design and fabrication of cd-like microfluidic platforms for diagnostics: microfluidic functions

10
Biomedical Microdevices 3:3, 245±254, 2001 # 2001 Kluwer Academic Publishers. Manufactured in The Netherlands. Design and Fabrication of CD-like Micro¯uidic Platforms for Diagnostics: Micro¯uidic Functions Marc J. Madou, 1 L. James Lee, 2 * Sylvia Daunert, 3 Siyi Lai, 2 and Chih-Hsin Shih 2 1 Department of Materials Science and Engineering 2 Department of Chemical Engineering The Ohio State University Columbus, Ohio 43210 3 Department of Chemistry University of Kentucky Abstract. In this paper, the design of a polymer based micro¯uidic compact disk (CD) platform is presented. Several micro¯uidic functions such as ¯ow sequencing, cascade micro-mixing, and capillary metering can be integrated into the CD by balancing the centrifugal force and the capillary force. These functions are demonstrated experimentally. For ¯ow sequencing, a two-point calibration design is used as an example to show how the release and ¯ow of ¯uids can be precisely controlled by the rotation speed of the CD. For cascade micro-mixing, a typical application is recon- stituting lyophilized protein. A simple metering technique based on bubble snap-off in the two-phase ¯ow is also described. Key Words. micro¯uidic, centrifugal force, capillary force, CD platform, ¯ow sequencing, micro-mixing, sample metering Introduction Current trends in biomedical diagnostics and drug discovery suggest a rapid growth in the need for high speed and high throughput chemical detection, screening, and compound synthesis. The main draw- backs of the existing technologies are their reliance on expensive instruments and large sample volume, a lack of portability, and an incomplete integration of sample processing. To accelerate drug delivery and therapeu- tics, contain high health care costs, and provide decentralized biomedical diagnostics (i.e., diagnostics for point-of-care), future technologies are moving towards increased miniaturization, integration, and automation. Microinstrumentation that is based on integrating large parallel arrays of miniaturized ¯uidic systems and sensors can greatly reduce reagent volume and sample contamination. It can also provide faster and more ef®cient compounding and separations in biome- dical and analytical applications. Tasks that are now performed in a series of conventional benchtop instruments can be combined into a single portable unit [1]. The major technical challenges in making a miniature biomedical instrument include: design and implementa- tion of necessary micro¯uidic functions; integration of these functions with complete automation; and develop- ment of cost-effective manufacturing technology [2]. Micro¯uidics is the manipulation of ¯uids in channels, with at least two dimensions at the micron scale. It is a core technology in a number of miniaturized systems developed for chemical, biological, and medical applica- tions [3]. A wide range of micro¯uidic components such as pumps, valves, mixers, and ¯ow sensors has been demonstrated [4]. The main challenge in making miniaturized systems is the integration of different micro¯uidic components to perform certain functions at high speed and high throughput. Integrated micro¯uidic systems have the potential for applications such as microreaction technology, on-chip ¯ow-through-PCR, bio-separation, clinical diagnostics, drug discovery and delivery, lab-on-a-chip technology, air bag triggers, and ink jet nozzles [5]. In this paper, we describe a compact disk (CD)-like micro¯uidic platform for biomedical diagnostics appli- cations [6]. The CD platform integrates a number of micro¯uidic functions. By spinning the disk, the centrifugal force overcomes the capillary force and the ¯uid is pumped from the center towards the edge of the disc. Control of ¯uid transfer from one reservoir to another is achieved by manipulating the spin velocity of the disc. By coupling the CD drive with a detection system, samples on the CD can be analyzed (e.g., based on adsorption or ¯uorescence). This micro¯uidic CD platform has the advantages of low-cost, easy operation, parallel detection, fast response suitable for point-of- care, and minimum sample usage (usually in sub- microliter range). A user only needs to place a drop of sample (e.g., blood or urine) on the CD, and a computer with a CD reader does the rest of the work. The user can also transmit the results via the Internet to the hospital or doctor's of®ce for medical consultation or for storing the data in a central data bank. *Corresponding author. 245

Upload: marc-j-madou

Post on 05-Aug-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

��������� ���������� ���� �������� ����� ���� ����� �������� ���� ��� � ��� ��!���� �� "�� #�!������ �

������ ��� ����� ��� �� ������� ����������� ��� ����� ���������� ���� ����������� ��� ����

���� �� ������� �� ����� ����� !"�#�� ������ �$

!�"� ����� ��� �%�%�&��� !%�%�

���'�� ��� �� �� ������ !������ ��� (�������������'�� ��� �� �%������ (���������� )%� *%�� ! � � +��#���� "

�������� *%�� ,$��-$��'�� ��� �� �%���� �" +��#���� " �� .�� ���"

/� ��� � $� !�� %�%��� !�� �� �&� � � %�'��� �� �� �����(��������%��! �� ) *+,- %�! ��� � %�� ��!��� .����� �����(����� ���!��� ��� � (�� �/������&� �� ���� �����0��1��&� �����%���' ��!����& ��� �� ��!�&��!�� ��!� !�� +, �' �������& !�����!�� �&� ���� ��� !�� ��%���' ����� "�� � ���!��� �������� !��!�� �1%������!�'� 2�� (�� �/������&� � !��0%���!������!��� �� �&� � � �� � �� �1��%� !� ��� ��� !�� ���� � ���(�� � (��� ��� �� %���� �' ���!���� �' !�� ��!�!��� %��� � !��+,� 2�� �� ���� �����0��1��&� � !'%��� �%%���!��� � �����0 !�!�!��& '�%���3�� %��!���� � ��%� ��!����& !�����/�� �� �� ������� ��%0� �� !�� !��0%�� � (�� � � � �� �������

.�" 0����� �����(������ ���!�� �&� ����� ��%���' ����� +,%�! ���� (�� �/������&� �����0��1��&� ��%� ��!����&

1� ����� ���

������� ������ � ���� �� ������� � ��� ����

�� ����� ������� � ���� ������ � ��� ���� ��� ���

����� ��� ��� ���������� ��� �� ���� ����

� ������� ��� ������� ��������� ��� ��� �����

� �� �� ��� ������ �� �������� ��� ���� ����� � ��

�������� ���������� ��� ����� ������ ������� � �� �

�� ��������� ��� �� � ������� ��������� �� ������

��� ������ �� � ������� ���� ������� ��� ���������

� �� ����� ��� ������ ��� ����� ��� ������

�� ��������� ���� �� ������� � ����� ������� �

��� �������� ����� ������ �� �������� ��� �����

������� � ������ ������������ ���������� ���

���������� ��������������� ���� � ���� ��

��������� ����� �������� ������ �� ��������� !��

������� ��� ������� �� ������� ���� � ������� ������

��� ������ ����������� "� �� ���� ������ ������ ���

���� ��# ��� ��������� ��� ���������� � ����

� �� ��� ������ �� ���� ������ ����� ���� ��� ���

��������� � � ����� �� ���������� �� ����

���������� �� � ����� ��� � ����� �������

��� $%&�

��� ��'�� �� �� �� ��������� � ����� � �������

���� �� ��������� � ����( ����� ��� ����������

��� �� �� ������ � ��!�� ��� ����) ��������� ��

����� ��� ���� ��� ������� ���������) ��� ��������

���� �� �������� ��� ������ ����� �� ������� $*&�

��!�� � � ��� ���������� �� !��� � ��������

��� �� ����� ��� �������� �� ��� � ��� � ���� "� � �

��� �� ������� � � ����� �� ��������� �������

��������� ��� ��� ��� ���� ��� ��� ��� �� ���� ��

���� $+&� ,��� ����� �� � ��!�� ��������� �� �

�� ������ ������� ������ ��� !�� ������� ��� ���

������������ $-&� ��� ��� �������� � �����

��������� ������� � ��� ��������� �� ��������

� ��!�� ��������� �� ������� ����� ��� ���� ��

��� ����� ��� ��� ����������� "��������� � ��!��

������� ���� ��� �������� ��� ���� ����� �� � ��

� ����� ��� �� �������� ��� �� !�����������.�/�

������������ �� �� ������� �� ���� �� ����� ���

�������� �������� �� �� �������� �� �� �������� ���

�� '�� ������� $0&�

"� ��� ������ �� ��� �� � ���� � ��� ��1�����

� ��!�� �������� ��� ���� �� ������� � �����

����� $2&� ��� �1 �������� ��������� � ����� ��

� ��!�� ��� ����� 3� ������ ��� ���� ���

��������� ��� � ���� ���� ��� ������� ��� � ��� ���

!�� � ������ ���� ��� ����� ������� ��� ���� �� ���

�� � ������� �� !�� �������� ���� ��� �������� ��

������� � � ����� � ���������� ��� ��� ���� �� ��

��� �� � 3� ������ ��� �1 ���� ��� � ���� ���

������� ������� �� ��� �1 �� � �������� ������ ����

�� ��������� �� !����� �� ��� ��� � ��!�� �1

�������� ��� ��� ���������� �� ���� ���� ���� ���������

�������� ���� ���� ���� �������� ������ ��� ��������

���� ��� ����� ������ ����� �������� � ���

� ������ ������� , ���� ���� ����� �� ��� � � ���� ��

������ ������ ���� �� ����� �� ��� �1� ��� � �������

��� � �1 ������ ���� ��� ���� �� ��� ����� ��� ���� ��

���� ������� ��� ������� �� ��� "������� �� ��� ������� ��

�� ���4� ��# � ��� ��� �� ���������� �� ��� ������ ���

���� � � ������ ���� ����

5������������ �������

�,2

6�� # ����� ��� �1 �������� ������ �� � ��������

����� ������� ����� � ��������� ��� �������� ������

��� � ��� �� ����� ��� � �������� ��������� ���������

�������� $2&� ��� �� ������ ��� !����������

�������� ����� ��� �� !�� ��� ����� ��� ��������

������ �� ������ �� �� �������� ��� �������� � �����

�7�� �� ���� ����� ��� �1�/8 ������ ����������

,�� ������������� ��� ������ ������� �� � �� ������

������ ������ �������� � ������� ��� ��� ������� ��� ���

���� ��� ������ ��� ������� � ��� ������� ��� �� �� ��

��� ����� � �� ��� ����� �� � ��!�� ��� ����� ���

����������� �� ������� ���� � ����� ���� �������

� ���� � .��� "" $9&�

����������� ��� ����

"� ����� �� ����� ��� !��� !�� ���� � ��������

������� ���� � ��� �1���������� � ����� �� ����������

��� ����� ��� ���� � :������� !��� �������������

������ ��� � ����:������� !��� 9; ���� �����

����� �36,� �������� ��� 36, ������� ����� �����

������ ������ ����� �� �� ���� �� ������ �� ��� �����

���� � �������� , ������ ���� �"6�8 ���� %<<1 �

��� ���� �� ��� ������ ���� ��� ���� �� ��� ���� �

���� ��� �� � �������� ��� ��� ������ �� ��� ���� �

���� ��� �� � � �� ������ ���� ,� ���� #���� �=�� �

"���������� � �������� �� #���� ��� ��������� � ���

�7��� , �������� ������� �� �.>+<*�+<<?=� 8 @?,�

� ���� ��� ���� ����� ��� ���� �� ��� ��� �������� ���

���� ��������� ��� !�� � ��� � �� ������ � ��������

� � ���� �7������ ������ ��� � �� �������� ���

%0< ��������+- ��������� �������� 0< ����� ���+- �� ����� ���� ��� ���� �� � ����� ����� ���������������������� ���� 6A�B � ������� �� ���

����������� ��� � �� ������ � ���� �� ��������� � �

������ ������������� � �. ,�� ���� ��� ������� �

���������� � ��� ������� C�� ������� �� � � ���

���� � !�� ��� � ���� ��� ����� ���� ��� � ����� ��

���� �� ���� ��� /������� ������� ��� �������� ���

����� �� ����� ��� 36, ������� !���� ������� ��� ���

� �� ������� �� �������� !�� ����� ��� ����� � C����

%�3� ���� ��� ����� ���� ���� ���� �� ������ � �����

�%<0 �� %<2 �� �%�� ��� ����� ������ 36, �������� ������ ������ ��� � :������� �7��� ��� ��������

�������� ���� ��� !�� ���� ���������� �� � ���� ���

� ��� D�����.�������� �7�����

� � ��-���%*B ��

�%�

����� � � ��� �������� !�� ����� �� � ���

���������� ������� �� ��� ������� �� �

��� �������� ���� ������ ��� ���� ��� ������� � � ����� ���� �� ��� !��� ��� � � ��� ������ ��

��� � �� ������� ����� ������� �� ��� ����� ����

��� ����� �� ������ ��� ���� � ��� ������ ��� ����� �

��� �� ��� ������� � ��������� !���

��� �� ������� ��� � � � ��

�,3 ��� �� ���

�'�� � ��!�� ��������� � ���� ������

������ ��� �� ������ ���� � ���� ����� ������

�����������) ��������� �� !��� ��� � �� ������� �� �

��������� ��������� ��� ���� ��� ������� !����

������� � �������� �������) ������) !�� ����

��� ������� �� ������) ����� ������ ������ �������)

������ ������� ��� ������) ��� ����������� ������ ��

��� !���� "� ��� ������ �� �� �� ��� ������ �� ��� �����

�� ����� � ��!�� ��� ���� � ���������� ���

��������� ��� ������� ��� �� �� ��� �1 ���������

C��� ��7��� �� ��� ������ ��� � ����� � �����

��������� !�� ��������� ��� ������� ������� ,

�� ��� � ������� ����� ������ ��7������ ����

�� ��� �1� , ����� �� ��7�� ���� �� ��� ��������

� ��� ��������� !�� �� � ���� ��� ����� ������

��������

��4 ��5������� " ��� ������� '��'������ �����'�����" #��#���=����� � ��!�� ��������� �� �������� ���� ���

������� ��� ������� � ���� �� ��� $2�B& ���

������ �� ��� �� � �� ��������� ��� ������� �� ���

�� �������� ��� ��� � ������ �������� !�� ������ "�

�������� ��� !�� ��������� �� � ��������� �� ����

����� ��� �� ����� �� ���������� "� ��� �������������

������ �� � �� ��� �� ���� � ����� ���� �� ������

��� ����� ��������� ��� ���� �� � �� ����� �� �

������ � ��� ����� ��� � ����� $2�E& �� �� ���� ����

�� � ��������� ������ �� � ���� ���� $2�%<&� ���

������ � ������ ��� ���� ��� ������ ��������

�������� ����� � ����� ���������� �� � ��� �������

����������� �� ��� ��� ���������� ������ ��� ������ �

����� ��� ��� �� � �� �������� � ����� ��

������� �� � ��� � ���� ������� .������������

��������� ���� ���� ��� ����� ��� ������� �� ���

����� ��� ��� ���� �� !��� ���� �� � ������� 8�

��� ����� ����� ��� �������� �� ��7��� �� � ��

��� ���������� �� ��� ���������� $%%F%0&� ��� ������

��� � $%2�%9&� ��� ��� ��������� $%B& ���� ���

��������� ���� ���� � ��� �������� ��� ������������

"� ��� ���������� �� ��� ����������� ��� ����� ��� ��

��� !�� ��� ��������� � ��� ����� ��� �� ������

��� �� #���� ��� �� ��� �� � ��� !���� "�

��� �������� �� ��� !�� � ��������� � ��� ����� ���

�� ��� �� #���� ��� ��� �� ��� �� ������ � ���

!���� @�� ��������� � ���� �� ��� ��� ��� ���� ���

���� � ����� ������ � �7�� ��� � ���� ����� � �� �

������ ������� ��� ���� ���� �� �� ��� �� ��

��������� ��� ����� ��� ������ � ������� ��� ��

���� ������ � ����� �������� � � ����� !�� �������

6� � ����� �� ��7��� � ��� ���� ���� ��� ���

�� ������ ������ ��� ��� � ������ ����� � ����� ����

��� ���� ����� ��� � � ��!�� ���� ������

D������� ���� ���� ��� ��� �� #���� ��� ������

�������� �� ��� ��������� �� !��� �� � ������ ��� � ��

�D �� �������� ��� ����� �������� ��� ��������

��� ��� � ��� �� ���� ��� ����� ��� �D ��7��������

$%E&� ������� ������� �� ���� � ���� ��� !��

���������� 6����� � ��� 3���� $*<& ���������� ���

���� � ����� ������ � �7�� ��� � ���� ����� � �

������ ��� �� �� !�� ������������ ��� ��������

������� ��� � � ���� �� ���� ��� !�� �� �

��� ���������� "� ��� ��� �� ������ ����� ������

$*%&� ��� ����� �������� ����� ���� ��� ������ �����

��� �� ��� ����� ����� ���� �7�� �� ���� �� ��� �7��

� ������� ��������� ��� ��� ���� �� ����� ���� �

����� �������� ��� �� ����� � ���� ���� ���� �� ���

� �������� ������� ������� ��� ���� � ��� �����

������ � ����� ��� ���� ��7��� ������ ������ �� ���

�� �� ������������ 3� �������� � ��������� �������

!�� ��������� � � ����� ������� ����������� ��� ��

��������� ��������� "� � ������ ���� � ����� ���� ���

������ ��� � ����� �� #�� !�� ������ ������� ������

����� �� ��� �� ����� �������� ��� �������� ��

������� ��� ��������� ���� �� !�� ���������� "� ��

���� � ����� ��������� ��� ��� ���������� ������

��� �� �� ��� �1�

,������ �������� �������� � ��� � ��!��

������ � ��� ���� �� ���� ��� ����� ��� !�� !���

����������� �������� ������ $*<�**F*-& �� ���#��

��� ����� �� ���� ������� ��7��� ����� ����� ��� ��

�������� � ������ �� ����� �� � �� � ����� �

������������ �D �� ������ ���������� ��� �7�� !��

��� �������� ���� ��� ��� �� ����� ������������ $*0&�

��� ������� �������� ��7���� � ��� ��� �� #���� �

������� �� ��� ��������� �� ��� !���� ��� ��� ���� ��

��� � ����� � �� G���� ������ $*2&� ,� ����������

������ � � �� ��� � ������ ������������� ���� ����� ��

��� ������� ��� � �� ���� ��� !�� � � ��� ��������

��� ��� ��� �� �������� � ���� �� � �������� �����

���� �������� ���� ��� ������� ��� �� ��� �������

������� �������� �������� ������ ��� ��� ��������� ��

��� ��7���� ��� ����� ����� ��� �������� � �������

/� ����� ��� ���� �� ����� ��� ����� ��� � ����� ���� ��

�������� ��� ��� � ������ ������ ��� ���� ����� �

������ � ��!�� ������� $2�B�*2F*B&�

"� ��� �1 ��������� ��� ��������� ��� � ������� ���

������ ��������� ���� ��� ������� ��� � �� '�� ����

���� !��� ��� ��������� � /. ���������� ����

���� HH�����44 ��������� ��� ������� ��� !�� �� !����

��� ��� ������� ��� �� �� � ��� ��� �� ������� ����

C���� *�� ��� ������ ��� � ��� ��� ���� ��� ��� ����� ��������� ��� � � ���� �(

���

��� ��*� �*�

����� � � ��� ������ �� ��� �7��� � � ��� �������

������ ��� �������� � � ������� ��� ���� ����� ��� �,6

���� �� �� ��� �1 ��������� ��� � � ��� ����� � �� ��7�� ������� ���� ��� ����� �� ��� �1�

"��������� �� �7����� �*� ���� � � �% �� � � �*���� $2&(

��� � ��*��* � �%���% � �**

�� ��* ��� ��

�+������ � � �7��� �� �%��*

*� ��� ������� ��� � ��� ���

���� ���� ��� �� ������ �� ������ � ���� �(

�� ��� �� �

!�-�

����� � � ��� ����� � ������ �� ��� !��� � � ��� ���� ������� ! � ��� ������� ��� ���� �� ��� �������� ��� � ���� ���� ���� ���� � ��� ������ $2&�

��� �7�� � �������� ���� ��� �������� ���� �� �

������� ���� ���� ��� ���� ���7��� � � ��� �������

����� �� �� � !��� ��� �������� ���� ���� ����������

��� ���� ���7��� �� ��� �� ������ ���� �7������ �+���� �-� � ���� �(

�� ��

� �� ��*� ��� �� � ��

�%*

�0�

����� ��� �7��� �� -!"�� � ��� ���������� ��������� ��� ������ ���� ��� �� ��� '�� ����

3� ������������ ������ ��� ������ ��������

��� ��� '�� ��� ��� ��� �� ����� ��� �� !��

��7��� �� �� � ��������

�� ����������� ��� !�� ��7��� �� ��� ���� � *�

���� ������� ����� ��� ��� �� ������� � �

��� ��� ���� $B�*B&� "� ��� ����� ���� C���� +�� ���

���������� �7��� ������ !�� �� ��� ������ �������� �

��� ����� �� ������ %� ���� %� ������ *� ���� *� ���

��� ������ � � ������ ��� ������� ����� �� ��� �1

��������� ��� ���� ������ �������� � ���� ���

�������� ��� ������ ��� ������ !���� � ����� ��

������� �������� ������ ����� ��� ��� �� ����

�������� ��������� ��� �������� ������ ��� ��������

"� ����� �� ���� ��� ���� ���7��� � �� �� � ���������

�:� � ���������� ����� ���� ������������� ����

���� ������� �.�� ����� %* � � �������� ���� ����

��� � *����� ������� ������ @� � ��� ��� ������

��� � !�� .� ����� � 6 �� � ���� ������ ���

����������� ����� ��� � ��!�� ������ � ����� �

C���� -� ��� ��� � ������� �� � ����� ����� ��� ��

0<<< ������� ������� � ?����� 3�� �� �� �� � �

���� ��� �� �� �� ���� �� ������ � ����� � ���� ��

1, %%0I:��� 6����� ��� ��� ������� ������ J���

��� ���� ������ �� ��� �1 ������ ����� � ��1 �����

�.������ ?.�K/***�� ��� ����� � ���������

���������� ���� � #��� ������ �� ��� �1 � ���������

� �� � ����� ��� ���� �� ��� �1 � ���� ���� �� �

������� �� � =�/ ��� ���� �������� C���� 0 ����� �

����� �� ��������� ����� ����� � ���� ���� 1������

����� ������� �������� ����� �� ���� ��� ��� ���� ��

��� ���� !��� ,� � ��� ������� ����� �0*- �������� ����

��� ������ % !�� ���� �� ��� ������ ��������� ����

��� ����� !��� ������ � ���� ���������� J��� ���

������� ����� � ������ � ������ ��� !��� �� ���� %�

������ *� ���� *� ��� ��� ������ ����� �� ��� ������

��� �� #����� ��������� � � ��� $� $��� ��

��� $� %� �$ ��� �������� � ��� ���� $���� ���

��� ,� &'$��������� ���$ � � �� ��� ���� ��������

�,7 ��� �� ���

�������� � ��� ���� ������ 3� ���� ���� ��� �� ��

�� ����� � ��� ����� ���� ��� ������ �� ��� � ����

!�� ����� �� � + ���� ���� �� ��� ��������� � ����� ��

��������� ����� � ��� ������ !��� C�� ����

���� ������ ��� ������ ������� ��� ��� � �������

D������� ��� ��!��� �� � �� �� ������ ��������

������ � �������� � ���� �� ������ ���� �� ���

������� ��������� ���� % ��������� ��� ������

�������� ��� ���� ���7��� �� ��� ��� �����������

C���� 2 ����� ��� ���� ������� �� ��� �:���� ����

�1�� ��������� ��� ������� � �� �:� �� ���� $9&�

��� ����������� ������� ����� ��������� ���� ��� ���

�� ������ ���� ���7��� ���

"� ������� ��� � ��!�� �������� ��� ����� ��

��������� ��� ������� ��� ���� �� �������� �����

C���� 9 ����� ����� ������ �� ��� *����� �������

������� J��� ��� ����� �� ��� ��������� ��� ������

���� �� ��������� �� � ����� �� ������������ ������

������ � ��� ��������� � ��� ����� ����� ���� ����� ��

���� �� ����� ��� ����� ��� ���� �7�� ������� �����

�������� 6���� ������ �� ����� ������ � ������ � ���

����� �� � ��� ������� ��� ���������� � ���� ����

���� �� ���� ��� ������� �������� ����� ��

��� ����� ,���� ��� ����� ������� ��� ��������

������ ��������� ������� ��� ��� ��������� � � ���

� ��!�� ���������� ��� �� ��� ����� "� ����� ��

������ ���� ��� ������ �������� � ��������� #���� ���

������ ����� �� � ����� ������ ��� ����� �� ��� ������

�������� ��� ��� ������� �� ���� �� ��� ������ ��������

��� ��� ����� �������� ��� ��������� "� 1���� " ��

C���� 9� ��� � ���� !�� ������ ������� ��� �����

������ �� ��� ������ ��������� ������ ���� ��� � ����

��� ������� "� 1���� ""� ��� ������ ���� � ��������

��� � ������� ���� ��� ������� ,������� ���� ������

��� 2� �� � ��(��� � � �� �$ ��� �������� � �)�����

������ ��� �������� � � ������� ��� ���� ����� ��� �,8

��� � ������ ��� ������ �������� �� ��� ������� #�� �

���� ����� "� 1���� """� ��� � ���� !�� ����� ���

��� ������ �������� ���� ��� ����� �� ��� ���� �������

������� #���� ��� �������

������� ��������9���3� ���� �� ��� � �������� !�� �������� ��� /�������

����� �� !�� !�� � ��� � ��!�� ������� �

��������� ����� �������� ���� ���� %�� ��� �� � ��

�������� !�� ����� ��� ���� � � ����� �� � ����

��������� ����� 1������ � ��� ��� ����� ��� � �

� ������� ��� �� ��� ������ �� ������ !��� 1����

�� � ������� � ��������� ���� �� � ������ ���

������� ���� �������� ��� ���� � ����� ��� ������

���� ���� !����

��� ����������� �� ��� ���� � ����� � ������ ���

!��� �� � � ����� � ���� �������� ����� 6��� �

���� ����� �� ����� ������ � ������� ���� �� ���

�� ��� �� �������� $*E�+<& �� ��������������# ����

$+%& ���� ��� ��������� ��� ������� , �����

������ � � �� ���� �� � !�� ��� ������� ������

!��� � ����� �� � ����� ��� ���� � ����� "�'� ��� ���

�7�� ��� ������� �7�� ��� � �������� �� � ����

��� ���� ���� $+<�+*&� ��� �� ��� ��� �� �����

� ������� � �� �� ����� ��� ������� ������ ��7����

��� ����� 6��� �� ��� ���� � ������ ������ �� �

���� ����� ����� ��� �������� ���� ����� ���� ��� ��

�������� � ��7���� $++&�

, ���� !�� #��� �� � ��������� ��� ��� �����

���� ��� �� ���� � ��� ��� �� � ���� ����� $+-&�

��� ����� ������� ���� ���� ��� ��� ����� "� �

���� ��# ��� ���� ���� ������ �� ��7���� ��������

�������������� "� ��� �������� ���� � ��!��

�������� ���� ��� ���� �� � � ����� � ��� ��

����� � ������ �� ��� ������ � �� �7�� ������� ����

���� �������� ���� ����� $+0&� ��� ����� � ������

��� � ��� ��� ������ ��� �� #���� �� �������� ��� ��

����� ��� ��� ��� �������� !�� ������� �� ����

������ ��� ��� ������� 6� ������ ���� ������� ����

��� ������������ $+0&� 8�� �� ���� ��� � � ���� ����

� ��� ����� �� ��� � ���!�� ������� 3� ������� ���

��� �� #��� �� ��� ����� � �� ��� ������ ���� ��� ��

������� ��� �� #��� �� ��� ����� � �� ��� �����

���� ��� ���� �� � � ����� ���� ��� !���

���� ��� ����� D������� ��� ��� �� ���� ������� �� ���

����� ��� �� ��������� �� !��� ��� ��������� ����

�� ������� ���� ������

��� �� ��� � ������ ���� ���� �� ������� ��� ���

�1 �������� � � ����� ���� ����� � C���� B�� "� ���

������ ��� ����� �������� � �������� % ��� ��������

������������� �� � ��� ������� ������ ���� ���� �� ���

'��� ���� � ��������� ���� �� ����� � ����

!��� ,� � !�� ��7��� ��� ��� ��������� ��� �

������� ��� ����� �������� ���� ��� ������� �����

������� ��� !�� �������� ��� ������ ���� ������� �� 6�

������ ������� ��� ������ � ������ ��� ���� � ���

��� ������ ������� �� ���� �� �� ��� ��� !�� ���

��������� ����� � ��� ���� ��� ��� $+2&� ��� ������

���� !��� ��� �������� * ����� � ���� ������ �

�� ����� 6� � � ����� ���� �� ��� ���� � ��� ������

������� ��� ����� ��������� ������ ������

���������� "� ����� �� ������� #�� �������� *� ���

����� ������ �� ��� ��� ����� �������� ����� ��

� ������� ������ ���� ��� ������ �� �������� *� ���

�� ��� ������� ������ ��� �� ����!�� ��������� ,����

��� ������ � ��������� ��� ������ ������� ��� � ������

������� ��� �������� ������������� �� � ����� �������

������ ���� ��� ���� ���� � ��������� ���� ���

)��� �� �#����� ������� �� ��� ���� ���(�����

������� �������� ���� 3���� ���7��� �� ��������

/������� J��� 1���� ��� ������ @����������

6����� %*9 2+�0 %*** %%*2

J��� * %*9 2+�0 %<+* %<*2

������� * *0- %*9 B+* B**

J��� % *0- %*9 2*+ 2**

������� % 0<B *0- -*9 0*-

��� 3� *��� ���(����� � �#� �+����#���� �� $���� �� ����� � �,�������

�2- ��� �� ���

������� �� ���� �� ���� !���� ��� ��� ������

�������� ��� ���� ���� C���� B ����� � �������� �� ��

��������� ���� ��������� ����� ���� �� ���

����� ������� ������� ���� �����

��'�����" �� ����� " ��� ���'����1������ �� ��� ���� ������� !��� ���� ��� �������� ��

������� � � ����� ��������� ��7��� � � �������� �

���� � ��!�� ���� ������ 6������ ������� ����

��� ��������� ��� ��� �������� ,� ��� �� �� ��7�� ��

����� �� ���� ������������� �7�� ����� ����

� �� ������� ��� ���������� ���� � ������� ��

� �������� ����� � ��������� ��� �� �������� $+9&�

��� �� ��7�� ������� ������������� #���� ���

� �� ������ �� �� � �������� ���� ��� ������� �

�7�� ���� � �'� ��� �� ������� � �������� ���

������� , ����� �7�� �������� ������ ���� <�0 ��

%*0 ��� ���� ������� ���� ��� �� ��7��� ,������

������ � �� ���� � �7�� ������ ���� � ������ ��������

�� � ����� �� ������� �������� ��� ��� ��� �� ���

�7�� !�� ��� �� ����!�� ������ ��� ��������

������� ������� �7�� ������� �� ���� � ��������

� ��7������ ����� � ������� ������ �� ��� ��� �

!�� ��7��� �� $2&� ����� �������� �������� ��7���

����� ���� ���� ����� ��� �������������

D���� �� ��� �� � ����� ������ � �� � ����

��� 6� %#��� -�$ ��� �������� � ��������

��� 7� ! ����� ��� ��'�� ������ .�/ 01 ����� � ��� �2 -1 � ��� $� ����2 31 ���$�� ���# ����)��2 41 ���� � #�����2 51 $� ��1 ��� .�/����� ��'����

������ ��� �������� � � ������� ��� ���� ����� ��� �2�

������ �������� J��� � ��� ��� � ��� �7������

!�� ������ ������� � ����� ���� � ��� ���� �� ��� �

����� �� �7��������� �� ����� ����� ���

�� ����� �� ��� HH��������44 ���������� ��� ���

��� ��� � /�������� �� ��� $+B&� J��� ��� ��� ���

������ � ����� ��� ������ #���� ��� � ������ �7���

��� ��� ����� ������ ��� ���������� ���� ���� ���

������ �7�� ������ � ��� ������� ��� �������� ���

����������� �������� �� ��� ��� ����� ���� ���

�������� �� ��� ������ �� ��� �������� �������

�������� ������� ������ � �7�� �������� �������

���� ��� ���� ��� ������ ��� ���� ������� L7�� � ����

����� ����� ��� ����� ��� ��� ����������� ����� �

� �������� �� � ������ ��� ����� ����� ��� ���������

��� ���� ��� ��� ��� �� ��� �������� � � ����� ����

����� � C���� E�

��� ����� �� ����� �� � ������ ��� ������

������� � � ��!�� ������� � ���� � #��� ������

�� �7�� � ������� ������ ��� ���� ���� ��� �������

���� C�� ��� ������� �� ����������� � � �� ������ ��� �

����� ��� ��� ������� ��� ��� ���� �� ����� �

C���� %<� ��� ����� �� ��� ������ ��� 29 ��� �� ������� %<< �� ��� ��� ����� ��� ���� ��� *< ��� "� ������ ���� ������� ��������������� �� � ����� ������ ,

:������� !�� ��� ��� ��� 1�� ������ *<<� 0<<

���� ��� ���� � ��� ����������� ��� �����������

����� ��� ��� ���� �� ��� ������� ��� !�� !�� �

� �� ������� �� ��� ��� ���������� ��� !�� �� ���

�� ��� ���� ��� � �� ������ ��� �������� � �

���� ������ , �������� �� ��� �������� � ����� �

C���� %<�

��� ������� ���� �� �� ��� ��� ��� �� � ���� ��

�� ����� ��� ������ ������� ����� ���(

��� ��6�

��2�

����� � ��� � ��������� ��� �� ���� ��� ����� � �������� ��� �7�� ��� 6� � ��� ������� ���� �� �� ��� ���

������

, ����������� �������� ��� � � ��#��� �������� ��� /���� $+E& ��

� � �� � �+��%

�9�

����� �� � ��� �������� ��� ��� �% � ��� ������ �����

�� ��� ���� � ���������� ������� ��� ���� �����

��� +��%

� � ��#��� �� ��� ������������� �� � ���

:������� �7�� #�� ����� � ��� ����� � ������

��� ��

3� ���� ��� ����������� ��� ��� ��� �������

����� ���� �� ��� ������� ��� ���� ��� ��� ��������

��� ��� ��� ������ ������� ����� � ����� � C����

%%� , ����� ��������� � ������� ��� ��� �����������

������� �� �������� ��� ��� ���� ��� ��� ����������

��� �������� ��� �� � ��������� ��

��� 8� #����� � ����� ���$� �� �� � ���� # �� �� ��� 7389� ��� �-� ! ��� #����� ������ � � ����� ���$� ���

�2� ��� �� ���

� � � � ��� <�2- �B������ � � � ������� �� ��� ���� � �7��� �� ++�2* � ��� ����

6� � ��� ����� � ������ ��� ������� !�� �������

� ��������� � ��� �������� ���� ��� ��� �7�� ������

������ ������� �� ��� ������ ���� ������ �������

�� � � ����� � ������������ ������� ��� ��������

�� ��� � �� ������ ��� ����� ���� ��� � ���������

��� ������ ��������� "������������ �� ��� �������

������ �� ��� �1 �������� � �������� �������� � ���

���

�����������

1���� �� � �1���� � ��!�� �������� ����� �� �

����� �� !�� ��� ���� � ���������� ����� ��� ����

���� ��� �� �������� ������������ ������� � ����� ��

���������� ���� ����� !���� ���� ���� ���� ��

���� �� !��� � ��� ���������� � ��� ��� ���

��� ����� ��� ��� ����:������� !�� ������ ���

���� � ��� ��������� ��� ������� ��� ��� ��� ���

������ ���� �� ��� ������ ����� � ��� ���� � ���

������� ��� ��� 8���� � ��!�� ��������� ���

������� ����������� �� !�� ���� ����� ��� ���� ���

��������� � ����� �� � ����� ��� ��� ������� ���

��� �� �� ��� �1 ���������

/����4�������

��� ������� ��� �� ����� ?��� K������ �� ?�����

3�� �� � ��� �� ������� �� ������� ��� ���� �

��������� � :,6, ��� ��� :6C ������ ��� "��������

6������ ��� ����������� ��"6 � �� ��� 8�� 6����

A��������

:���������

%� ,� ���� ��6� @����������� :� 3�������� @�G� � =���������

1�@� /������� ��� D� � J����� ,������ ��� ��� *0�%EE-��

*� �G� ����� ���������� � ��� �������� � ��/� .����� 3� �/����� %EE9��

+� � C���������� ����� @��� :��� �4� �C������ **� %EEE��-� .� ?�������� G� 3����'���� ��� 8�6� G������ G� ���� ��

������ �� %2B �%EE+��0� G��� ������� 1��� 1����� G�/� ,�������� 1��� ���� D� J��

8�G�,� 6 �������� ��� ?� � J�������� @�� ���������� ��� *9�*<<<��

2� �G� ���� ��� ?�G� K������� 6."@ .�� ������� +*0E� B<� 6��

G���� �, �%EEB��

9� L�G� L��� �G� ����� K�J� K������� 6� 1������� 6� L�� ��?� K���

M��G� G����� M� L�� ��� L� M�� 3���� �� ����� �� ��-��*<<%� � �������

B� �G� ����� M� L�� 6� L�� L�G� L��� ��� 6� 1������� �� �����

,������ 6������� 020 �*<<<��

E� G�3� C������ 6� ,������ �L� 3��������� G� �������� K� �������

�� ������� J� 1����� �� @����� G� C����� ��� 1� .��������� ����

����� �5� %E*9 �%EE+��%<� /� � ������� /� � J���� ��� /��� D���� "@@@ %EE<

A������� � 6������� .�� ������� +00� D�������� D" �%EE<��

%%� 1�G� D������� N� C��� K� C���� ��� K� 6����� 6��� 6���� 6����� O

, ������ J�������� *%� D���� D��� "������ 6� �%EE-��

%*� ��6� @����������� ?�G� � 3���� ,� .������ ��� � @����� ,����

����� 65� +-0% �%EE9��%+� G�/� J������ �,� 3����� ��� ��D� ����������� ,���� "��� �����

�� @�� ��� � �� 6����� .�� �� %+��� +<2 �*<<<��

%-� � 1��������� K�3� ?������ G� J���� G�/� ?���� L� 3������ ���

,� ������ 6��� 6���� 6����� ��� , ������ J�������� %*B �*<<<��

%0� D��� ������ 1��� L������� ,�@� ����� ,�@� 8���#�� ��� .�=�

��������� ,"��@ ,����� ������ L�� ,������� �,� �*<<<��

%2� ,� / ����� ,� .�������� K� D�������� ��� D� 6�������� "@@@

�� @�� ��� � ��� �� 6������ � @ 64E%�� *9%� :��� �%EE%��

%9� 6��� G� ����� /� D����������� ,�J� ����� ��� G� � /������

6��� 6���� 6����� ��� , ������ J�������� 20� D���� D��� "������

6� �%EE-��

%B� @� ������� ��� D� ��������� G� =� � 6 � �� ����� �7�-�� +2*0�%EE<��

%E� D�G� N���� ��� .�K� 1�������� ,���� ����� 66� +EE9 �%EE-��*<� ��6� 6����� � ��� �,� 3����� ,"��@ G� ���*�� +0< �%EEE��*%� ��K� G�� ��� ���G� K�� G� ,���� .���� 7��%%� .�� %�� 020B �%EEB��**� "� K������ K� A ���� D� 6����� 6� ?��� ��� K� 6����� /������

.���� ����� ��� %E+ �%EEE��*+� /�D� L�� P� M�� G� � 3����� G�6� ����� ��� 1�G� 3���� 6���

6���� 6����� O , ������ J�������� ***� D���� D��� "������ 6��

G��� �*<<<��

*-� >� ���� 6� L�� ��� L�G� L��� 3���� �� ����� �� ��*�� %<E�*<<%��

*0� 6��� G� ����� 6�=� @������� ��� G� � /������ ,���� �����

4��%0�� +*9+ �%EEE��*2� G� N���� 1� 3����'��� � 1��������� G� ?����� 1��� 1����� ���

?�G� K������� �� ����� ,������ 6������� 09E �*<<<��

*9� 1��� 1����� D�L� ?���� G� L�� :�C� 6�������� ��� ?�G� K�������

G� ,���� ����� 4�� -22E �%EEE��

��� ��� ��$� �� ���� ��� #����� �$�����) ����� ����� � ������ ��)�

������ ��� �������� � � ������� ��� ���� ����� ��� �2$

*B� �G� ����� M� L�� 6� L�� M��G� G����� L�G� L��� ��� 6� 1�������

6��� 6���� 6����� O , ������ J�������� %E%� D���� D��� "������

6�� G��� �*<<<��

*E� G� 3����'���� .� ?�������� G�.� K���� ��� ��/� :������ .�� ������

"@@@ �� @�� ��� � ��� �� 6������ � @ 6�� --% �%EE2��

+<� � K� �� 1� ��������� ,�?�/� @����� ��� ,� 3����� �������

G� ���� �� ������ 7� %*+ �%EEB��+%� :� 6 ��������� �� C����� ��� D� J������ G� ���� ��

������ 6�%�� EE �%EE2��+*� � @���������� ��6�G� L�������� /� ����� ��� G�D�G� C�������

G� ���� �� ������ �� **9F*-0 �%EE-��++� .� J���� K� D������ ��� @� M� ���������� �� ����� ,������

6������� *99 �*<<<��

+-� G� @����� 1� L������� ��� ,�.� .����� .�� ������ "@@@ ��

@�� ��� � ��� �� 6������ � @ 6�� E2F%<% �%EE9��

+0� G�J ��� ��� ��D� ,��� 6����6���� 6����� ��� , ������

J�������� 0*� D���� D���� G��� �*<<<��

+2� � M ��� D�D� 3��� ,6 @ � @ 6� .�� ������� -BE

�*<<<��

+9� K� D���7��� 1��� 3����� ��D� ����������� ��� �,� 3�����

,���� ����� 4�� -%<< �*<<<��+B� ���� /��������� .�,� ?������� ��� ��G� /����� ,"��@ G� ���0�� 90+�%EB9��

+E� K��� ������� ��� ��G� /����� ,��������� �#�� ���� ������ ��� �� ���)� :�/� ������ ���� �1����� .�������� :��M���� %EE%��

�2, ��� �� ���