobic/aerobic sequential reactor
system. Journal of Hazardous Materials B 2004;114:29-39.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
107
Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 23 em relação à resposta de
descoloração do Alaranjado II e pH por Pseudomonas aeruginosa UCP 992, após 24
h de cultivo a 40ºC
Níveis dos Fatoresa Descoloração (%)b Amostra
Inóculo Corante Agitação 24h 48h
pH(final)c
1 -1 -1 -1 93% 94% 7,20
2 +1 -1 -1 93% 85% 7,42
3 -1 +1 -1 83% 91% 7,39
4 +1 +1 -1 94% 90% 7,35
5 -1 -1 +1 11% 16% 6,92
6 +1 -1 +1 14% 19% 6,86
7 -1 +1 +1 16% 08% 6,87
8 +1 +1 +1 14% 11% 6,79
9d 0 0 0 51% 59% 7,42
10d 0 0 0 49% 58% 7,30
11d 0 0 0 50% 60% 7,45
12d 0 0 0 51% 59% 7,45 aNíveis dos fatores, codificados como valores de -1 e +1 e 0 (ponto central) na tabela, como segue:
Inóculo (107): 1 mL para o nível -1; 2,5 mL nível 0; 4 mL nível +1; Concentração do corante: 0,025
mM para o nível -1; 0,037 mM nível 0; 0,050 mM nível +1; Agitação: 0 rpm para nível -1; 75 rpm nível
0; 150 rpm nível +1. bResposta obtida com cada ensaio referente a descoloração do Alaranjado II por
Pseudomonas aeruginosa. cpH final do meio ao termino do experimento em cada ensaio. dEnsaios
em replicatas.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
108
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: COR
2**(3-0) design; MS Residual=,0014033
DV: COR
Effect Estimate (Absolute Value)
-,377515
,566273
-,943788
1,132546
1,321304
-29,0687
p=,05
(2)CORANTE
1by2
1by3
(1)INÓCULO
2by3
(3)AGITAÇÃO
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
Figura 1. Diagrama de Pareto mostrando os efeitos principais e interações das
variáveis independentes no processo de descoloração do Alaranjado II por
Pseudomonas aeruginosa UCP 992, após 24 h de cultivo a 40ºC. (1) Tamanho
do Inóculo, (2) Concentração do corante e (3) Faixa de agitação.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
109
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Glic
ose
(g L
-1)
DO
UFC
pH
Glicose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Glic
ose
(g L
-1)
DO
UFC
pH
Glicose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Glic
ose
(g L
-1)
DO
UFC
pH
Glicose
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)
% D
esco
lora
ção
Ln (U
FC m
L-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pH
Glic
ose
(g L
-1)
DO
UFC
pH
Glicose
Figura 2. Percentual de descoloração, crescimento celular, consumo de glicose e pH durante o
processo de remoção do azo corante Alaranjado II por Pseudomonas aeruginosa.
Ensaio 2Ensaio 1
Ensaio 3 Ensaio 4
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
110
Figura 3. Eletromicrografia de Pseudomonas aeruginosa (UCP 992)
após o processo de descoloração do azo corante Alaranjado II, por
microscopia eletrônica de varredura.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
111
0
1020
3040
50
6070
8090
100
17 33 67 83
Concentrações (%)
% M
orta
lidad
e
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Figura 4. Avaliação da toxicidade dos metabólitos formados durante o
processo de descoloração do Alaranjado II, por Pseudomonas
aeruginosa (UCP 992), após 48 h de cultivo a 40ºC, usando Artemia
salina.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
112
TERCEIRO ARTIGO
Potencial Aplicação do Consórcio de Geobacillus
stearothermophilus UCP 986 e Pseudomonas aeruginosa UCP
992 no Processo de Descoloração do Alaranjado II
Manuscrito submetido no periódico
Journal of Hazardous Materials
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
113
Potencial Aplicação do Consórcio de Geobacillus
stearothermophilus UCP 986 e Pseudomonas aeruginosa UCP
992 no Processo de Descoloração do Alaranjado II
N.S. Evangelista-Barreto, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco, Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade
Universitária, 50.670-901 Recife, PE, Brasil;
L. Cordi, Laboratório de Química Biológica, Universidade Estadual de Campinas,
Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Caixa Postal 6154, Distrito de Barão Geraldo,
Campinas, SP, Brasil;
N. Durán, Laboratório de Química Biológica, Universidade Estadual de Campinas,
Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Caixa Postal 6154, Distrito de Barão Geraldo,
Campinas, SP, Brasil e Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das
Cruzes, SP, Brasil.
R.H.S.F. Vieira, Departamento de Engenharia de Pesca e Instituto de Ciências do
Mar-LABOMAR, Universidade Federal do Ceará, Av. Abolição, 3207, Meireles,
60.165-081, Fortaleza, Ceará, Brasil *G.M. Campos-Takaki, Departamento de Química e Núcleo de Pesquisa em
Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes
Machado, 42, Boa Vista. 50.050-590 Recife, PE, Brasil. Tel.: +55-81-2119.4017
Fax: +55-81-2119.4043. E-mail: [email protected]
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
114
RESUMO
A descoloração do azo corante Alaranjado II (0,050 mM) foi realizada
utilizando Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) e Pseudomonas aeruginosa
(UCP 992), sob condições aeróbica e semi-aeróbica, por 48 h a 40ºC. A cor
remanescente, pH, biomassa, dosagem de proteínas totais, consumo de glicose e
toxicidade foram monitorados em intervalos de 12 h. Nos ensaios com 24 h
contendo G. stearothermophilus remoção do corante de 90% foi observada. Após
a adição de P. aeruginosa, remoção total do corante ocorreu com 36 h. O pH do
meio variou de 5,7 a 8,1 e a glicose foi consumida com 12 h. A glicose usada
como fonte de energia inicial, favorece o processo de descoloração. A biomassa
final foi de 2,54 g L-1 e a absorção dos nutrientes foi observada pela diminuição no
perfil protéico ao longo do cultivo. Bioensaios (CL50) usando Selenastrum
capricornutum nas amostras descoloridas apresentaram uma toxicidade ao redor
de 50%, no entanto, ao usar Artemia salina nenhuma toxicidade foi observada. A
descoloração do azo corante Alaranjado II pelo consórcio bacteriano demonstrou
ser um processo promissor no tratamento de amostras coloridas.
Palavras-chave: Descoloração, Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas
aeruginosa, corante têxtil, detoxificação.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
115
1. Introdução
Os corantes sintéticos têm sido intensamente usados no setor têxtil e em
tinturarias devido a fácil aplicação, baixo custo, firmeza e variedade de cores
quando comparados aos corantes naturais [1].
Os azo corantes compreendem a maioria dos corantes têxteis produzidos,
sendo comumente usados nas indústrias de impressão de papel, têxtil e
cosméticos [2, 3]. Os compostos azo são caracterizados pela presença de uma ou
mais ligações -N=N-, em associação com um ou mais sistemas aromáticos [1].
Acredita-se que cerca de 1000 mg/L de corantes esteja presente nos banhos de
tingimento [4], e devido à solubilidade na água [5], cerca de 40% do composto
não é fixado durante o processo de tingimento, sendo então liberado para o
ambiente [6]. A maioria destes compostos é altamente resistente ao ataque
microbiano e conseqüentemente, de difícil remoção nos efluentes, quando
tratados por processos biológicos convencionais, a exemplo do lodo ativado [7].
Atualmente, a aplicação de consórcios bacterianos tem sido de grande
interesse por parte da comunidade científica, principalmente, na elaboração de
novas metodologias com aplicação de novos microrganismos. A atividade
catabólica dos microrganismos em consórcios se complementa e interações
sintróficas presentes nestas comunidades pode conduzir a completa
mineralização dos azo corantes [8, 9].
A degradação bacteriana de compostos azo é freqüentemente iniciada sob
condições anaeróbicas por uma via de transformação enzimática que envolve a
quebra da ligação azo, através de enzimas azoredutases que utilizam à coenzima
reduzida NADH como doadora de elétrons [10]. Contudo, o processo de
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
116
descoloração anaeróbico apresenta como principal desvantagem a produção de
aminas aromáticas [11], consideradas mutagênicas e carcinogênicas [12]. Os azo
corantes, no entanto, podem sofrer completa mineralização numa etapa aeróbica
posterior através de enzimas não especificas, com hidroxilação e fissão do anel
aromático [13].
Nigam et al. [14] relataram 100% de remoção da cor, utilizando cultura
bacteriana mista, em amostras de efluente, contendo corantes reativos azo e
diazo. Abraham et al. [11] também relataram elevada eficiência de degradação de
uma mistura de corantes azo, usando um consórcio bacteriano aeróbico. Baseado
nisso, um consórcio bacteriano utilizando Geobacillus stearothermophilus UCP
986 e Pseudomonas aeruginosa UCP 992 foi realizado para avaliar a
descoloração e biodegradação do azo corante Alaranjado II, sob condições
aeróbicas e microaerofílicas.
2. Material e Métodos
2.1. Microrganismos
Foram utilizados duas espécies bacterianas, Geobacillus stearothermophilus
UCP 986, isolado de efluente de lodo têxtil na indústria Suape Têxtil,
Pernambuco, Brasil e Pseudomonas aeruginosa UCP 992, pertencente ao Banco
de Culturas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, NPCIAMB, UNICAP,
PE. Os isolados foram mantidos em meio Agar nutriente a 4ºC.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
117
2.1. Métodos Microbiológicos
2.1.1. Condições de cultivo
O pré-inóculo mantido por 12 h de cada microrganismo foi cultivado em 50 mL
de caldo Luria Bertani (LB) [15] em frascos Erlenmeyers de 125 mL de
capacidade e incubados sob agitação orbital de 150 rpm a 40ºC. Em seguida, um
inóculo de 1% do cultivo de G. stearothermophilus foi transferido para frascos
Erlenmeyers com capacidade de 250 mL, contendo 50 mL do meio LB com a
seguinte composição (g L-1): triptona 10, extrato de levedura 5 e NaCl 10,
adicionado de glicose 0,5 [16], pH 7,0 ± 0,2. Após o inóculo, foi acrescido o
corante Alaranjado II, na concentração final de 0,050 mM. Os frascos foram
mantidos sob agitação de 75 rpm por 24 h a 40ºC. Em seguida, um inóculo de 1%
de P. aeruginosa, foi adicionado ao meio, e os frascos deixados em repouso por
12 h e posteriormente submetidos à nova agitação (12 h). Alíquotas do
sobrenadante nos intervalos de 12, 24, 36 e 48 h foram retiradas para o
monitoramento da cor, pH, consumo de glicose e dosagem de proteínas. Ao final
de cada tempo, a biomassa era centrifugada a 4.000 rpm por 15 min. a 4ºC e
posteriormente submetida a liofilização para determinação do peso seco. Frascos
controle sem o microrganismo foram mantidos nas mesmas condições. Todos os
experimentos foram realizados em triplicata, sob condições controladas.
2.1.2. Ensaios com o corante
O corante Alaranjado II (C.I. 15510) do tipo azo reativo, foi adquirido da Sigma
(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA). O Alaranjado II apresenta
absorbância máxima a 485 nm e sua estrutura é ilustrado na Figura 1. A
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
118
descoloração do azo corante foi monitorada no comprimento de onda máxima do
sobrenadante após centrifugação (10.000 g por 8 min.), usando espectrofotômetro
UV-VIS (Espectronic Gênesis modelo 2). A eficiência na remoção da cor foi
expressa pela relação do percentual de descoloração da concentração inicial do
corante.
Remoção da cor (%) = (A) – (B) x 100
(A)
onde (A) indica a absorbância do caldo não inoculado e (B) indica a absorbância
residual do caldo.
2.1.3. Atividade fenoloxidase
O teste foi realizado a partir do cultivo de G. stearothermophilus e P.
aeruginosa em caldo LB a temperatura de 45 e 35°C, respectivamente, por 24 h.
Em seguida discos de cinco milímetros de diâmetro foram removidos,
assepticamente, e transferidos para o centro de placas de Petri contendo 20 mL
do meio Agar LB contendo ácido tânico e gálico (0.5%). A confirmação positiva no
teste foi observada através de uma zona de coloração marrom escuro ao redor
dos discos [17]. Placas sem o ácido tânico e gálico também foram utilizadas como
controle negativo.
Para testar a atividade de enzimas no líquido metabólico livre de células, após
a descoloração, discos de oxidase da SENSOBIODISC/CECON® foram
adicionados em tubos de ensaio contendo 2 mL da amostra. A positividade do
teste foi observada através da coloração rósea do meio.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
119
2.2. Métodos Analíticos
2.2.1. Determinação do pH, consumo de glicose e proteínas totais
O pH do líquido metabólico livre de células foi medido utilizado um pHmetro
Orion, modelo 310. O consumo de glicose foi determinado no líquido metabólico
livre de células através de kit comercial (Labtest®). A dosagem de glicose consiste
no método enzimático colorimétrico glicose-oxidase usando uma solução padrão
de glicose (100 mg dL-1) e medido espectrofotometricamente a 505 nm. A
determinação do consumo de proteínas foi realizada usando o método
colorimétrico do Biureto (kit Labtest®), com leitura de absorbância a 545 nm.
2.3. Testes de Toxicidade
2.3.1. Selenastrum capricornutum
O teste de toxicidade foi realizado usando a alga verde de água doce
Selenastrum capricornutum (adquirida na coleção de culturas de algas da
EMBRAPA, Jaguariúna/São Paulo, Brasil) [18]. Os ensaios foram realizados em
Erlenmeyers de 125 mL contendo diferentes concentrações (2,5, 5,0, 10 e 26 mL)
da amostra teste, meio mineral e a alga (inóculo - 106 cels mL-1 / 72 h / Aa 0,160 a
680 nm). Ensaios controle e branco também foram realizados. Todos os frascos
foram incubados a 24ºC e expostos sob agitação constante (100 rpm) à luz
fluorescente branca, para assegurar o crescimento exponencial das algas. Após
72 h, a densidade da alga foi medida através da fluorescência da clorofila das
algas, usando fluorímetro modelo F-4500 (Hitachi), para determinação da CL50.
Os ensaios foram realizados em triplicata e o volume final do teste era de 30 mL.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
120
2.3.2. Artemia salina
A toxicidade frente ao microcrustáceo A. salina foi determinada apenas pela
porcentagem de morte dos organismos em relação ao seu número total (10
larvas), na presença de diferentes concentrações da amostra teste, por 24 h [19].
O método consistiu em avaliar a morte das larvas de A. salina (cistos de camarão
disponíveis em lojas de alimentos para peixes), cultivando-os em diferentes
concentrações (17, 33, 67 e 83%) da amostra teste diluídas em 5 mL de água do
mar artificial (38 g L-1 de sal marinho). Após 24 h era feita a contagem dos
organismos sobreviventes, determinando-se a dose limite do poluente (CL50). Os
experimentos foram realizados em triplicata.
3. Resultados e Discussão
A descarga de efluentes coloridos no ambiente tem causado sérios problemas
ambientais. Os métodos geralmente utilizados no tratamento de efluentes
contendo corantes são os métodos físico-químicos. No entanto, a aplicação do
tratamento biológico tem sido mais atrativo, devido seu baixo custo e menor
impacto causado ao ambiente.
Devido a natureza recalcitrante dos azo corantes durante a degradação
aeróbica, o uso de consórcios microbianos tem demonstrado elevada eficiência
na degradação de alguns compostos azo. Segundo Watanabe and Baker [20] a
utilização de consórcios bacterianos contribui para que os microrganismos
possam agir em diversos poluentes.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
121
3.1. Descoloração do corante
No presente estudo, um consórcio bacteriano combinado contendo G.
stearothermophilus (UCP 986) e P. aeruginosa (UCP 992), mantidos numa
seqüência agitação-repouso-agitação foi realizado a fim de descolorir o azo
corante Alaranjado II. A taxa de descoloração do corante é mostrada na Figura 2.
Com 12 h de cultivo, mais de 50% do corante já havia sido removido. Neste
intervalo, (cultivo apenas com G. stearothermophilus) o processo de descoloração
ocorreu em parte por biosorção, visto que a biomassa foi prontamente colorida.
Segundo Chen [21], o acúmulo do corante, pode indicar toxicidade crônica às
células, onde a bioacumulação (para degradação ou armazenamento) é uma
condição necessária a sobrevivência da célula. Ainda nestas condições, a
biomassa celular apresentou um rendimento de 2,54 g L-1 (Figura 3). Após o
período de 24 h, apenas 10% do corante remanescente permanecia no meio,
indicando que a agitação moderada não afetou o processo de descoloração,
contribuindo ainda para aumentar a biomassa celular. Neste intervalo de tempo, a
descoloração ocorreu apenas por degradação, visto que a biomassa se
apresentava incolor. Nos frascos controle, sem a adição do microrganismo, não
houve alteração na cor.
Embora, os azo corantes tenham sido considerados como não sendo
biodegradáveis por bactérias, sob condições aeróbicas [14], devido a inibição da
enzima azoredutase pelo oxigênio [21], alguns compostos azo, têm sido relatados
como sendo reduzidos sob condições aeróbicas ou microaerofílicas [22].
No intervalo de tempo em que os frascos foram mantidos sob repouso (24 - 36
h) e P. aeruginosa foi adicionada ao meio, descoloração total e rendimento celular
máximo de 5,35 g L-1 foi observando. A etapa final (sob agitação) teve como
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
122
objetivo eliminar a presença de possíveis compostos facilmente oxidáveis,
formados durante a etapa de repouso. Nestas condições, os microrganismos já
apresentavam uma fase de declínio (biomassa 4,77 g L-1), provavelmente devido
à escassez de nutrientes (Figura 2).
A aplicação de consórcios na descoloração de corantes têxteis tem sido
bastante promissora, porque os microrganismos podem agir sinergicamente em
uma variedade de corantes e misturas de corantes, sendo degradados
principalmente, por co-metabolismo [20].
Alguns parâmetros foram analisados para análise do crescimento: faixa de pH,
consumo de glicose e dosagem protéica.
O pH diminuiu com 12 h (5,7), tendendo a faixa alcalina ao final do cultivo
(8,1). A diminuição inicial do pH é justificada pelo acúmulo de ácidos orgânicos,
resultante da degradação da glicose, quase totalmente ausente neste intervalo de
tempo. O aumento do pH, provavelmente ocorreu devido à formação de
compostos básicos, como por exemplo, aminas [23], sugerindo a degradação do
corante (Figura 2).
Segundo Adedayo et al. [24] a descoloração total do corante Vermelho de
Metila (5 mg L-1) usando um consórcio bacteriano, foi observada após 6 h em pH
6 e 7 e de apenas 82 e 65% em pH 8 e 9, respectivamente.
Com relação à adição do co-substrato, a glicose durante o co-metabolismo é
citada como realçando a eficiência de redução da cor. Segundo Van der Zee and
Villaverde [25] a descoloração dos azo corantes é um processo relativamente não
específico com relação ao seu doador de elétrons, no entanto, a presença de um
doador de elétron externo é um pré-requisito importante na redução dos azo
corantes. Mendez-Paz et al. [26] relataram que a taxa de remoção do corante
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
123
Alaranjado II foi altamente favorável quando a glicose era adicionada como co-
substrato. Por outro lado, Albuquerque et al. [28] citaram que a remoção de cor do
Alaranjado II sob condições anaeróbicas era muito baixa usando amido,
aumentando significantemente, com a adição do lactato.
O efeito favorável da glicose na degradação dos azo corantes ocorre devido o
aumento na formação de equivalentes redutores (flavina nucleotídeos), que são
responsáveis pela redução do corante [3, 28]. Por outro lado, mediadores redox
são bastante eficazes na redução de compostos azo, provavelmente devido a
natureza de seu grupo cromóforo -N=N-, que é eletronicamente instável e tem
capacidade de receber elétrons na forma reduzida do mediador [29].
Com relação à dosagem de proteínas totais (Tabela 1) analisadas no líquido
metabólico livre de células, se observou uma diminuição em torno de 50% ao fim
do cultivo, indicando um comportamento bioquímico clássico de absorção dos
nutrientes [30].
A ação de enzimas azoredutases insensíveis ao oxigênio envolvidas na
descoloração de alguns azo corantes, foi descrita por Zimmermann et al. [10]. A
partir daí, outros estudos demonstraram que algumas espécies bacterianas são
capazes de degradar aerobicamente estes compostos. Nachiyar and Rajkumar
[22] demonstraram a atividade de uma azoredutase (11U), como sendo
responsável pela redução da ligação azo na descoloração do Navitan Fast Blue
S5R.
Segundo Durán and Esposito [31] um número de enzimas oxidativas, como
peroxidases e/ou fenoloxidases podem agir em poluentes recalcitrantes
específicos, pela precipitação ou transformação para outros produtos, permitindo
assim, melhor tratamento final do disperdício.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
124
Considerando as informações da literatura, realizou-se testes de detecção da
atividade de fenoloxidase pelos microrganismos estudados. O teste foi realizado
usando ácido tânico e gálico como indicador e ambos os microrganismos
apresentaram atividade positiva. A adição de discos de oxidase bacteriana no
líquido metabólico livre de células também foi realizada, apresentando
positividade para este teste (Tabela 1).
Segundo Nachiyar and Rajkumar [22] Bacillus stearothermophilis (hoje
denominado G. stearothermophilus), tem sido considerado capaz de produzir
peroxidases. A lacase peroxidase independente produzida por uma espécie
bacteriana não identificada (BF2) foi citada como sendo a maior enzima oxidativa
envolvida na degradação de compostos azo [32]. Enquanto Flavibacterium é
capaz de produzir peroxidase na degradação aeróbica de compostos azo [33].
3.2. Avaliação da toxicidade
A porção não-biodegradável do corante formada durante o processo de
descoloração através de seus produtos intermediários ou compostos estáveis é
conhecida como sendo responsável pela toxicidade [34]. Segundo Carliell et al. [2]
as aminas aromáticas são mais tóxicas que seu composto original porque
penetram nas células dos microrganismos com maior facilidade.
Segundo Mendez-Paz et al. [28] a redução do corante Alaranjado II forma
como produtos intermediários, ácido sulfanílico e 1-amino-2-naftol, este último
quase nunca encontrado porque se auto-oxida rapidamente a 1,2-naftolquinona.
Devido a toxicidade apresentada por alguns corantes em seus intermediários
formados pela clivagem parcial da molécula, testes de toxicidade após a
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
125
descoloração do Alaranjado II foram realizados usando dois organismos
indicadores, à alga de água doce S. capricornutum e o microcrustáceo A. salina.
A toxicidade crônica foi avaliada usando S. capricornutum, sendo observada
inibição no crescimento dos organismos, quando expostos aos ensaios após 24 e
48 h de descoloração, em todas as concentrações testadas, quando comparadas
ao controle (Tabela 2).
Os valores da CL50 (concentração que causa 50% de inibição no crescimento
da alga) das amostras testes após 24 e 48 h de descoloração, calculados a partir
de curvas de regressão logarítmica (concentração da amostra versus inibição da
alga), foram de 17,8 e 8,7 mL (v.v-1), respectivamente. Segundo Reginatto [18], o
ensaio com algas, às vezes não permite diferenciar se o efeito causado pelas
amostras coloridas é um efeito tóxico real, ou, simplesmente, se a luz fornecida às
algas para seu crescimento, foi em parte, absorvida por estas amostras. Assim,
um outro bioensaio de toxicidade, empregando o microcrustáceo A. salina foi
realizado.
Os testes usando este bioindicador foram realizados em todos os intervalos de
descoloração estudados (12, 24, 36 e 48 h). Diferente dos resultados
apresentados para S. capricornutum, a toxicidade observada para A. salina
diminuiu com o decorrer da remoção do corante, ou seja, nas amostras com 12 e
24 h de descoloração, uma mortalidade de 37% e 17%, respectivamente, foi
observada apenas na maior concentração testada (83%), quando comparadas ao
controle. Nas amostras com 36 e 48 h de descoloração, a toxicidade foi
praticamente zero em todas as concentrações testadas. Assim, a diminuição na
toxicidade dos metabólitos formados no decorrer da descoloração, sugere a
degradação do composto. Segundo Isik and Sponza [34] uma seqüência de
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
126
processos biológicos anaeróbicos e aeróbicos são mais efetivos para reduzir a
toxicidade.
4. Conclusões
Baseado nisso, pode-se concluir que o consórcio microbiano contendo os
microrganismos G. stearothermophilus (UCP 986) e P. aeruginosa (UCP 992)
descolore efetivamente o azo corante Alaranjado II sob condições aeróbicas e
microaerofílicas, sugerindo a sua aplicação no tratamento de efluentes contendo
este composto e assim, podendo ser descarregado nos corpos d’água sem
causar danos a biota.
Agradecimentos Os autores agradecem à agência financiadora CNPq, FINEP/CTPETRO e
FACEPE pelo suporte financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.
Referências [1] P.K. Wong, P.Y. Yuen, Decolorization and biodegradation of methyl red by
Klebsiella pneumoniae RS 13. Water Res. 30 (1996) 1736-1744.
[2] C.M. Carliell, S.J. Barclay, N. Naidoo, C.A. Buckley, D.A. Mulholland, E. Senior,
Microbial decolorization of a reactive azo dye under anaerobic condition.
Water SA 21 (1995) p.61-69.
[3] P. Rajaguru, K. Kalaiselvi, M. Palanivel, V. Subburam, Biodegradation of azo
dyes in a sequential anaerobic-aerobic system. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54
(2000) 268-273.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
127
[4] N.H. Ince, G. Tezcanh, Treatability of textile dye-bath effluents by advanced
oxidation: preparation for reuse. Water Sci. Technol. 40 (1999) 183-190.
[5] S. Seshadri, P.L. Bishop, A.M. Agha, Anaerobic/aerobic treatment of selected
azo dyes in wasterwater. Waste Management 14 (1994) 127-137.
[6] B. Manu, S. Chaudhari, Anaerobic decolorisation of simulated textile
wasterwater containing azo dyes. Bioresour. Technol. 82 (2002) 225-231.
[7] Y. Ge, L. Yan, K. Qinge, Effect of environment factors on dye decolorization by
P. sordida ATCC 90872 in a aerated reactor. Proc. Biochemistry 39 (2004)
1401-1405.
[8] H.-J. Knachmuss, Basic knowledge and perspectives of biolimination of
xenobiotic compounds. J. Biotechnol. 51 (1996) 287-295.
[9] C.I. Pearce, J.R. Lloyd, J.T. Guthrie, The removal of colour from textile
wastewater using whole bacterial cells: a review. Dyes Pigm. 58 (2003) 179-
196.
[10] T. Zimmermann, H.G. Kulla, T. Leisinger, Properties of purified orange II
azoreductase, the enzyme initiating azo dye degradation by Pseudomonas
KF46. Eur. J. Biochemistry 129 (1982) 197-203.
11] T.E. Abraham, R.C. Senam, T.S. Shaffiqu, J.J. Roy, T.P. Poulose, P.P.
Thomas, Bioremediation of textile azo dyes by an aerobic bacterial
consortium using a rotating biological contactor. Biotechnol. Prog. 19 (2003)
1372-1376.
[12] M. Kudlich, M.J. Hetheridge, H.J. Knackmuss, A. Stolz, Autoxidation reactions
of different aromatic o-aminohydroxynaphthalenes that are formed during the
anaerobic reduction of sulfonated azo dyes. Environ. Sci. Technol. 33 (1999)
896-901.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
128
[13] C.O. O’Neill, F.R. Hawkes, D.L. Hawkes, S. Esteves, S.J. Wilcox, Anaerobic-
aerobic biotreatment of simulated textile effluent containing varied ratios of
starch and azo dye. Water Res. 34 (2000) 2355-2361.
[14] P. Nigam, I.M. Banat, D. Singh, R. Marchant, Microbial process for the
decolorization of textile effluent containing azo, diazo and reactive dyes.
Proc. Biochemistry 31 (1996) 435-442.
[15] S.C. Lin, K.G. Lin, C.C. Lo, Y.M. Lin, Enhanced biosurfactant production by a
Bacillus licheniformis mutant. Enzyme Microb. Technol. 23 (1998) 267-273.
[16] J. Konishi, Y. Ishi, T. Onaka, K. Okumura, M. Suzuki, Thermophilic carbon-
sulphur-bond-targeted biodesulfurization. Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997)
3164-3169.
[17] J.M. Harkin, J.R. Obst, Syringaldazine, an effective reagent for detecting
laccase and peroxidases in fungi. Experientia, 29 (1973) 381-387.
[18] V. Reginatto, Avaliação do ensaio de toxicidade com a alga Scenedesmus
subspicatus para o estudo de efluentes industriais. Tese de doutorado.
Campinas, SP, Brasil: Universidade Estadual de Campinas, 1998.
[19] B.N. Meyer, N.R. Ferrigni, J.B. Putnam, L.B. Jacobsen, D.E. Nichols, J.L.
McLaughlin, Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant
constituents. Planta Med. 45 (1982) 31-34.
[20] K. Watanabe, P.W. Baker, Environmentally relevant microorganisms. J.
Bioscience Bioeng. 89 (2000) 1-11.
[21] B.-Y. Chen, Understanding decolorization characteristics of reactive azo dyes
by Pseudomonas luteola: toxicity and kinetics. Process Biochem. 38 (2002)
437-446.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
129
[22] C.V. Nachiyar, G.S. Rajkumar, Degradation of a tannery and textile dye,
Navitan Fast Blue S5R by Pseudomonas aeruginosa. World J. Microbiol.
Biotechnol. 19 (2003) 609-614.
[23] S.T. Ambrósio, Remoção de corantes utilizados em indústria têxtil por
Cunninghamella elegans UCP 542. Tese de doutorado. Recife, PE, Brasil:
Universidade Federal de Pernambuco, 2002.
[24] O. Adedayo, S. Javadpour, C. Taylor, W.A. Anderson, M. Moo-Young,
Decolourization and detoxification of methyl red by aerobic bacteria from a
wastewater treatment plant. World J. Microbiol. Biotecnhnol. 20 (2004) 545-
550.
[25] F.P. Van der Zee, S. Villaverde, Combined anaerobic-aerobic treatment of
azo dyes - a short review of bioreactor studies. Water Res. 39 (2005) 1425-
1440.
[26] D. Mendez-Paz, F. Omil, J.M. Lema, Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under fed-batch and continuous conditions. Water Res. 39 (2005)
771-778.
[27] M.G.E. Albuquerque, A.T. Lopes, M.I. Serralheiro, J.M. Novais, H.M. Pinheiro,
Biological sulphate reduction and redox mediator effects on azo dye
decolourisation in anaerobic-aerobic sequencing batch reactors. Enzyme
Microb. Technol. 36 (2005) 790-799.
[28] D. Mendez-Paz, F. Omil, J.M. Lema, Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under batch conditions. Enzyme Microbial. Technol. 36 (2005a)
264-272.
[29] A.B. Santos, I.A.E. Bisschops, F.J. Cervantes, J.B. Van Lier, The
transformation and toxicity of anthraquinone dyes during thermophilic (55oC)
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
130
and mesophilic (30oC) anaerobic treatments. J. Biotechnol. 115 (2005) 345-
353.
[30] V.S. Andrade, B. Barros Neto, G.M. Campos-Takaki, A factorial design
analysis of chitin production by Cunninghamella elegans. Can. J. Microbiol.
46 (2000) 1042-1045.
[31] N. Durán, E. Esposito, Potential application of oxidative enzymes and
phenoloxidases-like compounds in wasterwater and soil treatment: a review.
Appl. Catal. B: Environ. 28 (2000) 83-99.
[32] R.C. Senan, T.E. Abraham, Bioremediation of textile azo dyes by aerobic
bacterial consortium. Biodegradation 15 (2004) 275-280.
[33] J.S. Cao, L.P. Wei, Q.G. Huang, S.L. Wang, S.K. Han, Reducing
degradations of azo dye by zero-valent iron in aqueous solution.
Chemosphere 38 (1999) 565-571.
[34] M. Isisk, D.T. Sponza, Monitoring of toxicity and intermediates of C.I Direct
Black 38 azo dye through decolorization in an anaerobic-aerobic sequential
reactor system. J. Hazardous Materials B 114 (2004) 29-39.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
131
Tabela 1. Concentração de proteína total e atividade enzimática, do líquido
metabólico livre de células no cultivo de Geobacillus stearothermophilus e
Pseudomonas aeruginosa, durante o processo de descoloração do Alaranjado II,
por 48 h a 40ºC
Ensaios Proteína total (g L-1) Atividade enzimática
(teste de oxidase)
0h 9,80 -
12h 6,60 +
24h 5,90 +
36h 5,20 ++
48h 4,80 ++
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
132
Tabela 2. Inibição no crescimento da alga Selenastrum capricornutum pelo líquido
metabólico proveniente do processo de descoloração do azo corante Alaranjado II
usando um consórcio microbiano, por 48 h a 40ºC
Inibição no crescimento da alga Selenastrum
capricornutum Concentração
(mL) 24 h (%) CL50
a (mL) 48h (%) CL50b (mL)
2,5 5 25
5 20 37
10 40 58
26 57
17,8
69
8,7
aCL50 24h: Eq: y = 22.654Lx(x) - 15.297 (R2 = 0.9912) bCL50 48h: Eq: y = 19.581Ln(x) + 7.6652 (R2 = 0.9674)
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
133
Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II.
N = N
OH
NaO3S
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 12 24 36 48
Tempo (h)
% D
esco
lora
ção
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
corante biomassa glicose pH
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
Biom
assa
(g L
-1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Glic
ose
(g L
-1)
Figura 2. Biomassa, pH, consumo de glicose e descoloração do azo
corante Alaranjado II usando um consórcio bacteriano, por 48 h a 40ºC.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
134
QUARTO ARTIGO
Processo de Descoloração e Detoxificação de um Efluente
Têxtil por Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas
aeruginosa e P. fluorescens, Isolados e em Cultura Mista
Manuscrito a ser submetido para publicação no periódico
Water Research
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
135
Processo de Descoloração e Detoxificação de um Efluente
Têxtil por Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas
aeruginosa e P. fluorescens, Isolados e em Cultura Mista
Norma S. Evangelista-Barreto1,4, Nelson Duran2,3, Lívia Cordi2, Regine H. S.
dos F. Vieira4, Galba M. Campos-Takaki1,5,6*
1Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, UFPE, PE, Brasil
2Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP, SP, Brasil
3Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes, SP, Brasil
4Instituto de Ciências do Mar-LABOMAR, UFC, CE, Brasil
5Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, UNICAP, PE, Brasil
6Departamento de Química, UNICAP, PE, Brasil
*Correspondência do autor: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química, Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50050-590 Recife – Pe, Brasil. Tel. +00-55-81-2119.4017; fax: +00-55-81-2119.4043. E-mail: [email protected]
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
136
RESUMO
A descoloração e detoxificação do efluente têxtil contendo o azo corante
Alaranjado II foram avaliadas usando três bioensaios contendo diferentes
combinações dos microrganismos Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas
aeruginosa e P. fluorescens, sob agitação e/ou repouso, com e sem adição de
nutrientes. Os resultados obtidos indicaram que a descoloração depende do tipo
de bioensaio e do tempo de cultivo. O Alaranjado II foi totalmente removido pelos
três bioensaios, na presença de nutrientes. A adição de glicose e extrato de
levedura aumentou efetivamente a eficiência do processo de descoloração
usando G. stearothermophilus. Em todos os bioensaios o pH do meio foi de 8,0 e
9,5. A remoção do carbono orgânico total (COT) nos bioensaios I (G.
stearothermophilus), II (P. aeruginosa e P. fluorescens) e III (consórcio dos três
microrganismos) foi de 70, 60 e 80%, respectivamente. A redução da demanda
química de oxigênio (DQO) variou em torno de 50-70%. Nos testes de toxicidade
usando Selenastrum capriconurtum e Artemia salina, redução parcial ou total da
toxicidade, formada a partir dos metabólitos produzidos durante a etapa de
clivagem da molécula do corante, foi observada apenas por Artemia salina,
quando comparada ao composto original.
Palavras-chave: efluente têxtil, descoloração, toxicidade, azo corante, consórcio.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
137
1. Introdução
Considerando à baixa fixação dos corantes durante o processo de tingimento
têxtil, uma descarga altamente colorida é perdida diretamente para o ambiente,
causando sérios danos ao ecossistema (Robinson et al., 2002). A presença de
pequenas concentrações de corantes nos efluentes é altamente visível e não
desejável, não somente devido à estética, mas principalmente, devido à redução
da luz, afetando o processo de fotossíntese (McMullan et al., 2001).
Neste sentido, as leis de proteção ambiental procuram ser claras quanto aos
critérios para lançamento de resíduos líquidos industriais no meio ambiente,
permitindo a eliminação dos resíduos somente após serem tratados, desde que
essa operação não implique na poluição das águas receptoras. Entretanto, a
degradação do ambiente prova à ineficiência desses tratamentos, sobretudo ao
supor que o ambiente pode tolerar determinado grau de poluição (Zanoni &
Carneiro, 2001; Uygur, 2001).
Os processos de tratamentos adotados pelas indústrias têxteis operam
basicamente por meio de sistemas físico-químicos, incluindo fotólise, coagulação,
ozonização, filtração por membranas ou avançados processos de oxidação
(APOs), dentre outros (Lin & Peng, 1996; Ciardelli et al., 2000; Ledakowicz et al.,
2001. Contudo, tais tecnologias para o setor têxtil, são consideradas dispendiosas
e de difícil manuseio (Robinson et al., 2001). Por outro lado, tais métodos
concentram os poluentes numa fase sólida ou líquida, requerendo tratamento
adicional ou de disposição. Os tratamentos biológicos, por sua vez, podem
promover a completa mineralização dos compostos poluentes, além de se
apresentar como uma tecnologia de baixo custo (Shaw et al., 2002).
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
138
O tratamento com microrganismos vivos ou inativados tem possibilitado a
remoção de corantes e efluentes têxteis, promovendo a descoloração através de
mecanismos enzimáticos e interações físico-químicas entre a molécula do corante
e os componentes da superfície de parede celular (Kunz et al., 2002; Aksu, 2005).
Adicionalmente, a complexidade dos consórcios microbianos se apresentam
como tecnologias alternativas que permitem agir em uma grande variedade de
poluentes (Watanabe & Baker, 2000; Senan & Abraham, 2004).
Segundo Seshadri et al. (1994) a descoloração de alguns azo corantes foi
realizada usando lodo ativado, em uma etapa anaeróbica e aeróbica. Neste
sistema, as ligações azo foram reduzidas na fase anaeróbica, resultando em
aminas aromáticas que foram degradadas aerobicamente via hidroxilação e
clivagem do anel aromático.
Uma outra rota a ser explorada é o emprego de microrganismos
termotolerantes ou termofílicos em sistemas de descoloração, uma vez que os
efluentes são produzidos em temperaturas elevadas (50-60ºC). Alternativamente,
as enzimas sintetizadas por estes microrganismos são de grande interesse no
âmbito biotecnológico. Este trabalho foi realizado na tentativa de investigar o
potencial de descoloração de um efluente têxtil usando o termofílico Geobacillus
stearothermophilus UCP 986 associado a Pseudomonas aeruginosa UCP 992 e
P. fluorescens CCT 4056.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
139
2. Material e Métodos
2.1. Microrganismos
Os experimentos foram realizados usando Geobacillus stearothermophilus
(UCP 986) e Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) pertencentes ao Banco de
Culturas no Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, UNICAP, Recife, PE, e
Pseudomonas fluorescens (CCT 4056), gentilmente cedida pelo Laboratório de
Química Biológica no Instituto de Química da UNICAMP, São Paulo, SP. As
linhagens foram mantidas em meio Ágar nutriente a 4ºC.
2.2. Alga
A cultura da alga foi adquirida da coleção de culturas de algas da EMBRAPA,
Jaguariúna, SP.
2.3. Corante
O corante do tipo azo reativo, Alaranjado II (C.I. 15510) foi adquirido da Sigma
(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA).
2.4. Efluente Têxtil
A amostra do efluente foi adquirida de uma indústria de tingimento de poliéster
na cidade de Americana, São Paulo, Brasil. As características físico-químicas do
efluente são apresentadas na Tabela 1.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
140
2.5. Condições Experimentais
2.5.1. Microrganismos e preparação do inóculo
G. stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens foram
cultivados em frascos de Erlenmeyers de 125 mL de capacidade, contendo 50 mL
do meio de crescimento caldo LB (g L-1: peptona 10, extrato de levedura 5, NaCl
10 e glicose 5, pH final 7,0 ± 0,2) (Konishi et al., 1997). Os frascos foram
incubados por 12 h sob agitação orbital de 150 rpm e temperatura de 35ºC para
Pseudomona aeruginosa e P. fluorescens e 50ºC para G. Stearothermophilus,
servindo como pré-inóculo.
2.5.2. Bioensaio I: Descoloração por G. stearothermophilus
O experimento foi realizado adicionando 1% do pré-inóculo (108 UFC mL-1) de
G. stearothermophilus em frascos Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL do
efluente diluído em água (50:50 v.v-1), a solução corante na concentração final de
0,050 mM (17,5 mg L-1) e uma solução de glicose e extrato de levedura a 0,25%
(v.v-1) (5 mL). O corante foi adicionado em virtude da falta de cor do efluente.
Paralelamente, frascos sem a glicose e extrato de levedura também foram
usados. O experimento foi mantido sob agitação de 150 rpm por 72 h, a 50ºC.
2.5.3. Bioensaio II: Descoloração por P. aeruginosa e P. fluorescens:
Nestas condições 1% de cada pré-inóculo (108 UFC mL-1) foi transferido para
frascos Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL do efluente diluído (50:50 v.v-
1), o corante na concentração final de 0,050 mM (17,5 mg L-1) e uma solução de
glicose e extrato de levedura a 0,25% (v.v-1) (5 mL). Frascos sem nutrientes
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
141
também foram comparados. O experimento foi mantido sob condições estáticas
por 48 h, a 35ºC.
2.5.4. Bioensaio III: descoloração utilizando um consórcio dos três
microrganismos
O experimento foi realizado nas mesmas condições do Bioensaio II, todavia
com agitação de 100 rpm por 48 h.
2.6. Procedimentos analíticos
2.6.1. Determinação do pH
O pH do meio livre de células foi medido a cada 24 h, usando um pHmetro
WTW 320/Set.
2.6.2. Determinação da demanda química de oxigênio (DQO)
Este método é utilizado para determinar o oxigênio necessário para oxidar
toda a matéria orgânica presente na amostra, que seja susceptível a um forte
agente oxidante, como o dicromato de potássio. O método utilizado foi o de
refluxo fechado colorimétrico APHA 5220 C5-12 (1995a), empregando dicromato
de potássio como agente fortemente oxidante (solução digestora), em meio ácido
(H2SO4), na presença de um catalisador (Ag2SO4), a elevada temperatura,
durante 2 horas. A análise consistiu em adicionar 2,5 mL da amostra teste, 1,5 mL
da solução digestora e 3,5 mL da solução H2SO4/ Ag2SO4 (solução catalisadora),
em tubo de digestão fechado, mantido a 150ºC, por 2 horas. A leitura de
absorbância foi realizada a 600 nm.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
142
2.6.3. Determinação do carbono orgânico total (COT)
As medidas da concentração de carbono total foram realizadas seguindo a
metodologia padrão APHA 6310B, 1995b), que se baseia na oxidação da matéria
orgânica catalisada a alta temperatura, empregando-se um analisador de carbono
orgânico total, modelo TOC 5000A (Shimadzu). Neste método, uma pequena
quantidade da amostra homogeneizada foi oxidada a 660ºC e catalisada por
platina adsorvida sobre óxido de alumínio. A água foi vaporizada e o carbono
orgânico oxidado a CO2, sendo quantificado por meio de um analisador de
infravermelho não dispersivo. O carbono inorgânico foi medido pela passagem da
amostra em uma câmara de reação que contém ácido fosfórico, na qual foi
convertido a CO2 e quantificado de maneira semelhante à descrita anteriormente.
O carbono orgânico total foi então obtido pela diferença entre o carbono total e o
carbono inorgânico.
2.6.4. Determinação da concentração do corante
A cada intervalo de 24 h, alíquotas de 2 mL foram centrifugadas a 10.000 g
por 8 min., para separação das células do líquido metabólico. A concentração do
corante no meio foi avaliada pela diminuição da absorbância, empregando
espectrofotômetro Hitachi modelo U-2000. O comprimento de onda foi fixado pela
absorção máxima do corante na região do visível, a 485 nm. A concentração do
corante foi calculada pela absorbância do caldo não inoculado e absorbância
residual do caldo.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
143
2.7. Testes de toxicidade
2.7.1. Toxicidade crônica
A toxicidade crônica foi realizada com a alga Selenastrum capricornutum,
segundo o método descrito por Reginatto (1998). Este teste consistiu no
crescimento da alga em diferentes diluições do efluente descolorido (2,5, 5, 10 e
26 mL), no meio mineral durante 72 h. O inóculo inicial foi de 106 cel mL-1 (Aa
0,160 a 680 nm). O crescimento da alga foi determinado por fluorescência
(fluorímetro modelo F-4500, Hitachi) a 680 nm, excitação a 435 nm. Os ensaios
foram realizados em triplicata para cada diluição da amostra teste.
2.7.2. Toxicidade aguda
Para este teste se utilizou a metodologia descrita por Meyer et al. (1982). O
método consiste em avaliar a morte das larvas de Artemia salina, cultivadas em
diferentes concentrações da amostra teste (17, 33, 67 e 83%) diluídas em 5 mL
de água artificial do mar, por 24 h. Em seguida, realizou-se a contagem dos
organismos sobreviventes, determinando-se a dose limite do poluente (CL50). Os
experimentos foram realizados em triplicata. O controle foi realizado contendo
somente água do mar.
3. Resultados e Discussão
A descoloração do efluente têxtil contendo o azo corante Alaranjado II foi
avaliada utilizando três diferentes condições experimentais. Os microrganismos
G. stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens isolados e em
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
144
consórcios foram usados no efluente contendo nutrientes (A) e efluente sem
nutrientes (B).
A ineficiência da descoloração aeróbica, inicialmente conhecida, tem sido
confirmada por vários pesquisadores (Wong & Yuen, 1996; Adedayo et al., 2004;
Senan & Abraham, 2004) e somente em alguns casos ensaios de toxicidade
foram realizados.
3.1 Descoloração do efluente
Quando comparando os três Bioensaios, observou-se que as melhores taxas
de remoção foram obtidas nos Bioensaios II e III e efluentes A e B. No Bioensaio
II e efluente B, a descoloração total ocorreu com 24 h, enquanto no Bioensaio II e
efluente A, a descoloração foi de 90%. Por outro lado, no Bioensaio III, observou-
se o contrário, ou seja, total remoção do corante no efluente A e remoção de 92%
no efluente B (Figura 1). Assim, a aplicação dos consórcios apresentou melhor
eficiência no processo de descoloração do efluente têxtil.
Segundo Chang et al. (2001), redução parcial e/ou completa clivagem na
ligação azo do corante Reativo Vermelho 22 foi observada por P. luteola, sendo
as enzimas azoredutases responsáveis pela clivagem do grupo azo.
A maior remoção do COT (80-90%) e DQO (50-70%) foi observada no
Bioensaio III e efluente A, enquanto no efluente B, foi de 80% e 76%,
respectivamente. No Bioensaio II efluentes A e B, a remoção do COT e DQO
ocorreu em torno de 60 e 50%, respectivamente (Tabela 2). Segundo Supaka et
al. (2004) nos processos aeróbicos, a presença de uma fonte de energia
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
145
disponível nos efluentes sintéticos, resulta na redução mais rápida da DQO,
devido ao crescimento celular e a manutenção da cultura.
A DQO restante presente no efluente, demonstra a recalcitrância do azo
corante, sugerindo que a sua remoção seja independente da atividade
degradadora (Mendez-Paz et al., 2005). Por outro lado, a baixa redução do COT é
sugerida pela biotransformação do azo corante em outros compostos
intermediários, como as aminas, porém sem nenhuma mineralização (Mendez-
Paz et al., 2005a). Segundo Supaka et al. (2004) a mineralização das aminas
aromáticas por meio do tratamento aeróbico, ocorre através de enzimas não
específicas que atuam na hidroxilação e fissão do anel dos compostos
aromáticos.
A re-coloração do meio (83%) foi observada no Bioensaio III efluente B (Figura
1). Resultados semelhantes foram encontrados por Libra et al. (2004) ao
estudarem a descoloração e parcial mineralização do corante diazo Reativo Preto
5 e observaram que a forma oxidada de um de seus metabólitos, que permanecia
no efluente aeróbico, apresentava cor, embora, nenhum traço do corante
estivesse presente. Hao et al. (2004) também relataram que o re-aparecimento da
cor pode ser causado pela modificação que a biomassa produz na molécula do
corante, que dependendo do arranjo formado, produz outros cromóforos coloridos
e também aminas, que ao serem parcialmente quebradas, podem ego-polimerizar
e formar compostos biológicos recalcitrantes e coloridos.
Com relação ao Bioensaio I, observou-se que a melhor remoção da cor (99%)
foi alcançada apenas com 72 h de cultivo, no efluente A (com nutrientes) (Figura
1). Este fato pode ser justificado pela baixa concentração do co-substrato,
evidenciado principalmente, no efluente sem nutrientes, que apresentou remoção
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
146
máxima da cor de 53%. A redução do COT e DQO foi de 60-70% e 45-50% para
o efluente A, respectivamente, e de 70% e 65%, respectivamente, para o efluente
B (Tabela 2). Nestas condições, re-coloração do meio também foi observada no
efluente B.
Embora, G. stearothermophilus tenha sido capaz de usar o corante como fonte
de carbono, a ausência de nutrientes, afetou o processo de descoloração,
apresentando uma remoção da cor inferior aquela observada em caldo Luria
Bertani (Evangelista-Barreto, 2004).
O aumento na eficiência da descoloração dos azo corantes requer doadores
de elétrons. Segundo Verma & Madamwar (2005) a glicose é a melhor fonte de
carbono usada na descoloração destes compostos. No entanto, em alguns casos,
outros substratos como acetato, etanol, amido, etc., podem ser mais indicados,
devido à própria natureza do substrato ou o microrganismo envolvido (Van der
Zee & Villaverde, 2005). Para Mendez-Paz et al. (2005a) a adição de glicose, fez
com que a remoção do Alaranjado II ocorresse mais rápida.
Por outro lado, os corantes quando reduzidos, também podem agir como
aceptor de elétrons na cadeia transportadora de elétrons (Adedayo et al., 2004).
Em alguns casos, na ausência de um doador de elétron como a glicose, os
substratos endógenos da biomassa fornecem equivalentes redutores necessários
à redução do corante (Van der Zee et al., 2001).
Segundo Van der Zee et al. (2000) a redução do Alaranjado II também pode
ocorrer na presença de 1-amino-2-naftol (1A2N) uma das aminas formadas, que
atua como mediador redox, acelerando a taxa de redução.
Com relação ao pH do meio, observou-se uma tendência alcalina (7,0 - 9,0)
em todos os Bioensaios, com exceção do Bioensaio I, efluente A (pH 6,6). A faixa
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
147
alcalina sugere a presença de possíveis compostos aminados, formados durante
a clivagem redutiva do corante (Tabela 2). A diminuição no pH se deve ao
metabolismo da glicose por G. stearothermophilus, formado compostos ácidos.
Os resultados da análise de variância realizada em função do Bioensaio e
efluente, são mostrados na Tabela 3. Devido o Fcalculado ter sido superior ao
Ftabelado, pode-se concluir, para um nível de significância de 5%, que o tipo de
bioensaio, tipo de efluente e a interação de ambos, afeta a descoloração do
efluente analisado.
O teste Tukey, calculado para comparar as médias dos Bioensaios, mostrou
para um nível de significância de 5%, que a diferença mínima significativa (dms)
de 4,994, foi menor que as médias calculadas para os Bioensaios II e III (~ 22),
logo, pode-se afirmar que as culturas contendo os consórcios (Bioensaios II e III)
são mais eficientes no processo de descoloração do efluente têxtil do que a
cultura no Bioensaio I. Quando comparando as médias do tipo de efluente (A e B)
encontrou-se uma dms de 6,264. Neste caso, apenas a condição A (efluente com
nutrientes) foi estatisticamente significativa (~12), podendo-se afirmar que o
efluente que recebeu os nutrientes, apresentou melhor eficiência de descoloração
do que o efluente sem nutrientes.
Dessa maneira, a degradação de compostos recalcitrantes com características
xenobióticas, usualmente requer atividade catabólica, que na maioria das vezes,
não pode ser exercida por um único microrganismo (Rajaguru et al., 2000). No
presente estudo, pôde-se observar que a aplicação de consórcios aumentou a
eficiência de descoloração do efluente têxtil e que a ausência de uma fonte de
carbono externa afetou fortemente a descoloração usando o termofílico G.
stearothermophilus.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
148
3.2. Avaliação da toxicidade
Os ensaios de toxicidade realizados após a etapa de descoloração dos
compostos azo, podem ser interpretados como evidências indiretas da formação
de aminas aromáticas e o seu potencial tóxico.
A toxicidade do efluente colorido após o processo de descoloração, foi
avaliada usando a alga S. capricornutum (toxicidade crônica) e o microcrustáceo
A. salina (toxicidade aguda). Com relação à taxa de crescimento da alga, se
observa inibição em todas as diluições testadas, quando comparadas ao controle
(Tabela 4). Na concentração contendo 10 mL da amostra, houve inibição no
crescimento da alga em torno de 50%, com inibição de 100% na maior
concentração (26 mL). A amostra do efluente sem a adição do corante, não
apresentou inibição no crescimento das algas. Os valores da CL50 (concentração
que causa 50% de inibição no crescimento da alga), obtidos a partir de curvas de
regressão (Freire, 2002) são apresentados na Tabela 4. A maior CL50 foi obtida no
Bioensaio I, efluente B, que apresentou a menor descoloração do efluente.
Segundo Reginatto (1998) amostras coloridas podem não ser indicadas para
este tipo de teste, uma vez que a cor do corante, além da presença de moléculas
orgânicas, pode interferir na determinação da concentração da alga.
Em virtude da baixa eficiência apresentada pelo bioensaio contendo S.
capricornutum, toxicidade aguda das amostras foi avaliada usando A. salina.
Semelhantes às algas, estes organismos apresentam grande importância
ecológica por se encontrarem na base da cadeia alimentar de muitos
ecossistemas.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
149
Dessa maneira, diferentes concentrações da amostra teste (17, 33, 67 e 83%)
foram usadas para avaliar o percentual de mortalidade dos organismos,
comparando-os ao controle que não apresentava nenhum corante ou substância
tóxica (Tabela 5). Assim, a maior mortalidade (40-45%) foi observada na maior
concentração da amostra (83%). A menor inibição foi observada na amostra BII-A
(consórcio 1, efluente A), demonstrando a não formação de compostos mais
tóxicos. A CL50 não foi calculada, devido à baixa taxa de mortalidade observada.
Segundo Isik & Sponza (2004) a toxicidade de um efluente após tratamento
anaeróbico e uma seqüência anaeróbica-aeróbica, usando Daphnia magna,
demonstrou que a toxicidade da descoloração no efluente anaeróbico era maior
quando comparada a seqüência anaeróbica-aeróbica. Libra et al. (2004) relataram
que a hidrólise do corante Reativo Preto 5 antes do tratamento biológico
anaeróbico-aeróbico impediu a toxicidade, embora completa mineralização do
composto não tivesse sido alcançada.
El-Naggar et al. (2004) estudando a biotoxicidade do Cristal Violeta usando P.
aeruginosa, observaram que a toxicidade das amostras descoloridas foi reduzida
aquela da amostra controle (corante sem tratamento), sugerindo que durante a
descoloração, produtos intermediários ou mais tóxicos não foram formados.
4. Conclusões
O efluente têxtil usado pode ser biologicamente degradado sob condições
aeróbicas e semi-aerofílicas. Entretanto, a taxa de remoção da cor usando G.
stearothermophilus, é mais elevada na presença de uma fonte adicional de
carbono e nitrogênio. Por outro lado, a combinação Pseudomonas aeruginosa e
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
150
P. fluorescens apresenta maior eficiência no processo de descoloração do
efluente têxtil.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Sr. Francisco Adão Camargo (Técnico do
Laboratório de Química Biológica, UNICAMP, SP) pelas análises de COT.
Agradecemos também à agência financiadora CNPq, FINEP/CTPETRO e
FACEPE pelo suporte financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.
Referências
Adedayo, O., Javadpour, S., Taylor, C., Anderson, W.A., Moo-Young, M., 2004.
Decolourization and detoxification of methyl red by aerobic bacteria from a
wastewater treatment plant. World J. Microbiol. Biotecnhnol. 20, 545-550.
Aksu, Z., 2005. Application of biosorption for the removal of organic pullutants: a
review. Process Biochem. 40, 997-1026.
American Public Health Association – APHA, 1995a Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater, 19th Ed., Washington DC, No 5220 C5-
12.
American Public Health Association – APHA, 1995b Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater, 19th Ed., Washington DC, No 6310B.
Ciardelli, G., Corsi, L., Marcucci, M., 2000. Membrane separation for wasterwater
reuse in the textile industry. Resources Conserv. Rec. 31, 189-197.
Chang, J-S., Chou, C., Lin, Y-C., Lin, P-J., Ho, J-Y., Hu, T-L., 2001. Kinetic
characteristics of bacterial azo-dye decolorization by Pseudomonas luteola.
Water Res. 35, 2481-2850.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
151
El-Nagar M.A., El-Aasar, S.A., Barakat, K.I., 2004. Bioremediation of crystal violet
using air bubble bioreactor packed with Pseudomonas aeruginosa. Water Res.
38, 4313-4322.
Evangelista-Barreto, N.S., Franco, L., Vieira, R.H.S.F., Campos-Takaki, G.
Cinética de crescimento do Geobacillus stearothermophilus frente ao azo
corante Alaranjado II In: IX Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental.
Anais... Curitiba: Brasil. 2004.
Freire, R.S. Efluente de indústria papeleira: processos alternativos de remediação
e empregos de novas metodologias eletroanalíticas para determinação de
compostos fenólicos. Tese de doutorado. Campinas, SP, Brasil: Universidade
Estadual de Campinas, 2002.
Hao, J.O., Kim, H., Chiang, P.-C., 2000. Decolorization of wastewater. Crit. Rev.
Environ. Sci. Technol. 30 (4) 449-505.
Isik, M., Sponza, D.T., 2004. Monitoring of toxicity and intermediates of C.I. Direct
Black 38 azo dye through decolorization in an anaerobic/aerobic sequential
reactor system. J. Hazard. Mater. B 114, 29-39.
Konishi, J., Ishi, Y., Onaka, T., Okumura, K., Suzuki, M., 1997. Thermophilic
carbon-sulphur-bond-targeted biodesulfurization. Appl. Environ. Microbiol. 63,
3164-3169.
Kunz, A., Peralta-Zamora, P., Moraes, S.G., Durán, N., 2002. Novas tendências
no tratamento de efluentes têxteis. Química Nova 25, 73-82.
Ledakowicz, S., Solecka, M., Zylla, R., 2001. Biodegradation decolourisation and
detoxification of textile wasterwater enhanced by advanced oxidation
processes. J. Biotechnol. 89, 175-184.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
152
Libra, J.A., Borchert, M., Vigelahn, L., Storn, T., 2004. Two stage biological
treatment of a diazo reactive textile dye and the fate of the dye metabolites.
Chemosphere 56, 167-180.
Lin, S.H., Peng, C.F., 1996. Continuous treatment of textile wasterwater by
combined coagulation, electrochemical oxidation and activated sludge. Water
Res. 30 (3), 587-592.
McMullan, G., Meehan, C., Conneely, A., Kirby, N., Robinson, T., Nigam, P.,
Banat, I.M., Marchant, R., Smyth, W.F., 2001. Microbial decolourisation and
degradation of textile dyes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 81-87.
Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, N.R., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E.,
McLaughlin, J.L., 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active
plant constituents. Planta Med. 45, 31-34.
Mendez-Paz, D., Omil, F., Lema, J.M., 2005. Anaerobic treatment of azo dye Acid
Orange 7 under fed-batch and continuous conditions. Water Res. 39, 771-778.
Mendez-Paz, D., Omil, F., Lema, J.M., 2005a. Anaerobic treatment of azo dye
Acid Orange 7 under batch conditions. Enzyme Microb. Technol. 36, 264-272.
Rajaguru, P., Kalaiselvi, K., Palanivel, M., Subburam, V., 2000. Biodegradation of
azo dyes in a sequential anaerobic-aerobic system. Appl. Microbiol. Biotechnol.
54, 268-273.
Reginatto, V. Avaliação do ensaio de toxicidade com a alga Scenedesmus
subspicatus para o estudo de efluentes industriais. Tese de doutorado.
UNICAMP. 105p. Campinas - Sp. 1998.
Robinson, T., McMullan G., Marchant, R., Nigam, P., 2001. Remediation of dyes in
textile effluent: a critical review on current treatment technologies with a
proposed alternative. Bioresour. Technol. 77, 247-255.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
153
Robinson, T., Chandran, B., Naidu, G.S., Nigam, P., 2002. Studies on the removal
of dyes from a synthetic textile effluent using barley husk in static-batch mode
and in a continuous flow, packed-bed, reactor. Bioresour. Technol. 85, 43-49.
Senan, R.C., Abraham, T.E., 2004. Bioremediation of textile azo dyes by aerobic
bacterial consortium. Biodegradation 15, 275-280.
Seshadri, S., Bishop, P.L., Agha, A.M., 1994. Anaerobic/aerobic treatment of
selected azo dyes in wastewater. Waste Manage 15, 127-137.
Shaw, C.B., Carliell, C.M., Wheatley, A.D., 2002. Anaerobic/aerobic treatment of
coloured textile effluents using sequencing batch reactors. Water Res. 36,
1993-2001.
Supaka, N., Juntongjin, K., Damronglerd, S., Delia, M.-L., 2004. Microbial
decolorization of reactive azo dyes in a sequential anaerobic-aerobic system.
Chem. Eng. J. 99, 169-176.
Uygur, A., 2001. Reuse of decolourised of azo dyes containing dichlorotriazinyl
reactive groups using an advanced oxidation method. Coloration Technol. 117,
111-113.
Van der Zee, F.P., Letting, G., Field, J.A., 2000. The role of auto (catalysis) in the
mechamism of an anaerobic azo reduction. Water Sci. Technol. 42, 301-308.
Van der Zee, F.P., Lettinga, G., Field, J.A., 2001. Azo dye decolourisation by
anaerobic granular sludge. Chemosphere 44, 1169-1176.
Van der Zee, F.P., Villaverde, S., 2005. Combined anaerobic-aerobic treatment of
azo dyes – a short review of bioreactor studies. Water Res. 39, 1425-1440.
Verma, P., Madamwar, D., 2005. Decolorization of azo dyes using Basidiomycete
strain PV 002. World J. Microbiol. Biotecnhnol. 21, 481-485.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
154
Zanoni, M.V.B., Carneiro, P.A., 2001. O descarte dos corantes têxteis. Ciência
Hoje 29 (174), 61-64.
Watanabe, K., Baker, P.W., 2000. Environmentally relevant microorganisms. J.
Biosci. Bioeng. 89, 1-11.
Wong, P.K., Yuen, P.Y., 1996. Decolorization and biodegradation of methyl red by
Klebsiella pneumoniae RS 13. Water Res. 30 (7), 1736-1744.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
155
Tabela 1. Características físico-químicas do efluente têxtil proveniente de uma
indústria de tingimento de poliéster
Efluente Têxtil
pH 6,41
TOC (ppm) 489,40
DQO (mg L-1) 1.750
Coloração incolor
Condutividade 19 mV
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
156
Tabela 2. Remoção do carbono orgânico total (COT), demanda química de
oxigênio (DQO) e pH durante a descoloração do efluente têxtil
% de remoção Tratamentos
COT (ppm) DQO (mg L-1) pH
Bioensaio I-Aa 60 - 70 45 - 50 7,1 - 8,8
Bioensaio I-Bb 71 - 61 63 - 65 7,0 - 9,3
Bioensaio II-A 51 - 60 33 - 47 6,9 - 8,3
Bioensaio II-B 51 - 62 33 - 47 6,9 - 8,2
Bioensaio III-A 81 - 90 58 - 70 7,0 - 8,4
Bioensaio III-B 82 - 83 73 - 76 6,9 - 8,5
aefluente com nutrientes e befluente sem nutrientes.
I: Geobacillus stearothermophilus, II: Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e III:
consórcio com os três microrganismos.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
157
Tabela 3. Análise de variância da descoloração do efluente têxtil sob as
condições: tipo de bioensaio (sem consórcio, consórcio 1 e consórcio 2) e tipo de
efluente (com e sem nutrientes)
Causa Variação GL SQ QM Fcal Ftab
Consórcio 2 1305,5000 652,7500 156,6600 5,14
Efluente têxtil 1 408,3333 408,3333 98,0000 5,99
Interação
microbiana
2 1447,1666 723,5833 173,6600 5,14
Corante 6 25,0000 4,1667
Total 11 3185,9999
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
158
Tabela 4. Inibição e CL50 no crescimento da alga Selenastrum capricornutum em contato com as amostras provenientes do
processo de descoloração do efluente têxtil, usando diferentes tratamentos
Inibição no crescimento da alga Selenastrum capricornutum (%) Concentração
(mL) BI-Aa CL50
(mL)
BI-Bb CL50
(mL)
BII-A CL50
(mL)
BII-B CL50
(mL)
BIII-A CL50
(mL)
BIII-B CL50
(mL)
Controle 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2,5 25 4 45 27 35 40
10 58 5,0 35 7,0 39 5,0 50 5,9 49 4,0 42 5,5
20 66 74 57 52 91 51
26 100 100 100 100 100 100
aefluente com nutrientes e befluente sem nutrientes.
BI: Geobacillus stearothermophilus, BII: Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII: consórcio com os três microrganismos.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
159
Tabela 5. Avaliação da toxicidade por Artemia salina em contato com as amostras
provenientes do processo de descoloração do efluente têxtil
Percentual de mortalidade para Artemia salina Concentração
(%) BI-Aa
(%)
BI-Bb
(%)
BII-A
(%)
BII-B
(%)
BIII-A
(%)
BIII-B
(%)
Controle 0 0 0 0 0 0
17 20 0 0 0 20 10
33 40 10 0 10 30 10
67 40 20 0 20 40 20
83 45 40 40 40 40 40
aefluente com nutrientes e befluente sem nutrientes.
BI: Geobacillus stearothermophilus, BII: Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII:
consórcio com os três microrganismos.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
160
01020304050
60708090
100110
BI-A BI-B BII-A BII-B BIII-A BIII-B
Amostras
% D
esco
lora
ção
24h
48h
72h
Figura 1. Descoloração do efluente têxtil por Geobacillus
stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens,
durante 72 h de cultivo. A = efluente com nutrientes, B = efluente sem nutrientes BI = Geobacillus stearothermophilus, BII = Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII = consórcio com os três microrganismos.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
161
CONCLUSÕES GERAIS
A partir dos resultados obtidos conclui-se:
PRIMEIRO ARTIGO
- Geobacillus stearothermophilus (UCP 986), remove efetivamente o azo corante
Alaranjado II em condições de co-metabolismo, não gerando metabólitos
intermediários tóxicos.
- A presença da glicose como co-substrato e a agitação, promovem o aumento do
processo de descoloração do Alaranjado II.
- Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) é eficaz na degradação do
Alaranjado II apresentando baixa toxicidade.
SEGUNDO ARTIGO
- Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) apresenta elevado potencial de
descoloração do azo corante Alaranjado II em condições microaerofílicas.
- A adição da glicose como co-substrato não apresenta efeito significativo no
processo de descoloração do azo corante.
- Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) no processo de clivagem do corante
produz metabólitos no sobrenadante do meio com natureza recalcitrante.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
162
TERCEIRO ARTIGO
- O consórcio microbiano contendo Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) e
Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) descolore efetivamente o azo corante
Alaranjado II, sob condições aeróbicas e microaerofílicas.
- O azo corante clivado pelo mecanismo de degradação do consórcio microbiano
apresenta a formação de metabólitos tóxicos, que são reduzidos ao longo do
cultivo, sugerindo a mineralização total do azo corante.
QUARTO ARTIGO
- O corante Alaranjado II presente no efluente têxtil pode ser biologicamente
degradado sob condições aeróbicas e semi-aerofílicas.
- A taxa de descoloração do azo corante usando Geobacillus stearothermophilus,
é aumentada pela presença de uma fonte adicional de carbono e nitrogênio.
- A utilização de consórcio é mais favorável no processo de descoloração do
efluente têxtil, devido ao sinergismo empregado pelos microrganismos.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
163
ANEXOS
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
164
PRIMEIRO ARTIGO
TRIMMED SPEARMAN-KARBER METHOD. VERSION 1.5 ENTER DATE OF TEST: 28/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 13 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): L ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT: % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 1, 5, 20, 30 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 13 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina
RAW DATA: (%)
Concentration Exposed
Number Mortalities
Controle 30 0 17.00 30 1 33.00 30 5 67.00 30 20 83.00 30 30
SPEARMAN-KARBER TRIM: 3.33% SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 49.28 95% LOWER CONFIDENCE: 43.13 95% UPPER CONFIDENCE: 56.30
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
165
SEGUNDO ARTIGO
TRIMMED SPEARMAN-KARBER METHOD. VERSION 1.5 ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 1 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 1, 6, 7, 29 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 1 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina
RAW DATA: (%)
Concentration Exposed
Number Mortalities
Controle 30 0 17.00 30 1 33.00 30 6 67.00 30 7 83.00 30 29
SPEARMAN-KARBER TRIM: 3.33% SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 59,77 95% LOWER CONFIDENCE: 52,28 95% UPPER CONFIDENCE: 68,24
ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 2 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 2, 4, 15, 25 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 2 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina
RAW DATA: (%)
Concentration Exposed
Number Mortalities
Controle 30 0 17.00 30 2 33.00 30 4 67.00 30 15 83.00 30 25
SPEARMAN-KARBER TRIM: 16.67%
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
166
SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 60,18 95% LOWER CONFIDENCE: 52,31 95% UPPER CONFIDENCE: 69,22 ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 3 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 3, 1, 7, 29 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 3 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina
RAW DATA: (%)
Concentration Exposed
Number Mortalities
Controle 30 0 17.00 30 3 33.00 30 1 67.00 30 7 83.00 30 29
SPEARMAN-KARBER TRIM: 6.67% SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 67,98 95% LOWER CONFIDENCE: 62,10 95% UPPER CONFIDENCE: 74,41 NOTE: MORTALITY PROPORTIONS WERE NOT MONOTONICALLY INCREASING.
ADJUSTMENTS WERE MADE PRIOR TO SPEARMAN-KARBER ESTIMATION.
ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 4 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Corante Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 0, 4, 7, 6 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y MINIMUM REQUIRED TRIM IS TOO LARGE: 78.3, SO SK IS NOT CALCULABLE.
Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...
167
TERCEIRO ARTIGO
24 horas
y = 22,654Ln(x) - 15,297R2 = 0,9912
0
10
20
3040
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30
Concentrações da amostra (mL)
Inib
ição
de
cres
cim
ento
(%)
48 horas
y = 19,581Ln(x) + 7,6652R2 = 0,9674
01020304050607080
0 5 10 15 20 25 30
Concentrações da amostra (mL)
Inib
ição
de
cres
cim
ento
(%)
The Official Journal of the International Biodeterioration and Biodegradation Society
Guide for Authors Submission of papers Submission of a manuscript implies that the author(s) have the authority to publish the work and that it is not being considered contemporaneously for publication elsewhere. Submission of a multi-authored manuscript implies the consent of all the participating authors. All papers will be independently refereed. All manuscripts for International Biodeterioration and Biodegradation should be submitted electronically through Elsevier Editorial System (EES), which can be accessed at http://ees.elsevier.com/ibb. You will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The system automatically converts source files to a single Adobe Acrobat PDF version of the article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF at submission for the review process, these source files are needed for further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail and via the Author's homepage, removing the need for a hard-copy paper trail. The above represents a very brief outline of this form of submission. It may be advantageous to print this "Guide for Authors" section from the "Author Gateway" site for reference in the subsequent stages of article preparation. Types of contribution Contributions may be original papers, review articles, case studies, short communications, reports of conferences or meetings, book reviews, or news of forthcoming meetings. The subject and content of review articles should be discussed with the Editors prior to submission to the journal. All papers should be written in English. Format of manuscripts Wherever possible, authors should consult a recent issue of the journal for style and layout. Manuscripts that do not conform to the style of the journal or in which the English is poor may be returned to authors before they are accepted for reviewing. It is in the interests of authors who are not familiar with the correct use of English to have someone proficient in the English language check their manuscript before it is submitted. The Editors reserve the right to adjust style to certain standards of uniformity. Information on author-paid and pre-acceptance language editing services available to authors can be found at http://authors.elsevier.com/LanguageEditing.html. The manuscript should be prepared on a word-processor, in single-spaced typing on pages of uniform size with a 2.5cm margin all round. Artificial (hyphenated) word breaks should not be used at the end of lines. Footnotes to the text should be avoided. All pages should be numbered consecutively. The first page of the manuscript should give:- title of the paper; name(s) of author(s); address(es); and name, full post address, e-mail address, and telephone and fax numbers of the corresponding author, to whom page proofs will be sent. On the first page the author also needs to state what the scientific relevance of the paper is. Please note that papers with a routine nature and lacking originality, novelty, and uniqueness will not be accepted for publication. In general, the manuscript should not exceed 10 000 words, or about 20 printed pages. It should comprise the following sections: Abstract. This summary, consisting of about 150-200 words, should report concisely on the purpose and results of the work described. It should be followed by up to five keywords. Introduction. This should give (a) a salient background to enable the reader to understand and assess the study presented and (b) a statement of the aims of the study.
Materials and Methods. Enough technical information should be given in this section for the experimental work to be repeated. New methods should be described fully, but for established methods reference to published papers or readily available manuals is adequate. Results. Results should be presented as concisely as possible. Use should be made here of well-constructed tables and figures. The text here should not be used to reiterate or discuss the results presented in tables and figures, but should direct the attention of the reader to the important findings in them. Data should not be presented in tables and figures where they can be more concisely set down in the text. Discussion. This section should interpret and discuss the results in the light of previous work; it should not repeat at length material presented in the Introduction or Results. In Short Communications, the Results and Discussion sections may be combined. Acknowledgements. Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title or otherwise. References. Following the Harvard system, there should be a list of references in alphabetical order at the end of the paper, following the Harvard system. All references in this list must be cited in the text, and vice versa. The references should be indicated at the appropriate place in the text using surnames and year of publication, as in Canale-Parola (1992), Eaton and Hale (1993), and for three or more authors Bjordal et al. (2000). Where in a series, references should be in ascending order of year, as in (Daniel and Nilsson 1986; Canale-Parola 1992; Eaton and Hale 1993; Björdal et al. 2000). Where two or more papers by the same author(s) are published in the same year they should be cited as Smith (1995a), Smith (1995b), etc. When together in parentheses they should appear as (Smith 1992a,b). Each reference in the list should give names and initials of ALL authors, and the year and the exact title of the paper or book. For journals there should follow the full title, volume number (but not part number), and initial and final page numbers of the article; for books there should follow the name of the publisher and place of publication. The styles for contributions to edited books and proceedings, reports and online articles are shown below. Björdal, C.G., Daniel, G., Nilsson, T., 2000. Depth of burial, an important factor in controlling bacterial decay of waterlogged archaeological poles. International Biodeterioration and Biodegradation 45, 15-26. Eaton, R.A., Hale, M.D.C., 1993. Wood - decay, pests and protection. Chapman and Hall, London. Dillon, H.K., Heinsohn, Miller, J.D., (Eds.), 1996. Field guide for the determination of biological contaminants in environmental samples. American Industrial Hygiene Association, Fairfax, VA. Adan, O.C.G., 1994. On the fungal defacement of interior finishes, PhD thesis, Eindhoven University of Technology, Eindhoven, The Netherlands. Canale-Parola, E., 1992. Free-living saccharolytic spirochetes: The genus Spirochaeta. In: Balows, A., Truper, M., Dworkin, M., Harder, W., Schleifer, K.H., (Eds.), The Prokaryotes (2nd ed.), Vol. 4, Springer-Verlag, New York, pp. 3524-3536. Huang, S.J., Bell, J.P., Knox, J.R., Atwood, H., Bansleben, D., Bitritto, W. Broghard, W., Chapin, T., Leong, K.W., Natarjan, K., Nepumuceno, J., Roby, M., Soboslai, J., Shoemaker, N., 1976. Design, synthesis and degradation of polymers susceptible to hydrolysis by proteolytic enzymes. In: Sharpley, J.M., Kaplan, A.M., (Eds.), Proceedings of the Third International Biodegradation Symposium, Applied Science, London, pp. 731-741. Daniel, G., Nilsson, T., 1986. Ultrastructural observations on wood-degrading erosion
bacteria. IRG/WP/1283. The International Research Group on Wood Preservation, Stockholm. Carey, J., Grant, C., 2002. The treatment of dry rot in historic buildings. Cathedral Communications Ltd, online at http://www.buildingconservation.com/articles/rot/rot.htm. Unpublished data or private communications should not appear in the reference list. References to unpublished data will only be accepted at the discretion of the Editors. Units The SI system should be used for all scientific and laboratory data; if, in certain instances, it is necessary to quote other units, these should be added in parentheses. Temperatures should be given in degrees Celsius. The unit 'billion' (109 in America, 1012 in Europe) is ambiguous and should not be used. Abbreviations for units should follow the suggestions of the British Standards publication BS 1991. The full stop should not be included in scientific abbreviations such as h (not h.), m (not m.), and ppm (not p.p.m.); '%' should be used in preference to 'per cent'; 'per', as in mg per liter, should be written in exponential notation as mg l-1 (not mg/l). Where abbreviations are likely to cause ambiguity or cannot be readily understood by an international readership, units should be given in full. Greek symbols and unusual symbols used for the first time should be defined by name in the left-hand margin. Abbreviations Abbreviations of chemical or other names should be defined when first mentioned, unless the abbreviation is commonly used and internationally known and accepted, e.g. ATP, DNA, EDTA, GC-MS, GLC, HPLC, IU (International Unit). For approximately, use approx. or c. (not ca.); for versus, use vs (not v.); for the statistical terms standard deviation, standard error and standard error of the mean, use SD, SE, and SEM without definition. Nomenclature Authors should check all chemical, biochemical, and microbiological names before submission of the manuscript. Chemical Abstracts should be consulted for names of chemical compounds; The Merck Index, 13th ed., 2001, is a useful alternative source. For biochemicals, the Compendium of Biochemical Nomenclature and Related Documents, published for The Biochemical Society, London, by Portland Press (1992), should be consulted. Enzymes should be given the (trivial) names in Enzyme Nomenclature (Academic Press, 1992) as recommended by the International Union of Biochemistry and the assigned EC number appended. Latin binomials should be used for all organisms other than man and farm stock. At first mention in both the Abstract and the main body of the text the full names should be given, as in Mangifera indica, and thereafter abbreviated by using only the initial letter of the generic name, as in M. indica. Where several genera have the same initial letter (and abbreviation of the generic names might cause confusion), the full generic name should be retained. For common generic names in bacteria, the abbreviations standardly used, e.g. Staph., Ser., and Strep. for Staphylococcus, Serratia, and Streptococcus, should be employed. For the correct spelling of bacterial names, authors should consult Bacterial Nomenclature Up to Date http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm or List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature http://www.bacterio.cict.fr. For fungal names, the Index Fungorum http://www.indexfungorum.org/Names/Names.asp or Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th edition (Commonwealth Agricultural Bureaux International, Egham, Surrey, 1995) should be consulted. Preparation of electronic illustrations General points • Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork. • Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.
• Use only the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Helvetica, Times, Symbol.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide all illustrations as separate files and as hardcopy printouts on separate sheets.
• Provide captions to illustrations separately.
• Produce images near to the desired size of the printed version. A detailed guide on electronic artwork is available on our website: http://authors.elsevier.com/artwork You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here. Formats Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please "save as" or convert the images to one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below): EPS: Vector drawings: Embed the font or save the text as "graphics". TIFF: Colour or greyscale photographs (halftones): Always use a minimum of 300 dpi. TIFF: Bitmapped line drawings: Use a minimum of 1000 dpi. TIFF: Combinations bitmapped line/half-tone (colour or greyscale): A minimum of 500 dpi is required. DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft Office applications please supply "as is". Please do not:
• Supply embedded graphics in your word-processor (spreadsheet, presentation) document;
• Supply files that are optimised for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution is too low;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content. Language editing Information on author-paid and pre-acceptance language editing services available to authors can be found at http://authors.elsevier.com/LanguageEditing.html. Proofs PDF proofs will be sent by e-mail to the corresponding author. To avoid delay in publication, only necessary changes should be made, and corrections should be returned promptly. Offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail or, alternatively, 25 free paper offprints. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. Online Publication Your article will appear on Elsevier's online journal database ScienceDirect as an "Article in Press" within approximately 4-6 weeks of acceptance. Articles in Press for this journal can be viewed at http://www.sciencedirect.com/science/journal/09648305. An Article in Press may
be cited prior to its publication by means of its unique digital object identifier (DOI) number, which does not change throughout the publication process. Services Authors can keep a track on the progress of their accepted article, and set up e-mail alerts informing them of changes to their manuscript's status, by using the 'Track a Paper' feature of Elsevier's http://authors.elsevier.com Author Gateway.
Submission checklist Before submission, authors should ensure that the following has been done: One Author designated as corresponding Author, and the article includes his or her: • E-mail address • Full postal address • Telephone and fax numbers All necessary files have been uploaded • Keywords • All figure captions • All tables (including title, description, footnotes) are complete Further considerations • Manuscript has been "spellchecked" • All text, including References and Legend for Tables and Figures, is single-spaced • References are in the correct format for this journal • All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa • Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Web) • Colour figures are clearly marked as being intended for colour reproduction on the Web (free of charge) and in print or to be reproduced in colour on the Web (free of charge) and in black-and-white in print • If only colour on the Web is required, black and white versions of the figures are also supplied for printing purposes • Enclose papers that are important for the understanding or judgement of the submitted manuscript, but which have either been submitted or are in press and are not yet published • Enclose, if desired, the names of up to three potential referees For any further information please contact the Author Support Department at [email protected]