desenvolvimento de preparado antigênico mitsuda-símile e ... · 1 prof. emérito da universidade...

Recebido em 18.11.2003.Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 01.06.2005. * Trabalho realizado na Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.1 Prof. Emérito da Universidade Federal do Paraná - UFPR, Dermatologista e Hansenologista, Pesquisador Titular - Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.2 Prof. Titular de Dermatologia PUC-PR. Diretor de Ensino e Pesquisa da Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.3 Prof. Adjunto de Dermatologia, PUC-PR, Hansenologista, Diretor de Assistência Médico-Social da Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.4 Dermatologista (in memoriam).5 Dermatologista Cirúrgica, Preceptora da Residência Médica na Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.6 Patologista da Santa Casa de Curitiba - Curitiba (PR), Brasil.7 Bacharel em Ciências Contábeis, Diretora-presidente da Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.

©2005 by Anais Brasileiros de Dermatologia

Desenvolvimento de preparado antigênico Mitsuda-símile esua avaliação em pacientes multibacilares Mitsuda-negativos*

Development of a Mitsuda-like antigen and its evaluation inmultibacillary, Mitsuda-negative leprosy patients*

Ruy Noronha Miranda1 Luiz Carlos Pereira2 Sérgio Fonseca Tarlé3

Rogério A. Nascimento4 Sandra L. de Mello5 Lismary A. F. Mesquita6

Ivone T. Dechandt7

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An Bras Dermatol. 2005; 80(4):355-62.

Investigação Clínica, Epidemiológica, Laboratorial e Terapêutica

Resumo: FUNDAMENTOS - A hanseníase, causada pelo Mycobacterium lepræ, manifesta-se por forma clínica denomi-nada paucibacilar, benigna, Mitsuda-positiva, imunocompetente, e por outra forma, denominada multibacilar, grave,Mitsuda-negativa, imunodeficiente. Doentes multibacilares, eliminadores de bacilos, são considerados os mantene-dores da endemia hansênica.OBJETIVOS - Os autores testaram cultura de micobactérias, obtida em laboratório, em pacientes Mitsuda-negativos, embusca de possível viragem imunológica.MÉTODOS - Com a cultura de micobactérias, foi preparado antígeno mitsudina-símile, que foi testado em 28 hansenianosMitsuda-negativos, os quais, após avaliação desse teste, foram submetidos a novo teste de Mitsuda. Outros 28 Mitsuda-negativos receberam a inoculação de placebo e, posteriormente, foram avaliados por meio de novo teste de Mitsuda.RESULTADOS - Nos pacientes inoculados com a mitsudina experimental houve respostas favoráveis: em 25 deles reaçõesmacroscópicas positivas, em quatro das quais, com granuloma tuberculóide. Avaliados por meio de novo teste deMitsuda, quatro deles responderam com típicas reações Mitsuda-positivas, com granuloma tuberculóide. Nos pacientestestados com placebo, as respostas foram negativas; a um novo teste de Mitsuda, houve uma resposta positiva.CONCLUSÕES – Em hansenianos Mitsuda-negativos, testados com mitsudina experimental, foram constatadas 14,29%de respostas favoráveis, com reações de Mitsuda-símiles provocadas por essa mitsudina; testados os pacientes, nova-mente, com o antígeno de Mitsuda, foram constatadas 14,81% de respostas favoráveis, com reações positivas.Palavras-chave: Antígeno de Mitsuda; Hanseníase; Imunidade celular

Abstract: BACKGROUND - Leprosy, a disease caused by Mycobacterium leprae, manifests itself into two clinical forms:the paucibacillary form is benign, Mitsuda positive and immunocompetent; the multibacillary form is severe,Mitsuda negative and immunodeficient. Multibacillary affected individuals, who release bacilli, are postulated tomaintain endemic leprosy.OBJECTIVES - The authors used cultivated mycobacteria to test Mitsuda negative patients, with the objective to induceimmune conversion.METHODS - A Mitsuda-like antigen was prepared from cultivated mycobacteria and tested in 28 Mitsuda negativeleprosy patients. All patients were evaluated and then submitted to a new Mitsuda test. A control group of 28 Mitsudanegative leprosy individuals were inoculated with placebo and later evaluated by a second Mitsuda test.RESULTS - Patients inoculated with the experimental Mitsuda antigen had favorable responses: 25 presented positivemacroscopic reactions and four were tuberculoid granuloma. When submitted to a second Mitsuda test, four individualspresented typical positive Mitsuda reactions, with tuberculoid granuloma. Among the control group inoculated withplacebo, the responses were negative, and there was one positive response observed for the second Mitsuda test.CONCLUSIONS - In Mitsuda negative leprosy patients tested with an experimental Mitsuda antigen, we observed14.29% of favorable responses, with Mitsuda-like reactions induced by the experimental Mitsuda antigen. When tes-ted again with the Mitsuda antigen, we observed 14.81% of favorable responses with positive reactions.Keywords: Mitsuda antigen; Leprosy; Cellular immunity

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356 Miranda RN, Pereira LC, Tarlé SF, Nascimento RA, Mello SL, Mesquita LAF, Dechandt IT.

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INTRODUÇÃOHanseníase é doença infecciosa crônica que

afeta globalmente cerca de 550.000 indivíduos porano.1 Causada pela bactéria Mycobacterium leprae(M. leprae), atinge primariamente a pele e o sistemanervoso periférico.2 A Organização Mundial da Saúde(OMS) lançou, em meados da década de 1980, umacampanha mundial cujo objetivo era eliminar a hanse-níase como problema de saúde pública (incidência <1/10.000 habitantes) até o ano 2000. No entanto, em2004, a doença ainda persiste em diversos países, comelevada prevalência, desde 1996.1 Como não existereservatório natural conhecido de importância bioló-gica para o M. leprae e o tratamento atual, fornecidogratuitamente pela OMS a todos os pacientes, é bas-tante eficaz na cura da doença, a origem desses novoscasos permanece obscura. O Brasil, com 40.000 han-senianos, é o segundo país do mundo em número dedoentes, só superado pela Índia.1

A manifestação clínica da hanseníase é bastan-te heterogênea. Segundo o critério clássico de classi-ficação das formas clínicas da doença proposto porRidley e Jopling,3 o paciente afetado pode apresentarum espectro de manifestações que varia entre as for-mas polares tuberculóide - mais branda e localizada -e virchoviana - sistêmica e mais grave. A hanseníasetuberculóide caracteriza-se por presença de poucaslesões de pele, raros bacilos detectáveis em biópsiade pele e nervos, e presença de forte resposta imuno-lógica celular tipo Th1 antiM. leprae. Pacientes comhanseníase virchoviana apresentam numerosas lesõesde pele, com presença abundante de bacilos e aner-gia a antígenos do M. leprae.3 As formas tuberculóidee virchoviana da doença correspondem aos tipos dehanseníase paucibacilar e multibacilar, respectiva-mente, preconizados pela OMS para fins de orienta-ção terapêutica.

Uma característica que distingue o M. leprae detodas as outras bactérias patogênicas à espécie huma-na é sua inabilidade de crescer em meios de culturaartificiais. Essa característica pode ser analisada hojesob a luz de dados recentes que indicam marcanteredução evolutiva do genoma do M. leprae.4

Comparativamente, enquanto o genoma do M. tuber-culosis contém mais de 4.000 genes, o do M. lepraecontém apenas 1.600 seqüências abertas de leitura(open reading frames, ORFs) previstas. Essa compara-ção sugere que o M. leprae perdeu cerca de 2.000genes desde que divergiu evolutivamente a partir deuma micobactéria ancestral comum, resultando emum parasita intracelular obrigatório altamente espe-cializado. A perda de função de genes envolvidos emvias metabólicas crucias oferece uma tentadora expli-cação para a impossibilidade de cultivo desse microor-ganismo.

Miranda e cols. obtiveram o crescimento demicroorganismos ácido-álcool-resistentes pela semea-dura de linfa cutânea de hansenianos multibacilaresem um meio de cultura original.5 Admite-se que umacultura de microorganismos é sugestiva de M. lepræse provocar, em testes cutâneos, respostas idênticas àsprovocadas pela mitsudina standard na reação clássi-ca de Mitsuda,6 isto é, respostas positivas nos pacien-tes paucibacilares (TT) hiperérgicos e negativas nosmultibacilares (LL) anérgicos. A utilização de uma mit-sudina bacilar experimental tipo Dharmendra,7 deno-minada C12-004 e preparada a partir das culturas obti-das por Miranda e cols., provocou forte resposta posi-tiva em pacientes miltibacilares não reagentes ao testede Mitsuda.8 Esse resultado sugere que a bactéria cul-tivada não era M. leprae. De fato, tipagens das cultu-ras obtidas por Miranda e cols., realizadas no InstitutoAdolpho Lutz de São Paulo e em Biomanguinhos, noRio de Janeiro, concluíram que a micobactéria cultiva-da era da espécie M. kansasii, conforme laudos ofi-ciais expedidos.

Estudos anteriores utilizaram diferentes prepa-rações antigênicas na indução de resposta imune empacientes hansenianos anérgicos.6,9,10 As observaçõesdos autores sugerem que uma mitsudina-símile prepa-rada a partir do microorganismo cultivado poderia sereficiente na indução de resposta imune ao antígenode Mistuda. Para testar essa hipótese, foi preparada einoculada em pacientes hansenianos anérgicos a mit-sudina-símile C12-004, sendo seus efeitos de induçãode imunidade avaliados por meio de subseqüenteteste de Mitsuda.

MATERIAIS E MÉTODOS1. Pacientes Cinqüenta e seis indivíduos adultos, de ambos

os sexos, sem doenças intercorrentes ou gravidez,portadores de hanseníase e Mitsuda-negativos, emdiversas fases de tratamento, foram sendo recrutadosrandomicamente entre os pacientes em tratamentoambulatorial na Fundação Pró-Hansen. O diagnósticoda doença foi efetuado por experientes hansenologis-tas com base em critérios clínicos, bacteriológicos, his-topatológicos e imunológicos (reação de Mitsuda). Aclassificação dos tipos clínicos da hanseníase foi feitacom base nos critérios descritos por Ridley e Jopling.3

Os pacientes foram reunidos em dois grupos de 28indivíduos; o primeiro, denominado "experimental",foi submetido à inoculação intradérmica da mitsudinaexperimental C12-004; o segundo grupo, denomina-do "controle", foi inoculado com um placebo. Todosos indivíduos recrutados foram instruídos sobre oprojeto de pesquisa, sem saber a qual grupo perten-ciam, instados a participar do mesmo e, uma vez con-


4. Mitsudina standardA mitsudina standard utilizada neste estudo foi

fornecida gentilmente pelo CPPI do Estado doParaná.

5. Inoculação dos pacientesTodos os indivíduos do grupo experimental,

constatada a negatividade da reação de Mitsuda,foram inoculados intradermicamente na face anteriordo antebraço direito com 0,1ml da mitsudina C12-004. Os indivíduos do grupo controle foram inocula-dos com 0,1ml da solução fisiológica. A leitura dosresultados das inoculações, em ambos os grupos, foirealizada conforme o cronograma da investigação,sendo consideradas positivas macroscopicamenteaquelas que responderam com a formação de umtubérculo com 3mm ou mais de diâmetro, biopsiadopara confirmação histopatológica. Depois de feita abiópsia excisional das respostas macroscópicas, todosos pacientes, como também os do grupo controle,foram submetidos a um novo teste de Mitsuda.

6. Análise estatísticaDiferenças entre a proporção de indivíduos

dos grupos experimental e controle que apresenta-ram resposta positiva à inoculação intradérmica commitsudina standard posterior à exposição à mitsudinaexperimental C12-004 foram estimadas utilizando-seo Teste Exato de Fisher.

RESULTADOSOs resultados obtidos nos 28 pacientes do

grupo experimental estão apresentados na tabela 1.Vinte e cinco pacientes (89,28%) apresentaram rea-ção macroscópica positiva à mitsudina experimentalC12-004 (Figura 1); quatro (pacientes 6, 13, 24 e 27),ou 14,29%, apresentaram imagens histopatológicastuberculóides Mitsuda-símiles (Figura 2); oito,pacientes (1, 5, 7, 10, 11, 14, 15 e 25) apresentaramrespostas histopatológicas contendo células epite-lióides ou gigantes (componentes da reação deMitsuda positiva; figuras 3 e 4); em 11 pacientes (5,6, 12, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 26 e 27) verificou-seausência de microorganismos na amostra histopato-lógica. Na seqüência, 27 pacientes do grupo experi-mental foram submetidos a nova prova de Mitsuda.Desses, quatro (14, 81%) responderam com reaçõesde Mitsuda positivas (Figura 5); em outros doispacientes (01 e 13), que também exibiram respostamacroscópica positiva, a análise histopatológica nãomostrou a formação de granuloma tuberculóide, e,por isso, foram consideradas falsas reações deMitsuda (Figura 6). Alguns pacientes que responde-ram macroscopicamente à inoculação da MitsudinaC12-004 mostraram respostas histopatológicas dis-

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cordantes, assinaram um Termo de ConsentimentoLivre e Esclarecido (TCLE). A execução do projeto foiautorizada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) daFundação Pró-Hansen.

2. Cultura de micobactériasConforme descrito,5 a cultura de micobactérias

utilizada no projeto foi obtida em plasma humano depessoa sadia, no desempenho de uma técnica origi-nal. O plasma contido em 20ml de sangue venoso dodoador, separado dos elementos figurados do sanguepelo repouso ou centrifugação, foi semeado com linfabacilífera de paciente multibacilar e mantido em estu-fa a 34ºC, até que, em caso de positividade, houvesseformação do sedimento brancacento, da massa bacilarem crescimento, por volta do quadragésimo quintodia de incubação. A análise óptica desse sedimentomostrou ser de microorganismos com todos os carac-teres morfológicos e tintoriais das micobactérias. Oimportante é que a análise seqüencial desse sedimen-to não o reconheceu como Mycobacterium lepræ,mas, sim, M. kansasii. O repique de sigla 191/39FYAfoi selecionado para o preparo da mitsudina experi-mental, que recebeu o rótulo de C12-004. Essa cultu-ra foi validada mediante o crescimento de seus repi-ques, em meio caldo-plasma.

3. Preparo da mitsudina C12-004A mitsudina experimental utilizada neste traba-

lho foi obtida segundo tecnologia do Centro deProdução e Pesquisa em Imunobiológicos (CPPI) daSecretaria de Saúde do Paraná, que é credenciadopara a produção e o fornecimento do antígeno deMitsuda e que realizou todas as provas de qualidadeda mesma. O conteúdo da cultura 191/39FYA foi trans-ferido para um balão de Erlenmeyer contendo 100mlde meio caldo-plasma, no qual foi homogeneizadopor agitação. Quatro alíquotas de 10ml dessa suspen-são bacteriana foram distribuídas em tubos de centri-fugação e centrifugadas até a separação dos microor-ganismos. O líquido sobrenadante foi decantado edescartado; o sedimento foi suspenso e lavado emsoro fisiológico, e novamente obtido por centrifuga-ção. Esse procedimento foi realizado mais uma vez, e,em seguida, o sedimento foi suspenso em 100ml desolução fisiológica fenicada a 0,5% para a contagem debacilos, que revelou ser 17x106 de microorganismospor mililitro. A suspensão foi envasada em frascos tipopenicilina, autoclavados a 120ºC durante 20 minutos,sendo submetida às provas de qualificação: dosagemde componentes químicos, esterilidade, inocuidade,reatividade cutânea, teste de necrose na cobaia e pH,todas satisfatórias e emitidas em laudos oficiais. O pla-cebo, participante da experiência, uma solução fisio-lógica, também foi submetido às provas mencionadas.

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cordantes: virchowiana (LL), paciente 04 (Figura 7);indeterminada (I), paciente 12 (Figura 8) (HE x400).11

Os pacientes do grupo controle, inoculadoscom o placebo, não forneceram respostas positivas àinoculação. Quando submetidos a subseqüente testede Mitsuda, apenas um deles apresentou respostamacroscópica positiva, que não foi analisada histopa-tologicamente. Não foi constatada diferença estatísti-ca significativa quando comparados os números deindivíduos de ambos os grupos que apresentaramreação de Mitsuda positiva posterior à inoculação damitsudina C12-004 ou do placebo (P = 0,351).

O permanente acompanhamento clínico dospacientes, durante a execução da pesquisa, não evi-denciou modificações significativas no curso próprio

da doença. Todos os pacientes prosseguiram com otratamento poliquimioterápico (PQT). Os surtos rea-cionais da hanseníase, tipos I e II, manifestaram-secomo é próprio dessa doença, durante o curso doProjeto, na população do grupo experimental(48,14%) e na do grupo controle (51,85%).

DISCUSSÃO A intradermorreação de Mitsuda é teste

usado na avaliação do tipo de resposta imune contraM. lepræ apresentado por um indivíduo.2 O resulta-do da reação de Mitsuda em pessoas sadias tem valorpreditivo quanto ao tipo de manifestação clínica dadoença a ser apresentada pelo paciente. Reação deMitsuda positiva indica intensa resposta imune celu-


FIGURA 1: Resposta à mitsudina C12-004, aos 25 dias FIGURA 3: Resposta tardia à mitsudina C12-004, imagens vir-chowianas e tuberculóides, BT (HEx100)

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FIGURA 2: Resposta granulomatosa à mitsudina C12-004, aos 45dias (HEx100)

FIGURA 4: Resposta tardia à mitsudina C12-004, imagens virchowianas e tuberculóides, BT (HEx100)



FIGURA 5: Reação de Mitsuda positiva induzida pela mitsudinaC12-004 (HEx100)

FIGURA 7: Resposta virchowiana (LL) em reação macroscópica pos-itiva à inoculação da mitsudina C12-004 (Zihelx400)

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FIGURA 6: Estrutura histopatológica de uma falsa reação deMitsuda (HEXx400)

FIGURA 8: Resposta indeterminada (I) em reação macroscópicapositiva à inoculação da mitsudina C12-004 (HEx400)

lar, tipo Th1, e está associada a baixo risco de desen-volvimento da forma virchoviana da doença. Poroutro lado, uma reação de Mitsuda negativa indicaresposta imune predominantemente humoral, tipoTh2, e alto risco de manifestação da forma sistêmica,multibacilar da hanseníase.12,13 Nesse contexto, consi-dera-se válido procurar induzir imunidade celularespecífica contra o Mycobacterium lepræ no hanse-niano anérgico (multibacilar, LL). A indução da posi-tividade do teste de Mitsuda tem sido obtida pelaexposição do doente anérgico a antígenos que não oM. lepræ. Na presente investigação, uma mitsudinaexperimental (C12-004) foi elaborada a partir de cul-tura de Mycobacterium kansasii, obtida de lesõescutâneas de portador de hanseníase multibacilar. Aobtenção de cultura de micobactéria que não o M.

lepræ a partir de lesão de paciente hanseniano mul-tibacilar assemelha-se a achados de outros autores,conforme descrito por Cochrane14 e, mais recente-mente, por Chakrabarty.6 A mitsudina C12-004, quan-do inoculada intradermicamente em pacientes anér-gicos, promoveu resposta imune celular específicaem 14,29% da população estudada. Esse resultadosugere capacidade de indução de imunidade celularcom antígenos presentes na própria mitsudina C12-004. Foi evidenciada a viragem imunológica em qua-tro dos 27 pacientes submetidos a uma nova exposi-ção a antígenos específicos do M. lepraæ, isto é, em14,81% da população estudada, que apresentaramreação de Mitsuda clássica positiva. Apenas umpaciente apresentou coincidência de resultados posi-tivos obtidos com a mitsudina C12-004 e a mitsudinastandard. Merecem atenção outros resultados da


mitsudina bacilar preparada com cultura de micobac-térias que não o Mycobacterium leprae.

A própria mitsudina experimental provocoureações positivas Mitsuda-símiles em quatro (14,29%)de 28 pacientes testados. Um posterior teste deMitsuda clássico respondeu, em outros quatro de 27(14,81%), com reações de Mitsuda positivas.

Admite-se que a porcentagem de respostasfavoráveis poderia ser mais elevada se a concentra-ção de microorganismos na mitsudina experimentalfosse superior a 17 milhões de microorganismos pormililitro.

A presença de células epitelióides e gigantes nosexames histopatológicos de respostas macroscópicas àmitsudina experimental, consignadas como BT natabela, em oito pacientes, foi interpretada como umatentativa dos respectivos organismos em desenvolverimunidade celular. A não-coincidência do padrão dasrespostas histopatológicas aos dois antígenos, mitsudi-na experimental e standard, faz admitir que o estímu-lo antigênico difere entre os mesmos. As respostas emque não foram vistas as bactérias injetadas com a mit-sudina experimental sugerem que os respectivos orga-nismos adquiram a capacidade de lisar as bactérias.

A inoculação de placebo em 28 outros pacien-tes de um grupo chamado "controle", não produziurespostas, e uma segunda testagem com a mitsudinastandard forneceu resposta macroscópica positivaem um paciente.

Não houve, nos dois grupos de pacientes,modificações apreciáveis no curso de suas doenças,sofrendo eles as costumeiras reações hansênicas nasfreqüências conhecidas. �

análise histopatológica obtidos com a inoculação daprópria mitsudina experimental, quais sejam, respos-ta parcial tuberculóide em oito pacientes e ausênciados bacilos inoculados com a mitsudina experimen-tal em 11 pacientes. As observações dos autores indi-cam ainda a ocorrência de duas falsas reações deMitsuda, constatadas na prova final, caracterizadaspela não-correspondência de granuloma tuberculói-de a uma resposta macroscópica positiva. Os 28pacientes do grupo controle não mostraram qual-quer resposta à inoculação do placebo. Quando tes-tados por meio de um segundo teste de Mitsuda,apenas um paciente respondeu macroscopicamente,não tendo sido essa resposta avaliada em exame his-topatológico. A ausência de significância estatística (P= 0.351) para a diferença entre o número de indiví-duos que apresentaram reação de Mitsuda positiva(1/28) é provavelmente devida ao pequeno númeroda população testada e sugere a replicação dos resul-tados em uma amostra ampliada.

Não foi interrompido o tratamento específicodos doentes durante o curso dos experimentos. Aocorrência de surtos reacionais em 48,14% dospacientes do grupo experimental e 51,85% do grupocontrole obrigou-os ao uso de corticóides e talidomi-da, o que pode ter influído negativamente nos resulta-dos, devido à ação imunomoderadora dessas drogas.

CONCLUSÕESO desenvolvimento do presente projeto permi-

tiu constatar que foi possível obter indícios de imuni-dade celular em hansenianos multibacilares, Mitsuda-negativos, por meio de injeção intradérmica de uma

AGRADECIMENTOSOs autores não poderiam ter realizado

os trabalhos do presente Projeto sem o valiosoapoio das seguintes entidades, às quais sãoimensamente gratos: à Diretoria da FundaçãoPró-Hansen, na qual tiveram curso os traba-lhos; ao CEP da Fundação Pró-Hansen, por terautorizado a execução do Projeto e emitido ospareceres relativos a seus oito relatórios tri-mestrais; ao CPPI do Paraná, pelo fornecimen-to da mitsudina standard e o preparo da mitsu-

dina C12-004; ao laboratório da Santa Casa deCuritiba, pela realização dos exames e fotogra-fias histopatológicos; à Conep do MS, por teracolhido todos os oito relatórios trimestraisreferentes ao Projeto; aos pacientes submeti-dos às provas, por seu espírito de colaboração.Um especial agradecimento ao professorMarcelo Távora Mira, por ter procedido a revi-são do texto.


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