Desenho de Desenho de primerprimer e e otimizações de PCRotimizações de PCR

Éderson KidoÉderson Kido

Com base emCom base emhttp://http://www.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htmwww.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htm

Molecular Biology Techniques Molecular Biology Techniques ManualManual

Fatores que afetam a PCRFatores que afetam a PCR

Temperatura de denaturaçãoTemperatura de denaturação

Se o ácido nuclêico é aquecido em tampão de Se o ácido nuclêico é aquecido em tampão de força iônica < 150 mM de NaCl, a força iônica < 150 mM de NaCl, a temperatura de denaturação fica < 100temperatura de denaturação fica < 100ooC. C. Logo, a PCR trabalha entre 91-97Logo, a PCR trabalha entre 91-97ooC.C.

A meia-vida da A meia-vida da Taq Taq Pol a 95Pol a 95ooC é ~30min. C é ~30min. Logo, o número de ciclos não supera muito Logo, o número de ciclos não supera muito em 30.em 30.

Temperatura de denaturaçãoTemperatura de denaturação

Diminui após ~10 ciclos, pois o tamanho Diminui após ~10 ciclos, pois o tamanho médio do DNA alvo também decresce.médio do DNA alvo também decresce. moldes menores de 300bp (50% de CG) tem moldes menores de 300bp (50% de CG) tem

temperatura de denaturação de 88temperatura de denaturação de 88ooC.C.

Tempo de permanência: denaturação da Tempo de permanência: denaturação da TaqTaq. Em geral: 94. Em geral: 94ooC – 1min. C – 1min. Se reduzir o tempo, maior número de ciclos é Se reduzir o tempo, maior número de ciclos é

possível. Se aumentar a temperatura, diminua possível. Se aumentar a temperatura, diminua o tempo.o tempo.

Temperatura de anelamento (Ta)Temperatura de anelamento (Ta)

Depende do tamanho e composição dos Depende do tamanho e composição dos primersprimers..

~5~5ooC abaixo do menor Tm do par de C abaixo do menor Tm do par de primers.primers. Tm = 4(G + C) + 2(A + T)Tm = 4(G + C) + 2(A + T)ooCC Se Ta for muito baixo, Se Ta for muito baixo, primers primers podem anelar podem anelar

em alvos similares e amplificar produtos não em alvos similares e amplificar produtos não específicos. Se Ta for alto demais, a específicos. Se Ta for alto demais, a probabilidade do anelamento diminui e a probabilidade do anelamento diminui e a quantidade de produto também.quantidade de produto também.

Temperatura de anelamentoTemperatura de anelamento

Maioria dos Maioria dos primersprimers anelam em menos de anelam em menos de 30 s, a não ser que 30 s, a não ser que Ta seja muito próximo Ta seja muito próximo do Tm ou do Tm ou primersprimers muito longo.muito longo.

Tamanho do Tamanho do primerprimer

Geralmente de 18 – 22 basesGeralmente de 18 – 22 bases

Seqüência de 16 bases: estatisticamente -> Seqüência de 16 bases: estatisticamente -> uma vez em cada 4uma vez em cada 416 16 bases (~4 bilhões bases (~4 bilhões bases; ~ tamanho do genoma humano ou do bases; ~ tamanho do genoma humano ou do milho). milho).

Assim, seqüências maiores que 17 são Assim, seqüências maiores que 17 são específicas!específicas!

PrimersPrimers degenerados degenerados

PrimersPrimers com opções em diferentes locais com opções em diferentes locaisAmplificação de seqüências Amplificação de seqüências relacionadas em diferentes organismosrelacionadas em diferentes organismos

. . TCTCGAATTCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT NCCYAAYTGNCCNT

where Y = T + C, and N = A + G + C + T,where Y = T + C, and N = A + G + C + T,

Degeneração diminui a especificidade dos Degeneração diminui a especificidade dos primersprimers, aumenta ocorrência de , aumenta ocorrência de mismatches mismatches e e backgroundbackground..

Base deoxiinosina pareia com qualquer base.Base deoxiinosina pareia com qualquer base.

PrimersPrimers derivados de alinhamentos derivados de alinhamentos múltiplosmúltiplos

Temperatura de elongaçãoTemperatura de elongação

Elongação ocorre a partir da temperatura Elongação ocorre a partir da temperatura de anelamento. de anelamento.

Em ~70Em ~70ooC, a extensão ocorre com ~100 C, a extensão ocorre com ~100 bases/s (1 min é suficiente para produto bases/s (1 min é suficiente para produto de 2 kb; para 3 kb, até 3 min). de 2 kb; para 3 kb, até 3 min).

Normalmente 70-72Normalmente 70-72ooC, por 30s a 3 min.C, por 30s a 3 min.

Reação de PCRReação de PCR

Tampão de PCR:Tampão de PCR: 10-50 mM Tris-HCl pH 8.3,10-50 mM Tris-HCl pH 8.3,

até 50 mM KCl, >1.5mM MgClaté 50 mM KCl, >1.5mM MgCl22,,

primersprimers 0.2 – 1 uM (cada), 0.2 – 1 uM (cada),

50 – 200 uM (dNTP, cada)50 – 200 uM (dNTP, cada)

BSA até 100 ug/ml,BSA até 100 ug/ml,

Detergente não-iônico: Tween-20 ou Triton X-Detergente não-iônico: Tween-20 ou Triton X-100100 (0.05 - 0.10% v/v; previne agregação da (0.05 - 0.10% v/v; previne agregação da enzima)enzima)

Modernos são proprietáriosModernos são proprietários

ConsideraçõesConsiderações

PCR trabalha bem com tampão da transcriptase PCR trabalha bem com tampão da transcriptase reversa: logo, síntese de cDNA com posterior PCR.reversa: logo, síntese de cDNA com posterior PCR.

> 50 mM de KCl ou NaCl inibe a Taq, mas presença > 50 mM de KCl ou NaCl inibe a Taq, mas presença auxilia no anelamento.auxilia no anelamento.

[Mg[Mg2+2+] afeta anelamento, especificidade do produto, ] afeta anelamento, especificidade do produto, atividade enzimática... atividade enzimática... PrimersPrimers, dNTPs e moldes quelam , dNTPs e moldes quelam e seqüestram o íon. De 0,5 a 2,5 mM > [dNTP].e seqüestram o íon. De 0,5 a 2,5 mM > [dNTP].

PrimersPrimers: <1 uM (a menos que sejam degenerados); : <1 uM (a menos que sejam degenerados); geralmente 0,2 uM.geralmente 0,2 uM.

Nucleotídeos: ~50 mM (longos produtos exigem mais). Nucleotídeos: ~50 mM (longos produtos exigem mais).

Número de ciclosNúmero de ciclos

Depende da concentração do DNA alvo.Depende da concentração do DNA alvo.

40-45 ciclos amplificam 50 moléculas alvos até 40-45 ciclos amplificam 50 moléculas alvos até

[ ] igual a 25-30 ciclos, com 3x10[ ] igual a 25-30 ciclos, com 3x1055 moléculas. moléculas.

Se o produto não for feito em 30 ciclos, Se o produto não for feito em 30 ciclos, reamplificar (20-30 ciclos) 1 uL, com novo mix.reamplificar (20-30 ciclos) 1 uL, com novo mix.

Efeito plateauEfeito plateau

Atenua o acúmulo do Atenua o acúmulo do produto, qdo este atinge produto, qdo este atinge de 0,3 a 1nM.de 0,3 a 1nM.

Devido: degradação de Devido: degradação de enzima; depleção de enzima; depleção de dNTPs, dNTPs, primersprimers; inibição ; inibição pelo produto; competição pelo produto; competição por produtos não por produtos não específicos; re-específicos; re-anelamento, etcanelamento, etc

Nested Nested PCRPCR

PCR1 detecta a partir de 1000 moléculas; PCR2 detecta a partir de 1.

PrimerPrimer design design

Tamanho: 17-28 bases;Tamanho: 17-28 bases;Composição: 50% (C+G);Composição: 50% (C+G);Deveria terminar (3´) em G ou C;Deveria terminar (3´) em G ou C;Tm entre 50-80Tm entre 50-80ooC;C;Três ou mais Gs ou Cs (3´) podem causar Três ou mais Gs ou Cs (3´) podem causar misprimingmispriming em regiões ricas em G ou C (evitar); em regiões ricas em G ou C (evitar);Evitar Evitar primersprimers com complementaridade de com complementaridade de bases (dímeros de primers);bases (dímeros de primers);Evitar complementaridade de bases em mesmo Evitar complementaridade de bases em mesmo primerprimer (haipin, estruturas secundárias) (haipin, estruturas secundárias)

Problemas Problemas