desenvolvimento de matrizes polimÉricas...
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DESENVOLVIMENTO DE MATRIZES POLIMÉRICAS COMPOSTAS POR POLI (ε-CAPROLACTONA) E POLI (L- ÁCIDO LÁTICO) -
PCL/PLLA - COM TETRACICLINA PELA TÉCNICA DE ROTOFIAÇÃO. M. T.O. Machado¹, J.J.Bonvent¹, M.R.Manhani ², S. A. A. Pinto3, C. A. C. Zavaglia3,
A.R.Santos¹ ¹ Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH), Universidade Federal do ABC,
Santo André; ²Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo, Suzano; 3Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São
Paulo, Brasil.
Resumo. A rotofiação é uma técnica que surgiu para melhorar a produção de
fibras que podem ser usadas na regeneração ou cicatrização tecidual. As lesões de
pele são de grande interesse no mundo industrial, a produção de matrizes
poliméricas com o objetivo de auxiliar a cicatrização são cada vez mais importantes
devido às limitações dos produtos disponíveis. Foram construídas soluções
poliméricas compostas por PCL/PLLA (50/50%) e tetraciclina (TC), pela técnica de
rotofiação. Para analise morfológica foi utilizado o Microscópio Eletrônico de
Varredura (MEV), modelo JCM 6000(Jeol) e microscópio invertido de fluorescência,
modelo DMI 6000 (Leica). Obtivemos materiais fibrosos com diâmetro de fibras entre
2 a 5 µm. As fibras mostraram-se homogêneas na incorporação de TC indicando
uma boa incorporação da tetraciclina ao material. Nossos resultados apontam para a
produção de fibras em escala nanométricas e micrométricas incorporadas com TC,
sugerindo utilização para procedimentos na regeneração e cicatrização tecidual.
Palavras-chave: biomateriais, engenharia de tecidos, poli(ε-caprolactona),
poli(L- ácido lático), tetraciclina, cicatrização.
1.INTRODUÇÃO
Cerca de 1,5 bilhões de pessoas no mundo possuem algum tipo de doenças de
pele como consequência de maus cuidados ou do envelhecimento, apesar dos
avanços recentes na compreensão do processo de cicatrização de feridas e lesões
agudas e crônicas (Valacchi et al., 2012).
Anualmente, segundo dados da OMS, em todo o mundo, 11 milhões de
pessoas sofrem por queimaduras e são atribuídas a elas 300 mil mortes. Além disso,
mais de 6 milhões de pessoas sofrem de úlceras cutâneas, só nos EUA mais de 3
milhões de pacientes sofrem de feridas crônicas (Yildirimer; Thanh; Seifalian, 2012;
Pereira et al., 2013; Sun et al., 2014).
Estima-se que aproximadamente 1,5% da população sofrem de problemas
relacionados com a recuperação adequada da função da pele, citando em especial
os pacientes idosos ou aqueles com arteriosclerose, que podem facilmente sofrer de
úlceras e escaras (Valacchi et al., 2012).
Há um interesse mundial em lesões de pele devido as diferentes situações
clinicas, tais como os traumatismos, infecções, doenças autoimunes e feridas
agudas e crônicas que predispõem á infecções, a perda de água que gera a
hipotermia aumentando a morbidade ocasionando em internações prolongadas com
alto custo e até mesmo levando à morte (Ferreira et al., 2011; Valacchi et al., 2012).
Limitações como o implante de pele, têm impulsionado a procura de meios
alternativos, o interesse por materiais sintéticos ou biológicos que possam ser
utilizados como substitutos cutâneos são notadamente crescente (Atiyeh &
Costagliola, 2007; Ferreira et al., 2011).
A escolha do substituto cutâneo depende de fatores que envolvem o tipo,
tamanho e profundidade da ferida, presença de comorbidades do paciente assim
como a experiência do cirurgião. As opções disponíveis são os aloenxertos
(derivados da pele de cadáver); os xenoenxertos – derivados da pele de animais ou
os sintéticos que são construídos por Engenharia de Tecidos (Ferreira et al., 2011).
A Engenharia de Tecidos, termo criado durante o encontro da National Science
Foundation (NSF) em 1987, é uma técnica que se refere à combinação de métodos
da Biologia Celular e Tecidual com áreas da Engenharia e Cirurgia, para reparar ou
substituir o tecido lesionado e está interligada com a medicina regenerativa (Hench,
1998; Santos Jr et al., 2009; Atala, 2009).
Surgiu para auxilia na resolução do problema dos curativo de pele, a
necessidade de se criar um curativo que seja capaz de interagir com o tecido
lesionado acelerando o processo de cicatrização de modo que o tecido formado seja
o desejado, que a função original seja restabelecida e que o procedimento seja
reprodutível e de baixo custo se faz cada vez mais necessários. Desta forma, nosso
trabalho veio para somar com as poucas informações existentes sobre a rotofiação e
a produção de fibras.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Materiais utilizados.
Os polímeros estudados neste trabalho foram a poli(ε-caprolactona) (PCL) CAS
24980-41-04 com massa molar reportada de 70.000 g/mol, comprados da empresa
Sigma Aldrich e o poli L- ácido lático (PLLA) com massa molecular entre 185.000 e
259.000g/mol CAS 4511-42-6-95-6-5 fornecidos pela empresa PURAC. Os solventes
utilizados foram clorofórmio [CHCL3, 99%], acetona [(CH3)2CO, 99.5%] e
Dimetilformamida (CH3)2NC(O)H todos obtidos pelo laboratório Sigma Aldrich.
2.2. Preparação de solução da Blenda de PCL/PLLA.
Os polímeros foram utilizados nas proporções 50/50% (m/m). Os polímeros
foram pesados utilizando balança analítica, solubilizados primeiramente em
clorofórmio deixados sobre agitação mecânica por 1h. Foram preparadas soluções
nas concentrações 3%, 5%, 7% (m/v) utilizando o clorofórmio como solvente. Para a
solução denominada 20:80% (m/v), os polímeros foram pesados na concentração de
5% (m/v) e solubilizados em 80% de clorofórmio por 45 minutos e após foi
adicionada 20% de acetona sob agitação por mais 15 minutos.
2.3. Incorporação da Tetraciclina (TC) à Blenda.
Para a incorporação da TC ao material, pesou-se 250mg de TC e adicionou-se
a 1 mililitro de Dimetilformamida (DMF) sob agitação mecânica por 1h. A solução
contendo TC foi preparada utilizando 9ml de solução controle adicionando 1ml da
solução de TC.
2.4. Produção de matrizes poliméricas pela técnica de rotofiação.
Foi empregada a técnica de rotofiação para a preparação das amostras
utilizando equipamento disponível no Departamento de Engenharia de Materiais
(DEMA) da Faculdade de Engenharia Mecânica (FEM), Universidade Estadual de
Campinas (Unicamp), sob a supervisão da professora Dra. Cecília Amélia de
Carvalho Zavaglia. As condições ambientais no dia da preparação giravam em torno
de 23°C e 50% de umidade relativa do ar. Foram rotofiados 10ml de cada solução a
velocidade de 3554rpm. As soluções foram vertidas no aparelho de maneira manual
e produziram amostras em forma de fibras. As fibras serão denominadas conforme a
sua composição (concentração da solução polimérica), como demonstra a tabela 1.
Esta tabela também apresenta todos os componentes utilizados no preparo das
soluções.
Tabela 1. Soluções poliméricas utilizadas no preparo das amostras com a
nomenclatura
Nomenclatura Amostras Composição Massa % TC
F3% C Fibra 3% controle 10ml de CHCL3+ 150mg de
PCL+ 150 de PLLA
300mg PCL/PLLA -
F3%T Fibra 3% com TC 9ml da solução 3%C + 1ml de
TC/250mg
270mg PCL/PLLA
+250mg TC
48,07%
F4% C Fibra 4% controle 10ml de CHCL3+ 150mg de
PCL+ 150 de PLLA
400mg PCL/PLLA -
F4%T Fibra 4% com TC 9ml da solução 3%C + 1ml de
TC/250mg
360mg PCL/PLLA
+250mg TC
40,98%
F5% C Fibra 5% controle 10ml de CHCL3+ 250mg de
PCL+ 250mg de PLLA
500mg PCL/PLLA -
F5% T Fibra 5% com TC 9ml da solução 5%C + 1ml
de TC/250mg
450mg PCL/PLLA
+250mg TC
35,71%
F7%C Fibra 7% controle 10ml de CHCL3+ 315mg de PCL
+315mg de PLLA
700mg PCL/PLLA -
F7%T Fibra 7% com TC 9ml da solução 7%C + 1ml de
TC/250mg
630mg PCL/PLLA
+250mg TC
28,40%
F20:80%C Fibra 20:80%
controle
8ml da solução 5%C+ 2ml de
(CH3)2CO
500mg PCL/PLLA -
F20:80%T Fibra 20:80% 9ml da solução 20:80C+ 1ml de 450mg PCL/PLLA 35,71%
com TC TC/250mg +250mg TC
2.5. Análise de superfície por (MEV).
A morfologia das amostras foi caracterizada pelo aparelho de microscopia
eletrônica de varredura Jeol (Tokyo, Japão), modelo JCM 6000. Todas as amostras
foram afixadas em suportes e recobertas por ouro em metalizador Sputter Coater
(Scancoat Six), sob corrente de 20mA durante 1m15s com tensão de recobrimento
em 2.0Kv.
A morfologia de superfície foi analisada em aumento de até 1000x devido às
diferenças de espessura de cada material. As fibras foram esticadas para melhorar a
observação.
2.6. Espectroscopia na região do infravermelho por transformada de
Fourier (FTIR).
Para a análise de FTIR foi utilizado o Espectrofotômetro Perkin Elmer
(Massachusetts, EUA) modelo Frontier 100 FT-IR, no modo de refletância total
atenuada (ATR) na região de 4000 a 650 cm-1, com resolução de 4cm-1 e 32
varreduras com temperatura e umidade controladas. Equipamento está localizado no
Laboratório de Espectroscopia, Eletrônica e Óptica, na Universidade Federal do
ABC, Campus Santo André. A finalidade da análise foi verificar a presença dos
polímeros PCL/PLLA utilizados nas soluções poliméricas.
2.7. Microscopia de fluorescência.
2.7.1. Análise de Fluorescência
A fluorescência emitida pela molécula de TC é atribuída a sua estrutura
molecular conter anéis aromáticos. Utilizamos o microscópio de luz invertido de
fluorescência Leica (Wetzlar, Alemanha), modelo DMI 6000, para determinar e
quantificar a incorporação da TC.
2.7.2. Quantificação de TC
A produção de fibras e membranas ocorre de forma simultânea e para saber
qual a quantidade de TC foi incorporada as amostras fizemos o teste quantificação
usando a fluorescência emitida pela amostra e correlacionamos com a quantidade
de TC incorporada a mesma. Para isso, todos os parâmetros para obtenção e
captação das imagens foram padronizados utilizando o software Leica Application
Suite - LAS - AF6000 Modular System – Advanced Fluorescence. Foram utilizadas 3
amostras e selecionados 10 campos aleatoriamente, totalizando 30 valores, a partir
destes foi gerado um valor médio para cada amostra e foi posteriormente comparado
entre todas as amostras por meio de gráfico.
2.8. Análise Microbiológica.
Somente as fibras 7% foram submetidas aos testes de atividade antibacteriana,
devido a pouca produção de fibras obtidas a partir das demais concentrações. Os
testes foram realizados na Universidade São Judas Tadeu, sob a supervisão da
Professora Dra. Maria Raquel Manhani. O testes foram realizados em triplicata com
bactérias Staphylococcus aureus.
2.9. Cultura celular e toxicidade in vitro
Foram utilizadas células Vero, uma linhagem celular fibroblástica de células do
rim de macaco verde africano (Cercopithecus aeothiops), obtidas no Instituto Adolfo
Lutz, São Paulo, Brasil. Foram cultivadas em meio de cultura 199 (Lonza Group Ltd,
USA) com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB, Nutricell Nutrientes Celulares,
Campinas, SP, Brazil) a 37o C em estufa com 5% de CO2. Foram feitas trocas de
meio sempre que houvesse acidificação do mesmo e os subcultivos foram efetuados
duas vezes por semana. As células Vero são recomendadas para estudos sobre
citotoxicidade e interações entre células em biomateriais (ISO 10993-5, Kirkpatrick,
1992). As células Vero foram inoculadas em placa de cultura de 24 poços na
concentração de cerca de 4,0 x 105 células/poço (1,0ml) sobre as blendas de
PLLA/PCL (com e sem tetraciclina). Foram utilizados anéis de titânio como peso
para manter as amostras no fundo dos poços. As células foram mantidas em meio
199 com 10% de SFB a 37o C com 5% CO2, o meio foi trocado diariamente. Após
48hs de incubação o meio contido nos poços foi retirado e guardado para posterior
analise bioquímica. As amostras foram fixadas em Paraformaldeido 2,5% (em PBS
0,1M em pH 7,2) na própria placa de cultura e lavadas em água destilada duas
vezes. Então, foram fotografadas em microscópio invertido Zeiss Axio observer A1
com a objetiva de 20x. As imagens foram capturas pelo programa Axiovision.
3. RESULTADOS
3.1. Produção das amostras
A quantidade de fibras produzidas foi relacionada à concentração da solução,
as concentrações 3% e 4% não produziram fibras, as concentrações 5%, 7% e
20:80% produziram fibras em diferentes taxas, conforme demonstra a tabela 2.
Tabela 2. Produção de membranas e fibras utilizando 10ml de solução.
Concentração
Da solução
Fibras
3% Controle -
3% Tetra -
4% Controle -
4% Tetra -
5% Controle +
5% Tetra +
7% Controle +++
7% Tetra +++
20:80% Controle +
20:80% Tetra +
3.2. Aspecto macroscópico das amostras
A Figura 1 mostra o aspecto macroscópico das fibras obtidas pelo processo de
rotofiação. As fibras apresentam aspecto volumoso com aspecto de fios enovelados.
As amostras incorporadas com TC são amarelas por causa da cor característica das
TCs e as amostras controles são brancas, devido à cor dos polímeros PCL e PLLA.
Figura 1. Amostras produzidas pela técnica de rotofiação. Fibra controle
(branca) fibra incorporada com TC (amarela).
3.3. Análise de superfície por Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
3.3.1 Fibras
Em todas as fibras observam-se diferenças morfológicas significativas entre as
fibras controles e as com TC. Conforme pode ser observado nas figuras 2, 3 e 4.
3.3.1.1. Fibras 5%
Figura 2. Micrografia das Fibras 5%. Na F5%C observam-se poucas fibras e
predominância de esferas porosas. Na F5%T maior presença de fibras com esferas
menos porosas.
3.3.1.2. Fibras 7%
Figura 3. Micrografia das Fibras 7%. Na F7%C predominância de fibras e
presença de esferas porosas. Na F7%T poucas fibras, presença de esferas com
menor porosidade.
3.3.1.3. Fibras 20:80%
Figura 4. Micrografia das Fibras 20:80%. Na F20:80%C observam-se
predominância de esferas porosas com poucas fibras. Na F20:80%T presença de
muitas esferas sem poros com pouquíssimas fibras.
3.5. Análise de Fluorescência
Para identificar a TC as fibras foram submetidas ao teste de fluorescência e
verificou-se a incorporação da mesma em todas as amostras. Conforme a figura 5
demonstra.
Figura 5. Fibras com e sem TC. Campo claro observa-se Fibras sem emissão
de fluorescência. Campo de fluorescência com emissão de fluorescência somente
nas fibras incorporada à TC. Barra de aumento: 150 µm.
3.6. Análise de quantificação de fluorescência das Fibras
Para mensurar a quantidade de TC incorporada as fibras foram realizados os
testes de quantificação. O resultado da figura 6 demonstra que as fibras 5% e
20:80% incorporaram TC de forma equivalente e a fibra 7% incorporou mais quando
comparadas.
Fibras 5%T Fibras 7%T Fibras 20:80%T
10
20
30
40
50
Flu
ore
scê
ncia
(%
)
Figura 6. Gráfico da quantificação de fluorescência das fibras.
3.7. Teste microbiológico em Placas de Petri
Verificou-se atividade antibacteriana na F7%T, verificou-se halos com medidas
aproximadas em triplicata . Conforme a tabela 3 demonstram.
Tabela 3. Medidas dos halos formados pela atividade da tetraciclina
Amostra 1°amostra (mm) 2°amostra(mm) 3°amostra(mm) Média (mm)
7%T Fibra 21 21 21 21
3.8. Cultura celular e toxicidade in vitro
Somente as Fibras 7% foram cultivadas devido a falta de fibras nas demais
concentrações. Com 48h de incubação observamos nas amostras controles um
tapete celular confluente com grande quantidade de células com um padrão
morfológico semelhante ao controle de crescimento em placa. Por outro lado, nas
F7%T observamos células retraídas e/ou fragmentadas, condizentes com toxicidade
celular.
Figura 7. Imagens obtidas pela microscopia óptica de luz invertida das fibras
com células. Barra de aumento: 100 µm.
4. DISCUSSÃO
A técnica de rotofiação demonstrou que a formação de fibras é dependente da
concentração da solução polimérica. A concentração 3% e 4% não foi capaz de
gerar fibras, a concentração 5% produziu pouca quantidade e a concentração
20:80% que foi elaborada como comparativo de solvente produziu em escala
equivalente a concentração 5% demonstrando que a adição de acetona como
solvente, neste trabalho não influenciou positivamente o aumento da taxa de
produção das fibras. Apesar das análises das fibras em todas as concentrações,
somente a concentração 7% produziu quantidade favorável para uma possível
produção em larga escala. Demonstrando que quanto maior a concentração da
solução polimérica mais fibras são formadas. Tão pouco a inserção da TC promoveu
melhora na produção das mesmas.
No MEV foi observado em todas as fibras presença de esferas e fios com
diâmetro entre 2 a 5 µm, e em menor quantidade fios menores que 2 µm. A TC
influenciou na porosidade, demonstrando diminuição tanto nas fibras como nas
esferas. Somente nas F7%C foi observado fibras com poros. Na observação de
fluorescência, foram tomados todos os cuidados necessários de padronização de
parâmetros para que a emissão de fluorescência fosse igual para todos os materiais.
As fibras mostraram-se homogêneas, desta maneira, indicando uma boa
incorporação da tetraciclina ao material. Na análise quantitativa foi demonstrado
fluorescência de forma equivalente nas F5%T e F20:80%T e maior fluorescência nas
F7%T. No teste antibacteriano foi avaliado somente a F7%T devido a falta a pouca
produção das outras fibras, e demonstrou que a técnica de rotofiação não interferiu
na atividade de TC, formando halos de inibição nas placas de Petri. Porém, nos
testes em célula a quantidade de 250mg de TC foi citotóxica. Já as fibras controles
formaram tapete confluente de células demonstrando adesão e proliferação celular.
5. CONCLUSÃO
Nossos resultados apontam para a produção de fibras em maior escala a partir
da solução polimérica com concentração de 7%. A concentração de 250mg de TC
interfere na morfologia das fibras e na adesão celular, dependendo de ajustes para
serem utilizadas. As fibras controles são indicadas para procedimentos de
engenharia tecidual ou regeneração tecidual guiada.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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