design und synthese niedermolekularer inhibitoren der serinpro · design und synthese...
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Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie
Mar t ins r i ed
Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren
der Serinproteasen uPA und FXa
Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen
Therapie
Dissertation
Stefan Sperl
Martinsried 2000
online: http://tumb1.biblio.tu-muenchen.de/publ/diss/allgemein.html
Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie
Mar t ins r i ed
Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der
Serinproteasen uPA und FXa
Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen Therapie
Stefan Sperl
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Dr. Adelbert Bacher
Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. Luis Moroder
2. Univ.-Prof. Dr. Johannes Buchner
3. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Hiller
Die Dissertation wurde am 13.06.2000 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 18.07.2000 angenommen.
Teile der vorliegenden Arbeit wurden wie folgt zusammengefaßt:
Publikationen:
Sperl, S.; Bergner, A.; Stürzebecher, J.; Bode, W.; Moroder, L. (2000). Urethanyl-3-
Amidinophenylalanine Derivatives as Inhibitors of Factor Xa; X-Ray Crystal Structure
of a Trypsin/Inhibitor Complex and Modeling Studies. Biol. Chem. 381, 321-329.
Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;
Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). (4-aminomethyl)-phenylguanidine
derivatives as non-peptidic highly selective inhibitors of human urokinase. X-ray crystal
structure of an uPA/inhibitor complex at 1.8 Å resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
97, 5113-5118.
Zeslawska, E.; Schweinitz, A.; Karcher, A.; Sondermann, P.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.;
Jacob, U. (2000). Crystals of the urokinase type plasminogen activator variant βc-uPA
in complex with small molecule inhibitors open the way towards structure based drug
design. J. Mol. Biol. 301, 465-475.
Magdolen, V.; Arroyo de Prada, N.; Sperl, S.; Muehlenweg, B.; Luther, T.; Wilhelm, O.
G.; Magdolen, U.; Graeff, H.; Reuning, U.; and Schmitt, M. (2000). Natural and
synthetic inhibitors of the tumor-associated serine protease urokinase-type plasminogen
activator. Adv. Exp. Med. Biol. 477, 331-342.
Bürgle, M.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.; Schmalix, W.; Kessler, H.; Magdolen, V.; Wilhelm,
O. G.; Schmitt, M. (2000). Urokinase and its Receptor (CD87): new targets for tumor
therapy. in: Proteinase and peptidase inhibition: recent potential targets for drug
developement. (Smith, J. & Simons, C., ed.), Gordon & Breach Science Publishers,
Lausanne, Suisse. (im Druck).
Schmitt, M.; Wilhelm, O. G.; Reuning, U.; Krüger, A.; Harbeck, N.; Lengyel, E.; Graeff,
H.; Gänsbacher, B.; Kessler, H.; Bürgle, M.; Stürzebecher, J.; Sperl, S.; Magdolen, V.
(2000). The urokinase plasminogen activator system as a novel target for tumour
therapy. Fibrinolysis & Proteolysis 14, 114-132.
Patentanmeldungen:
Sperl, S., Moroder, L., Magdolen, V., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G. (1999). Selektive
Inhibitoren des Urokinase -Plasminogen Aktivators. (DE 199 403 89.9)
Sperl, S., Jacob, U., Arroyo de Prada, N., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G., Bode, W.,
Magdolen, V., Huber, R., Moroder, L. (2000). Hochselektive Inhibitoren des Urokinase-
Plasminogenaktivators. (DE 100 137 15.6)
Sperl, S., Stürzebecher, J, Moroder, L. (2000). Derivate des (R)-3-Amidinophenylalanins
als Inhibitoren des Faktors Xa (eingereicht).
Vorträge:
Sperl, S. (1998). Design and synthesis of substrate-based inhibitors of urokinase. 16th
Winter School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.
Sperl, S. (1999). New Lead Structures for uPA and Factor Xa Inhibitors. 17th Winter
School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.
Sperl, S. (1999). Design und Synthese von selektiven uPA Inhibitoren. 4. Jenaer
Proteolysetag, DFG-Rundgespräch, Erfurt.
Sperl, S. (2000). Design, Synthesis and X-Ray Structure of a new class of selective uPA
Inhibitors. International Symposium on Proteinase Inhibitors and Activators – Strategic
Targets for Therapeutic Intervention, Oxford, UK.
Poster:
Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;
Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). Design, synthesis and X-ray crystal
structure of a new class of selective uPA-inhibitors. 15th International Congress on
Fibrinolysis and Proteolysis, Hamamatsu, Japan.
Meinen Eltern
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 1997 bis Juni 2000 am Max-
Planck-Institut für Biochemie in Martinsried unter Anleitung von Herrn Prof. Dr.
Luis Moroder angefertigt.
Mein besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Luis
Moroder, der mir diese sehr interessante Aufgabe gestellt hat. Er hatte immer ein
offenes Ohr für unkonventionelle Ideen und ließ mir gleichzeitig den nötigen
Freiraum zur Ausgestaltung des Themas und zur Umsetzung der Ideen. Darüber
hinaus möchte ich mich bei ihm auch für die übertragene Verantwortung innerhalb
der Arbeitsgruppe und das mir damit erwiesene Vertrauen bedanken.
Desweiteren bedanke ich mich recht herzlich bei allen Kooperationspartnern, ohne
die diese interdisziplinäre Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ich danke
Ewa Zeslawska, Dr. Uwe Jakob und Prof. Dr. Robert Huber (Abteilung
Strukturforschung) für die Röntgenstrukturanalyse des uPA/Inhibitor-Komplexes,
Dr. Andreas Bergner und Prof. Dr. Wolfram Bode (Abteilung Strukturforschung)
für die Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/FXa-Inhibitor-Komplexes und die
Durchführung der Modelling-Experimente,
PD Dr. Jörg Stürzebecher, Christa Böttner und Reiner Sieber (Klinikum der
Universität Jena, Zentrum für vaskuläre Biologie und Medizin, Erfurt) für die
rasche Bestimmung der Inhibitionskonstanten und die pharmakokinetischen
Untersuchungen,
Nuria Arroyo de Prada und Dr. Viktor Magdolen (Klinikum rechts der Isar der
Technischen Universität München) für die Toxizitätsuntersuchungen und die
zahlreichen interessanten und hilfreichen Diskussionen,
Prof. Dr. Marianne Jochum und Prof. Dr. Hans Fritz für die finanzielle
Unterstützung durch den Sonderforschungsbereich 469 der LMU München.
Mein weiterer Dank gilt:
PD Dr. Olaf G. Wilhelm (Wilex Biotechnology GmbH, München) für sein großes
Vertrauen und Interesse an meiner Arbeit.
Der ganzen Arbeitsgruppe „Bioorganische Chemie“, die mich sehr freundlich
aufgenommen hat und deren Mitglieder mich stets nach Kräften unterstützt haben.
Namentlich hervorheben möchte ich Constanze Müller, die sehr viel Zeit und
Geduld bewies, um einen ehemaligen „Anorganiker“ in einen brauchbaren
bioorganischen Chemiker zu konvertieren. Günther Loidl, der mich bei etlichen
Gläsern Wein den Frust über nicht-inhibierende „Inhibitoren“ vergessen ließ.
Bernhard Gabriel und Norbert Schaschke danke ich für die zahlreichen
Diskussionen bei Syntheseproblemen. Besonders danken möchte ich Jürgen Musiol,
der zu jedem Problem stets hilfreiche Literatur bereithielt, aber auch für die netten
Kaffeepausen. Lissy Weyher und Sigi Bauer danke ich für die zuverlässige
Durchführung der Massenspektrometrie ebenso wie Hans Stocker für seine Hilfe
bei allen technischen Fragen. Meinem „Nachfolger“ Markus Michael Müller
wünsche ich weiterhin viel Erfolg und danke ihm, daß er mich diese Arbeit
weitgehend ungestört schreiben ließ. Vielen Dank auch an Bernd Mühlenweg, der
sich drei Jahre mit mir eine Stelle teilen mußte und während unserer
„Gründungsphase“ viel Engagement bewies.
Bei meiner WG (Ela, Flo, Julia und Amely) bedanke ich mich herzlichst für die
lustige Zeit und für das große Verständnis, wenn ich mich mal wieder um die
Hausarbeit gedrückt habe.
Besonderer Dank gebührt schließlich meinem cariñito Nuria, die mir durch ihre
unendliche Liebe die Freizeit versüßt und immer für mich da ist.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung __________________________________________________________ 1
1.1. Klassifizierung der Proteasen _____________________________________________ 1
1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen __________________________________ 2
1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA und Trypsin __ 4
2. Urokinase Inhibitoren ________________________________________________ 7
2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung ______________ 7
2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator__________________________________ 10
2.3. Das uPA-uPAR-System _________________________________________________ 12
2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 _______________________ 13
2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze______________ 14
2.6. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 16
2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren _________________________________________________ 16
2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren________________________________________________ 18
2.7. Zielsetzung____________________________________________________________ 21
2.8. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 22
2.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 22
2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren____________________________ 27
3. Faktor Xa Inhibitoren________________________________________________ 51
3.1. Die Blutgerinnungskaskade ______________________________________________ 51
3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren _______________________________ 54
3.3. Zielsetzung____________________________________________________________ 59
3.4. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 60
3.4.1. Inhibition von FXa und verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen ________________ 60
3.4.2. Synthese von 3- und (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten _________________________ 63
3.4.3. Röntgenstrukturanalyse des FXa-Inhibitors 84 im Komplex mit Trypsin und Modelling-
Experimente _____________________________________________________________ 64
3.4.4. Einfluß der Chiralität von Amidino-Phenylalanin-Derivaten auf die Inhibition von FXa __ 69
4. Zusammenfassung und Ausblick _______________________________________ 73
4.1. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 73
4.2. FXa-Inhibitoren _______________________________________________________ 74
5. Summary __________________________________________________________ 77
5.1. uPA-inhibitors_________________________________________________________ 77
5.2. fXa-inhibitors _________________________________________________________ 78
6. Experimenteller Teil _________________________________________________ 80
6.1. Materialien und Methoden ______________________________________________ 80
6.2. Enzymkinetik _________________________________________________________ 82
6.2.1. Ermittlung der Inhibitionskonstanten (Ki-Werte)_________________________________ 82
6.2.2. Eingesetzte Enzyme und Substrate zur Ki-Wert-Bestimmung _______________________ 82
6.3. Röntgenstrukturanalyse des Inhibitor/uPA Komplexes _______________________ 83
6.3.1. Kristallisation mit Benzamidin als Inhibitor_____________________________________ 83
6.3.2. Soaking des uPA-Inhibitors 75 und Röntgenstrukturanalyse ________________________ 84
6.4. Röntgenstrukturanalyse des Faktor Xa Inhibitor 84/Trypsin-Komplexes ________ 85
6.5. Modelling-Experimente mit Faktor Xa Inhibitoren __________________________ 87
6.6. In vivo Eliminationsstudien ______________________________________________ 87
6.7. Toxizitätsstudien am uPA Inhibitor 75 ____________________________________ 88
6.8. Synthese der uPA Inhibitoren ____________________________________________ 89
6.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 89
6.8.2. nicht-peptidische Inhibitoren / Phenylguanidine _________________________________ 90
6.9. Synthese der Faktor Xa Inhibitoren ______________________________________ 111
7. Literaturverzeichnis ________________________________________________ 121
Abkürzungen
Die Nomenklatur der Aminosäuren und Peptide entspricht den Vorschlägen der
IUPAG-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur (Europ. J. Biochem.,
1984, 138, 9-37)
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
AcOH Essigsäure
AcOEt Essigsäure-Ethylester
Adoc 1-Adamantyloxycarbonyl
ATF Aminoterminales Fragment des uPA
Boc tert-Butyloxycarbonyl
ber. berechnet
Bz Benzyl
DC Dünnschichtchromatografie
DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
DCM Dichlormethan
DIEA Diisopropylethylamin
DIPE Diisopropylether
DMF Dimethylformamid
ESI Elektro-Spray-Ionisierung
EtOH Ethanol
FAB Fast Atom Bombardement
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FXa Faktor Xa (aktiviert)
h Stunde(n)
HBTU O-(Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium
Hexafluorophosphat
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
HOSu Hydroxysuccinimid
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
HV Hochvakuum
i-PrOH Isopropanol
Ki Inhibitionskonstante
LM Lösungsmittel
M Molar
MS Massen-Spektrometrie
MeOH Methanol
n. b. nicht bestimmt
p. a. Pro Analyse
PAI-1/2 Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1/2
Pbf 2,2,4,4-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
pNA p-Nitroanilid
Rf Retentionsfaktor in der Dünnschichtchromatographie
RT Raumtemperatur
TBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-
tetrafluoroborat
TFA Trifluoressigsäure
TFE Trifluorethanol
TIPS 2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl
Tos p-Toluolsulfonyl
tR Retentionszeit in der HPLC
uPA Urokinase-Typ Plasminogenaktivator
uPAR uPA-Rezeptor
Z Benzyloxycarbonyl
1. Einleitung 1
1. Einleitung
1.1. Klassifizierung der Proteasen
Proteolytische Enzyme sind eine große und wichtige Gruppe von Proteinen die eine
Spaltung von Peptidbindungen katalysieren. Eine grobe Einteilung der Proteasen
läßt sich nach ihrem unterschiedlichen Katalysemechanismus vornehmen (Barrett,
A. J. et al. 1998).
A. Endopeptidasen: katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen im
inneren der Polypeptidkette
1. Serin-Proteasen Serin, Histidin und Aspartat im aktiven Zentrum
2. Cystein-Proteasen Cystein im aktiven Zentrum
3. Aspartat-Proteasen Aspartat-Reste im aktiven Zentrum
4. Metalloproteasen Metallion im aktiven Zentrum
5. Nicht klassifizierte Proteasen
B. Exopeptidasen: katalysieren die Abspaltung einer oder mehrerer
Aminosäuren vom N- oder C-Terminus des Substrats
1. Aminopeptidasen spalten eine Aminosäure vom N-Terminus ab
2. Dipeptidyl-Peptidasen spalten zwei Aminosäuren vom N-Terminus ab
3. Tripeptidyl-Peptidasen spalten drei Aminosäuren vom N-Terminus ab
4. Carboxy-Peptidasen spalten eine Aminosäuren vom C-Terminus ab
5. Peptidyl-Dipeptidasen spalten zwei Aminosäuren vom C-Terminus ab
Jede der aufgeführten Klassen läßt sich in Unterklassen („Clans“) aufteilen. Die
Serinproteasen werden zum Beispiel nach der Aminosäuresequenz ihrer
katalytischen Reste Asp, His und Ser unterteilt. Für trypsin-ähnliche Serinproteasen
gilt also die sequenzabhängige Reihenfolge His57–Asp102–Ser195, wohingegen
Subtilisin (eine extrazelluläre Endopeptidase aus Bacillus subtilis) die Reihenfolge
1. Einleitung 2
Asp–His–Ser aufweist. Die folgenden Kapitel befassen sich näher mit der Klasse
der trypsin-ähnlichen Serinproteasen.
1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen
Die dreidimensionale Röntgenstruktur des Rinder-Trypsins wurde bereits 1974
aufgeklärt (Huber, R. et al. 1974) und entwickelte sich zum Prototypen der
Serinproteasen mit Argininspezifität. Die Tertiärstrukturen dieser Enzyme zeigen
ein stark konserviertes Strukturmerkmal, obwohl die Primärstrukturen stark
voneinander abweichen können. Das allgemeine Nummerierungssystem der
Aminosäurereste folgt dem der homologen Protease Chymotrypsin. Chymotrypsin
hat eine beinahe identische Tertiärstruktur wie Trypsin, obwohl die beiden Enzyme
weniger als 50% Identität in der Primärstruktur aufweisen und Chymotrypsin eine
Substratspezifität für aromatische Reste besitzt. Die Positionen von
„Schlüsselresten“, wie jenen der katalytischen Triade (Asp102, His57 und Ser195) und
Asp189 am Boden der S1-Spezifitätstasche, sind in allen trypsin-ähnlichen
Serinproteasen identisch.
Die Tertiärstruktur dieser Proteasen besteht vorwiegend aus β-Faltblättern. Sie ist
charakterisiert durch 2 Domänen, wobei jede Domäne ein „β-barrel“ ausbildet. Die
„Active-Site Cleft“ mit der katalytischen Triade ist genau zwischen den beiden
Domänen lokalisiert (Abbildung 1). Jede der „barrel“-ähnlichen Domänen ist aus 6
anti-parallel laufenden Strängen aufgebaut, wobei 4 der 5 verbindenden „loops“
Haarnadel-Schleifen sind. Neben wenigen, kurzen Helices besitzen alle Enzyme
eine lange C-terminale α-Helix (Abbildung 1, rot).
Mitte Mai 2000 verzeichnete die Brookhaven Protein-Datenbank 160
Röntgenkristallstrukturen von Trypsin, 97 von Thrombin, 4 von Faktor Xa und 2
vom Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA). Viele dieser Strukturen sind
Komplexe mit synthetischen oder natürlichen Inhibitoren, die aufgeklärt wurden,
um die Bindung und Selektivität der Inhibitoren rationell verbessern zu können. Die
1. Einleitung 3
Tatsache, daß es vergleichsweise wenige Röntgenstrukturen von FXa und uPA gibt,
spiegelt die Schwierigkeiten wieder, die bei der Kristallisation dieser beiden
Enzyme auftreten. Da aber gerade diese Enzyme interessante Zielmoleküle in der
Therapie schwerwiegender Erkrankungen darstellen, kann man die hohe strukturelle
Ähnlichkeit der trypsin-ähnlichen Serinproteasen nutzen und Komplexstrukturen
von FXa- oder uPA-Inhibitoren mit Trypsin anfertigen.
Abbildung 1: Richardson-Diagramm der Tertiärstruktur von β-Trypsin im
Komplex mit dem Thrombin-Inhibitor NAPAP (PDB-Code:
1PPC). Die Sekundärstrukturelemente α-Helix und β-Faltblatt
sind dargestellt als helikales Band bzw. verdrehte Pfeile (Bode,
W. et al. 1990)
1. Einleitung 4
Anschließend überlagert man die Trypsin/Inhibitor-Komplexstruktur mit einer
bekannten Struktur des Targetenzyms und erhält so Informationen über den
Bindungsmodus des Inhibitors (Banner, D. W. et al. 1991; Bode, W. et al. 1990;
Gabriel, B. et al. 1998; Matsuzaki, T. et al. 1989; Renatus, M. et al. 1998; Stubbs,
M. T. et al. 1995; Turk, D. et al. 1991).
1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA
und Trypsin
Obwohl Sekundär- und Tertiärstruktur aller trypsin-ähnlichen Serinproteasen
identisch sind, unterscheiden sie sich doch in einigen Bereichen entscheidend in der
Aminosäuresequenz (Primärstruktur). Gerade diese Unterschiede sind es aber, die
für die Selektivität der einzelnen Proteasen verantwortlich zeichnen. In Abbildung 2
sind die strukturellen Gemeinsamkeiten und Unterschiede der aktiven Zentren (S1-
S3/S4) von Faktor Xa, uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator), Thrombin, tPA
(Gewebe-Typ Plasminogenaktivator) und Trypsin schematisch dargestellt (Renatus,
M. et al. 1998).
Allen trypsin-ähnlichen Serinproteasen gemeinsam ist die relativ tiefe,
argininspezifische S1-Tasche. Die selektive Erkennung der basischen
Argininseitenkette erfolgt über die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der
positiv geladenen Guanidiniumfunktion des Arginins und der negativ geladenen
Carboxylgruppe des Asp189 am Boden der S1-Tasche. In uPA und Trypsin ist
außerdem die Bildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der Seitenkette des Ser190-
Restes und der ε-NH Gruppe der Guanidinofunktion möglich. Diese
Wechselwirkung ist bei Thrombin, FXa und tPA nicht möglich, da diese Enzyme
anstelle von Serin eine Alanin-Mutation besitzen.
In der S2-Region gibt es bereits größere Unterschiede. Durch den sogenannten „60-
Insertion-Loop“ – bestehend aus Tyr60A, Pro60B, Pro60C und Trp60D – ist diese Region
1. Einleitung 5
zusammen mit His57, Ser214 und Leu99 in Thrombin zu einer großen, lipophilen
Tasche ausgebildet, die z. B. Prolinreste in P2 sehr gut beherbergen kann. Bei uPA
tritt hingegen der entgegengesetzte Effekt auf. Hier ist die S2-Tasche durch den
„99-Insertion-Loop“ aus Thr98A und Leu98B in Verbindung mit His99 stark
verkleinert, so daß in dieser Region nur kleine Aminosäurereste wie Glycin binden
können. Dieser „99-Loop“ hat Auswirkungen bis in die S3/S4-Region, die in uPA
ebenfalls räumlich beschränkt und sehr hydrophob ist.
Die S3/S4-Region von Faktor Xa ist größer als die von uPA und ebenfalls sehr
hydrophob. Am Ende dieser Region befindet sich jedoch ein elektronegativer
Hohlraum, der von Glu97 und den Carbonyl-Sauerstoffen von Ile75 und Thr98 erzeugt
wird. Dieser Bereich kann z. B. von bis-basischen synthetischen Inhibitoren für eine
weitere ionische Interaktion genutzt werden (Gabriel, B. et al. 1998). Allerdings
besitzen auch tPA und Thrombin diesen elektronegativen Bereich, so daß auf diese
Weise keine selektiven FXa-Inhibitoren erzeugt werden können. Andererseits ist die
S3/S4-Region von tPA durch die räumliche Nähe der Arg174-Seitenkette weniger
hydrophob als die entsprechende Region in FXa, Trypsin oder Thrombin.
1. Einleitung 6
HN
O
OO
NH2
NH2N
O O
Asp189
Tyr99
Thr98
Asp97Thr175
Arg174
Trp215
Leu217
δ− δ−
δ−
OH
HN
O
OO
O O
Asp189
Tyr99
Thr98
Glu97Ile175
Phe174
Trp215
Glu217
δ− δ−
δ−
OH
O
O
O O
Asp189
His99
Trp215
Arg217
NH
HN
NH2
H N2
NH
NH
Leu98BThr98AHO
OH
Tyr272
HN
O
O
O O
Asp189
Leu99
Thr98
Asn97
Gln175
Trp215
Ser217
δ−
δ−
HO
O N
HN
O
OO
O O
Asp 189
Thr 98
Arg 97Val 175
Ile 174
Trp 215
Glu 217
δ− δ−
δ−
O
O
Leu 99
Trp 60D
Pro 60C
Pro 60B
Tyr 60A
OH
Faktor Xa uPA
Thrombin
tPA Trypsin
Abbildung 2: Schematische Darstellung der aktiven Zentren von FXa, uPA,
Thrombin, tPA und Trypsin
2. Urokinase Inhibitoren 7
2. Urokinase Inhibitoren
2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung
Bei der Tumorinvasion wandern Tumorzellen aus einem Primärtumor aus, um an
einer entfernten Stelle des Körpers einen Sekundärtumor (Metastase,
Tochtergeschwulst) zu bilden. Dafür sind eine Reihe aufeinanderfolgender
Vorgänge notwendig, welche als metastatische Kaskade bezeichnet werden
(Abbildung 3) (McKinnell, R. G. et al. 1998; Reuning, U. et al. 1998).
Der Prozeß der Metastasierung beinhaltet die Loslösung einzelner Tumorzellen aus
dem Primärtumor-Zellverband, die Adhäsion an und Invasion dieser Zellen durch
die extrazelluläre Matrix, Intravasation, den Transport mit dem allgemeinen
Blutkreislauf, erneute Adhäsion an die Basalmembran, Extravasation und
anschließend erneute Invasion der Zellen durch die extrazelluläre Matrix um die
Metastase zu bilden.
Für den Abbau der extrazellulären Matrix ist eine gerichtete proteolytische Aktivität
der Tumorzelle nötig. Diese wird durch verschiedene proteolytische Systeme
vermittelt, die miteinander interagieren und sich gegenseitig aktivieren (Koblinski,
J. E. et al. 2000). Im Einzelnen sind es
(1) die Serinproteasen Plasmin, uPA und tPA) (Danø, K. et al. 1985; Schmitt, M.
et al. 1997)
(2) die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Cockett, M. I. et al. 1998; Kahari, V.
M. et al. 1999; Kleiner, D. E. et al. 1999; Westermarck, J. et al. 1999)
(3) die Cysteinproteinasen, z. B. Cathepsin B, H und L (Michaud, S. et al. 1998;
Sloane, B. F. 1990)
(4) die Aspartatproteinasen, z. B. Cathepsin D (Garcia, M. et al. 1996; Rochefort,
H. et al. 1996; Rochefort, H. et al. 1999)
2. Urokinase Inhibitoren 8
Klonale Expansionund Wachstum
Adhäsion an undInvasion durch die
Basalmembran
Intravasation
Tumorzellhaufen
MetastaseMetastase
Basal-membran
Basal-membran
Primär-tumor
Transformierte Zelle
Metastatischer Subklon
Invasion durch dieExtrazellulärmatrix
Interaktion mitLymphozyten
Tumorzellhaufen
Adhäsion an dieBasalmembran
Extravasation
Metastase
Basal-membran
Basal-membran
Lymphozyt
Vene
Blutplättchen
Basal-membranExtrazellulär-
matrix
Abbildung 3: Weg der Krebszelle vom Primärtumor zum Ort der Metastase nach
McKinnell, R. G. et al. (1998)
2. Urokinase Inhibitoren 9
uPA/uPAR
Plasminogen
Plasmin
pro-uPA/uPAR +
+Abbau von EZM- Fibrin- Fibronektin- Proteoglykane
Cathepsin B, L
+
pro-MMPs MMPs
+
-
PAI-1,2
+
Abbau vonBasalmembran-Kollagen-
TIMPs
α2-Antiplasmin
-
CystatineSteffine
-
Abbildung 4: Aktivierungskaskade der perizellulären Plasmin-Proteolyse
Eine zentrale Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt uPA
(Abbildung 4). Nach Bindung des Zymogens pro-uPA an den
zelloberflächengebundenen uPA-Rezeptor (uPAR, CD87) wird uPA rasch durch die
Cathepsine B oder L aktiviert. Die proteolytische Aktivität wird durch die Bindung
an den Rezeptor auf die Zelloberfläche fokussiert. Plasminogen wird durch den
uPA-uPAR-Komplex zu Plasmin aktiviert, das verschiedene Bestandteile der
extrazellulären Matrix abbauen kann. Desweiteren ist Plasmin durch einen positiven
„Feedback“-Mechanismus in der Lage, erneut uPA zu aktivieren. Zum anderen
werden durch uPA auch Matrixmetalloproteasen aktiviert, die schließlich zum
Abbau von Basalmembran-Kollagenen beitragen. Diese proteolytischen Prozesse
ermöglichen den Krebszellen schließlich die Invasion in benachbartes Gewebe
sowie die Metastasierung. Wegen der zentralen Rolle des uPA an diesen
pathologischen Prozessen, stellt die Inhibition der proteolytischen Aktivität des
Plasminogenaktivators ein vielversprechendes Ziel in der Tumortherapie dar.
2. Urokinase Inhibitoren 10
2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator
Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (Urokinase, uPA, EC 3.4.21.31) wurde
erstmals bereits 1966 von White und Mitarbeitern aus Urin isoliert, wovon sich
auch der Name ableitet (White, W. F. et al. 1966). Das Interesse an diesem Enzym
stieg sprunghaft an, nachdem der schwedische Gynäkologe Åsted entdeckte, daß
uPA sehr stark von humanen Ovarialkarzinomzellen produziert wird (Åstedt, B. et
al. 1976). Inzwischen ist bekannt, daß uPA von einer Vielzahl normaler und
maligner Zellen synthetisiert und sekretiert wird (Danø, K. et al. 1985).
uPA wird als einkettiges Zymogen pro-uPA exprimiert, das aus 411 Aminosäuren
aufgebaut ist, 12 Disulfidbrücken enthält und mit Asn302 über eine
Glykosylierungsstelle verfügt (Wun, T. C. et al. 1982). Das Proenzym besteht aus
drei Domänen, wie in Abbildung 5 dargestellt.
• „Growth-Factor-Like Domain“ (GFD) uPA1-44:
In der N-terminalen GFD-Domäne befindet sich die Bindungsstelle zum
zelloberflächenassoziierten uPA-Rezeptor (Pollanen, J. J. 1993; Stoppelli, M.
P. et al. 1985). Diese Domäne besitzt eine starke Sequenzhomologie mit dem
epidermalen Wachstumsfaktor („Epidermal Growth Factor“, EGF) (Gunzler,
W. A. et al. 1982; Steffens, G. J. et al. 1982). Trotz dieser Homologie besteht
keine Affinität zwischen EGF und uPAR .
• Kringle-Domäne uPA45-135:
Diese Domäne besitzt Affinität zum extrazellulären Matrix-Proteoglykan
Heparin.
• Protease-Domäne uPA136-411:
In dieser C-terminalen Domäne befinden sich die Reste His204, Asp255 und
Ser356, die zusammen die katalytische Triade der Serinprotease bilden
(Strassburger, W. et al. 1983).
2. Urokinase Inhibitoren 11
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Domänen von pro-uPA
Durch enzymatische Spaltung, z. B. durch Plasmin, Kallikrein, Cathepsin D oder L,
der Peptidbindung zwischen Lys158 und Ile159, wird das inaktive, einkettige pro-
uPA zum zweikettigen HMW-uPA („high molecular weight uPA“) aktiviert. Die A-
Kette (uPA1-158) ist nach der Spaltung mit der B-Kette (uPA159-411) über eine
Disulfidbrücke zwischen Cys148 und Cys279 verknüpft. Erst durch die mit der
Spaltung einhergehende Konformationsänderung wird das aktive Zentrum
exponiert. HMW-uPA kann durch weitere Proteolyse in das aminoterminale
Fragment (ATF, uPA1-135) und „low molecular weight uPA“ (LMW-uPA, uPA136-
411) weiter prozessiert werden. LMW-uPA besitzt die volle proteolytische Aktivität
(Ellis, V. et al. 1991), kann aber nicht mehr an der uPA-Rezeptor binden.
Die Röntgenkristallstruktur der uPA-B-Kette, die das katalytische Zentrum enthält,
wurde erstmals 1995 von Spraggon und Mitarbeitern beschrieben (Spraggon, G. et
al. 1995). Die Auflösung dieser Struktur war mit 2,5 Å vergleichsweise gering. Erst
kürzlich wurden hochaufgelöste Röntgenstrukturen der uPA-B-Kette im Komplex
mit bekannten, synthetischen Inhibitoren veröffentlicht (Nienaber, V. et al. 2000)
2. Urokinase Inhibitoren 12
(mehrere Komplexstrukturen, Auflösung: =1,5 Å), (Katz, B. A. et al. 2000)
(Auflösung 1,75, PDB-Code: 1C5X).
2.3. Das uPA-uPAR-System
Der uPA-Rezeptor (uPAR, CD 87) ist ein aus 313 Aminosäuren aufgebautes,
hochglycosyliertes (Kohlenhydratanteil 30%) Protein mit einem auffällig hohen
Cysteinanteil (Danø, K. et al. 1994). Der Rezeptor besteht aus 3 strukturell
ähnlichen Domänen und einem C-terminalen GPI-Anker, wobei die N-terminale
Domäne die GFD-Bindungsstelle enthält (Behrendt, N. et al. 1991), über die uPA
an uPAR bindet. Da uPAR keine Transmembrandomäne besitzt, ist eine
Signaltransduktion nur durch Wechselwirkung mit anderen Transmembranproteinen
möglich.
Der wichtigste natürliche Inhibitor des uPA ist der Plasminogenaktivator-Inhibitor
Typ 1 (PAI-1; siehe Kapitel 2.6.1). PAI-1 hemmt sowohl HMW-uPA als auch
LMW-uPA in freier oder rezeptorgebundener Form, tPA und in geringerem Maße
auch Plasmin.
Sobald sich auf der Zelloberfläche ein trimärer Komplex aus uPAR, uPA und PAI-1
gebildet hat, wird dieser mittels des Macroglobulinrezeptors (CD 91) in die Zelle
internalisiert (Casslen, B. et al. 1998; Conese, M. et al. 1995; Nykjaer, A. et al.
1997). Dort werden PAI-1 und uPA lysosomal abgebaut, während der uPAR auf der
Zelloberfläche regeneriert wird und erneut uPA binden kann. Bei Tumorzellen wird
der uPAR an die Migrations-/Invasionsfront regeneriert, wodurch die gerichtete
proteolytische Aktivität zustande kommt.
Im Gegensatz dazu wird der trimäre Komplex aus uPAR-uPA-PAI-2 (siehe Kapitel
2.6.1) nicht internalisiert, sondern auf der Zelloberfläche prozessiert. Durch
Spaltung des Komplexes entstehen 2 Fragmente: Ein 70 kD großes Fragment, das
PAI-2 und das aktive Zentrum von uPA enthält und ein 22 kD-Fragment, das das
ATF von uPA sowie uPAR enthält. Das ATF bleibt an uPAR gebunden und
2. Urokinase Inhibitoren 13
verhindert dadurch die erneute Bindung von uPA an den Rezeptor (Ragno, P. et al.
1995; Ragno, P. et al. 1998).
Somit kann PAI-2 als „wirklicher“ Inhibitor von uPA und uPAR betrachtet werden,
während PAI-1 zwar die proteolytische Aktivität von uPA inhibiert, der uPAR aber
nach erfolgter Internalisierung des trimären Komplexes wieder auf die
Zelloberfläche zurückkehrt und erneut uPA binden kann. Dieser Unterschied ist ein
Grund für die unterschiedliche prognostische Relevanz von PAI-1- und PAI-2-
Konzentrationen in Tumoren (siehe Kapitel 2.4).
2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2
Nach der chirurgischen Entfernung eines soliden Tumors muß anhand geeigneter,
experimentell bestimmbarer Parameter das Risiko einer Neuerkrankung abgeschätzt
werden, um die Art und Intensität einer notwendigen Nachbehandlung (z. B.
Chemotherapie oder Bestrahlung) festzulegen. Seit einigen Jahren haben sich die
Bestandteile des uPA-uPAR-Systems zu wichtigen prognostischen Markern bei
einer Vielzahl von Krebserkrankungen entwickelt. Allein in den letzten 5 Jahren
sind weit über Hundert Veröffentlichungen zu diesem Thema erschienen. Der
interessierte Leser sei deshalb an dieser Stelle nur auf einige neuere Reviews
verweisen: (Allgayer, H. et al. 1997; Duffy, M. J. et al. 1999; Harbeck, N. et al.
1998; Look, M. P. et al. 1999; Pappot, H. et al. 1995; Reuning, U. et al. 1998).
Untersuchungen haben ergeben, daß hohe uPA-Werte nach der operativen
Entfernung verschiedener Tumoren mit einer schlechten Prognose für das
krankheitsfreie Überleben des Patienten verbunden sind. PAI-1-Werte stellten sich
mit der Zeit als noch bessere prognostische Marker heraus. Interessanterweise sind
es ebenfalls hohe Werte dieses uPA-Inhibitors, die eine schlechte Prognose
bedeuten, obwohl zunächst die proteolytische Aktivität von uPA gehemmt wird.
Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens ist die Tatsache, daß der uPAR nach
Internalisierung des trimären Komplexes aus PAI-1/uPA/uPAR an der
2. Urokinase Inhibitoren 14
Invasionsfront der Tumorzelle regeneriert wird und es nach Bindung von uPA
wieder zur gerichteten Proteolyse kommt.
Untersuchungen des uPAR-Gehalts zeigten ebenfalls, daß hohe Antigenwerte im
Tumorgewebe, aber auch im Blut, mit einer schlechten Prognose korrelieren, wenn
auch mit geringerer Signifikanz. Im Gegensatz zu den anderen Komponenten des
PA-Systems korrelieren hohe PAI-2-Werte mit einer guten Prognose für
rezidivfreies und Gesamtüberleben.
2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze
Wie in den Kapiteln 2.1-2.3 erläutert, spielt uPA eine zentrale Rolle in der Plasmin-
aktivierungskaskade und damit in den Prozessen der Tumorinvasion und
Metastasierung. Im vorangehenden Kapitel wurde gezeigt, daß hohe uPA- und
uPAR-Werte mit einer schlechten Prognose für das Überleben eines Krebspatienten
einhergehen. Aus diesen Befunden ergeben sich vier unterschiedliche Ansatzpunkte
zur therapeutischen Interaktion mit dem uPA-uPAR-System wie in Abbildung 6
erläutert.
2. Urokinase Inhibitoren 15
GPI
GFD
Kringle
Protease
uPAR
GFD
Kringle
Protease
GFD
Kringle
Protease
GPI
uPAR
Inhibitor desaktiven Zentrums
uPA-Antagonist
uPAR-Antagonist
Inhibition derGenexpression(Antisense)
Aktives Zentrum
Abbildung 6: Inhibitionsmöglichkeiten des uPA/uPAR-Systems
• Reduktion der uPA- und/oder uPAR-Expression durch Antisense-Nukleotide
• uPAR-Antagonisten: Die Blockade des uPAR führt zu einer langsameren
Aktivierung von uPA und vor allem zur Aufhebung der Zelloberflächen-
fokussierung der proteolytischen Aktivität. Hierzu wurden z. B. zyklische,
vom ATF abgeleitete Peptide entwickelt, die etwa genauso gut an den
Rezeptor binden wie uPA selbst (Burgle, M. et al. 1997).
• uPA-Antagonisten: ähnlich wie uPAR-Antagonisten können auch uPA-
Antagonisten die Fokussierung der Proteolyse auf die Zelloberfläche
verhindern. Als möglicher Ansatzpunkt erwies sich „löslicher“ uPAR der
mit zelloberfächengebundenem uPAR um die Bindungsstelle zu uPA
konkurriert (Behrendt, N. et al. 1996)
2. Urokinase Inhibitoren 16
• synthetische „uPA-Active-Site“-Inhibitoren zur Verringerung der
proteolytischen Aktivität von uPA. Solche Inhibitoren müssen
hochspezifisch sein, da sonst auch verwandte Serinproteasen gehemmt
werden, wodurch sich eventuell schwere Nebenwirkungen ergeben könnten.
2.6. uPA-Inhibitoren
Die proteolytische Aktivität von uPA wird durch 2 natürliche Inhibitoren reguliert.
Wegen der zentralen Rolle von uPA in pathologischen Prozessen wie der
Tumorinvasion und der Metastasierung, werden zunehmend auch synthetische
Inhibitoren als potentielle Arzneimittel interessant. Für eine Zusammenstellung
natürlicher und synthetischer Inhibitoren siehe auch Magdolen, V. et al. (2000).
2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren
Die Aktivität des uPA/uPAR-Systems wird durch die Plasminogenaktivator-
Inhibitoren Typ 1 (PAI-1) und Typ 2 (PAI-2) reguliert [für Reviews zu diesen
Inhibitoren siehe Egelund, R. et al. (1997) und Ny, T. et al. (1997)]. Diese beiden
Inhibitoren gehören zur Serin-Protease-Inhibitor Superfamilie (Serpine) und
besitzen 55% Sequenzhomologie (33% Aminosäureidentität). Die strukturelle
Ähnlichkeit der beiden Proteine wurde durch Röntgenkristallstrukturen aktiver
Mutanten bewiesen [PAI-1: PDB-Code: 1B3K (Sharp, A. M. et al. 1999); PAI-2:
PDB-Code: 1BY7 (Harrop, S. J. et al. 1999)]. Beide Inhibitoren hemmen sowohl
uPA als auch tPA („Tissue-Type Plasminogen Activator“) durch Bildung eines 1:1
Komplexes. Aktives PAI-1 ist nur metastabil (Halbwertszeit etwa 2 h) und geht
spontan in eine latente, inaktive Konformation über. Durch Einführen von 4
Punktmutationen kann die Halbwertszeit allerdings auf über 140 h verlängert
werden (Berkenpas, M. B. et al. 1995). In vivo wird die Halbwertszeit von aktivem
PAI-1 durch Bindung an das extrazelluläre Matrix- und Plasma-Protein Vitronektin
auf etwa 4 h verdoppelt (Kanse, S. M. et al. 1996). Im Gegensatz zu PAI-2, wird
2. Urokinase Inhibitoren 17
PAI-1 mit einem Signalpeptid (21 Aminosäuren) synthetisiert und von den Zellen in
glycosylierter Form sezerniert. Dem Inhibitor PAI-2 hingegen fehlt ein spaltbares
Signalpeptid. Es liegt zu 80% in nicht-glycosylierter Form intrazellulär vor (Ny, T.
et al. 1997).
Zwei weitere Serpine, die neben Thrombin, Trypsin, Plasmin bzw. Protein C auch
uPA und tPA hemmen, sind die Inhibitoren der Proteinase Nexin-1 und des Protein-
C. Unter physiologischen Bedingungen reagieren sie allerdings wesentlich
langsamer mit den Plasminogenaktivatoren als PAI-1 und PAI-2 (Andreasen, P. A.
et al. 1997; Sprengers, E. D. et al. 1987). Aprotinin und der Tumor-assoziierte
Trypsininhibitor (TATI) wurden ebenfalls als Inhibitoren von uPA beschrieben. Die
Inhibitionskonstanten dieser Enzyme gegen uPA liegen jedoch im mikromolaren
Bereich, so daß diesen Inhibitoren keine physiologische Bedeutung zukommt.
Tabelle 1: Natürliche uPA-Inhibitoren
Inhibitor Inhibition von uPA Literatur
PAI-1 k2=1-2 x 107 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)
PAI-2 k2=2,4 x 106 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)
Tumor-Associated TrypsinInhibitor (TATI) Ki = 0,3 µM (Turpeinen, U. et al. 1988)
Aprotinin Ki = 27 µM (Lottenberg, R. et al. 1988)
2. Urokinase Inhibitoren 18
2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren
Verglichen mit der Vielzahl reversibler synthetischer Inhibitoren die gegen andere
trypsin-ähnliche Serinproteasen wie z. B. Thrombin (Hauptmann, J. et al. 1999)
oder FXa (siehe Kapitel 3.2) entwickelt wurden, gibt es nur sehr wenige effiziente
uPA-Inhibitoren. Das gemeinsame Strukturmerkmal dieser uPA-Inhibitoren ist eine
basische Amidino- oder Guanidinogruppe, die die Ausbildung einer Salzbrücke zu
Asp189 in der S1-Tasche ermöglicht. Eine Übersicht bekannter uPA-Inhibitoren ist
in Tabelle 2 zusammengestellt. Die meisten dieser Verbindungen zeigen kaum oder
keine Selektivität für uPA, sondern hemmen auch Enzyme des Verdauungstraktes
(Trypsin) sowie der Blutgerinnungskaskade (z.B. Faktor Xa und Thrombin). Die
besten Verbindungen weisen lediglich Inhibitionskonstanten im niederen
mikromolaren Bereich auf.
Billström und Mitarbeiter konnten bei oraler Gabe des Inhibitors p-Amino-
Benzamidin im Mausmodell eine klare Verlangsamung des Wachstums von DU145
Tumoren feststellen (Billström, A. et al. 1995). Das Diuretikum Amilorid stellt
einen selektiven uPA-Inhibitor mit einer allerdings relativ hohen
Inhibitionskonstante von 7 µM dar. Im Mausmodell wurde gezeigt, daß Amilorid
die Bildung von Lungenmetastasen verhindert (Vassalli, J. D. et al. 1987). Die
derzeit potentesten und selektivsten "Active-Site" uPA-Inhibitoren sind die
substituierten Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine B-428 und B-623 mit einem Ki-
Wert von 0,53 bzw. 0,16 µM (Towle, M. J. et al. 1993). Für einen dieser
Inhibitoren, B-428, konnte gezeigt werden, daß diese Verbindung uPA-vermittelte
Prozesse wie die proteolytische Degradation von extrazellulären Matrixproteinen,
Tumorzelladhäsion, -migration und -invasion in vitro effektiv inhibieren kann
(Alonso, D. F. et al. 1996a). Desweiteren hemmt der synthetische Inhibitor in einem
syngenen Mammakarzinom-Maus-Modell die lokale Tumorinvasion (Alonso, D. F.
et al. 1996b; Alonso, D. F. et al. 1998) sowie die Metastasierung von Ratten-uPAR
überexprimierenden Zellen in einem syngenen Modell für Ratten-Prostata-
2. Urokinase Inhibitoren 19
Karzinom (Rabbani, S. A. et al. 1995). Bei einer Kombinationstherapie mit dem
Anti-Östrogen Tamoxifen konnte ebenfalls eine Verringerung des Tumorvolumens
und von Metastasen in einem Ratten-Mammakarzinom-Modell beobachtet werden
(Xing, R. H. et al. 1997).
Tabelle 2: Synthetische uPA-Inhibitoren
Inhibitor Inhibition vonuPA
Literatur
NH2
NH
NH2
p-Amino-Benzamidin
Ki = 82 µM(Billström, A. et al. 1995;Geratz, J. D. et al. 1981;Jankun, J. et al. 1997)
NH
NH2NH
R
mono-subst. Phenylguanidine
Ki = 6 µM(Yang, H. et al. 1990)
NH
NH2R
Benzamidine
Ki = 5 µM (Stürzebecher, J. et al. 1978)
N
N NH NH2
NHO
NH2
Cl
NH2
Amilorid
Ki = 7 µM (Jankun, J. et al. 1997;Vassalli, J. D. et al. 1987)
NH
NNH
NH2
R
5-Amidinobenzimidazole undAmidinoindole
Ki > 4 µM (Geratz, J. D. et al. 1981;Tidwell, R. R. et al. 1983)
2. Urokinase Inhibitoren 20
Inhibitor Inhibition vonuPA
Literatur
SH
R
NH
NH2
Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine
Ki [µM]:
B428: 0,53
B623: 0,16
(Alonso, D. F. et al. 1996a;Alonso, D. F. et al. 1996b;Alonso, D. F. et al. 1998;Rabbani, S. A. et al. 1995;Swiercz, R. et al. 1999;Towle, M. J. et al. 1993;Xing, R. H. et al. 1997)
O
NH O
R
S O
NH2
NH
3-Amidinophenylalanin-Derivate
Ki ≥ 0,5 µM(Stürzebecher, J. et al. 1999)
Pyr-Leu-Arg-H (Peptidaldehyd) IC50 = 11 µM (Kawada, M. et al. 1995;Saino, T. et al. 1988)
Ecotin Variante: M84R + D70R Ki = 50 pM (Yang, S. Q. et al. 1998a;Yang, S. Q. et al. 1998b)
2. Urokinase Inhibitoren 21
2.7. Zielsetzung
In den vorangehenden Kapiteln wurde die hohe klinische Relevanz des Urokinase-
Typ Plasminogenaktivatorsystems in der Tumorprogression und Metastasierung
näher erläutert. Ziel dieser Arbeit war es, Inhibitoren der proteolytischen Aktivität
von uPA als Leitstrukturen für Therapeutika zu entwickeln. Aufgrund der, auf
medizinische Anwendung hin ausgerichteten Themenstellung, sollten die
Inhibitoren eine möglichst hohe Selektivität gegenüber den strukturverwandten,
trypsin-ähnlichen Serinproteasen aufweisen. Aus dem gleichen Grund sollte es sich
um reversible Inhibitoren, also ohne „Active-Site“-reaktive Gruppe handeln.
Desweiteren sollte das Molekulargewicht aus pharmakokinetischen Gründen nicht
über 500 D betragen.
Als Ausgangspunkt für die Inhibitorenentwicklung diente die Röntgenkristall-
struktur, die 1995 von Spraggon und Mitarbeitern publiziert wurde (Spraggon, G. et
al. 1995). Da die Selektivität sehr wichtig war, sollten alle Verbindungen auch auf
die Inhibition der trypsin-ähnlichen Serinproteasen Thrombin, FXa, tPA, Trypsin
und Plasmin untersucht werden.
Mit vielversprechenden Leitstrukturen sollten Röntgenkristallstruktur-
Untersuchungen durchgeführt werden, um das rationelle Design noch aktiverer
Hemmstoffe zu ermöglichen.
2. Urokinase Inhibitoren 22
2.8. Ergebnisse und Diskussion
2.8.1. Tripeptid-Methylketone
Modelling der Tripeptid-Methylketone
Bis vor kurzem war nur eine einzige Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex
mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon bekannt
(Spraggon, G. et al. 1995). Dieser Inhibitor bildet unter Abspaltung eines
Chloridions eine kovalente Bindung zwischen dem Imidazolring des His57 und der
Methylengruppe des Inhibitors aus. Desweiteren bildet die Seitenkette von Ser195
mit dem Keton ein Halbketal (siehe Abbildung 7), das durch Wasserstoffbrücken
mit Gly193 NH und Ser195 NH stabilisiert ist.
Ausgehend von dieser Struktur wurden Tripeptid-Methylketone als reversible
Inhibitoren synthetisiert, die keine kovalente Bindung mit His57 eingehen können.
Durch Angriff des Ser195 O? an das Keton, ist auch bei diesen Verbindungen die
Halbketalbildung prinzipiell möglich. Dieses Halbketal ist ein Analogon des
tetraedrischen Übergangszustands, der während der Substratspaltung auftritt.
Allerdings können Ketone durch Serinproteasen nicht gespalten werden und eignen
sich deshalb als Inhibitoren, die den genannten Übergangszustand stabilisieren.
2. Urokinase Inhibitoren 23
Ser
His
195
57NH N
H
NH2NH
NH
CH2
N
NH
NH2
+NH2
O
ON
O O
O O
S1-TascheS3-Tasche
Gly193
O O
NH2
+NH2
NH
Asp189
Arg217
Abbildung 7: Bindungsmodus des irreversiblen Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-
Chloromethylketon an uPA (Spraggon, G. et al. 1995). Wasserstoffbrücken sind als
gestrichelte rote Linien, kovalente Bindungen als durchgezogene rote Linien
dargestellt.
Neben der, direkt aus der Röntgenstruktur entnommenen Peptidsequenz, wurden
auch noch weitere Sequenzen synthetisiert. Eine Studie von Song-Hua Ke (Ke, S.
H. et al. 1997) mit verschiedenen peptidischen Substraten ermittelte eine Präferenz
von uPA für die Sequenz Ser-Gly-Arg (P3-P1), so daß davon auszugehen ist, daß
auch der analoge Tripeptid-Methylketon-Inhibitor eine höhere Affinität zu uPA
besitzen sollte. Modelling-Experimente mit der bekannten uPA-Röntgenstruktur
(Spraggon, G. et al. 1995) ergaben, daß sich der P2-Rest Glycin auch durch das
starrere Prolin ersetzten läßt, wodurch man die Flexibilität des Inhibitors
einschränken und damit den entropischen Verlust bei der Bindung an das Enzym
verringern könnte.
2. Urokinase Inhibitoren 24
Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie
Zur Synthese von Methylketonen aus Peptiden sind 2 verschiedene Methoden
gebräuchlich. Die von John S. McMurray und Douglas F. Dyckes beschriebene
Abwandlung der Dakin-West-Reaktion (Dakin, H. D. et al. 1928; McMurray, J. S.
et al. 1985) hat allerdings den Nachteil, daß die C-terminale Aminosäure während
der Reaktion vollständig racemisiert. Eine weitere Methode stellt die Umsetzung
von N-Methoxy-N-Methylamiden (Weinrebamid) mit Methyl-Grignard-Reagenz
dar (Nahm, S. et al. 1981) (Abbildung 8).
R N
O
Me
OMe MeMgBr
THF NMe
OMeRMe
O Mg
R Me
OH3O+
Abbildung 8: Synthese von Methylketonen aus Weinrebamiden
Die N-Methylgruppe des Weinrebamids kann auch durch einen mit einem
polymeren Träger verbundenen Linker ersetzt werden (Dinh, T. Q. et al. 1996). Zur
Synthese der Tripeptid-Methylketone wurde eine Festphasensynthese nach Fmoc-
Strategie an einem Weinreb AM-Harz (NovaBiochem) gewählt (Abbildung 9). Da
das Weinrebamin sehr wenig nukleophil ist, wurde die erste Aminosäure [Fmoc-
Arg(Pbf)-OH] mit HATU/HOAt/DIEA im Verhältnis 1:1:1:2 mit einem 4-fachen
molaren Überschuß an den Harzlinker gekoppelt. Der weitere Aufbau der
Peptidkette erfolgte standardmäßig mit 4 Äquivalenten Fmoc-Xaa-
OH/TBTU/HOBt/DIEA (1:1:1:2). Die Fmoc-Abspaltung war nach 2
aufeinanderfolgenden Zyklen von 3 min und 12 min mit 20% Piperidin in DMF
quantitativ. Im letzten Schritt wurde das seitenkettengeschützte Produkt mit 20
Äquivalenten Methyl-Grignard-Reagenz in absolutem THF unter gleichzeitiger
2. Urokinase Inhibitoren 25
Ausbildung des Methylketons vom Harz abgespalten. Die Schutzgruppenabspaltung
erfolgte schließlich in 95% TFA.
PNOMe
ArgFmoc
PNOMe
HCH3 +Arg
PNOMe
Fmoc
1. Piperidin2. Fmoc-Xaa1-OH/ HOBt/HBTU/DIEA
1. Piperidin2. Fmoc-Xaa2-OH/ HOBt/HBTU/DIEA
PNOMe
ArgXaa1Fmoc
1. Piperidin2. Fmoc-Arg(Pbf)-OH/ HOAt/HATU/DIEA
PNOMe
ArgXaa1Xaa2Fmoc
PNOMe
ArgXaa1Xaa2Ac
Xaa1Xaa2Ac
1. CH3MgBr2. H+
1. Piperidine2. Ac2O
Abbildung 9: Synthese von Tripeptid-Methylketonen am polymeren Träger
2. Urokinase Inhibitoren 26
Inhibition von uPA und strukturverwandten Enzymen
Alle dargestellten Tripeptid-Methylketone wurden auf Inhibition von uPA und den
strukturverwandten Serinproteasen Plasmin, FXa, Thrombin und Trypsin untersucht
(Tabelle 3). Die Inhibitionskonstanten aller getesteter Verbindungen waren größer
als 1 mM (mit Ausnahme von Verbindung 3, die Trypsin mit 12 µM hemmt).
Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Hemmwirkung des irreversiblen
Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon praktisch ausschließlich durch
Bildung einer kovalenten Bindung mit His57 erzielt wird und nicht durch
Wechselwirkung mit den uPA-Bindungstaschen S1-S3. Daraus folgt direkt, daß der
irreversible Inhibitor praktisch keine Selektivität gegenüber den verwandten
Serinproteasen aufweisen kann und deshalb in vivo nicht verwendet werden kann.
Auf der Basis von Peptidaldehyden, die den tetraedrischen Übergangszustand
besser stabilisieren können als Methylketone, könnten vermutlich auch uPA-
Inhibitoren entwickelt werden. Aus oben genannten Gründen würde aber auch mit
solchen Inhibitoren das Selektivitätsproblem nicht zufriedenstellend gelöst werden.
Deshalb wurde schließlich mit der Entwicklung kleiner, organischer Moleküle als
uPA-Inhibitoren ein vollkommen neuer Weg eingeschlagen (Kapitel 2.8.2).
Tabelle 3: Struktur-Wirkungsbeziehung der Tripeptid-Methylketone auf dieInhibition von uPA und verwandten Serinproteasen
Ki [µM]Nr. Sequenz
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(1) Ac-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(2) Ac-Glu-Gly-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(3) H-Glu-Pro-D,L-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 12
(4) Ac-Glu-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(5) Ac-Ser-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
2. Urokinase Inhibitoren 27
2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren
Strukturbasiertes Inhibitordesign
Abbildung 10 zeigt das katalytische Zentrum der Röntgenkristallstruktur von uPA
im Komplex mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon
(Spraggon, G. et al. 1995). Aus dem Bindungsmodus dieses substratähnlichen
Inhibitors lassen sich einige wichtige Rückschlüsse für das Inhibitordesign ziehen:
• Das natürliche Substrat Plasminogen wird von uPA nach Arginin 560 gespalten.
Die Guanidinogruppe des Arginins interagiert dabei mit der Seitenkette von
Asp189 in der S1-Tasche über eine Salzbrücke.
• Verglichen mit der S2-Tasche in Thrombin, ist die S2-Tasche von uPA durch
die Insertion von Thr97A und Leu97B im sogenannten „99-Loop“ stark
verkleinert. In der P2-Position des Substrats oder Inhibitors sind aus diesen
sterischen Gründen kleine Aminosäurereste wie Glycin bevorzugt.
• Ebenso wie in Thrombin gibt es eine S3/S4-Tasche die vorwiegend von den
hydrophoben Seitenketten aromatischer Aminosäuren gebildet wird.
Ein möglicher uPA-Inhibitor sollte somit ein Argininmimetikum in P1, einen
kleinen Spacer in P2 und einen hydrophoben Rest in P3 enthalten.
2. Urokinase Inhibitoren 28
Abbildung 10: Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex mit dem irreversiblen
Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon
Untersuchung verschiedener Argininmimetika
Zunächst wurden verschiedene Kopfgruppen synthetisiert und auf ihre
inhibitorische Wirkung getestet (Tabelle 4). Alle enthalten einen hydrophoben
Benzolring, substituiert mit basischen Amidino- bzw. Guanidino-Gruppen.
Prinzipiell sind alle diese Derivate also in der Lage an Asp189 in der S1-Tasche über
eine Salzbrücke zu binden.
Benzamidin (111) und Phenylguanidin (6) inhibieren uPA im mikromolaren
Bereich. Benzylcarbamidin (112), das zu Phenylguanidin isoster ist, hatte hingegen
2. Urokinase Inhibitoren 29
keine inhibitorische Aktivität auf die untersuchten trypsinartigen Serinproteasen.
Wegen der besseren Selektivität wurde aufgrund dieser Ergebnisse Phenylguanidin
(6) als Kopfgruppe gewählt.
Tabelle 4: Struktur-Wirkungsbeziehung verschiedener Argininmimetika
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(111)NH2
NH81 350 410 220 35
(6) NH
NH2NH
30 > 1000 > 1000 > 1000 163
(112) NH2NH
> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(7) NH NH2
NH> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
Screening verschiedener Phenylguanidin-Derivate – Suche nach einem
geeigneten P2-Spacer
Im nächsten Schritt wurde versucht, einen P2-Spacer geeigneter Länge zu finden.
Sämtliche Derivate der 4-Guanidino-Benzoesäure (8-11), des 4-Guanidino-Anilins
(31), sowie des 4-Guanidino-Phenylalanins (15, 18, 21) zeigten keine oder nur sehr
geringe hemmende Wirkung auf uPA (Tabelle 5). Interessanterweise sind die zu
Verbindung 18 und 21 analogen 3- bzw. 4-Amidino-Phenlalaninderivate als Serin-
proteaseinhibitoren bekannt (Gabriel, B. 1998; Gabriel, B. et al. 1998;
Stürzebecher, J. et al. 1999). Durch die Guanidinofunktion scheint sich also eine
2. Urokinase Inhibitoren 30
völlig andere Bindungsgeometrie zu ergeben. Derivate von 3-Guanidinobenzylamin
erfüllen offensichtlich ebensowenig die strukturellen Voraussetzungen für einen
uPA-Inhibitor (66, 73, 74) wie Sulfonamid-Derivate des 4-Guanidinobenzylamins
(37–45). Einzig und allein Urethanyl- oder Acyl-Derivate des 4-
Guanidinobenzylamins (28, 29, 47, 49, 50) zeigten die gewünschte uPA Inhibition.
Während die Acyl-Derivate 47, 49 und 50 zumindest Trypsin noch mit
vergleichbaren Inhibitionskonstanten hemmen wie uPA, konnte für die
Urethanylderivate 28 und 29 keine Hemmwirkung auf Trypsin, Thrombin, FXa und
Plasmin nachgewiesen werden. Das tert-Butyloxycarbonyl-Derivat (29) wurde nun
als neue Leitstruktur für weitere Derivatisierungen eingesetzt.
Tabelle 5: Substituierte Phenylguanidine – Suche nach einem geeigneten Spacer umdie S2-Tasche zu überbrücken.
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(8) NNH
NH2NH
O
O
O
O
59 400 >1000 36 500
(9) NH
NH2NH
O
N MeMeO
100 100 >1000 >1000 >1000
(10) ONH
NH2NH
O
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(11) NH
NH2NH
O
OMe >1000 n. b. >1000 >1000 >1000
2. Urokinase Inhibitoren 31
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(15)NH
NH2NH
NH
OO
OOMe
200 >1000 >1000 85 >1000
(18) NH
NH2NH
NH
OO
OOMe
>1000 300 >1000 >1000 >1000
(21) NH
NH2NH
NH
OOMe
SO
O>1000 >1000 >1000 54 >1000
(37)NH
NHNH2
NH
SO
O
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(38) NH
NHNH2
NH
SO
O
FF
F
F F
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(39) NH
NHNH2
NH
SO
ONH
O >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(41) NH
NHNH2
NH
SO
OCF3
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(42) S
N
NH
NHNH2
NH
SO
ONH
O
240 >1000 >1000 >1000 >1000
2. Urokinase Inhibitoren 32
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(43) NH
NHNH2
NH
SO
OF3C
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(44)SO
ON
OCF3
NH
NHNH2
NH
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(45)S
O
OS
O
O
O
NH
NH NH2
NH
NH
NHNH2
NH
>1000 >1000 >1000 >1000 63
(66)NH
NHNH2
NH
ONH >1000 450 600 >1000 >1000
(73)NH
S NH
NH2 NH
O
O >1000 >1000 1300 >1000 >1000
(74)NH
O
ONH
NH2 NH
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(31)NH
ONH
NHNH2O
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(28) NH
NHNH2
NHO
O 16 >1000 >1000 >1000 >1000
2. Urokinase Inhibitoren 33
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(29) NH
NHNH2
NHO
O 36 >1000 >1000 >1000 >1000
(47)NH
NHNH2
NHO
NH
OO
37 n. b. >1000 >1000 >1000
(49)NH
NHNH2
NHO
NH
SO
O
NH
O
21 >1000 >1000 >1000 42
(50)NH
NHNH2
NHO
NH
SO
O
32 >1000 >1000 >1000 36
Einfluß der hydrophoben Wechselwirkungen in P3
Im nächsten Schritt sollten die hydrophoben Wechselwirkungen optimiert werden.
Hierzu wurde die tert-Butylgruppe der Leitstruktur 29 sukzessive durch andere
Alkyl-, Zykloalkyl- und aromatische Gruppen ausgetauscht (Tabelle 6). Bei allen
durchgeführten Variationen stellten wir fest, daß der Einfluß der hydrophoben
Wechselwirkungen weitaus geringer war als der Einfluß des geeigneten P2-Spacers
(siehe Tabelle 5). So bewegen sich die Inhibitionskonstanten nur im Bereich
zwischen 10 und 50 µM. Der bis-basische Inhibitor 54 hebt sich mit einer
Inhibitionskonstante von 2,8 µM etwas aus diesem Umfeld ab. Durch die zwei
Guanidino-Benzylaminreste in einem Molekül ist die Konzentration des Inhibitors
formal aber doppelt so hoch, d. h. hätte der Inhibitor nur eine Guanidinofunktion,
2. Urokinase Inhibitoren 34
wäre der Ki-Wert etwa 6 µM. Deshalb ist auch nicht davon auszugehen, daß die
zweite Phenylguanidin-Einheit außerhalb der uPA-„Active-Site“ bindet, während
der erste Phenylguanidinrest in der S1-Tasche gebunden ist. Eine deutlichere
Verbesserung der Inhibitionskonstante findet man für diese Verbindung allerdings
in Bezug auf Tryptase, die ein Tetramer mit vier katalytisch aktiven Untereinheiten
bildet. Für die Kopfgruppe 4-Guanidino-Benzylamin (59) wurde gegen Tryptase
eine Inhibitionskonstante von 200 µM ermittelt. Durch den bis-basischen Inhibitor
54 verbessert sich hier der Ki auf 1 µM, was zumindest teilweise für bivalentes
Binden (gleichzeitiges Binden in zwei Untereinheiten der Tryptase) spricht.
Wegen der beobachteten leichten Präferenz für den sperrigen und inerten
Adamantylrest (Verbindung 36) und wegen der kommerziellen Verfügbarkeit der
benötigten Derivate, wurde der Inhibitor 36 als Leitstruktur für die weiteren
Optimierungsschritte gewählt.
Tabelle 6: Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in P3
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(29) NH
NHNH2
NHO
O 36 >1000 >1000 >1000 >1000
(33) NH
NHNH2
NH
O
O
27 >1000 >1000 >1000 >1000
(34) NH
NHNH2
NHO
O 51 >1000 >1000 >1000 >1000
2. Urokinase Inhibitoren 35
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(35) NH
NHNH2
NHO
O 52 >1000 >1000 >1000 >1000
(36) NH
NHNH2
NHO
O 13 >1000 >1000 >1000 >1000
(32) NH
NHNH2
NH
NH2
NH
46 >1000 >1000 >1000 >1000
(59)NH
NHNH2
NH2
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(53) NH
NH NH2
NH
O
O
NN 11 >1000 >1000 >1000 >1000
(52)NH
NH
NH2NH
O
O
NO2
MeOOMe
35 >1000 >1000 >1000 >1000
(28) NH
NHNH2
NHO
O 16 >1000 >1000 >1000 >1000
(51)O2N
NH
NH
NH2NH
O
O 12 200 >1000 >1000 36
(54) NH
NHNH2
NH
O
OO
ONH
NH
NHNH2
2,8 47 >1000 >1000 11
2. Urokinase Inhibitoren 36
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(64) NH
NHNH2
NHO
NH
OO
70 390 >1000 >1000 >1000
(65)NH
NHNH2
NHO
NH252 250 >1000 >1000 >1000
Untersuchung der Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-Eigenschaften des P2-
Spacers
Als nächstes wurde untersucht, welche Atome des P2-Spacers für die Bindung zum
Enzym wichtig sind. Hierzu wurden einzelne Atome durch isostere Gruppen mit
anderen Wasserstoffbrücken-Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften ausgetauscht
(Tabelle 7). So wurde zum Beispiel der Wasserstoffbrückenakzeptor O (Verbindung
36) durch die inerte Gruppierung CH2 (Verbindung 58) bzw. den Donor NH (75)
ausgetauscht. NH als H-Brückendonor scheint an dieser Stelle stark bevorzugt zu
sein, so daß sich die Inhibitionskonstante auf 2,4 µM verbesserte (75). Tauscht man
den Harnstoff in Verbindung 75 durch den isosteren Thioharnstoff (60) aus, ist
keinerlei uPA-Inhibition mehr zu messen. Beim Austausch des benzylischen NH in
Verbindung 75 durch die inerte Methylengruppe (62) verschlechtert sich die
Inhibitionskonstante auf 120 µM. Dieser Austausch beeinflußt auch die Selektivität,
so daß Plasmin vergleichbar gehemmt wird. Das Verkürzen des P2-Spacers von
Verbindung 75 um ein Atom in Verbindung 63 führte ebenso zu einer
Verschlechterung der uPA-Inhibition wie auch der Austausch der Adamantylgruppe
2. Urokinase Inhibitoren 37
durch einen Phenylring (Verbindung 77, Ki=29 µM). Der zu Verbindung 77 analoge
Thioharnstoff (55) hemmt uPA nicht-kompetitiv (allosterisch) bei einer
Konzentration von 1 µM, während Trypsin mit Ki=37 µM kompetitiv gehemmt
wird. Diese Beispiele zeigen gut, wie wichtig jedes einzelne Atom eines kleinen
Inhibitors für eine hohe Affinität zum Enzym sein kann.
Die Analyse aller durchgeführten Derivatisierungen ergab folgende Ergebnisse (
Abbildung 11):
NH
NHNH2
NHO
NH
wichtigsehrwichtig
wichtig
essentiell
kann ersetztwerden
Abbildung 11: Analyse des Inhibitors 75, basierend auf den durchgeführten
Derivatisierungen
• Die 4-Guanidino-Benzyleinheit ist essentiell für die Bindung in der S1-Tasche
und läßt keine Veränderungen zu
• Der anschließende Harnstoff ist für gute Inhibitionskonstanten wichtig; das
Ersetzen einzelner Atome in dieser Gruppe und die damit verbundene
Abnahme der uPA-Inhibition, stützt die Annahme, daß die Harnstoffgruppe
in drei Wasserstoffbrücken involviert ist.
• Die Art und Größe der hydrophoben Gruppe (hier Adamantan) spielt eine
untergeordnete Rolle – durch andere Derivate mit Wasserstoffbrücken-
Donor/Akzeptoreigenschaften läßt sich die uPA-hemmende Wirkung des
Inhibitors eventuell noch verbessern
2. Urokinase Inhibitoren 38
Tabelle 7: Optimierung des P2-Spacers durch Austausch einzelner Atome durchisostere Gruppen mit anderen Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-eigenschaften
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin tPA
(36) NH
NHNH2
NHO
O 13 >1000 >1000 >1000 >1000
(58) NH
NHNH2
NHO
40 >1000 >1000 >1000 n. b.
(75) NH
NHNH2
NHO
NH 2,4 >1000 >1000 600 >1000
(62) NH
NHNH2
CH2O
NH
120 130 >1000 >1000 n. b.
(60) NH
NHNH2
NHS
NH >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(77) NH
NHNH2
NHO
NH
29 170 >1000 >1000 >1000
(76) NH
NHNH2
NHO
NH 7,4 200 220 >1000 n. b.
(63) NH
NHNH2
NHO
102 460 >1000 >1000 n. b.
2. Urokinase Inhibitoren 39
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin tPA
(56)NH
NH
NH2NH
O
18 >1000 >1000 >1000 >1000
(78) NH
NHNH2
NHO
NHO
Cl37 180 >1000 >1000 n. b.
(55) NH
NHNH2
NHS
NH
nicht-
kompetitiv>1000 >1000 >1000 n. b.
Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (75)
Zur Synthese von N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (Abbildung 12)
geht man vom kommerziell erhältlichen p-Aminobenzylamin aus. Im ersten Schritt
wird die Aminomethylgruppe mit tert-Butyloxycarbonyl geschützt (22).
Anschließend erfolgt die Umsetzung mit einem bis-Benzyloxycarbonyl-geschützten
Guanidinylierungsreagenz (Feichtinger, K. et al. 1998). Nach Abspaltung der Boc-
Schutzgruppe (23) wird das freie Amin mit Adamantylisocyanat zum
Adamantylharnstoff umgesetzt. Im letzten Schritt wird die Guanidinofunktion durch
katalytische Hydrierung an einem Pd-Katalysator entschützt um Inhibitor 75 zu
erhalten.
2. Urokinase Inhibitoren 40
NH2
NH2
BOC2O (NH-Z)CF3SO2 N C(NH-Z)
NH
NH2
NH
N
Z
Z
H2/Pd/C
NHNH
N
Z
Z
NH
O
NH H
HH
NH2
NH
O
O *HCl
1.
2. 6M HCl/Dioxan
NHNH2
NH
NH
O
NH H
HH
1-Adamantylisocyanat/TEA
(75)
(23)(22)
Abbildung 12: Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-
Harnstoff (75)
Röntgenkristallstruktur-Untersuchung des uPA/Inhibitor-75-Komplexes
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe für Strukturforschung ist es gelungen die
rekombinant hergestellte uPA-B-Kette im Komplex mit Benzamidin zu
kristallisieren. Da Benzamidin ein schwacher uPA-Inhibitor ist, konnte es im
Kristall mittels der „Soaking“-Technik durch den Inhibitor 75 ersetzt werden.
Abbildung 13 zeigt die halbtransparente Oberflächendarstellung der
Röntgenstruktur von uPA im Komplex mit dem Inhibitor 75. Das Enzym ist in der
Standardorientierung für Serinproteasen abgebildet, das heißt die „Active-Site
Cleft“ verläuft von links nach rechts.
2. Urokinase Inhibitoren 41
Abbildung 13: Halbtransparente Oberflächendarstellung des uPA/Inhibitor 75-
Komplexes
Wie erwartet bindet der Phenylguanidinteil in die S1-Tasche unter Ausbildung der
canonischen Salzbrücke zu Asp189. Die Harnstoffgruppe durchquert das katalytische
Zentrum und plaziert den sperrigen Adamantylrest in die S1'-Tasche.
2. Urokinase Inhibitoren 42
Abbildung 14: Vergleich der Bindungsmodi des irreversiblen Inhibitors H-Glu-
Gly-Arg-Chloromethylketon (C-Atome in gelb) und des Inhibitors
75 (C-Atome in grün)
Wie oben erläutert, wurde der Inhibitor ursprünglich dahingehend entwickelt, daß er
die Taschen S1-S3 von uPA zur Bindung nutzt. Substratähnliche Inhibitoren wie
das in Abbildung 14 gezeigte Tripeptid-Chloromethylketon (C-Atome in gelb)
würden in diese Taschen binden. Der Inhibitor 75 (C-Atome in grün) durchquert in
unerwarteter Weise das aktive Zentrum und plaziert den hydrophoben Rest in die
S1’-Tasche. Dieser völlig neue Bindungsmodus ermöglicht es erstmals die
gestrichene Seite der „Active-Site“ für strukturbasierte Verbesserungen des
Inhibitors zu nutzen.
Das Schema in Abbildung 15 zeigt den experimentellen Bindungsmodus des
Inhibitors 75 in uPA.
2. Urokinase Inhibitoren 43
NH
NH2
NH2
NH
O
NH
OO
+
-
O
H2O
Ala183
Asp189
OHO
O
Gly219
Ser190
H2O
O
Ser214
H2O
NH2
O
Gln192
SS
Cys58
Cys42NH
NHis57
NH
Gly193
BackboneGly 193Asp194Ser195
2.72Å
2.67Å
2.90Å
2.58Å
2.82Å
2.90Å
2.66Å
2.91Å
3.20Å
3.10Å
2.78Å
Abbildung 15: Bindungsmodus des Inhibitors 75 (blau) an uPA (wichtige Reste in
schwarz). Wasserstoffbrückenbindungen sind als rote, punktierte
Linien wiedergegeben.
Neben der canonischen Salzbrücke zu Asp189 ist die Guanidinofunktion noch in
zwei weitere Wasserstoffbrücken zu Gly219 O und der Seitenkette von Ser190
involviert. Interessanterweise binden die Stickstoffatome der Harnstoffgruppe über
Wassermoleküle einerseits zu Ser214 O und andererseits zur Seitenkette von Gln192.
Das Sauerstoffatom der Harnstoffgruppe formt eine starke Wasserstoffbrücke mit
Gly193 N. Wie bereits auf Seite 36 gezeigt, ist das Austauschen eines Atoms der
Harnstoffgruppe stets mit einem Verlust an Hemmwirkung des Inhibitors
verbunden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Harnstoffgruppe in drei
Wasserstoffbrücken involviert ist, läßt sich dieser Befund sehr leicht erklären.
2. Urokinase Inhibitoren 44
Die Adamantylgruppe ist an hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt. Zum einen
mit den „Backbone“-Atomen zwischen Gly193 und Ser195, mit der Disulfidbrücke
zwischen Cys58 und Cys42 und schließlich mit der hydrophoben Ebene des
Imidazolrings von His57.
Der Inhibitor durchquert die „Active-Site“ ohne direkte Wechselwirkung mit den
katalytischen Resten Ser195 und His57. In der aktiven Konformation dieser Reste
wäre das Binden des Inhibitors im gefundenen Bindungsmodus aus sterischen
Gründen nicht möglich. Um die Bindung des Inhibitors dennoch zu ermöglichen,
müssen die Seitenketten von Ser195 und His57 eine andere Konformation einnehmen.
Abbildung 16: Umordnung der „Active-Site“-Reste His57 und Ser195 durch die
Bindung von Inhibitor 75. (violett: aktive Konformation der
katalytischen Triade; grün: umgeordnete Konformation während
der Bindung des Inhibitors 75)
2. Urokinase Inhibitoren 45
In violett ist in Abbildung 16 die natürliche, aktive Anordnung der katalytischen
Triade dargestellt, wie man sie auch in der Röntgenstruktur von uPA im Komplex
mit Benzamidin vorfindet. Der Imidazolring von His57 bildet Wasserstoffbrücken-
Bindungen zu Asp102 und Ser195.
Während der Bindung des Inhibitors 75 werden diese Reste nun aus Platzgründen
umgeordnet, wie in Abbildung 16 in gün dargestellt. Dabei wird das ursprüngliche
Netz aus Wasserstoffbrücken zerstört. Um den damit verbundenen energetischen
Verlust wenigstens teilweise zu kompensieren, wird ein Wassermolekül neu in die
Struktur eingefügt. Dieses Wassermolekül ist nahezu perfekt tetraedrisch zwischen
Ser195, His57, Asp102 und Ser214 koordiniert.
Die hier beobachtete Umordnung zeigt ganz klar die Grenzen der heutigen
Modellingprogramme, die solche Adaptionen des Enzyms nicht berücksichtigen
können. Deshalb war es auch nicht möglich, den gefundenen Bindungsmodus mit
dem Computerprogramm FlexX vorherzusagen.
Diskussion der Selektivität des Inhibitors 75
Wie aus Tabelle 8 hervorgeht, besitzt der Inhibitor eine sehr hohe Selektivität. Die
wichtigsten Enzyme der Blutgerinnungskaskade sowie tPA und Plasmin, die für die
Fibrinolyse notwendig sind, werden von diesem Inhibitor nicht beeinflußt.
Wodurch die hohe Selektivität für uPA zustande kommt, ist aber trotz gelöster
Röntgenkristallstruktur nicht einfach zu verstehen. Im Falle von Thrombin, FXa
und tPA ist Ser190 durch Ala ersetzt (siehe Abbildung 15). Dadurch kann in diesen
Enzymen die Wasserstoffbrücken-Bindungskapazität der Guanidinogruppe nicht
vollständig abgesättigt werden. Desweiteren ist in Thrombin (Bode, W. et al. 1989)
und FXa (Padmanabhan, K. et al. 1993) die S1'-Tasche durch die Seitenketten von
Lys60F bzw. Gln61 kleiner als in uPA. In tPA befinden sich die geladenen
Seitenketten von Arg39 und Glu60A nahe an der S1'-Tasche, und würden die
2. Urokinase Inhibitoren 46
hydrophoben Wechselwirkungen der Adamantylgruppe stören. Aus sterischen
Gründen wäre auch die notwendige Umorientierung des His57 (siehe Seite 44) in
Thrombin, FXa und tPA stark gehindert. Die synergistische Wirkung aller dieser
und wahrscheinlich noch weiterer kleiner Unterschiede, wird also letztlich zur
beobachteten hohen Selektivität des Inhibitors 75 beitragen.
Tabelle 8: Inhibitionskonstanten von Inhibitor 75 für verschiedene Serinproteasen
Ki [µM]Inhibitor
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin tPA TryptasePlasma-
KallikreinFXIIa
75 2,4 >1000 >1000 600 46 >1000 400 >1000 >1000
Strukturbasierte Vorschläge zur Verbesserung der Leitstruktur 75
Die genaue Kenntnis des Bindungsmodus des Inhibitors 75 wird in Zukunft die
Optimierung dieser Leitstruktur stark vereinfachen. In diesem Kapitel sollen einige
Verbesserungsvorschläge vorgestellt werden, die wahrscheinlich eine stärkere
Bindung des Inhibitors zum Enzym ermöglichen würden und somit die
Inhibitionskonstante verbessern könnten (Abbildung 17).
• Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in der S1'-Tasche:
Insbesondere die hydrophobe Wechselwirkung mit der Disulfidbrücke
zwischen Cys58 und Cys42 dürfte sich durch Einführung eines
Chlorsubstituenten im Adamantylrest deutlich verbessern lassen.
• Optimierung von Wasserstoffbrückenbindungen in des S1'-Tasche:
Südöstlich der Adamatylgruppe befindet sich im Kristall ein
Wassermolekül, das zwischen Tyr151 Oγ, Val41 O und Tyr40 O dreifach
koordiniert und somit in der Elektronendichte gut definiert ist. Durch einen
Hydroxymethl-Substituenten am Adamantylrest, ließe sich dieses
Wassermolekül aus der Struktur verdrängen und die Hydroxyfunktion wäre
2. Urokinase Inhibitoren 47
anschließend nahezu perfekt tetraedrisch koordiniert. Anstelle der
Hydroxymethl-Gruppe könnte z. B. auch eine Carbonsäureamidfunktion
verwendet werden.
• Optimierung der Wasserstoffbrücken-Bindungen der Harnstoffgruppe:
Wie in Abbildung 15 dargestellt, binden die Stickstoffatome des bis-
substituierten Harnstoffs über Wassermoleküle an Ser214 O und an die
Seitenkette von Gln192. Durch Substitution der Harnstoff-Stickstoffatome
mit Hydroxyethylfunktionen, ließen sich zwei direkte Wasserstoffbrücken
zwischen dem Inhibitor und dem Enzym verwirklichen, die eine höhere
Bindungsstärke bewirken als die beiden wasservermittelten Bindungen.
Beispiele für die Realisierung eines solchen Inhibitors sind in Abbildung 17 und 18
zusammengefaßt.
NH
NH2
NH2
O
Cl
OH
OH
OH
OO
+
-
Asp189
OHO
O
Gly219
Ser190
O
Ser214NH2
O
Gln192
SS
Cys58
Cys42NH
NHis57
NH
Gly193
2.72Å
2.67Å
2.90Å 2.90Å
2.78Å
OH
Tyr151
O
O
Tyr40
Val41
Abbildung 17: Möglicher Bindungsmodus eines strukturbasiert verbesserten
Inhibitors (Änderungen sind in grün dargestellt)
2. Urokinase Inhibitoren 48
NH
NHNH2
N
O
Cl
NH2
NH2
OH
O
O NH
NHNH2
O
HHH
Cl
NH2
NH2
OH
O
O
NH
NHNH2
O
NH2
OH
O
NH2
O
Abbildung 18: Weitere Strukturvorschläge für Inhibitoren mit verbesserten
Bindungseigenschaften
Untersuchung der Toxizität des Inhibitors 75
Die Zytotoxizität des Inhibitors wurde für drei verschiedenen Krebszellinien
bestimmt, indem steigende Inhibitorkonzentrationen zusammen mit den Zellen
inkubiert wurden und anschließend die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt wurde.
Die abgebildeten Kurven (Abbildung 19) repräsentieren die Ergebnisse nach 48 h
Inkubation, wobei sich nach 24 bzw. 72 h aber sehr ähnliche Resultate ergaben.
Dies bedeutet, daß bestimmte Inhibitorkonzentrationen toxisch wirken, die
Inkubationszeit hingegen scheinbar keinen Einfluß auf die Toxizität einer
bestimmten Konzentration hat. Für zwei Zellinien (MDA-MB-231 und OV-MZ-6)
war der Inhibitor bis zu einer Konzentration von 250 µM nicht toxisch.
Interessanterweise beeinflußte diese Konzentration bereits die Überlebensrate der
Keratinozyten-Krebszellinie A431. Auf jeden Fall liegen die toxischen
Konzentrationen aber 50- bis 100-fach über den Inhibitionskonstanten, was einen
großen therapeutischen „Spielraum“ für Tierexperimente schafft.
2. Urokinase Inhibitoren 49
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
0 1 5 10 15 20 50 100
250
500 750 1000
Inhibitor-Konzentration [µM]
Abs
orpt
ion
[560
-640
nm
]
MDA-MB-231 OV-MZ-6A431 Puffer Kontrolle
Abbildung 19: Effekt des Inhibitors 75 auf die Zellproliferation. Die
Pufferkontrolle ist nur für OV-MZ-6-Zellen dargestellt
Pharmakokinetische Charakterisierung
Ein guter Anhaltspunkt für die orale Bioverfügbarkeit einer Substanz ist der
Verteilungskoeffizient zwischen Oktanol und Wasser. Eine sehr gute orale
Aufnahme erhält man normalerweise wenn der Logarithmus des
Verteilungskoeffizienten (logPOktanaol/Wasser) etwa +2 ist. In Übereinstimmung mit der
bei physiologischem pH positiv geladenen
Guanidinogruppe entspricht der Logarithmus des
Verteilungskoeffizienten der Verbindung 75 einem
Wert von –1,3 (experimentell mittels HPLC
bestimmt). Dies bedeutet, daß die orale
Bioverfügbarkeit des Inhibitors wahrscheinlich
eher schlecht ist, sofern keine aktiven
Transportsysteme für diese Verbindung existieren.
SO
NH
O
O
NH
O N
NH2 NHNAPAP
2. Urokinase Inhibitoren 50
Für Clearance-Studien wurde der Inhibitor intravenös in Ratten appliziert. Die
Dosis betrug 1 mg/kg. Wie in Abbildung 20 dargestellt, wird der Inhibitor 75 sehr
rasch aus der Blutzirkulation eliminiert. Die Eliminationsrate ist vergleichbar mit
der Eliminationsrate des bekannten Thrombin-Inhibitors NAPAP (siehe
Formelzeichnung) der ebenfalls eine basische Gruppe und einen hydrophoben Rest
besitzt. Leider liegen noch keine Ergebnisse bezüglich des Eliminationsweges oder
in Bezug auf den Metabolismus der Verbindung 75 vor.
Abbildung 20: Plasma-Elimination des Inhibitors 75 nach intravenöser
Applikation von 1 mg/ml in Ratten
3. Faktor Xa Inhibitoren 51
3. Faktor Xa Inhibitoren
3.1. Die Blutgerinnungskaskade: ein therapeutischer Ansatz bei
Thromboseerkrankungen
Die Blutgerinnung hat eine Notfallfunktion: größere Blutverluste sollen bei
Gefäßverletzungen vermieden werden. Der Hauptvorgang dieser Gerinnung besteht
darin, daß lösliches Fibrinogen (Faktor I) in unlösliches Fibrin überführt wird, das
anschließend durch Faktor XIIIa zu einem festen Fibringerinsel vernetzt wird.
Hierfür ist ein proteolytischer Katalysator, das Thrombin, notwendig. Durch
Proteolyse wird das Zymogen Prothrombin (Faktor II) in Thrombin umgewandelt.
Diese Aktivierung wird von Faktor Xa (FXa, andere Namen: Plasma-
Thrombokinase, Plasma-Thromboplastin, Stuart-Power-Factor, Autoprothrombin
C) katalysiert. FXa seinerseits wird wiederum durch proteolytische Spaltung aus der
inaktiven Vorstufe Faktor X gebildet. Die komplette Kaskade der einzelnen
Aktivierungsschritte, die letztendlich zur Bildung von Fibrin führt ist in Abbildung
21 dargestellt.
Man unterscheidet zwei unterschiedliche Aktivierungskaskaden die letztlich bei der
Aktivierung von FX zusammenlaufen. Beim intrinsischen System beginnt die
Blutgerinnungskaskade intravasal durch Kontaktaktivierung von FXII an
„Rauhigkeiten“ der endothelialen Auskleidung der Gefäße. Der extrinsische
Aktivierungsprozeß beruht hingegen auf der Freisetzung von FIII („tissue factor,
TF) aus dem endoplasmatischen Retikulum beschädigter oder zestörter
Gewebszellen. Die extrinsische Aktivierungskaskade läuft somit nach einer
Verletzung der Blutgefäße ab, aber auch bei einem Herzinfarkt oder anderen
pathologischen Zuständen (z. B. Entzündung oder Blutvergiftung) wird FIII
freigesetzt. Nach Bindung von FVII an den freigesetzten TF wird FVIIa durch
Autoaktivierung oder durch Proteolyse (Thrombin, FXa, FXIIa) erzeugt. Da beide
Enzymkaskaden bei der Aktivierung von FX zusammenlaufen, spielt der
entstehende FXa eine zentrale Rolle innerhalb des Blutgerinnungssystems.
3. Faktor Xa Inhibitoren 52
Faktor XI Faktor XIa
+
Faktor IX Faktor IXa
Ca2+
+
Faktor X Faktor XaCa
2+ +Faktor VIIIa, PL,
+
Prothrombin ThrombinCa
2+ +Faktor Va, PL,
+
+
Fibrinogen Fibrin
Faktor XIIIa
Fibrin(quervernetzt)
+
OberflächeFaktor XIIHMW-KininogenPrekallikrein
+
+
Faktor VIIa Faktor VII
Faktor IX
Faktor X
+
+ PL
+ Faktor III, PL
ThrombinFaktor XaFaktor XIIa
+
+Aktivierung
Co-Faktoren
Legende:
Intrinsischer Weg Extrinsischer Weg
Spaltprodukte
-
+
Plasminogen Plasmin
uPA,tPA
- Abbau FIBRINOLYSE
BLUTGERINNUNG
PL: Phospholipid
Abbildung 21: Die Blutgerinnungskaskade
3. Faktor Xa Inhibitoren 53
Die Synthese der Zymogene Prothrombin, FXII, FIX und FX ist Vitamin-K
abhängig. Sie enthalten γ-Carboxyglutaminsäurereste (Gla) die zusammen mit
Calciumionen die funktionelle Gla-Domäne bilden und sich dadurch an
Phospholipidmembranen anheften können. Bei Vitamin-K-Mangel kann die
zusätzliche γ-Carboxylgruppe nicht in vorhandene Glutaminsäurereste eingebaut
werden. Nach ihrer
Aktivierung sind die
Proteasen ohne Gla-Reste
viel weniger aktiv als jene
mit funktioneller Gla-
Domäne. In diesen
Mechanismus greifen die
oral wirksamen Vitamin-K-
Antagonisten Dicumarol,
Warfarin, Acenocoumarin
und Phenocumaron
(Abbildung 22) ein (Gulba,
D. C. 1996). Allerdings sind bei der Behandlung mit diesen Wirkstoffen auch viele
andere Proteasen betroffen, so daß eine Dauerbehandlung von Patienten nur unter
ständiger ärztlicher Kontrolle möglich ist. Die Anwendung beschränkt sich daher
auf die Prophylaxe nach akuten thrombotischen Ereignissen (Glusa, E. et al. 1996).
Ein weiterer Nachteil der Coumarin-Derivate ist der um 24 bis 36 h verzögerte
Wirkungseintritt nach Behandlungsbeginn, sowie die sich erst nach einigen Tagen
wieder einstellende Normalisierung des Blutgerinnungssystems nach Absetzen des
Medikaments.
Bestehende Blutgerinsel werden durch Plasmin wieder aufgelöst. Zur Fibrinolyse
bei akuten Thrombosen werden deshalb tPA oder andere Plasminogenaktivatoren
intravenös verabreicht (siehe Abbildung 21 unten).
O
OH
O O
OH
O O O
O
OH
O O
OH
O O
OH
NO2
O
Dicumarol Warfarin
Acenocoumarin Phenocoumaron
Abbildung 22: Vitamin-K-Antagonisten als oralwirksame Antikoagulantien
3. Faktor Xa Inhibitoren 54
3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren
Die Blutgerinnungskaskade ist ein hochreguliertes System. Bis auf FVIIa werden
alle aktiven Gerinnungsenzyme durch das Glykoprotein Antithrombin III (ATIII)
inhibiert. Durch Heparin wird die ansonsten langsam verlaufende Bildung des
Enzym-Inhibitor-Komplexes zwischen ATIII und FXa stark beschleunigt. Heparin
fördert also indirekt die Inhibition der Gerinnungsenzyme. „Low-Molecular-
Weight“-Heparin führt zur selektiven Inhibition von FXa, da nur die Bildung des
ATIII-FXa-Komplexes beschleunigt wird, während es keinen Einfluß auf die
Inhibition der anderen Gerinnungsenzyme ausübt.
Weitere gerinnungshemmende Enzyme sind Protein C und Protein S. Durch
proteolytische Spaltung inaktiviert Protein C die Blutgerinnungsfaktoren FV und
FVIII, so daß die Blutgerinnungskaskade und damit die Thrombinproduktion
unterbrochen wird. Protein S ist ein Co-Faktor von Protein C.
Selektive FXa-Inhibitoren konnten auch im Speichel hämatophager Tiere gefunden
werden (Dodt, J. 1995; Markwardt, F. 1996). Hierzu gehören:
• Antistasin (ATS)
aus dem Mexikanischen Blutegel Haementeria officinalis, [119 Aminosäuren,
auch rekombinante Form (rATS), Ki=43 pM, kein Effekt auf Thrombin]
(Dunwiddie, C. T. et al. 1993; Hauptmann, J. et al. 1993)
• Tick Anticoagulant Peptide (TAP)
aus der Weichzecke Ornithodoros moubata, [60 Aminosäuren auch
rekombinante Form (rTAP), Ki=200 pM, Selektivität (FXa/Thrombin): 90000]
(Dunwiddie, C. T. et al. 1993)
• Yagin
aus dem Blutegel Hirudo medicinalis (Rigbi, M. et al. 1996) [133
Aminosäuren, auch rekombinant hergestellt, Halbwertszeit in Pavianen mehr
als 2 h, in einem Hasen-Thrombosemodell war Yagin als Zusatz zur tPA-
3. Faktor Xa Inhibitoren 55
Thrombolyse dem Einsatz von Hirudin oder Heparin überlegen (Kornowski,
R. et al. 1996)]
• Draculin
aus der Vampirfledermaus Desmodus rotundus (Apitzcastro, R. et al. 1995)
• „Ancylostoma Caninum Anticoagulant Peptide“ (AcAP)
aus dem Hakenwurm Ancylostoma caninum (Cappello, M. et al. 1995)
• FXa Hemmstoff der Gelbfiebermücke
aus den Weibchen der Gelbfiebermücke Aedes aegypti. Da die männlichen
Mücken kein Blut saugen, produzieren sie auch den FXa-Inhibitor nicht
(Stark, K. R. et al. 1995).
Wegen der zentrale Rolle von Thrombin in thrombotischen Erkrankungen, war
dieses Enzym über Jahrzehnte das Hauptziel in der Inhibitor-Entwicklung zur
antithrombotischen Therapie. Obwohl Heparin lange Zeit der Thrombin-Hemmstoff
der Wahl war, hat es doch einige Nachteile. Hierzu gehört die geringe Effektivität in
der Inhibition von Thrombin das an Blutgerinsel gebunden ist, wie auch die oftmals
auftretenden und nicht-akzeptierbaren Blutungen. Inzwischen wurden
hochwirksame, synthetische Thrombinhemmstoffe entwickelt. Doch auch mit
diesen Verbindungen zeigt sich die Tendenz von Blutungskomplikationen,
insbesondere in Verbindung mit einer Antikoagulationstherapie mittels tPA
(Antman, E. M. 1996; Philippides, G. J. et al. 1996; Zeymer, U. et al. 1995). Ein
weiterer und entscheidender Nachteil von Thrombininhibitoren ist, daß sie die
kontinuierliche Produktion von Thrombin aus Prothrombin nicht verhindern
können, und deshalb sehr hohe Konzentrationen dieser Inhibitoren nötig sind.
Im Gegensatz dazu inhibieren FXa-Inhibitoren gerade diese Nachproduktion von
Thrombin, wobei aber immer ein Mindestlevel an Thrombin für die primäre
Blutgerinnung zu Verfügung steht.
3. Faktor Xa Inhibitoren 56
In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl von synthetischen FXa-Inhibitoren
entwickelt worden. Einige dieser Substanzklassen sind in Tabelle 9
zusammengefaßt. Bei einer genaueren Betrachtung der Strukturen lassen sich drei
unterschiedliche Entwicklungsrichtungen feststellen:
1. Inhibitoren mit zwei basischen Gruppen
2. Inhibitoren mit einer basischen Gruppe
3. Inhibitoren, die ohne stark basische Gruppe aktiv sind
Wie in Kapitel 1.3 beschrieben, besitzt FXa neben der sauren S1-Tasche noch eine
weitere, negativ geladene Bindungsstelle am Ausgang der S4-Tasche. Diese beiden
Bindungsstellen werden von den bis-basischen Inhibitoren adressiert. Die wohl
bekanntesten Vertreter dieser Inhibitorklasse sind die Daiichi-Verbindung DX-
9065a sowie das symmetrische bis-Benzamidin BABCH. Der große Nachteil dieser
Verbindungen sind die beiden sehr basischen Gruppen und die damit verbundene
schlechte orale Bioverfügbarkeit.
Zur zweiten Gruppe gehören die Verbindungen „Tenstop“ (Tosyl-Glycyl-(3-
Amidino)-Phenylalanin-Methylester) und die Verbindung der Firma Berlex
Biosciences. Letztere wurde in einem aufwendigen parallelsynthetischen Verfahren
aus der Verbindung Tenstop entwickelt.
Wegen der besseren Bioverfügbarkeit wurden bei Zeneca und Rhône-Poulenc
Rhorer Verbindungen entwickelt, die ohne basische Amidino- oder Guanidino-
funktionen auskommen und trotzdem sehr gute Inhibitionkonstanten besitzen.
3. Faktor Xa Inhibitoren 57
Tabelle 9: Synthetische FXa-Inhibitoren
Inhibition [Ki]Struktur und Name
FXa ThrombinLiteratur
N
NH2
NH
OH O
O
NH
Daiichi DX-9065a
0,041 µM > 2000 µM
(Hara, T. et al. 1995;Herbert, J. M. et al.1996; Katakura, S. etal. 1993; Katakura, S.et al. 1995)
NH
S
O OO
O
NH O
NH
NH2
Tenstop
0,84 µM 66 µM (Stürzebecher, J. et al.1989)
O
NH
NH2 NH2
NH
BABCH
0,013 µM 3,8 µM (Wagner, G. et al.1977)
O
NH2
NHO
NH
NH2
DABE
0,57 µM 14,9 µM(Tidwell, R. R. et al.1978; Tidwell, R. R. etal. 1980)
NNH
NH2
NSO
O
O
NH
COOH
Yamanouch Pharma. YM-60828
1,3 nM >100 µM
(Kawasaki, T. et al.1998; Sato, K. et al.1997; Taniuchi, Y. etal. 1998)
NH2
NH
N SO2NH2MeOOC
DuPont Pharmaceuticals
1,3 nM 200 nM (Fevig, J. M. et al.1998)
3. Faktor Xa Inhibitoren 58
InhibitionSynthetische FXa-Inhibitoren
FXa ThrombinLiteratur
NH
NH2
NH
O
OO
O
O
Hoffmann-LaRoche
0,03 µM 4,7 µM (Klein, S. I. et al.1998)
NH
NH2
O
O
NH2
NH
DuPont Merck
34 nM 1200 nM (Maduskuie, T. P. etal. 1998)
Cl
SN
O O
N
O
N
N
Zeneca
3 nM 50 µM (Faull, A. W. 1996)
N
N
N
NMe
COOHF F
O OOH
NH2
NHMe
Berlex Biosciences
0,11 nM 2000 nM (Buckman, B. O. et al.1998)
NN
NH2
NH2
O
NH
S NO O
Rhône-Poulenc Rhorer
6 nM >4µM(Becker, M. R. et al.1999; Choi-Sledeski,Y. M. et al. 1999)
3. Faktor Xa Inhibitoren 59
3.3. Zielsetzung
Nachdem man erkannte, daß die direkte Hemmung von Thrombin zu nicht-
tollerierbaren Nebenwirkungen (z. B. schweren Blutungen) führen kann, fand die
Entwicklung selektiver FXa-Inhibitoren als antithrombotische Arzneistoffe in den
letzten Jahren zunehmendes Interesse. Ziel dieser Arbeit war es, durch Verkürzung
des N-terminalen Restes des FXa-Inhibitors „Tenstop“ (siehe Tabelle 9) auf der
Basis von N-Urethanyl-(3-Amidino)-Phenylalanin neue Leitstrukturen für FXa-
Inhibitoren zu entwickeln. Die Röntgenstruktur von FXa war in nicht-komplexierter
Form (Padmanabhan, K. et al. 1993), sowie im Komplex mit dem reversiblen
Inhibitor DX-9065a bekannt (Brandstetter, H. et al. 1996). Desweiteren gab es eine
Röntgenkristallstruktur des Trypsin/„Tenstop“-Komplexes (Renatus, M. et al.
1998), in der der Inhibitor einen substratähnlichen Bindungsmodus einnimmt sowie
eine Trypsin/Inhibitor-Komplexstruktur mit einem von Tenstop abgeleiteten bis-
basischen Inhibitor (Gabriel, B. et al. 1998).
3. Faktor Xa Inhibitoren 60
3.4. Ergebnisse und Diskussion
3.4.1. Inhibition von FXa und verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen
In Tabelle 10 sind die Inhibitionskonstanten der untersuchten 3- bzw. (4-Amidino)-
Phenylalanin-Derivate gegenüber FXa, uPA, Thrombin und Trypsin aufgelistet. Die
Präferenz von FXa für 3-Amidino- gegenüber (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten
steht im Einklang mit früheren Beobachtungen (Gabriel, B. et al. 1998; Kunitada, S.
et al. 1996; Maduskuie, T. P. et al. 1998). Interessanterweise erfüllt das (4-
Guanidino)-Phenylalanin-Derivat (15) offensichtlich nicht die sterischen Ansprüche
an einen P1-Rest für FXa, so daß keine Inhibition meßbar war. Im Vergleich zum
(4-Amidino)-Phenylalanin-Derivat (93) tritt dieser Verlust an inhibitorischer
Aktivität ebenso bei uPA, Thrombin und Trypsin auf. Die Verbindungen 87 und 89
(freie Säure bzw. Amid-Derivat) besitzen keinen signifikanten Unterschied in der
Inhibition von FXa. Dieses Ergebnis würde einen Bindungsmodus ähnlich dem des
Inhibitors DX-9065a vorhersagen (Brandstetter, H. et al. 1996; Renatus, M. et al.
1998), bei dem die Carboxylatgruppe in den Lösungsmittelraum steht und keine
Wechselwirkung mit dem Enzym eingehen kann. Allerdings wiederspricht dieser
Theorie die signifikant verbesserte Inhibitionskonstante des Methylester-Derivats
(84), die eine zusätzliche Wechselwirkung des Esters in der Nähe der S1-Tasche
nahelegt.
Als mögliche S3/S4-Interaktionspartner wurden verschiedene hydrophobe Gruppen
getestet. Ein Vergleich der tert-Butyl-Gruppe (81), mit der planaren 9-
Fluorenylmethyl- (83) oder Benzyl-Gruppe (110) zeigt eindeutig eine Bevorzugung
der sterisch anspruchsvollen und nicht-aromatischen Adamantylgruppe (84). Diese
Verbindung hemmt FXa im submikromolaren Bereich (Ki=0,62 µM) und besitzt
eine vergleichsweise hohe Selektivität gegenüber uPA (Ki=44 µM), Thrombin
(Ki=2,9 µM), Trypsin (Ki=6 µM), Plasmin (Ki=38 µM), tPA (Ki=200 µM), Tryptase
(Ki=28 µM), Plasma Kallikrein (Ki=18 µM) und FXIIa (Ki>1000 µM). Um die
3. Faktor Xa Inhibitoren 61
Rolle der Urethangruppe als potentiellen Wasserstoffbrückenakzeptor zu
analysieren, wurde sie durch den isosteren Harnstoff (85) ausgetauscht. Während
diese Substitution nahezu keinen Einfluß auf die Inhibition von FXa hat, steigert sie
doch die Selektivität des Inhibitors insbesondere gegenüber uPA entscheidend.
Tabelle 10: Struktur-Wirkungsbeziehung von Urethanylderivaten des 3/4-Amidino-Phenylalanins
NH
O
R2R1
R3
Ki [µM]Nr. R1 R2 R3
FXa uPA Thrombin Trypsin
(81)O
OOMe 3-Amidino 16 36 10 13
(105)O
ON
Me
OMe3-Amidino 16 79 6,7 35
(106)O
OL-Pro-OBz 3-Amidino 14 96 3,2 9,8
(108)O
OD-Pro-OBz 3-Amidino 14 > 1000 0,72 11
(107)O
OL-Pro-OH 3-Amidino 69 > 1000 66 > 1000
3. Faktor Xa Inhibitoren 62
Ki [µM]Nr. R1 R2 R3
FXa uPA Thrombin Trypsin
(109)O
OD-Pro-OH 3-Amidino 52 > 1000 49 80
(83)O
OOMe 3-Amidino 3,4 140 12 12
(110) OO N 3-Amidino 33 120 5,2 9,7
(89)O
O N 3-Amidino 1,7 49 1,6 9,5
(87)O
O OH 3-Amidino 2,1 > 1000 86 39
(84)
O
O OMe 3-Amidino 0,62 44 2,9 6,0
(93)
O
O OMe 4-Amidino 1,4 47 0,32 12
(85)O
NH OMe 3-Amidino 0,90 > 1000 12 17
(15)O
O OMe 4-Guanidino > 1000 200 85 > 1000
3. Faktor Xa Inhibitoren 63
3.4.2. Synthese von 3- und (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten
Die allgemeine Synthese der Amidino-Phenylalanin-Derivate ist in Abbildung 23
für N-Adamantyloxycarbonyl-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester beschrieben.
NH2
O
OH
CN
BOC2O
NH
O
OH
CN
O
O NH
O
OHO
O
NH2 NOH
H2NOH
KOH / EtOH
NH
O
OHO
O
NH2 NH
H2 / Pd
6M HCl/Dioxan MeOH/HCl
pH 2,5
NH
O
OO
NH2 NH
OMeNH2
O
NH2 NH
OMe
Adoc-F
H
H
HNH
O
OMeO
O
NH NH2
(79)
(80)(81)(82)
(84)
Abbildung 23: Synthese der Amidinophenylalanin-Derivate
Kommerziell erhältliches (3-Cyano)-Phenylalanin (Senn Chemicals, Dielsdorf,
Schweiz) wurde zunächst nach Standardmethoden N-terminal mit tert-
Butyloxycarbonyl geschützt (79). Die Umsetzung mit Hydroxylamin, gefolgt von
katalytischer Hydrierung zum Amidin (80) erfolgte nach einer leicht abgewandelten
3. Faktor Xa Inhibitoren 64
Vorschrift von Stüber und Mitarbeitern (Stüber, W. et al. 1995). Der Methylester
(81) wurde durch Lösen in Methanol mit katalytischen Mengen an HCl innerhalb
von 2 Tagen erhalten. Nach Abspaltung der Boc-Schutzgruppe in 6M HCl/Dioxan
(82), konnten weitere N-terminale Derivatisierungen vorgenommen werden. Da sich
manche Reaktionen wegen der ungeschützten Amidinofunktion (z. B. die
Kupplungen zum Piperidid 89 oder zum Weinrebamid 105) auf der Stufe des
Amidins 80 nicht ohne größere Mengen an Nebenprodukten durchführen ließen,
wurden diese Reaktionen bereits auf der Stufe des Cyanophenylalanins 79
durchgeführt und die Amidinofunktion erst im letzten Syntheseschritt aufgebaut.
3.4.3. Röntgenstrukturanalyse des FXa-Inhibitors 84 im Komplex mit Trypsin
und Modelling-Experimente
Alle trypsinartigen Serinproteasen besitzen eine sehr ähnliche Tertiärstruktur,
unterscheiden sich aber maßgeblich in ihrer Aminosäuresequenz (siehe Kapitel 1.2).
Diese Tatsache legt einen vergleichbaren Bindungsmodus eines Inhibitors in allen
verwandten Enzymen nahe. Tatsächlich konnte der Bindungsmodus einiger FXa-
Inhibitoren auch im Komplex mit Trypsin vorhergesagt werden (Gabriel, B. et al.
1998; Renatus, M. et al. 1998; Stubbs, M. T. et al. 1995). Der gleiche Ansatz wurde
zuvor bereits für Thrombin-Inhibitoren beschrieben (Banner, D. W. et al. 1991;
Bode, W. et al. 1990; Brandstetter, H. et al. 1992; Matsuzaki, T. et al. 1989; Turk,
D. et al. 1991). Da Trypsinkristalle wesentlich leichter zu erhalten sind als FXa-
Kristalle, stellt diese Vorgehensweise eine vielversprechende Alternative zur
Bestimmung des Bindungsmodus in FXa dar.
Da die racemische Verbindung 84 mit einer Inhibitionskonstante von 6 µM noch
ausreichend Affinität zu Trypsin besitzt, konnte die Röntgenkristallstruktur dieser
Verbindung im Komplex mit Trypsin gelöst werden. Hierzu wurden mit
Benzamidin komplexierte Trypsinkristalle (Stubbs, M. T. et al. 1995) in einer
Lösung des Inhibitors 84 „gesoakt“, wodurch Benzamidin durch den besseren
Inhibitor verdrängt wurde. In Abbildung 24 ist der gefundene Bindungsmodus
3. Faktor Xa Inhibitoren 65
dargestellt. Die 2FoFc Elektronendichtekarte war besonders für die
Benzamidingruppe sehr gut definiert. Neben der erwarteten canonischen Salzbrücke
zur Asp189-Seitenkette am Boden der S1-Tasche, gibt es zwei
Wasserstoffbrückenbindungen zu Ser190 O und Gly219 O. Außerhalb der S1-Tasche
war die Elektronendichte weniger gut definiert und ließ dadurch eine eindeutige
Bestimmung der Chiralität des Amidino-Phenylalanins nicht zu. Die Region des
Adamantylrestes war jedoch wieder klar definiert. Die Strukturverfeinerung wurde
deshalb sowohl mit dem L- bzw. D-Enantiomer separat, als auch durch Behandlung
beider Enatiomere gleichzeitig („Occupancy Refinement“) durchgeführt. Das
Ergebnis dieser Verfeinerungszyklen unterstützt ein
Abbildung 24: Röntgenkristallstruktur des FXa-Inhibitors 84 (D-Enantiomer) im
Komplex mit Trypsin
3. Faktor Xa Inhibitoren 66
gleichzeitiges Binden beider Enantiomere, wobei das D-Enantiomer aber etwas
bevorzugt zu sein scheint. Der Methylester-Sauerstoff des D-Enantiomers bildet
eine Wasserstoffbrücke mit Gly219 N, während das Stickstoffatom des Amidino-
Phenylalanins mit der Seitenkette des Cys220 interagiert. Die Adamantylgruppe
bindet südöstlich der „Active-Site Cleft“ in einer kleinen, hydrophoben Vertiefung,
die durch die Seitenketten der Reste Cys191, Cys220, Asn143, Gln192, Lys145 und Thr149
ausgebildet wird.
Die Überlagerung des Trypsin/Inhibitor Komplexes mit der katalytischen Domäne
von FXa schließt einen ähnlichen Bindungsmodus in FXa aus (Abbildung 25B).
Fakt ist, daß FXa im Gegensatz zu Trypsin in der entsprechenden Region keine
hydrophobe Vertiefung besitzt. Deshalb würde die Adamantylgruppe mit den
Seitenketten von Arg143, Glu147, Lys148 sowie Gln192 kollidieren. Da auf diesem
Wege keine Aussage über den Bindungsmodus des Inhibitors in FXa gemacht
werden konnte, wurden Docking-Experimente mit dem Computerprogramm FlexX
durchgeführt (Rarey, M. et al. 1996). Um die Performance des Programms zu
überprüfen, wurde der Inhibitor aus unserer Trypsin-Kristallstruktur entfernt, und
anschließend von FlexX wieder in die Struktur „gedockt“. Den höchsten Score (-
42,7) und damit die stärkste Bindung erhielt die Lösung für das D-Enantiomer die in
Abbildung 25C in violett dargestellt ist. FlexX sagt ein Binden des Adamantylrestes
in einer Vertiefung südwestlich der „Active-Site“ voraus. Die 6. Lösung (grün,
Score –41,6) entspricht allerdings dem in der Röntgenkristallstruktur gefundenen
Bindungsmodus. Mit dem L-Enantiomer war es nicht möglich den gefundenen
Bindungsmodus vorherzusagen.
Für Docking-Experimente an FXa wurde die Röntgenkristallstruktur des FXa/DX-
9065a-Komplexes (PDB-Code: 1FAX) (Brandstetter, H. et al. 1996) sowie die
unkomplexierte Struktur (PDB-Code: 1HCG) (Padmanabhan, K. et al. 1993)
verwendet. Paradoxerweise führt die Bindung des Inhibitors DX-9065a an FXa
verglichen mit der unkomplexierten Form zu einer Kontraktion der S1-Tasche.
Deshalb schlugen alle Versuche Verbindung 84 oder auch nur Benzamidin in die
3. Faktor Xa Inhibitoren 67
1FAX-Struktur zu docken fehl. Im Gegensatz dazu war FlexX sehrwohl in der Lage
die Apoenzymstruktur 1HCG unter Ausbildung der canonischen Salzbrücke mit
Asp189 als Rezeptormolekül zu erkennen. In der Konformation mit dem höchsten
Score (D-Enantiomer, violett, Score –35,3) bindet die Adamantylgruppe
südwestlich der „Active-Site Cleft“ (Abbildung 25D). Dabei ist sie von den
Seitenketten von Trp215, Glu217 und Phe174 umgeben und somit südlich der S3/S4-
Region angesiedelt. Diese Vorhersage ist mit der besten Lösung für Trypsin
(Abbildung 25C) identisch. Im weiteren wurden allerdings sehr unterschiedliche
Lösungen mit vergleichbaren Score-Werten gefunden. Im Gegensatz dazu wurde
für das L-Enantiomer ganz klar eine Bindung der Adamantylgruppe in der S3/S4-
Region gefunden (Abbildung 25D, grau, Score -37). Dieser Bindungsmodus
entspricht dem der Leitstruktur „Tenstop“ in Trypsin (Renatus, M. et al. 1998) und
hebt sich von alternativen Lösungen durch eine hohe Score-Differenz ab (Score-
Cluster 2: -29,9). Die Adamantylgruppe ist von den hydrophoben Resten Tyr99,
Phe174 und Trp215 umgeben. Ein drittes Rezeptor-Modell wurde aus der Struktur
1FAX durch Anwendung einer einfachen Moleküldynamik-Rechnung gewonnen,
wodurch sich die S1-Tasche etwas aufweitete und somit das Docking ermöglichte.
Das Resultat war eine klare Vorhersage eines Bindungsmodus, bei dem die
Adamantylgruppe in der S1'-Tasche liegt (Abbildung 25D, grün, umgeben von
Cys42, Phe41 und Gln192). Dieser Bindungsmodus ähnelt sehr stark dem für den uPA-
Inhibitor 75 in der Röntgenkristallstruktur gefundenen Bindungsmodus (siehe Seite
40).
3. Faktor Xa Inhibitoren 68
Abbildung 25: Experimenteller und modellierter Bindungsmodus des Inhibitors 84in Trypsin und FXa. Oberflächendarstellung von (A) Röntgenkristallstruktur desTrypsin/Inhibitor 84 Komplexes; (B) Überlagerung der Trypsin/84 Struktur auf dieStruktur von FXa; (C) Docking-Experimente mit Trypsin (violett: Lösung mithöchstem Score, D-Enantiomer; grün: 6. Lösung, Bindungsmodus analog demBindungsmodus in der Trypsin/Inhibitor 84 Kristallstruktur); (D) Ergebnisse derDocking-Experimente mit FXa (siehe Kapitel 3.4.3). Alle Bilder haben die gleicheOrientierung des Enzyms, mit der von links nach rechts verlaufenden „Active-SiteCleft“. Bereiche des Enzyms, die positive bzw. negative Ladungen aufweisen, sindblau bzw. rot eingefärbt. Die Abbildung wurde mit dem Programm GRASP erzeugt(Nicholls, A. et al. 1993)
3. Faktor Xa Inhibitoren 69
3.4.4. Einfluß der Chiralität von Amidino-Phenylalanin-Derivaten auf die
Inhibition von FXa
Eine klare Unterscheidung zwischen dem D- und L-Enantiomer konnte weder in der
Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/Inhibitor 84-Komplexes noch durch Docking-
Experimente erzielt werden. Deshalb wurden beide Enantiomere dieser Verbindung
synthetisiert. Die Inhibitionskonstanten des L-Enantiomers (Verbindung 94) sowie
des D-Enantiomers (95) sind in Tabelle 11 zusammengefaßt. Beide Enantiomere
werden etwa mit vergleichbarer Affinität von Trypsin erkannt, wobei das D-
Enantiomer etwas bevorzugt ist. Dieses Ergebnis stimmt sehr gut mit der
Röntgenstrukturanalyse der racemischen Verbindung 84 überein.
FXa wird jedoch durch das D-Enantiomer 95 (Ki=0,39 µM) etwa 10-fach besser
inhibiert als durch das L-Enantiomer 94. Dieses Ergebnis impliziert, daß der
Bindungsmodus der Verbindung 95 in FXa nicht substratähnlich sein kann.
Während die Inhibition von Trypsin, Thrombin und Plasmin nur wenig von der
Chiralität der Verbindung abhängt, kann uPA offensichtlich nur das L-Enantiomer
94 erkennen.
Modelling-Experimente mit dem D-Enantiomer 95 (Abbildung 25D, violett bzw.
grün) sagen einen Bindungsmodus voraus, bei dem die Methylester-Gruppe in
Richtung der hydrophoben S3/S4-Region zeigt. Um diese Hypothese zu überprüfen,
wurde der Methylester durch Benzylamid (98) und Phenethylamid (99) ersetzt.
Dabei sollten zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen des Phenylrings in der
S3/S4-Tasche für eine Erhöhung der inhibitorischen Aktivität sorgen (Tabelle 11).
Durch das Phenethylamid-Derivat (99) (Ki=0,074 µM) konnte die
Inhibitionskonstante, verglichen mit Verbindung 95, um den Faktor 5 verbessert
werden, was stark für die Richtigkeit dieser Hypothese spricht. Wahrscheinlich ist
der „Spacer“ des Benzylamid-Derivats (98) für eine gute Interaktion in der S3/S4-
Tasche von FXa noch zu kurz, so daß sich die Inhibitionskonstante für diese
Verbindung nur um den Faktor 2 verbesserte, während der längere Spacer in
3. Faktor Xa Inhibitoren 70
Verbindung 104 offensichtlich ebensowenig die sterischen Anforderungen für eine
gute Interaktion mit dem Enzym erfüllt.
H
H
HO
O
O
NH NH2
NH
R
Tabelle 11: Struktur-Wirkungsbeziehung enantiomerenreiner Derivate des 1-Adamantyloxycarbonyl-(3-Amidino)-Phenylalanins
Ki [µM]Nr. R Enan-
tiomer FXa uPA Thrombin Trypsin Plasmin
(94) OMe L 4,6 59 8,6 17 16
(95) OMe D 0,39 > 1000 1,6 5,7 8,9
(97) NH D 0,34 400 2,8 40 50
(98) NH D 0,22 > 1000 1,3 4,6 26
(99)NH
D 0,074 > 1000 1,2 2,7 39
(104) NH O
O D 0,23 > 1000 1,5 2,2 23
3. Faktor Xa Inhibitoren 71
Wie in Kapitel 3.2 erläutert, besitzt FXa am Ausgang der S4-Tasche eine negativ
geladene Region, die bereits in einigen synthetischen Inhibitoren zur Bindung
ausgenutzt wurde. Aus diesem Grund wurde das 4-Hydroxyphenethylamid 100,
sowie das Hydroxyamidinderivat 102 und das Amidinderivat 103 synthetisiert
(Tabelle 12). Die Inhibitionskonstanten für diese Verbindungen liegen zwischen 0,2
und 0,5 µM und bringen somit keine Verbesserung. Eventuell ist die Position der
Substitution am Phenylring für diese hydrophile Wechselwirkung ungeeignet, oder
die geometrischen Notwendigkeiten werden nicht erfüllt. Dieses Problem ließe sich
aber nur durch eine Röntgenkristallstruktur der Verbindung 99 in FXa
zufriedenstellend lösen.
Tabelle 12: Derivatisierungen der Inhibitoren 98 und 99, die Interaktionen mit derelektronegativen Region am Ende der S4-Tasche ermöglichen sollten.
Ki [µM]Nr. R Enan-
tiomer FXa uPA Thrombin Trypsin Plasmin
(100)NH
OH
D 0,17 > 1000 1,2 2,5 19
(101)NH
CND 0,54 > 1000 2,0 6,6 18
(102)
NH
NH
NH
OH
D 0,48 > 1000 5,9 2,0 47
(103)NH
NH2
NH D 0,42 25 3,3 1,2 11
3. Faktor Xa Inhibitoren 72
Das herausragende Ergebnis der dargestellten Untersuchungen ist die hohe
Präferenz von FXa für N-1-Adamantyloxycarbonyl-(3-amidino)-Phenylalanin-
Derivate in der D-Konfiguration, während die Leitstruktur Tosyl-Glycyl-(3-
Amidino)-Phenylalanin-Methylester (Tabelle 9, „Tenstop“) nur in der L-
Konfiguration an FXa bindet und dabei die Taschen S1-S4 zur Bindung ausnutzt.
4. Zusammenfassung und Ausblick 73
4. Zusammenfassung und Ausblick
4.1. uPA-Inhibitoren
Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA) spielt eine zentrale Rolle bei
pathologischen Prozessen wie Tumorinvasion und Metastasierung, indem er
Plasmin und Matrix-Metalloproteasen aktiviert, die Bestandteile der extrazellulären
Matrix abbauen können. Durch die Bindung von uPA an den membrangebundenen
uPA-Rezeptor, kommt es an der Tumorinvasionsfront zu einer gerichteten
proteolytischen Aktivität. Deshalb stellt die Inhibition des Plasminogenaktivators
ein vielversprechendes Ziel in der
Tumortherapie da.
uPA ist eine trypsinähnliche Serinprotease mit
einer verhältnismäßig kleinen S2-Tasche und
einer, im Vergleich zu Trypsin, ebenfalls
kleinen, hydrophoben S3/S4-Region.
Ausgehend vom Argininmimetikum
Phenylguanidin (6), wurde dieses anhand von
Struktur-Wirkungsbeziehungen schrittweise
derivatisiert (siehe Abbildung 26) , um einen
„Spacer“ geeigneter Länge zur Überbrückung
der S2-Tasche zu finden (Verbindung 29).
Anschließend wurden die hydrophoben
Wechselwirkungen durch Einführen eines Adamantylrestes optimiert (36). Das
Wasserstoffbrücken-Bindungspotential des Spacers konnte durch weitere
Derivatisierungen noch verbessert werden, so daß mit N-Adamantyl-N'-(4-
Guanidinobenzyl)-Harnstoff (75) nun ein hochselektiver uPA-Inhibitor als neue
Leitstruktur zur Verfügung steht.
Die Röntgenkristallstruktur des uPA/Inhibitor 75-Komplexes, zeigt, daß der
Adamantylrest in der S1'-Tasche von uPA über hydrophobe Wechselwirkungen
NH
NH2NH
NH
NHNH2
NHO
O
NH
NHNH2
NHO
O
NH
NHNH2
NHO
NH
Ki = 30 µM
Ki = 36 µM
Ki = 13 µM
Ki = 2,4 µM
(6)
(29)
(36)
(75)
Abbildung 26: Entwicklungsstufen des
uPA-Inhibitors 75
4. Zusammenfassung und Ausblick 74
gebunden ist, und nicht, wie zunächst angenommen, in der S3/S4-Region bindet.
Die genaue Kenntnis des Bindungsmodus wird die weitere Optimierung der
Leitstruktur in Bezug auf inhibitorische Aktivität deutlich vereinfachen. Erste
strukturbasierte Verbesserungsvorschläge wurden in Kapitel 2.8.2 besprochen.
Toxizitätsuntersuchungen mit Verbindung 75 anhand von drei unterschiedlichen
Krebszellinien haben gezeigt, daß zelltoxische Konzentrationen um einen Faktor 50
bis 100 oberhalb der inhibitorisch wirksamen Konzentration liegen. Aufgrund
dieses positiven Befundes sind für die nähere Zukunft einige in vivo Versuche
geplant, in denen die Effektivität des Inhibitors als anti-metastatische Verbindung
überprüft werden soll.
4.2. FXa-Inhibitoren
Die Entwicklung selektiver FXa-Inhibitoren als antithrombotische Arzneistoffe
fand in den letzten Jahren zunehmendes Interesse, da man erkannte, daß die direkte
Hemmung von Thrombin zu nicht-tollerierbaren Nebenwirkungen (z. B. schweren
Blutungen) führen kann. Ein weiterer Nachteil von Thrombin-Inhibitoren ist auch,
daß die Neugenerierung von Thrombin aus pro-Thrombin mit ihnen nicht verhindert
werden kann, und deshalb für eine effektive Antikoagulationstherapie sehr hohe
Mengen an Thrombin-Inhibitor gebraucht werden. Durch die Hemmung von FXa
ergeben sich deshalb zwei große Vorteile. Zum einen wird die Neubildung von
Thrombin unterbunden, da die Aktivierung von pro-Thrombin durch FXa gehemmt
wird. Noch wichtiger ist jedoch, daß durch die Hemmung von FXa immer eine
Minimalkonzentration von Thrombin im Blut aufrechterhalten wird, die für die
primäre Hämostase notwendig ist.
4. Zusammenfassung und Ausblick 75
Ausgehend vom bekannten FXa-Inhibitor
„Tenstop”, sollte untersucht werden, wie sich
der Ersatz des Tosyl-Glycyl-Restes durch eine
Urethangruppe auf die Affinität zu FXa
auswirkt. Einzelne Entwicklungsstufen sind in
Abbildung 27 dargestellt.
Der Austausch der tert-Butylgruppe in
Verbindung 81 durch den größeren
Adamantylrest (84) führte erstaunlicherweise
zu einer 25-fachen Verbesserung der FXa-
Inhibition. Da die Kristallisation von FXa
immer noch mit großen Schwierigkeiten
verbunden ist, wurde der Bindungsmodus des
Inhibitors 84 durch Röntgenstrukturanalyse in
Trypsin untersucht. Obwohl dieses Verfahren in der Literatur bereits öfters
beschrieben wurde, führte es in diesem Fall nicht zum Erfolg: der Adamantylrest
befindet sich in der Trypsinstruktur in einer kleinen hydrophoben Tasche südöstlich
der „Active-Site Cleft“. Diese Tasche existiert aber in FXa nicht. Vielmehr würde
der Inhibitor in einem vergleichbaren Bindungsmodus mit dem Enzym kollidieren.
Um dennoch Informationen über einen möglichen Bindungsmodus in FXa zu
erhalten, wurden verschiedene Modelling-Experimente durchgeführt. Während für
die Adamantylgruppe von Verbindung 84 keine eindeutige Vorhersage getroffen
werden konnte, zeigte der Methylester in mehreren Bindungsvorschlägen in
Richtung der S3/S4-Tasche. Zur Überprüfung dieser Theorie wurde der Ester durch
hydrophobere Gruppen ersetzt, die in der S3-Tasche durch zusätzliche
Wechselwirkungen zu einer Verbesserung der Inhibitionskonstante beitragen
sollten. Das Phenethylamid (99) verbesserte die inhibitorische Aktivität in der Tat
auf Ki = 70 nM. Für eine endgültige Bestätigung dieser Theorie sowie für gezielte,
NH
S
O OO
O
NH O
NH
NH2
NH
O
O OO
NH
NH2
NH
O
O OO
NH
NH2
NH
O
O NHO
NH
NH2
Ki = 0,84 µM
Ki = 16 µM
Ki = 0,62 µM
Ki = 0,07 µM
Tenstop (Leitstruktur)
(99)
(84)
(81)
Abbildung 27: Entwicklungsstufen des
FXa-Inhibitors 99
4. Zusammenfassung und Ausblick 76
strukturbasierte Verbesserungen des Inhibitors, wäre aber dennoch eine
Röntgenstrukturanalyse nötig.
Desweiteren konnte durch gezielte Synthese enantiomerenreiner Verbindungen, das
D-Enantiomer als das mindestens 10-fach stärker bindende Derivat ermittelt
werden. Dieser Befund überrascht um so mehr, da die Leitstruktur „Tenstop“ nur in
der L-Konfiguration aktiv ist und einen substratähnlichen Bindungsmodus aufweist.
Neben dem 1-Adamantyloxycarbonylderivat 84 wurde auch der isostere
Adamantylharnstoff 85 synthetisiert. Während dieser OàN-Austausch kaum
Einfluß auf die Inhibition von FXa hatte, verschlechterte sich doch die
Hemmwirkung gegenüber den verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen. Vor
allem gegenüber uPA war keinerlei Inhibition mehr zu detektieren. Bei künftigen
Verbesserungen der Leitstruktur 99 sollte man diese Veränderung zur Erzielung
einer höheren Selektivität bedenken, zumal Harnstoffe z. B. gegenüber Säuren
(Magensäure) wesentlich stabiler sind als Urethane.
Außerdem ist durch Ersetzen der C-terminalen Gruppe (Phenethylamid)
höchstwahrscheinlich noch eine weitere Steigerung der Aktivität möglich.
Naphthylgruppen werden z. B. schon seit längerem sehr erfolgreich für hydrophobe
Wechselwirkungen in der S3/S4-Tasche eingesetzt
Letztlich bleibt zu hoffen, daß es gelingt eine Röntgenkristallstruktur von FXa im
Komplex mit dem Inhibitor 99 zu erhalten. Die daraus resultierende exakte
Kenntnis des Bindungsmodus, würde strukturbasierte Verbesserungen dieser
Leitstruktur stark vereinfachen.
5. Summary 77
5. Summary
5.1. uPA-inhibitors
By activation of plasmin and matrix-metalloproteinases that are able to degrade
several extra-cellular matrix components, the urokinase-type plasminogen activator
(uPA) plays a central role in pathologic processes like tumor-cell invasion and
metastasis. The binding of uPA to its cell-
surface associated receptor (uPAR) enables
the directed proteolytic activity. Therefore,
inhibition of uPA may represents a promising
target in tumor therapy.
uPA is a trypsin-like serine protease with
comparable small S2- , S3- and S4-pockets.
Based on structure-activity relationships
(SAR), the starting-compound phenyl-
guanidine (6) was derivatized in order to
obtain a suitable spacer to bridge the S2-
pocket (see figure 28, compound 29).
Subsequently the hydrophobic interactions
were optimized by the introduction of an adamantyl moiety (36). Further
derivatizations led to an improved hydrogen-bonding potential of the spacer.
Finally, a highly selective uPA-inhibitor [N-adamantyl-N'-(4-guanidinobenzyl)-urea
(75)] was obtained, which represents a new lead-structure for the developement of
anti-metastatic drugs.
The X-ray crystal structure of uPA complexed with the inhibitor 75 showed an
unexpected binding mode, with the adamantyl moiety involved in hydrophobic
interactions in the S1'-pocket. The knowledge of the exact binding-mode will
definitely facilitate further improvements of the lead compound 75 in terms of
inhibitory potency. Some structure-based proposals to improve the binding of the
NH
NH2NH
NH
NHNH2
NHO
O
NH
NHNH2
NHO
O
NH
NHNH2
NHO
NH
Ki = 30 µM
Ki = 36 µM
Ki = 13 µM
Ki = 2,4 µM
(6)
(29)
(36)
(75)
Figure 28: Stages of developement of the
uPA-inhibitor 75
5. Summary 78
inhibitor to the uPA active-site cleft have been discussed in chapter 2.8.2. Toxicity
studies for the inhibitor 75 on three different cancer cell-lines proved cell-toxic
concentrations to be 50- to 100-fold higher than the active concentrations. Because
of this positive result, in vivo studies are planed, in order to verify the anti-invasive
and anti-metastatic properties of this compound.
5.2. fXa-inhibitors
The interest in developing selective inhibitors of factor Xa (fXa) as anti-thrombotic
drugs increased by leaps and bounds after recognizing the strong side effects that
can occure by treatment with direct thrombin inhibitors. A second disadvantage of
thrombin inhibitors is, that they are not able to prevent a continuous production of
thrombin by activating pro-thrombin. Therefore increasing amounts of an inhibitor
are necessary for an efficient anti-thrombotic therapy. Thus, inhibition of fXa would
present two major advantages. Firstly, the fXa-mediated regeneration of thrombin is
suppressed. Even more importantly, the minimal thrombin concentration in the
blood is maintained, that is necessary for the
primary haemostasis.
Starting from the well known fXa-inhibitor
„Tenstop“ (see figure 29) the tosyl-glycyl
residue was replaced with several urethanes.
Surprisingly, replacement of the tert-butyl
group led to a 25-fold improvement of the
fXa-inhibition. Since crystallisation of fXa is
still difficult, the binding mode of compound
84 to the related enzyme trypsin was
investigated. Although this indirect approach
has previously been described, it did not
produce helpful results in our case. In trypsin,
the adamantyl residue occupies a small
hydrophobic pocket, south-east of the active-site cleft. Since this pocket does not
NH
S
O OO
O
NH O
NH
NH2
NH
O
O OO
NH
NH2
NH
O
O OO
NH
NH2
NH
O
O NHO
NH
NH2
Ki = 0.84 µM
Ki = 16 µM
Ki = 0.62 µM
Ki = 0.07 µM
Tenstop (lead-compound)
(99)
(84)
(81)
Figure 29: Stages of developement of the
fXa-inhibitor 99
5. Summary 79
exist in fXa, in a comparable binding mode the inhibitor would clash with the
enzyme.
Therefore, to obtain information on the binding mode of the inhibitor, several
modeling experiments were performed. While the interaction site of the adamantyl
residue could not be clearly predicted, several docking results predicted the methyl
ester group pointing towards the S3/S4-pocket. To prove this working assumption,
the ester was exchanged by hydrophobic residues, that should enhance the
inhibition constants by additional hydrophobic interactions within the S3-pocket.
Indeed, with the phenethylamide-derivative 99, the inhibitory activity could be
improved to Ki = 70 nM. However, only the X-ray crystal structure of an
fXA/inhibitor 99-complex could ultimately prove the postulated binding mode and
allow for structure-based inhibitor design.
Furthermore, by synthesizing enantiomerically pure derivatives, the D-enantiomer
showed an inhibition constant at least 10-fold better than the L-enantiomer. This
result was very surprising since the lead-compound „Tenstop“ is active only in the
L-configuration and shows a substrate-like binding mode.
Besides the 1-adamantyloxycarbonyl-derivative 84, also the isosteric thiourea 85
was synthesized. While this OàN-exchange had nearly no influence on the
inhibition of fXa, this compound exhibited a much weaker inhibitory activity for the
related trypsin-like enzymes. Especially for uPA no inhibition was detectable. As a
possible perspective to improve the selectivity of the lead-compound 99, the ureas
would be promising even because of the higher chemical stability compared to the
acid-labile urethanes.
6. Experimenteller Teil 80
6. Experimenteller Teil
6.1. Materialien und Methoden
Die verwendeten Lösungsmittel wurden von den Firmen Aldrich, Baker, Fluka und
Merck entweder in p. a. Qualität bezogen oder nach den üblichen Standardverfahren
gereinigt. Für analytische HPLC und präparative HPLC wurde LiChrosolv
Acetonitril von Merck eingesetzt. Weitere gängige Chemikalien wurden von
Aldrich, Bachem, Fluka und Merck bezogen. Zur Synthese der Amidino-
Phenylalanin-Derivate wurde racemisches 3- bzw. (4-Cyano)-Phenylalanin der
Firma Senn Chemicals (Dielsdorf, Schweiz) bzw. die isomerenreinen Verbindungen
Boc-L-(3-Cyano)-Phenylalanin und Boc-D-(3-Cyano)-Phenylalanin der Firma
Synthetech (Albany, Oregon, USA) eingesetzt. Als Katalysator für die
Hydrogenolyse wurde 10 % Pd auf Aktivkohle (Typ E10 E/W) der Firma Degussa
verwendet. p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid war in der Abteilung aus
früheren Synthesen vorhanden.
Dünnschichtchromatographie
Zur Dünnschichtchromatographie wurden Kieselgel-60-Fertigplatten mit
Fluoreszenzindikator der Firma Merck (Darmstadt) verwendet. Die Detektion der
Substanzen erfolgte in der Regel durch UV Absorption sowie mittels Chlor/o-
Tolidin (1.5 g o-Tolidin und 4.2 g KI in 60 ml Eisessig und 940 ml Wasser). Bei
schlecht detektierbaren Substanzen wurde mit KMnO4 (2 % in Wasser) oxidiert.
Als Laufmittel wurden folgende Lösungsmittelgemische eingesetzt:
Laufmittel A: Hexan:AcOEt:AcOH = 20:10:2
Laufmittel B: CHCl3:MeOH:AcOH = 10:10:2
Laufmittel C: CHCl3:MeOH:AcOH = 10:20:2
Laufmittel D: Hexan:AcOEt:AcOH = 10:10:1
Laufmittel E: AcOEt:n-BuOH:AcOH:H2O = 10:6:2:2
Laufmittel F: CHCl3:MeOH:AcOH = 40:10:2
6. Experimenteller Teil 81
Laufmittel G: CHCl3:MeOH:AcOH = 190:10:2
Laufmittel H: CHCl3:MeOH:NH3 = 20:20:9
Präparative Säulenchromatographie
Für die präparative Säulenchromatographie wurde Kieselgel 60 (230-400 mesh
ASTM) der Firma Merck (Darmstadt) eingesetzt. Die verwendeten
Lösungsmittelgemische werden bei den entsprechenden Synthesen angegeben.
Analytische und präparative HPLC
Analytische HPLC wurde mit einer Flußrate von 1 ml/min auf Nucleosil 100/C8
Säulen der Firma Macherey-Nagel (Düren) durchgeführt. Dazu wurden folgende
Säulen und Gradienten verwendet:
(A) Säule 125/4, linearer Gradient, MeCN/2% H3PO4 von 5:95 auf 90:10 in 13
min mit weiteren 2 min isokratischer Elution.
(B) Säule 125/4, linearer Gradient, MeCN/2% H3PO4 von 5:95 auf 80:20 in 30
min.
(C) Säule 50/4, linearer Gradient, MeCN/2% H3PO4 von 5:95 auf 90:10 in 9 min
und 1 min isokratische Elution.
Für die präparative HPLC wurde Nucleosil RP 18 der Firma Macherey-Nagel
(Düren) mit den jeweilig angegebenen Eluenten und Gradienten benutzt.
Massenspektrometrie
FAB-Massenspektren wurden an einem Finnigan MAT 900 und ESI-
Massenspektren an einem PE API 165 aufgenommen. Letzteres Gerät wurde auch
zur kombinierten HPLC-MS Analyse eingesetzt.
6. Experimenteller Teil 82
6.2. Enzymkinetik
6.2.1. Ermittlung der Inhibitionskonstanten (Ki-Werte)
Die Ki-Werte für die Hemmung der verschiedenen Enzyme wurden unter
Verwendung spezifischer synthetischer Substrate ermittelt. Die Reaktionen wurden
auf Mikrotiter-Platten ausgeführt und mit einem Mikroplate-Reader MR 5000 der
Firma Dynatech (Denkendorf) bei 25 °C gemessen. Das Testmedium bestand aus
200 µL Tris-Puffer (0,05 M; 0,154 M NaCl, 5 % EtOH, pH 8,0), 25 µL wäßriger
Substratlösung und 50 µL Enzymlösung. Die Ki-Werte wurden jeweils mit zwei
verschiedenen Substrat- und fünf unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen
bestimmt. Drei Minuten nach Meßbeginn wurde die Reaktion durch Zugabe von 25
µL 50 %-iger Essigsäure gestoppt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 405
nm erfaßt. Die Dissoziationskonstanten der Enzym-Inhibitor-Komplexe wurden
nach Dixon (Dixon, M. 1953) mit einem linearen Regressionsprogramm berechnet.
Die errechneten Ki-Werte sind Mittelwerte aus mindestens 3 Einzelbestimmungen.
6.2.2. Eingesetzte Enzyme und Substrate zur Ki-Wert-Bestimmung
Folgende Enzyme und Substrate wurden mit den jeweils in Klammern angegebenen
Aktivitäten und Konzentrationen zur Ermittlung der Inhibitionskonstanten
eingesetzt. Die verwendeten Substrate stammen von der Firma Pentapharm Ltd.
(Basel, Schweiz):
• bov. Pankreas-Trypsin (42 U/mg, 0,0038 U/mL), Serva (Heidelberg); Substrat:
MeSO2-D-hexahydrotyrosyl-Gly-Arg-pNA (0,18 und 0,06 mM).
• bov. Thrombin wurde gemäß der Beschreibung von Walsmann (Walsmann, P.
1968) hergestellt (2262 U/mg, 0,45 U/mL); Substrat: MeSO2-D-
hexahydrotyrosyl-Gly-Arg-pNA (0,18 und 0,09 mM).
• bov. FXa (5 U/vial, 0,11 U/mL), Diagnostic Reagents Ltd. (Thame, UK);
Substrat: MeSO2-D-Nle-Gly-Arg-pNA (0,36 und 0,18 mM).
6. Experimenteller Teil 83
• hum. FXa (4 mg/vial, 0,18 µg/mL), Kordia Lab. Supplies (Leiden,
Niederlande); Substrat: MeSO2-D-Nle-Gly-Arg-pNA (0,36 und 0,18 mM).
• hum. uPA (500000 U/vial, abschließende Konzentration 150 U/mL),
Ribosepharm GmbH (Haan); Substrat: Bz-ßAla-Gly-Arg-pNA (0,18 und 0,09
mM).
• sc-tPA wurde aus CHO-Zellen gereinigt (4,1 mg/mL, 0,0031 µg/mL); Substrat:
MeSO2-D-hexahydrotyrosyl-Gly-Arg-pNA (0,54, 0,27 and 0,145 mM)
(Stürzebecher, J. et al. 1992).
• hum. Plasmin (0,67 CTA-U/mg, 0,06 CTA-U/mL), Behringwerke AG
(Marburg); Substrat: Tos-Gly-Pro-Lys-pNA (0,18 und 0,09 mM).
6.3. Röntgenstrukturanalyse des Inhibitor/uPA Komplexes
Die Röntgenstrukturanalyse des uPA/Inhibitor-75-Komplexes wurde in
Kooperation mit der Abteilung Prof. Huber (Abteilung für Strukturforschung, Max-
Planck-Institut für Biochemie, Martinsried) durchgeführt.
6.3.1. Kristallisation mit Benzamidin als Inhibitor
LMW-uPA wurde von Uwe Jakob (Abteilung Robert Huber) in E. coli
überexprimiert und aufgereinigt. Dabei wurde die Punktmutation C122S eingeführt,
so daß später die Disulfidbrücke zwischen Cys1 und Cys122 nicht gebildet werden
kann. Nach Aktivierung mit Plasmin wird so die katalytisch aktive B-Kette
erhalten, die momentan die kürzeste zu kristallisierende Einheit darstellt
(Zeslawska, E. et al. 2000).
Erste Kristallisationsversuche wurden mit einem Pipettierroboter (Crybot, Qiagen,
Deutschland) unter Anwendung der „hanging-drop“-Dampfdiffusionsmethode
unternommen. Alle Kristalle wurden zunächst in benzamidinhaltigen Lösungen
6. Experimenteller Teil 84
gezüchtet. Benzamidin wurde später durch „soaken“ der Kristalle in Lösungen des
gewünschten Inhibitors ersetzt.
6.3.2. Soaking des uPA-Inhibitors 75 und Röntgenstrukturanalyse
Hierzu wurde ein Kristall in 5µl einer Lösung bestehend aus 1,25M LiSO4, 1M
(NH4)2SO4, 0,125M Natrium-Zitrat/HCl pH5,2 und einer Suspension des Inhibitors,
eingelegt. Durch täglichen Austausch dieser Lösung wurde Benzamidin im Kristall
langsam durch den Inhibitor 75 ausgetauscht. Anschließend wurde der Kristall
(Abmessungen 100 µm x 80 µm x 250 µm) auf einem
Drehanodenröntgengenerator (Rigaku, Japan) montiert. Die Detektion der Reflexe
erfolgte mit einem Flächendetektor der Firma Mar Research (Deutschland) bis zur
gerätespezifischen Auflösung von 1,8 Å. Zur Auswertung der Reflexe wurden die
Routinen der Programmsammlung CCP4 (Bailey, S. 1994) verwendet. Zur Lösung
der Struktur wurde die von Spraggon und Co-Autoren beschriebene uPA-
Röntgenstruktur (Spraggon, G. et al. 1995) (PDB-Zugangscode: 1LMW) und das
Programm AMoRe (Navaza, J. 1994) verwendet. Für die Strukturverfeinerung mit
CNS (Brünger, A. T. 1998) wurde das Engh-Huber-Parameterset (Engh, R. A. et al.
1991) verwendet. Die kristallographischen Daten sind in Tabelle 13
zusammengefaßt.
6. Experimenteller Teil 85
Tabelle 13: Kristallographische Daten der Röntgenstruktur des uPA/Inhibitor 75-
Komplexes
Datensammlungsstatistik
Raumgruppe P212121
Zellkonstantena=52,85Å, b=54,77Å, c=81,58Å
α=β=γ=90°
Multiplizität 2.3
Vollständigkeit (gesamt/2.0 Å/1.8 Å) 84 % / 93 % / 60 %
Rmerge (gesamt/2.0 Å/1.8 Å) 8,7 % / 20 % / 56 %
Verfeinerungsstatistik
unabh. Reflexe 20187
R-Faktor 20.0 %
freier R-Faktor 24.0 %
σBindungslängen 0,005 Å
σBindungswinkel 1.2°
σB- Faktoren 4,4 Å2
Moleküle in der asymm. Einheit 1
6.4. Röntgenstrukturanalyse des Faktor Xa Inhibitor 84/Trypsin-
Komplexes
Die Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/Inhibitor 84-Komplexes wurde in
Kooperation mit Andreas Bergner (Abteilung Prof. R. Huber) durchgeführt.
6. Experimenteller Teil 86
Benzamidin-komplexierte Trypsinkristalle wurden gezüchtet wie von Stubbs und
Mitarbeitern beschrieben (Stubbs, M. T. et al. 1995). Ein Kristall wurde für 3 Tage
in eine 2mM Lösung des Inhibitors 84 (2,5M Ammoniumsulphat, pH 8) eingelegt,
wodurch Benzamidin im Kristall durch den Inhibitor ausgetauscht wurde. Das
verwendete Röntgengerät wurde bereits unter 6.3.2 erläutert. Die Daten wurden mit
den Computerprogrammen MOSFLM (Leslie, A. G. W. 1994) und CCP4 (Bailey,
S. 1994) und den Koordinaten der Struktur von β-Trypsin (PDB-Zugangscode:
1PPH) ausgewertet. Die Strukturverfeinerung wurde in alternierenden Schritten mit
X-PLOR (Brünger, A. T. 1993) und dem 3D-Modellierprogramm TURBO-FRODO
(Roussel, A. et al. 1989) durchgeführt. Da die Elektronendichte eine eindeutige
Bestimmung der Inhibitorkonfiguration nicht zuließ, wurde die Verfeinerung mit
den getrennten D- bzw. L-Enantiomeren sowie mit einer anteilmäßigen Besetzung
beider Enantiomere durchgeführt. Die kristallographischen Daten sind in Tabelle 14
zusammengefaßt.
Datensammlungs- und Verfeinerungsstatistik
Raumgruppe P212121
Zellkonstantena=63,7Å, b=63,5Å, c=69,1Å
α=β=γ=90°
Vollständigkeit (gesamt / letzte Schale) 96,3 % / 83,3 %
Rsym (gesamt / letzte Schale) 3,9 % / 8,1 %
R-Faktor 19,5 – 19,9 %
Tabelle 14: Kristallographische Daten des Inhibitor 84/Trypsin-Komplexes
6. Experimenteller Teil 87
6.5. Modelling-Experimente mit Faktor Xa Inhibitoren
Die beschriebenen Untersuchungen wurden in Kooperation mit Andreas Bergner
(Abteilung Prof. R. Huber) durchgeführt.
Modelling-Experimente wurden mit dem Computerprogramm FlexX (Rarey, M. et
al. 1996) auf SGI Workstations durchgeführt. Hierzu wurden die Koordinaten der
unkomplexierten FXa-Röntgenstruktur (Padmanabhan, K. et al. 1993) (PDB-
Zugangscode: 1HCG) verwendet. Zur Validierung der Ergebnisse, sollten auch
Dockingversuche an der beschriebenen Röntgenstruktur des FXa-DX9065a-
Komplexes durchgeführt werden (Brandstetter, H. et al. 1996) (PDB-Zugangscode:
1FAX). Paradoxerweise führt die Bindung des Inhibitors (DX-9065a) in dieser
Struktur zu einer Kontraktion der S1-Tasche, so daß es FlexX nicht möglich war,
den Inhibitor 84 oder auch nur Benzamidin korrekt in die S1-Tasche zu docken.
Aus diesem Grund wurde diese Struktur einer einfachen Molekül-Dynamik-
Simulation (gemittelte Struktur nach 10 ps Simulation) unterworfen. Diese
gemittelte Struktur diente als drittes Rezeptormodell.
6.6. In vivo Eliminationsstudien
NAPAP (siehe Seite 49) und die Verbindung 75 wurden in wäßriger Lösung in
Dosen von 1 mg/kg intravenös narkotisierten (Urethan, 1.5 g/kg i.p.) Ratten
appliziert. Blutproben wurden nach unterschiedlichen Zeitintervallen aus der
Hauptschlagader entnommen, mit Zitratlösung antikoaguliert und zentrifugiert.
Blutplasma wurde auf einer Chromabond C18 Festphasen-Extraktionssäule
(Macherey-Nagel, Düren) aufgetragen. Die Inhibitorkonzentrationen in den
einzelnen Plasmaproben wurden mittels HPLC an einer Nucleosil 7/C18-Säule
(Macherey-Nagel, Düren) bei einer Flußrate von 1 mL/min mit dem Eluenten
ACN/Wasser/1M Perchlorsäure = 15/70/0.04 bestimmt. NAPAP wurde mittels
Fluoreszenzdetektor (λex = 232 nm, λem = 343 nm), der uPA Inhibitor 75 mit einem
UV-Detektor (λ = 238 nm) nachgewiesen.
6. Experimenteller Teil 88
6.7. Toxizitätsstudien am uPA Inhibitor 75
Die Zytotoxizität des uPA Inhibitors 75 wurde in Kooperation mit Nuria Arroyo de
Prada (Frauenklink der TU München) anhand von 3 verschiedenen Krebszellinien
(Eierstockkrebszellinie OVMZ-6, Brustkarzinomzellinie MDA-MB-231,
Keatinozytenzellinie A431) mit dem nicht-radioaktiven Zell-Proliferations-Assay
CellTiter96TM der Firma Promega (Mannheim) bestimmt. Hierzu wurden die Zellen
auf 96-Loch-Mikrotiterplatten ausgesät und, mit steigenden Mengen des Inhibitors,
24, 48 bzw. 72 Stunden bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Nach Zugabe einer
Tetrazoliumsalz-haltigen Lösung {[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-
(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium} wurden die Zellen
weitere 4 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit erfolgt durch lebende Zellen die
metabolische Umwandlung des Tetrazolium-Salzes in ein Formazanprodukt
(Abbildung 30). Durch Zugabe einer Stop-Lösung wurde dieser Vorgang beendet.
N
N NN
O COOH
SO3
+
-
NN N
N
N
SH
O COOH
O3S-
MTS Formazan
NS
Abbildung 30: Metabolische Formazan-Bildung durch lebende Zellen
Nach Inkubation über Nacht, wurde mittels eines ELISA-Readers die Absorption
bei 560 nm und 640 nm gemessen. Die Differenz der Meßwerte bei diesen
Wellenlängen ist der Anzahl lebender Zellen direkt proportional.
6. Experimenteller Teil 89
6.8. Synthese der uPA Inhibitoren
6.8.1. Tripeptid-Methylketone
Die Synthese der Peptid-Methylketone wurde manuell in Maßstäben von 0,2 – 0,5
mmol auf N-Fmoc-N(OCH3)-(CH2)2-CO-AM Harz (Weinreb-AM Harz)
durchgeführt. Um die Fmoc-Gruppe des Linkers abzuspalten wurde das Harz in
DMF/CH2Cl2 (4:1) gequollen, mit 20% Piperidin in DMF/CH2Cl2 (4:1) für 3 min
und ein zweites mal für 12 min behandelt und anschließend mit CH2Cl2 und DMF
gewaschen. Durch Reaktion mit einem sechsfachen Überschuß an Fmoc-Arg(Pbf)-
OH/HATU/HOAt/DIEA (1:1:1:2) in DMF/CH2Cl2 (4:1) für 1 h wurde das Harz mit
0.5 mmol/g beladen, wie nach quantitativer Fmoc-Abspaltung und darauffolgender
Vermessung des Piperidiniumaddukts bei 301 nm mit einem angenommen ε von
7800 l mol-1 cm-1 bestimmt wurde. Die Verlängerung der Peptidkette erfolgte nach
Standardmethoden der Fmoc/tBu-Strategie mit Kopplung von vierfachen
Überschüssen an Fmoc-AA-OH/HBTU/HOBt/DIEA (1:1:1:2) in DMF/CH2Cl2
(4:1). Die Fmoc-Abspaltung erfolgte wie oben beschrieben. Soweit gewünscht,
wurde zur Acetylierung der N-Termini der Verbindungen das harzgebundene Peptid
nach Fmoc-Abspaltung mit 10 Äquivalenten Ac2O/DIEA (1:1) in DMF/CH2Cl2
(4:1) behandelt. Nach reduktiver Abspaltung mit 20 Äquivalenten MeMgBr in THF
für 1 h, wurde nach dem Abfiltrieren des Harzes mit AcOEt verdünnt, mit etwas Eis
hydrolysiert und gegen 5% KHSO4 verteilt. Die organische Phase wurde über
Na2SO4 getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels, wurden die als
Rohprodukte erhaltenen seitenkettengeschützten Peptid-Methylketone schließlich
während 1 h in 95%-iger TFA entschützt. Nach Einengen der Lösung wurde das
Produkt mit DIPE gefällt, zentrifugiert und aus Wasser lyophyllisiert. Die so
erhaltenen Produkte besaßen eine Reinheit von mehr als 90% und wurden nicht
weiter aufgereinigt.
Folgende Verbindungen wurden nach dieser Methode synthetisiert:
Ac-Arg-CH3 (1): Ausbeute: 23 mg (28%); HPLC (Gradient B): tR 3,2 min; FAB-
MS: m/z = 215,2 (M+H)+; ber. für C9H18N4O4: 214,2
6. Experimenteller Teil 90
Ac-Glu-Gly-Arg-CH3 (2): Ausbeute: 28 mg (15%); HPLC (Gradient B): tR 5,4 min;
ESI-MS: m/z = 401,0 (M+H)+; ber. für C16H28N6O6: 400,2
H-Glu-Pro-D,L-Arg-CH3 (3): Ausbeute: 29 mg (12%); HPLC (Gradient B): tR 3,7
min; FAB-MS: m/z = 399,2 (M+H)+; ber. für C17H30N6O5: 398,2
Ac-Glu-Hyp-Arg-CH3 (4): Ausbeute: 12 mg (21%); HPLC (Gradient B): tR 5,1 min;
FAB-MS: m/z = 457,3 (M+H)+; ber. für C19H32N6O7: 456,2
Ac-Ser-Hyp-Arg-CH3 (5): Ausbeute: 20 mg (70%); HPLC (Gradient B): tR 6,2 min;
FAB-MS: m/z = 415,3 (M+H)+; ber. für C17H30N6O6: 414,2
6.8.2. nicht-peptidische Inhibitoren / Phenylguanidine
Allgemeine Arbeitsvorschriften:
Zur Synthese der aromatischen Guanidinoverbindungen wurden die entsprechenden
aromatischen Amine mit einem bis-Z- bzw. bis-Boc-geschützten
Guanidinylierungsreagenz umgesetzt und die resultierenden Guanidino-
verbindungen anschließend entschützt. Als bis-Z-geschütztes
Guanidinylierungsreagenz wurde das von Feichtinger et al. beschriebene N,N'-
Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin synthetisiert (Feichtinger, K. et al. 1998).
Zur Darstellung von N,N'-di-Boc-1-Guanylpyrazol wurde in kommerziell
erhältliches N-Boc-1-Guanylpyrazol (Fluka) gemäß Wu et al. eine zweite Boc-
Schutzgruppe eingeführt (Wu, Y. et al. 1993).
6. Experimenteller Teil 91
Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (AAV1): Guanidinylierung mit N,N'-di-Boc-1-
Guanylpyrazol
Die Aminokomponente (ca. 0,1 mmol) wurde in 1-2 ml Aceton gelöst, mit einem
Äquivalent N,N'-di-Boc-1-Guanylpyrazol versetzt und bei 50 °C in einem fest
verschlossenen Gefäß gerührt. Der Reaktionsfortschritt wurde mittels DC oder
HPLC verfolgt. Je nach Art des Amins betrug die Reaktionszeit bis zu 1 Woche.
Nach Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum, wurde der Rückstand zwischen
AcOEt/5% KHSO4 verteilt und die organische Phase 3x mit 5% KHSO4 gewaschen.
Nach Trocknung der organischen Phase über wasserfreiem Na2SO4, wurde das
Lösungsmittel abgezogen und das Produkt aus Ether umkristallisiert. Weitere
Derivatisierungen wurden auf dieser geschützten Stufe durchgeführt.
Zum Abspalten der Boc-Schutzgruppen wurde das Produkt in eiskalter 6N
HCl/Dioxan gelöst und 15 min. bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde
abgezogen und das Produkt als Hydrochlorid-Salz aus i-PrOH/DIPE
umkristallisiert.
Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (AAV2): Guanidinylierung mit N,N'-
Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin
Die Durchführung dieser Reaktion erfolgte wie in AAV1 beschrieben mit einem
Äquivalent N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin.
Zum Abspalten der Z-Schutzgruppen wurde die Substanz in Methanol gelöst, mit
einem Äquivalent 1M HCl versetzt und über einem Pd/C-Katalysator hydriert. Das
Lösungsmittel wurde anschließend abgezogen und das Produkt als Hydrochlorid-
Salz aus i-PrOH/DIPE umkristallisiert.
6. Experimenteller Teil 92
Spezielle Arbeitsvorschriften:
Phenylguanidin Hydrochlorid (6):
Phenylguanidin wurde nach AAV1 aus frisch destilliertem Anilin (13 µl; 0,139
mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 32 mg (92%); DC (Laufm. A): Rf = 0,08; ESI-MS: m/z = 136,2 (M+H)+;
ber. für C7H9N3: 135,1
Benzylguanidin Hydrochlorid (7):
Die Titelverbindung wurde nach AAV1 aus Benzylamin (207 µl; 1,96 mmol)
synthetisiert.
Ausbeute: 345 mg (95%); DC (Laufm. A): Rf = 0,09; ESI-MS: m/z = 150,0
(M+H)+; ber. für C8H11N3: 149,1
p-Guanidino-Benzoesäure-OSu Hydrochlorid (8):
p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid (500 mg; 2,32 mmol), HOSu (267 mg;
2,32 mmol), DCC (495 mg; 2,55 mmol) wurden bei 0 °C in DMF (6 ml) gelöst, bei
dieser Temperatur 3 h gerührt und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Der
ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das LM abgezogen. Der
Rückstand kristallisierte durch Behandlung mit Ether.
Ausbeute: 345 mg (95%); DC (Laufm. B): Rf = 0,55; ESI-MS: m/z = 276,8 (M+H)+;
ber. für C8H11N3: 276,1
p-Guanidino-Benzoesäure-Weinrebamid Hydrochlorid (9):
Eine Lösung von p-Guanidino-Benzoesäure-OSu Hydrochlorid (8) (100 mg; 0,32
mmol), N-Methoxy-N-Methylamin (31,2 mg; 0,32 mmol) und TEA (90 µl; 0,65
mmol) in DMF (1 ml) wurde 24 h bei RT gerührt. Nach Abfiltrieren des NS wurde
das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand 3x aus Methanol umkristallisiert.
Ausbeute: 50 mg (60%); DC (Laufm. B): Rf = 0,47; ESI-MS: m/z = 222,2 (M+H)+;
ber. für C8H11N3: 223,2
6. Experimenteller Teil 93
p-Guanidino-Benzoesäureneopentylester Hydrochlorid (10):
Eine Lösung von p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid (200 mg; 0,93 mmol),
Neopentylalkohol (90 mg; 1,02 mmol) und DCC (198 mg; 1,02 mmol) in Pyridin (1
ml) wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels im HV
wurde der Rückstand in wenig MeOH gelöst und die Verunreinigungen mit viel
Ether ausgefällt. Nach Abziehen des Ethers wurde das Rohprodukt in EtOH/AcOEt
1:1 gelöst, mit 160 µl 6N HCl/Dioxan versetzt und mit Hexan ausgefällt.
Ausbeute: 50 mg (60%); HPLC (Gradient A): tR 6,9 min; ESI-MS: m/z = 250,2
(M+H)+; ber. für C13H19N3O2: 249,1
p-Guanidino-Benzoesäuremethylester Hydrochlorid (11):
Zu einer Lösung von p-Guanidino-Benzoesäure Hydrochlorid (1 g; 4,64 mmol) in
Methanol (40 ml) wurde bei 0 °C langsam Thionylchlorid (405 µl; 5,57 mmol)
zugetropft und dann bei RT gerührt. Nach 3 h wurde nochmals die gleiche Menge
an Thionylchlorid zugegeben und die Reaktionslösung über Nacht weitergerührt.
Nach Abziehen des LMs im HV wurde das Rohprodukt aus Methanol
umkristallisiert um ein farbloses Produkt zu erhalten.
Ausbeute: 1,03 g (97%); DC (Laufm. B): Rf = 0,62; ESI-MS: m/z = 194,2 (M+H)+;
ber. für C9H11N3O2: 193,1
p-Nitro-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (12):
Zu einer Lösung von p-Nitro-Phenylalanin (1 g; 4,72 mmol) in Methanol (5 ml)
wurde bei 0 °C langsam Thionylchlorid (687 µl; 9,44 mmol) zugetropft und dann
bei RT gerührt. Nach 4 h wurde nochmals die gleiche Menge an Thionylchlorid
zugegeben und die Reaktionslösung über Nacht weitergerührt. Nach Abziehen des
LMs im HV wurde das Rohprodukt mit DIPE gewaschen um ein hellgelbes Produkt
zu erhalten.
Ausbeute: 1,19 g (97%); DC (Laufm. C): Rf = 0,70; ESI-MS: m/z = 226,2 (M+H)+;
ber. für C10H12N2O4: 225,2
6. Experimenteller Teil 94
N-Adoc-(4-nitro)-Phenylalanin-Methylester (13):
Eine Lösung von Verbindung 12 (500 mg; 1,91 mmol) und Adoc-F (454 mg; 2,29
mmol) in Dioxan (15 ml) wurde mit 1 ml 2N NaOH versetzt und bei RT gerührt.
Nach 5 min ist der pH Wert auf 5 gefallen und es wurden noch 0,5 ml NaOH
zugegeben. Eine Stunde später wurde das LM abgezogen und der Rückstand
zwischen AcOEt/H2O verteilt. Die organische Phase wurde getrocknet und das LM
abgezogen. Das erhaltene gelbe Öl wurde ohne weitere Aufarbeitung
weiterverarbeitet.
Ausbeute: 940 mg (100%); HPLC (Gradient A): tR 12,7 min;
N-Adoc-(4-Amino)-Phenylalanin-Methylester (14):
Eine Lösung von N-Adoc-(4-nitro)-Phenylalanin-methylester (13) (0,94 g; 1,91
mmol) in MeOH (20 ml) wurde mit 2 ml 1N AcOH versetzt und über Pd/C hydriert.
Nach 3 h wurde der Kat. abfiltriert und das LM abgezogen. Durch Behandlung mit
DIPE wurde ein hell rosafarbener Feststoff erhalten.
Ausbeute: 670 mg (94%); HPLC (Gradient A): tR 9,0 min; ESI-MS: m/z = 373,4
(M+H)+; ber. für C21H28N2O4: 372,2
N-Adoc-(4-Guanidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (15):
Die Titelverbindung wurde aus (14) (57 mg; 0,153 mmol) nach AAV2 unter Zusatz
von TEA (21 µl; 0,153 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 21 mg (30%); HPLC (Gradient A): tR 9,5 min; ESI-MS: m/z = 415,4
(M+H)+; ber. für C22H30N4O4: 415,2
N-Boc-(4-nitro)-Phenylalanin-Methylester (16):
Eine Lösung von Verbindung 12 (500 mg; 1,91 mmol) und Boc2O (461 mg; 2,11
mmol) in Dioxan (5 ml) wurde mit 1 ml 2N NaOH versetzt und bei RT gerührt.
Nach 1 h wurden weitere 0,5 ml NaOH zugegeben. Eine Stunde später wurde das
LM abgezogen und der Rückstand zwischen AcOEt/H2O verteilt. Die organische
6. Experimenteller Teil 95
Phase wurde mit 5% KHSO4 und 5% NaHCO3 gewaschen, getrocknet und das LM
abgezogen. Die Verbindung kristallisierte im Vakuum.
Ausbeute: 597 mg (96%); HPLC (Gradient A): tR 11,2 min; ESI-MS: m/z = 325,4
(M+H)+; ber. für C15H20N2O6: 324,2
N-Boc-(4-Amino)-Phenylalanin-Methylester (17):
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung (vgl. Verbindung 14) von
Verbindung 16 gewonnen und über eine Kieselgelsäule (25 x 5 cm, Eluent:
Hexan/AcOEt/AcOH = 10:10:1) gereinigt.
Ausbeute: 730 mg (57%); HPLC (Gradient A): tR 6,7 min; DC (Laufm. D): Rf =
0,40; ESI-MS: m/z = 295,4 (M+H)+; ber. für C15H22N2O4: 294,2
N-Boc-(4-Guanidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (18):
Die Titelverbindung wurde aus (17) (500 mg; 1,67 mmol) nach AAV2 unter Zusatz
von TEA (256 µl; 1,5 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 342 mg (55%); HPLC (Gradient A): tR 7,5 min; ESI-MS: m/z = 337,2
(M+H)+; ber. für C22H30N4O4: 336,2
N-TIPS-(4-Nitro)-Phenylalanin-Methylester (19):
Eine Lösung von Verbindung 12 (80 mg; 0,31 mmol), 2,3,5-Triisopropyl-Phenyl-
Sulfonylchlorid (103 mg; 0,341 mmol) und TEA (86 µl; 0,62 mmol) in DMF (1 ml)
wurde bei RT gerührt. Nach 3 h wurde das LM abgezogen, der Rückstand in AcOEt
(10 ml) aufgenommen und mit 5% KHSO4 , 5% NaHCO3 und Wasser gewaschen.
Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und das LM abgezogen. Das
erhaltene farblose Öl wurde ohne weitere Aufarbeitung weiterverarbeitet.
Ausbeute: 110 mg (71%); DC (Laufm. A): Rf = 0,50; HPLC (Gradient A): tR 13,7
min; ESI-MS: m/z = 491,4 (M+H)+; ber. für C25H34N2O6S1: 490,2
6. Experimenteller Teil 96
N-TIPS-(4-Amino)-Phenylalanin-Methylester (20):
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Reduktion von Verbindung 19 (110
mg; 0,22 mmol) in Methanol erhalten. Nach 4 h wurde der Kat. abfiltriert und das
LM abgezogen. Nach Trocknung im Vakuum wurde ein weißes Pulver erhalten.
Ausbeute: 100 mg (99%); HPLC (Gradient A): tR 10,9 min
N-TIPS-(4-Guanidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (21):
Die Titelverbindung wurde nach AAV2 erhalten unter Zusatz von TEA (30 µl;0,217
mmol). Die bis-Z-geschützte Guanidinoverbindung wurde über eine Kieselgelsäule
gereinigt (Säule: 19 cm x 2 cm; Fließmittel: Hexan/Ether = 1:4; Rf = 0,85).
Ausbeute: 20 mg (17%); HPLC (Gradient A): tR 13,7 min; ESI-MS: m/z = 503,2
(M+H)+; ber. für C26H38N4O4S1: 502,3
4-(N-Boc-Aminomethyl)-Anilin (22):
Zu einer Lösung von 4-Aminobenzylamin (2 ml; 17,6 mmol) in 10 ml Dioxan und
2N NaOH (17,6 ml; 35,2 mmol) wurde eine Lösung von Boc2O (3,08 g; 14,6 mmol)
in Dioxan (30 ml) zugetropft und über Nacht gerührt. Nach Abziehen des LM
wurde der Rückstand zwischen AcOEt/H2O verteilt, die organische Phase 2x mit
H2O gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM abgezogen. Nach Trocknung im
Vakuum wurde ein hellgelbes Pulver erhalten.
Ausbeute: 2,38 g (76%); HPLC (Gradient A): tR 5,6 min; ESI-MS: m/z = 223,0
(M+H)+; ber. für C12H12N2O2: 222,1
1-[4-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (23):
Die Titelverbindung wurde durch Guanidinylierung von Verbindung 22 (500 mg;
2,24 mmol) nach AAV2 hergestellt.
Ausbeute: 1,07 g (90%); HPLC (Gradient A): tR 13,4 min; ESI-MS: m/z = 533,4
(M+H)+; ber. für C29H32N4O6: 532,2
1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid (24):
6. Experimenteller Teil 97
Verbindung 23 (1 g; 1,878 mmol) wurde in eiskalter 3N HCl/Dioxan Lösung (20
ml) gelöst und anschließend für 2 h bei RT gerührt. Das LM wurde abgezogen und
das kristalline Produkt im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 872 mg (99%); HPLC (Gradient A): tR 10,2 min; ESI-MS: m/z = 433,3
(M+H)+; ber. für C29H32N4O6: 432,1
4-(N-Z-Aminomethyl)-Anilin (25):
Zu einer Lösung von 4-Aminobenzylamin (1 ml; 8,82 mmol) in 10 ml Dioxan und
2N NaOH (8,82 ml; 17,64 mmol) wurde bei 0°C eine Lösung von Z-Cl (1,12 ml;
7,94 mmol) in Dioxan (5 ml) zugetropft und über Nacht bei RT gerührt. Nach
Abziehen des LM wurde der Rückstand in 100 ml H2O aufgenommen, mit 6N HCl
auf pH 1 angesäuert und die als Nebenprodukt entstandene di-Z-Verbindung 2x mit
wenig AcOEt extrahiert. Die organische Phase wurde nochmals mit 3N HCl
gewaschen. Nach Vereinigung der wäßrigen Lösungen wurde der pH-Wert mit
NaHCO3 auf 10 erhöht und das Produkt 3x mit AcOEt extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4), das LM abgezogen und das
erhaltene Öl mit Hexan behandelt um einen leicht gelblichen Feststoff zu erhalten.
Ausbeute: 1,35 g (60%); HPLC (Gradient A): tR 7,0 min; ESI-MS: m/z = 257,1
(M+H)+; ber. für C15H16N2O2: 256,1
1-[4-(N-Z-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Boc-Guanidin (26):
Die Titelverbindung wurde durch Guanidinylierung von Verbindung 25 (495 mg;
1,93 mmol) nach AAV1 synthetisiert.
Ausbeute: 670 mg (70%); HPLC (Gradient A): tR 12,1 min; ESI-MS: m/z = 499,2
(M+H)+; ber. für C26H34N4O6: 498,3
1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Boc-Guanidin Hydrochlorid (27):
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von Verbindung 26 (600
mg; 1,2 mmol) in Ethanol gewonnen. Nach Abfiltrieren des Kat. und Abziehen des
6. Experimenteller Teil 98
LMs wurde der Rückstand in wenig i-PrOH aufgenommen, mit 6N HCl/Dioxan
(200 µl; 1,2 mmol) versetzt und mit DIPE ausgefällt.
Ausbeute: 355 mg (74%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 365,2
(M+H)+; ber. für C18H28N4O4: 364,2
4-(N-Z-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluoracetat (28):
Die Titelverbindung wurde durch Abspalten der Boc-Schutzgruppen mit TFA (1,5
ml) aus Verbindung 26 (25 mg; 0,05 mmol) gewonnen. Nach Abziehen der TFA
wurde das Produkt aus i-PrOH/DIPE gefällt.
Ausbeute: 18 mg (90%); HPLC (Gradient A): tR 7,6 min; ESI-MS: m/z = 299,2
(M+H)+; ber. für C16H18N4O2: 298,1
4-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (29):
Die Titelverbindung wurde durch kat. Hydrierung von Verbindung 23 (25 mg;
0,047 mmol) gewonnen. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen des LMs
wurde das Rohprodukt in wenig i-PrOH aufgenommen, mit 6N HCl/Dioxan (8 µl;
0,047 mmol) versetzt und mit DIPE ausgefällt.
Ausbeute: 12 mg (85%); HPLC (Gradient A): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 265,4
(M+H)+; ber. für C13H20N4O2: 264,2
1-[4-(N-Boc-Amino)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (30):
Die Titelverbindung wurde aus 4-(N-Boc-Amino)-anilin (500 mg; 2,4 mmol) nach
AAV2 synthetisiert.
Ausbeute: 1,12 g (90%); HPLC (Gradient A): tR 14,9 min; ESI-MS: m/z = 519,2
(M+H)+; ber. für C28H30N4O6: 518,2
4-(N-Boc-Amino)-Phenylguanidin Hydrochlorid (31):
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von Verbindung 30 (50
mg; 0,097 mmol) in AcOEt erhalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators und
Abziehen des LMs, wurde das Rohprodukt in wenig Dioxan gelöst, mit HCl/Dioxan
(16 µl; 0,097 mmol) angesäuert und mit DIPE gefällt.
6. Experimenteller Teil 99
Ausbeute: 21 mg (76%); HPLC (Gradient A): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 251,2
(M+H)+; ber. für C12H18N4O2: 250,1
4-Guanidinomethyl-Phenylguanidin di-Hydrochlorid (32):
Die Titelverbindung wurde aus 4-Aminobenzylamin (200 mg; 0,447 mmol) durch
zweifache Guanidinylierung nach AAV2 synthetisiert.
Ausbeute: 67 mg (54%); ESI-MS: m/z = 207,2 (M+H)+; ber. für C9H14N6: 206,1
4-(N-Ethyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (33):
Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid
(24) (50 mg; 0,107 mmol), Chlorameisensäureethylester (10 µl; 0,107 mmol) und
TEA (45 µl; 0,321 mmol) in DCM (1 ml) wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach
Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt gelöst und 3x mit 5% KHSO4
und 1x mit H2O gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4) und
das LM abgezogen.
Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung an Pd/C in Methanol
abgespalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das LM abgezogen und das
Produkt mit DIPE aus i-PrOH (nach Zusatz von einem Äquivalent HCl/Dioxan)
gefällt.
Ausbeute: 12 mg (42%); HPLC (Gradient A): tR 5,0 min; ESI-MS: m/z = 236,2
(M+H)+; ber. für C11H16N4O2: 236,1
4-(N-Neopentyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (34):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Chlorameisensäure-
neopentylester (16 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 28 mg (83%); HPLC (Gradient A): tR 8,2 min; ESI-MS: m/z = 279,4
(M+H)+; ber. für C14H22N4O2: 278,2
4-(N-Isobutyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (35):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Chlorameisensäure-
isobutylester (14 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.
6. Experimenteller Teil 100
Ausbeute: 18 mg (56%); HPLC (Gradient A): tR 7,5 min; ESI-MS: m/z = 265,4
(M+H)+; ber. für C13H20N4O2: 264,2
4-(N-Adamantyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (36):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Fluorameisensäure-
adamantylester (21 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 15 mg (37%); HPLC (Gradient A): tR 9,9 min; ESI-MS: m/z = 343,4
(M+H)+; ber. für C19H26N4O2: 342,2
4-[N-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydro-
chlorid (37):
Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid
(24) (50 mg; 0,107 mmol), 2,4,6-Triisopropylphenylsulfonylchlorid (32 mg; 0,107
mmol) und TEA (45 µl; 0,321 mmol) in DCM (1 ml) wurde über Nacht bei RT
gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt gelöst und 3x mit
0,5N HCl und 1x mit H2O gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet
(Na2SO4) und das LM abgezogen.
Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung an Pd/C in Methanol
abgespalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das LM abgezogen und das
Produkt mit DIPE aus i-PrOH gefällt.
Ausbeute: 18 mg (37%); HPLC (Gradient A): tR 10,6 min; ESI-MS: m/z = 431,4
(M+H)+; ber. für C23H34N4O2S1: 430,2
4-[N-(Pentafluorphenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydrochlorid (38):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit Pentafluorphenyl-
sulfonylchlorid (16 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 10 mg (22%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 395,0
(M+H)+; ber. für C14H11N4O2S1F5: 394,1
4-[N-(4-Acetamido-Phenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydrochlorid
(39):
6. Experimenteller Teil 101
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 4-Acetamido-phenyl-
sulfonylchlorid (25 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 23 mg (54%); HPLC (Gradient A): tR 9,3 min; ESI-MS: m/z = 362,0
(M+H)+; ber. für C16H19N5O3S1: 361,1
4-[N-(3-Trifluormethyl-Phenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydro-
chlorid (40):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 3-Trifluormethylphenyl-
sulfonylchlorid (17 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 15 mg (34%); HPLC (Gradient A): tR 8,3 min; ESI-MS: m/z = 373,4
(M+H)+; ber. für C15H15N4O2S1F3: 372,1
4-[N-(4-Trifluormethyl-Phenylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydro-
chlorid (41):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 4-Trifluormethylphenyl-
sulfonylchlorid (26 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 18 mg (41%); HPLC (Gradient A): tR 8,4 min; ESI-MS: m/z = 373,0
(M+H)+; ber. für C15H15N4O2S1F3: 372,1
4-[N-(2-Acetamido-4-Methyl-5-Thiazolsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin
Hydrochlorid (42):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 2-Acetamido-4-Methyl-5-
Thiazolsulfonylchlorid (26 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 43 mg (96%); HPLC (Gradient A): tR 6,7 min; ESI-MS: m/z = 383,2
(M+H)+; ber. für C14H18N6O3S2: 382,1
4-[N-(Trifluormethylsulfonyl)-Aminomethyl]-Phenylguanidin Hydrochlorid (43):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit Trifluormethyl-
sulfonylchlorid (18 µl; 0,107 mmol) synthetisiert. Das ausgefällte Rohprodukt
wurde durch präparative HPLC (linearer Gradient von 5% ACN auf 60% ACN in
30 min.) weiter aufgereinigt.
6. Experimenteller Teil 102
Ausbeute: 9 mg (21%); HPLC (Gradient A): tR 6,9 min; ESI-MS: m/z = 297,2
(M+H)+; ber. für C9H11N4O2S1F3: 296,1
4-[N-(1,2,3,4-Tetrahydro-2-(Trifluoracetyl)-Isochinolin-7-Sulfonyl)-Aminomethyl]-
Phenylguanidin Hydrochlorid (44):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 1,2,3,4-Tetrahydro-2-
(Trifluoracetyl)-Isochinolin-7-Sulfonylchlorid (35 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 8 mg (15%); HPLC (Gradient A): tR 8,3 min; ESI-MS: m/z = 456,4
(M+H)+; ber. für C19H20N5O3S1F3: 455,1
4,4'-Bis-(4-Guanidino-Benzylaminosulfonyl)-Diphenylether Dihydrochlorid (45):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 37 mit 4,4‘-Bis-Chlorosulfonyl-
Diphenylether (19,6 mg; 0,054 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 15 mg (53%); HPLC (Gradient A): tR 8,0 min; ESI-MS: m/z = 623,6
(M+H)+ und m/z = 312,4 (M+2H)2+; ber. für C20H19N4O5S2: 622,2
1-[4-(N-Boc-Glycyl-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (46):
Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid
(24) (200 mg; 0,426 mmol), Boc-Gly-OSu (116 mg; 0,426 mmol) und TEA (119 µl;
0,852 mmol) in DMF (5 ml) wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Abziehen des
LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen und 3x mit 5% KHSO4, 3x 5%
NaHCO3 und H2O gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na2SO4)
und das LM abgezogen.
Ausbeute: 236 mg (94%); HPLC (Gradient A): tR 12,4 min; ESI-MS: m/z = 590,2
(M+H)+; ber. für C31H35N5O7: 589,2
4-(N-Boc-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (47):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 46 (16 mg; 0,027 mmol) durch
katalytische Hydrierung über Pd/C in MeOH gewonnen.
Ausbeute: 9 mg (94%); HPLC (Gradient A): tR 6,0 min; ESI-MS: m/z = 322,4
(M+H)+; ber. für C15H23N5O3: 321,2
6. Experimenteller Teil 103
1-[4-(H-Glycyl-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid (48):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 46 (260 mg; 0,441 mmol) durch
Entschützen in 3M HCl/Dioxan (10 ml) hergestellt. Nach 1 h wurde das LM
abgezogen und das Produkt aus i-PrOH/DIPE gefällt.
Ausbeute: 180 mg (76%); HPLC (Gradient A): tR 10,1 min; ESI-MS: m/z = 490,4
(M+H)+; ber. für C26H27N5O5: 489,3
4-(4-Acetamidophenylsulfonyl-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid
(49):
Eine Lösung von 4-(H-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (48)
(30 mg; 0,057 mmol), 4-Acetamidophenylsulfonylchlorid (13 mg; 0,057 mmol) und
TEA (24 µl; 0,171 mmol) in DCM (1 ml) wurde 4 h bei RT gerührt. Nach Abziehen
des LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen und mit 1M HCl
gewaschen. Das LM wurde abgezogen und der Rückstand in MeOH über Pd/C
katalytischen hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde die Lösung im
Vakuum stark eingeengt und das Produkt mit Ether ausgefällt.
Ausbeute: 21 mg (81%); HPLC (Gradient A): tR 5,8 min; ESI-MS: m/z = 419,2
(M+H)+; ber. für C18H22N6O4S1: 418,1
4-(2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl-Glycyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin
Hydrochlorid (50):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 49 mit 2,4,6-Triisopropyl-
phenylsulfonylchlorid (17 mg; 0,057 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 10 mg (33%); HPLC (Gradient A): tR 10,3 min; ESI-MS: m/z = 488,4
(M+H)+; ber. für C25H37N5O3S1: 487,3
4-(4-Nitrobenzyloxycarbonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluoracetat
(51):
Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-phenyl]-2,3-Di-Boc-guanidin Hydrochlorid
(27) (50 mg; 0,125 mmol), Chlorameisensäure-4-Nitrobenzylester (27 mg; 0,125
6. Experimenteller Teil 104
mmol) und TEA (52 µl; 0,375 mmol) in DCM (1 ml) wurde über Nacht bei RT
gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen,
mit 0,5 M HCl und H2O gewaschen und die organische Phase getrocknet (Na2SO4).
Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand 1,5 h in 95% TFA (2 ml) gerührt um
die Boc-Schutzgruppen abzuspalten. Die Lösung wurde im Vakuum stark eingeengt
und das Produkt mit DIPE ausgefällt.
Ausbeute: 15 mg (27%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 344,0
(M+H)+; ber. für C16H17N5O4: 343,1
4-(6-Nitroveratryloxycarbony)-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluoracetat
(52):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Chlorameisensäure-
nitroveratrylester synthetisiert.
Ausbeute: 18 mg (28%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 404,2
(M+H)+; ber. für C18H21N5O6: 403,2
4-(4-Phenylazobenzyloxycarbony-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrotrifluor-
acetat (53):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Chlorameisensäure-4-
phenylazobenzylester (Schwyzer, R. et al. 1958) synthetisiert.
Ausbeute: 25 mg (39%); HPLC (Gradient A): tR 10,0 min; ESI-MS: m/z = 403,2
(M+H)+; ber. für C22H22N6O2: 402,2
2,2-bis-[N-(4-Guanidinobenzyl)-Carbamoyloxy-4-Phenyl]-Propan di-Hydrochlorid
(54):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit 2,2-Bis-[4-
(Chlorcarbonyloxy)-Phenyl]-Propan (22 mg; 0,0625 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 19 mg (45%); HPLC (Gradient A): tR 8,8 min; ESI-MS: m/z = 609,4
(M+H)+ und 305,2 (M+2H)2+; ber. für C33H36N8O4: 608,3
N-Phenyl-N'-(4-guanidinobenzyl)thioharnstoff Hydrotrifluoracetat (55):
6. Experimenteller Teil 105
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Phenylisothiocyanat (15
µl; 0,125 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 20 mg (39%); HPLC (Gradient A): tR 6,3 min; ESI-MS: m/z = 300,2
(M+H)+; ber. für C15H17N5S1: 299,1
Benzoesäure-(4-Guanidino)-Benzylamid Hydrochlorid (56):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 24 mit Benzoylchlorid (12 µl;
0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 21 mg (64%); HPLC (Gradient A): tR 5,5 min; ESI-MS: m/z = 269,2
(M+H)+; ber. für C15H16N4O1: 268,1
2-Iod-Essigsäure-(4-Guanidino)-Benzylamid Hydrotrifluoracetat(57):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 51 mit Iodessigsäre-p-
Nitrophenylester (23 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 42 mg (76%); HPLC (Gradient A): tR 2,7 min; ESI-MS: m/z = 333,0
(M+H)+; ber. für C10H13N4O1I1: 332,0
2-(1-Adamantyl)-Essigsäure-(4-Guanidino)-Benzylamid Hydrotrifluoracetat (58):
Eine Lösung von Verbindung 24 (50 mg; 0,123 mmol), 2-(1-Adamantyl)-
Essigsäure (21 mg; 0,107 mmol), TBTU (40 mg; 0,107 mmol), HOBt (17 mg; 0,123
mmol) und TEA (45 µl; 0,321 mmol) in DMF (1ml) wurde über Nacht bei RT
gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen,
mit 5% KHSO4 und 5% NaHCO3 gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM
abgezogen. Der Rückstand wurde in 95% TFA (3 ml) für 3 h gerührt, das LM
abgezogen und das Rohprodukt mit DIPE aus iPrOH ausgefällt.
Ausbeute: 15 mg (31%); HPLC (Gradient A): tR 8,7 min; ESI-MS: m/z = 341,2
(M+H)+; ber. für C20H28N4O1: 340,2
4-Aminomethylphenylguanidin di-Hydrochlorid (59):
6. Experimenteller Teil 106
Die Titelverbindung wurde durch kat. Hydrierung von Verbindung 24 (65 mg;
0,139 mmol) an 10% Pd/C in MeOH (10 ml) nach Zusatz von 6 N HCl/Dioxan (47
µl; 0,28 mmol) gewonnen.
Ausbeute: 30 mg (91%); HPLC (Gradient A): tR 1,0 min; ESI-MS: m/z = 165,2
(M+H)+; ber. für C8H12N4: 164,1
N-(1-Adamantyl)-N'-(4Guanidinobenzyl)-Thioharnstoff Hydrochlorid (60):
Eine Lösung von Verbindung 59 (30 mg; 0,127 mmol), 1-Adamantylisothiocyanat
(24 mg; 0,127 mmol) und TEA ( 17,6 µl; 0,127 mmol) in DMF (1 ml) wurde 5 h bei
RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand mit DIPE aus iPrOH
gefällt und 2 mal mit Ether gewaschen.
Ausbeute: 14 mg (28%); HPLC (Gradient A): tR 9,8 min; ESI-MS: m/z = 358,0
(M+H)+; ber. für C19H27N5S1: 357,2
3-(4-N,N'-di-Z-Guanidino)-Phenyl-Propionsäure (61):
Eine Suspension von 3-(4-Amino)-Phenyl-Propionsäure (200 mg; 1,21 mmol) und
N,N’-Dibenzyloxycarbonyl-N''-triflylguanidin (556 mg; 1,21 mmol) in Aceton (200
µl) wurde im geschlossenen Gefäß für ca. 5 min auf 50 °C erhitzt, wodurch sich
eine klare gelbe Lösung ergab. Nach kurzer Zeit fiel das Produkt aus der Lösung
aus, und die zähe Suspension wurde mit Aceton (1ml) verdünnt und weitere 30 min
gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand 3x mit DIPE gewaschen.
Ausbeute: 550 mg (83%); HPLC (Gradient A): tR 10,8 min; ESI-MS: m/z = 476,2
(M+H)+; ber. für C26H25N3O6: 475,2
3-(4-Guanidinophenyl)-Propionsäure-(1-Adamantyl)-Amid Hydrochlorid (62):
Eine Lösung von Verbindung 61 (100 mg; 0,21 mmol), 1-Adamantylamin (32 mg;
0,21 mmol), TBTU (81 mg; 0,252 mmol), HOBt (34 mg; 0,252 mmol) und TEA
(88 µl; 0,63 mmol) in DMF (2 ml) wurde 1 h bei RT gerührt. Nach Abziehen des
LMs wurde der Rückstand in AcOEt aufgenommen und mit 5% NaHCO3, 0,5 M
6. Experimenteller Teil 107
HCl und H2O gewaschen. Nach Trocknen (Na2SO4) und Abziehen des LMs wurde
das geschützte Zwischenprodukt aus MeOH (500 µl) umkristallisiert.
Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung (10% Pd/C) in MeOH
abgespalten. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen des LMs bildete sich
ein farbloses Öl, das sich durch Behandlung mit Ether und Hexan verfestigen ließ.
Ausbeute: 21 mg (27%); HPLC (Gradient A): tR 7,4 min; ESI-MS: m/z = 341,0
(M+H)+; ber. für C20H28N4O1: 340,2
1-Adamantylcarbonsäure-(4-Guanidinobenzyl)-Amid Hydrochlorid (63):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit 1-Adamantyl-
carbonsäurechlorid (21 mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 17 mg (40%); HPLC (Gradient C): tR 5,8 min; ESI-MS: m/z = 327,2
(M+H)+; ber. für C19H26N4O1: 326,2
Boc-Phe-(4-Guanidinobenzyl)-Amid Hydrochlorid (64):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 33 mit Boc-Phe-OSu (39 mg;
0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 15 mg (31%); HPLC (Gradient C): tR 5,9 min; ESI-MS: m/z = 412,0
(M+H)+; ber. für C22H29N5O3: 411,2
H-Phe-(4-Guanidinobenzyl)-Amid Hydrochlorid (65):
Die Titelverbindung wurde durch Rühren von Verbindung 65 (8 mg; 0,018 mmol)
in 6N HCl/Dioxan (100 µl) erhalten. Das Produkt wurde mit DIPE ausgefällt und
im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 5 mg (72%); HPLC (Gradient C): tR 1,0 min; ESI-MS: m/z = 312,2
(M+H)+; ber. für C17H21N5O1: 311,2
N-(1-Adamantyl)-N'-(3-Nitrobenzyl)-Harnstoff (66):
Eine Lösung von 3-Nitrobenzylammoniumchlorid (100 mg: 0,53 mmol), 1-
Adamantylisocyanat (94 mg; 0,53 mmol) und TEA (148 µl; 1,06 mmol) in DCM (4
6. Experimenteller Teil 108
ml) wurde über Nacht bei 4° stehen gelassen. Nach Abziehen des LMs wurde der
Rückstand in AcOEt aufgenommen, mit 0,5 M HCl und H2O gewaschen und die
organische Phase getrocknet (Na2SO4). Durch Abziehen des LMs und Trocknen im
Vakuum wurde ein weisses Produkt erhalten.
Ausbeute: 172 mg (99%); HPLC (Gradient C): tR 7,4 min; ESI-MS: m/z = 330,2
(M+H)+; ber. für C18H23N3O3: 329,2
N-(1-Adamantyl)-N'-(3-Aminobenzyl-Harnstoff (67):
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Reduktion (10% Pd/C) von
Verbindung 66 in 20 ml MeOH/AcOEt = 1:1 erhalten.
Ausbeute: 100 mg (64%); HPLC (Gradient C): tR 5,7 min; ESI-MS: m/z = 300,1
(M+H)+; ber. für C18H25N3O1: 299,1
N-(1-Adamantyl)-N'-(3-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (68):
Die Titelverbinding wurde aus Verbindung 67 (50 mg; 0,167 mmol) nach AAV1
synthetisiert. Die Z-Schutzgruppen wurden anschließend durch katalytische
Hydrierung abgespalten.
Ausbeute: 28 mg (44%); HPLC (Gradient C): tR 5,7 min; ESI-MS: m/z = 342,2
(M+H)+; ber. für C19H27N5O1: 341,2
N-Boc-3-Nitrobenzylamin (69):
Eine Lösung von 3-Nitro-Benzylammoniumchlorid (800 mg; 4,24 mmol) und
Boc2O (925 mg; 4,24 mmol) in einer Mischung aus Dioxan (10 ml) und 2 M NaOH
(4,24 mml; 8,48 mmol) wurde 2h bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde
der Rückstand in AcOEt aufgenommen, mit 5% KHSO4, 5% NaHCO3 und H2O
gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Nach Abziehen des LMs wurde das
resultierende Öl mit DIPE behandelt, wobei das Produkt kristallisierte.
Ausbeute: 860 mg (80%); HPLC (Gradient C): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 253,2
(M+H)+; ber. für C12H16N2O4: 252,1
N-Boc-3-Aminobenzylamin (70):
6. Experimenteller Teil 109
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von N-Boc-3-
Nitrobenzylamin (69) (860 mg; 2,52 mmol) in MeOH gewonnen.
Ausbeute: 720 mg (82%); HPLC (Gradient C): tR 2,5 min; ESI-MS: m/z = 223,2
(M+H)+; ber. für C12H16N2O4: 222,1
1-[3-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin (71):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 70 (700 mg; 2,7 mmol) durch
Guanidinylierung nach AAV1 erhalten. Das Rohprodukt wurde 2x aus MeOH
umkristallisiert.
Ausbeute: 720 mg (38%); HPLC (Gradient C): tR 8,3 min; ESI-MS: m/z = 533,4
(M+H)+; ber. für C29H32N4O6: 532,2
1-[3-Aminomethyl-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid (72):
Die Titelverbindung wurde durch Abspalten der Boc-Schutzgruppe von Verbindung
71 (500 mg; 0,937 mmol) in 6N HCl/Dioxan (2 ml) gewonnen.
Ausbeute: 460 mg (98%); HPLC (Gradient C): tR 6,8 min; ESI-MS: m/z = 433,4
(M+H)+; ber. für C24H24N4O4: 432,2
3-(2,4,6-Tri-Isopropylphenylsulfonyl-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid
(73):
Eine Lösung von Verbindung 72 (30 mg; 0,064 mmol), 2,4,6-Tri-
Isopropylphenylsulfonylchlorid (19 mg; 0,064 mmol) und TEA (27 µl; 0,192
mmol) in DCM (1 ml) wurde 2h bei RT gerührt. Nach Verdünnen mit DCM (10 ml)
wurde die Lösung mit 5% KHSO4, 5% NaHCO3 und H2O gewaschen und das LM
abgezogen.
Die Z-Schutzgruppen wurden durch katalytische Hydrierung (10% Pd/C) in MeOH
[unter Zusatz von 1M HCl (60 µl)] abgespalten.
Ausbeute: 25 mg (83%); HPLC (Gradient C): tR 7,0 min; ESI-MS: m/z = 431,2
(M+H)+; ber. für C23H34N4O2S1: 430,2
6. Experimenteller Teil 110
3-(N-Boc-Aminomethyl)-Phenylguanidin Hydrochlorid (74):
Die Titelverbindung wurde durch katalytische Hydrierung aus Verbindung 71 (30
mg; 0,056 mmol) gewonnen. Das Produkt wurde aus iPrOH/Ether gefällt.
Ausbeute: 16 mg (96%); HPLC (Gradient C): tR 4,8 min; ESI-MS: m/z = 265,1
(M+H)+; ber. für C13H20N4O2: 264,2
N-(1-Adamantyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (75):
Eine Lösung von 1-[4-(Aminomethyl)-Phenyl]-2,3-di-Z-Guanidin Hydrochlorid
(24) (50 mg; 0,107 mmol), 1-Adamantylisocyanat (19 mg; 0,107 mmol) und TEA
(45 µl; 0,321 mmol) in DCM (1 ml) wurde bei RT gerührt. Nach 5 h wurde das LM
abgezogen, der Rückstand in AcOEt (10 ml) aufgenommen und mit 0,1 M HCl
gewaschen. Nach Trocknung der organischen Phase (Na2SO4) wurde das LM
abgezogen.
Die Abspaltung der Z-Schutzgruppen erfolgte durch katalytische Reduktion (10%
Pd/C) in MeOH. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen des LMs wurde
das Produkt aus iPrOH/DIPE umkristallisiert.
Ausbeute: 30 mg (74%); HPLC (Gradient A): tR 8,6 min; ESI-MS: m/z = 342,2
(M+H)+; ber. für C19H27N5O1: 341,2
N-(2-Naphthyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (76):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 75 mit 2-Naphthylisocyanat (18
mg; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 33 mg (83%); HPLC (Gradient A): tR 7,1 min; ESI-MS: m/z = 334,0
(M+H)+; ber. für C19H19N5O1: 333,2
N-(Phenyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (77):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 75 mit Phenylisocyanat (12 µl;
0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 25 mg (56%); HPLC (Gradient A): tR 6,5 min; ESI-MS: m/z = 284,0
(M+H)+; ber. für C15H17N5O1: 283,1
6. Experimenteller Teil 111
N-(2-Chloracetyl)-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff Hydrochlorid (78):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 75 mit 2-Chloracetylisocyanat
(9,1 µl; 0,107 mmol) synthetisiert.
Ausbeute: 17 mg (50%); HPLC (Gradient A): tR 6,6 min; ESI-MS: m/z = 284,0
(M+H)+; ber. für C11H147N5O2Cl1: 283,1
6.9. Synthese der Faktor Xa Inhibitoren
Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (AAV3): Synthese der Amidinofunktion aus
Nitrilen
Zur Synthese der Amidino-Funktion wurden die Vorschriften von (Jendralla, H. et
al. 1995; Stüber, W. et al. 1995) abgewandelt.
Eine Lösung des aromatischen Nitrils (3 mmol), Hydroxylammoniumchlorid (5,2
mmol) und KOH(f) (8,6 mmol) in absolutem EtOH (50 ml) wurde über Nacht
refluxiert. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen KCl und Abziehen des LMs wurde
der Rückstand in H2O (50 ml) aufgenommen und mit 1M HCl auf pH 3 angesäuert.
Zur Abtrennung des Nebenprodukts (Amid) wurde die Lösung mit AcOEt extrhiert.
Anschließend wurde die wäßrige Phase 5x mit wassergesättigtem n-BuOH
extrahiert. Das LM der vereinten BuOH-Lösungen wurde bei 35 °C im HV
abgezogen und das Produkt (N-Hydroxyamidin) aus i-PrOH/DIPE gefällt.
Zur Synthese der Amidin-Verbindung wurde das entsprechende N-Hydroxyamidin
(2,7 mmol) bei 50 °C in H2O (100 ml) über 10% Pd/C hydriert (Anmerkung: Die
Reaktion konnte im Allgemeinen nicht durch HPLC verfolgt werden, da Edukt und
Produkt die gleiche Retentionszeit aufwiesen). Nach Abfiltrieren des Katalysators
wurde das LM abgezogen (HV, 40 °C), mit Toluol nachrotiert und das Produkt im
Vakuum getrocknet.
6. Experimenteller Teil 112
Spezielle Arbeitsvorschriften:
N-Boc-D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin (79):
Zu einer Lösung von D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin (5g; 26,3 mmol) in Dioxan (25
ml) und 1M NaOH (26,3 ml; 26,3 mmol) wurde unter Rühren eine Lösung von
Boc2O (5,74 g; 26,3 mmol) in Dioxan (5 ml) zugegeben. Nach 1 h wurde das LM
abgezogen, der Rückstand zwischen 5% KHSO4/AcOEt verteilt und 3x mit AcOEt
extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4) und das
LM abgezogen. Das erhaltene Öl kristallisierte über Nacht bei 4 °C.
Ausbeute: 6,9 g (91%); DC (Laufm. B): Rf = 0,76; HPLC (Gradient A): tR 8,2 min;
ESI-MS: m/z = 291,0 (M+H)+; ber. für C15H18N2O4: 290,1
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (80):
Die Titelverbindung wurde aus Verbidung 79 (1 g; 3,44 mmol) nach AAV3
synthetisiert.
Ausbeute: 690 mg (58%); DC (Laufm. E): Rf = 0,18; HPLC (Gradient A): tR 5,3
min; ESI-MS: m/z = 308,4 (M+H)+; ber. für C15H21N3O4: 307,2
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (81):
Eine Lösung von Verbindung 80 (400 mg; 1,16 mmol) in MeOH (10 ml) wurde mit
6M HCl auf pH 2,5 angesäuert und 24 h bei RT stehen gelassen. Das LM wurde
abgezogen und das Produkt im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 415 mg (100%); DC (Laufm. E): Rf = 0,41; HPLC (Gradient A): tR 5,9
min; ESI-MS: m/z = 322,2 (M+H)+; ber. für C16H23N3O4: 321,2
D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Di-hydrochlorid (82):
Eine Lösung von Verbindung 81 (230 mg; 0,64 mmol) in 6 M HCl/Dioxan (5ml)
wurde bei RT gerührt. Nach 1 h wurde das LM abgezogen und das Produkt im
Vakuum getrocknet.
6. Experimenteller Teil 113
Ausbeute: 188 mg (100%); DC (Laufm. B): Rf = 0,10; ESI-MS: m/z = 222,2
(M+H)+; ber. für C11H15N3O2: 221,2
N-Fmoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (83):
Eine Lösung von Verbindung 82 (50 mg; 0,17 mmol), Fmoc-Cl (44 mg; 0,17 mmol)
und TEA (24 µl; 0,17 mmol) in DMF (500 µl) wurde bei RT gerührt. Um die
Reaktion zu vervollständigen wurde nach 30 min. nochmals TEA (12 µl; 0,085
mmol) zugegeben. Nach 3 h wurde das LM abgezogen und der Rückstand in H2O
gelöst und die Lösung mit 1M HCl auf pH 3 angesäuert. Der gebildete NS wurde
abzentrifugiert, im Vakuum getrocknet und aus AcOEt/DIPE umkristallisiert.
Ausbeute: 60 mg (73%); DC (Laufm. F): Rf = 0,58; HPLC (Gradient A): tR 8,0 min;
ESI-MS: m/z = 444,0 (M+H)+; ber. für C26H25N3O4: 443,2
N-Adoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (84):
Die Titelverbindung wurde wie für Verbindung 83 beschrieben mit Adoc-F (32 mg;
0,16 mmol) synthetisiert und aus AcOEt/DIPE umkristallisiert.
Ausbeute: 60 mg (86%); DC (Laufm. F): Rf = 0,55; HPLC (Gradient A): tR 7,6 min;
ESI-MS: m/z = 400,0 (M+H)+; ber. für C22H29N3O4: 399,2
N-1-Adamantylaminocarbonyl-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Methylester
Hydrochlorid (85):
Eine Lösung von Verbindung 82 (46 mg; 0,156 mmol), 1-Adamantylisocyanat
(27,7 mg; 0,156 mmol) und TEA (22 µl; 0,156 mmol) in DMF (500 µl) wurde 3 h
bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand aus i-PrOH/DIPE
umkristallisiert.
Ausbeute: 55 mg (81%); HPLC (Gradient A): tR 8,7 min; ESI-MS: m/z = 399,4
(M+H)+; ber. für C22H30N4O3: 398,2
N-Adoc-D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin (86):
Eine Lösung von D/L-3-Cyanophenylalanin (2 g; 10,5 mmol), Adoc-F (2,08 g; 10,5
mmol) und 2 M NaOH (7,8 ml; 15,6 mmol) in Dioxan (50 ml) wurde 3 h bei RT
6. Experimenteller Teil 114
gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde der Rückstand zwischen AcOEt/5%
KHSO4 verteilt und die wäßrige Phase 3x mit 5% KHSO4 extrahiert. Die
organischen Phasen wurden vereinigt, gertrocknet (Na2SO4) und das LM
abgezogen. Das erhaltene gelbliche Öl wurde mit Ether behandelt und bildete
anschließend im Vakuum einen weißen Schaum.
Ausbeute: 3,7 g (96%); DC (Laufm. B): Rf = 0,72; HPLC (Gradient A): tR 11,5 min;
ESI-MS: m/z = 369,4 (M+H)+; ber. für C21H24N2O4: 368,2
N-Adoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (87):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 86 (3,5 g; 9.5 mmol) nach AAV3
synthetisiert.
Ausbeute: 3,0 g (75%); HPLC (Gradient A): tR 9,4 min; ESI-MS: m/z = 386,4
(M+H)+; ber. für C21H27N3O4: 385,2
N-Adoc-D/L-(3-Cyano)-Phenylalanin-Piperidid Hydrochlorid (88):
Zu einer Lösung von Verbindung 86 (300 mg; 0,814 mmol) und Piperidin (480 µl;
4,88 mmol) in DCM (5 ml) wurde unter heftigem Rühren bei 0 °C langsam
Thonylchlorid (120 µl; 1,63 mmol) zugetropft. Anschließend wurde die Lösung 2 h
bei RT gerührt, mit DCM verdünnt und mit 5% NaHCO3, 5% KHSO4, und H2O
gewaschen. Nach Trocknung (Na2SO4) wurde das LM abgezogen und das Produkt
im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 240 mg (68%); DC (Laufm. G): Rf = 0,76; ESI-MS: m/z = 436,2
(M+H)+; ber. für C26H33N3O3: 435,3
N-Adoc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Piperidid Hydrochlorid (89):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 88 (240 mg; 0,55 mmol) nach AAV3
synthetisiert.
Ausbeute: 84 mg (31%); HPLC (Gradient A): tR 10,0 min; ESI-MS: m/z = 453,4
(M+H)+; ber. für C26H36N4O3: 452,3
6. Experimenteller Teil 115
N-Boc-D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (90):
Die Titelverbindung wurde ausgehend von D/L-4-Cyanophenylalanin analog zu
Verbindung 80 hergestellt.
Ausbeute: 57%; HPLC (Gradient A): tR 5,2 min; ESI-MS: m/z = 308,4 (M+H)+; ber.
für C15H21N3O4: 307,2
D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin Di-hydrochlorid (91):
Die Titelverbindung wurde durch Entschützen von Verbindung 90 (625 mg; 2,037
mmol) in 6 M HCl/Dioxan hergestellt wie für Verbindung 82 beschrieben.
Ausbeute: 540 mg (95%); DC (Laufm. H): Rf = 0,23; ESI-MS: m/z = 208,3
(M+H)+; ber. für C10H13N3O2: 207,2
H-D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin-Methylester di-Hydrochlorid (92):
Zu einer Lösung von Verbindung 91 (230 mg; 0,824 mmol) in MeOH (2 ml) wurde
bei –70 °C Thionylchlorid (180 µl; 2,47 mmol) zugetropft und anschließend 18 h
bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde das Produkt aus EtOH/Ether
kristallisiert.
Ausbeute: 182 mg (75%); DC (Laufm. H): Rf = 0,54; ESI-MS: m/z = 222,4
(M+H)+; ber. für C11H15N3O2: 221,1
N-Adoc-D/L-(4-Amidino)-Phenylalanin-Methylester Hydrochlorid (93):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 92 (50 mg; 0,17 mmol) mit Adoc-F
synthetisiert wie für Verbindung 84 beschrieben.
Ausbeute: 32 mg (43%); HPLC (Gradient A): tR 9,4 min; ESI-MS: m/z = 400,0
(M+H)+; ber. für C22H29N3O4: 399,2
N-Adoc-L-(3-Amidino)-Phenylalanin-MethylesterHydrochlorid (94):
Die Titelverbindung wurde aus L-(3-Cyano)-Phenylalanin analog zu Verbindung 84
synthetisiert.
6. Experimenteller Teil 116
HPLC (Gradient A): tR 9,6 min; ESI-MS: m/z = 400,0 (M+H)+; ber. für C22H29N3O4:
399,2
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-MethylesterHydrochlorid (95):
Die Titelverbindung wurde aus D-(3-Cyano)-Phenylalanin analog zu Verbindung 84
synthetisiert.
HPLC (Gradient A): tR 8,2 min; ESI-MS: m/z = 400,0 (M+H)+; ber. für C22H29N3O4:
399,2
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (96):
Die Titelverbindung wurde aus D-(3-Cyano)-Phenylalanin analog zu Verbindung 87
synthetisiert.
HPLC (Gradient A): tR 9,0 min; ESI-MS: m/z = 386,0 (M+H)+; ber. für C21H27N3O4:
385,2
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-Propylamid Hydrochlorid (97):
Eine Lösung von Verbindung 96 (50 mg; 0,118 mmol), TBTU (46 mg; 0,142
mmol), HOBt (19 mg; 0,142 mmol) und n-Propylamin (29 µl; 0,354 mmol) in DMF
(2 ml) wurde 3 h bei RT gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde das erhaltene Öl
in AcOEt (20 ml) gelöst. Nach kurzer Zeit bildete sich ein weißer flockiger NS des
Produktes der abzentrifugiert, mit wenig AcOEt gewaschen und im Vakuum
getrocknet wurde.
Ausbeute: 11 mg (20%); HPLC (Gradient A): tR 7,9 min; ESI-MS: m/z = 427,4
(M+H)+; ber. für C24H34N4O3: 426,3
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-Benzylamid Hydrochlorid (98):
Zu einer Lösung von Verbindung 96 (30 mg; 0,071 mmol), Benzylamin (23 µl;
0,213 mmol) und HOBt (11 mg; 0,085 mmol) in DMF (2ml) wurde TBTU (27 mg;
0,085 mmol) zugegeben und die Reaktionsmischung 3 h bei RT gerührt. Nach
Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt (10 ml) aufgenommen, mit 5%
NaHCO3 und H2O gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM abgezogen. Nach
6. Experimenteller Teil 117
Abziehen des LMs wurde das Rohprodukt erneut in AcOEt (1 ml) aufgenommen,
mit 6 M HCl/Dioxan (10 µl) versetzt und mit MTBE gefällt. Das Produkt wurde mit
Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 16 mg (43%); HPLC (Gradient C): tR 6,5 min; ESI-MS: m/z = 475,2
(M+H)+; ber. für C28H34N4O3: 474,3
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-[(2-Phenyl)-1-Ethylamid] Hydrochlorid (99):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 96 (30 mg; 0,071 mmol) mit
Phenethylamin (27 µl; 0,213 mmol) analog zu Verbindung 98 synthetisiert. Nach 3
h Reaktionszeit wurde nochmals TBTU (15 mg; 0,047 mmol) zugesetzt und die
Reaktionsmischung weitere 3 h gerührt um die Reaktion zu vervollständigen. Nach
Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt (10 ml) aufgenommen, 3x mit
5% NaHCO3 und 1x mit 0,5 M HCl gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und das LM
abgezogen. Das Rohprodukt wurde aus i-PrOH/DIPE kristallisiert, mit Ether
gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 10 mg (27%); HPLC (Gradient C): tR 6,8 min; ESI-MS: m/z = 489,4
(M+H)+; ber. für C29H36N4O3: 488,3
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-[2-(4-Hydroxyphenyl)-1-Ethylamid] Hydro-
chlorid (100):
Eine Lösung von Verbindung 96 (30 mg; 0,071 mmol), Tyramin (9,7 mg; 0,071
mmol), TBTU (27 mg; 0,085 mmol) und HOBt (11 mg; 0,085 mmol) in DMF (2ml)
wurde mit TEA (30 µl; 0,215 mmol) versetzt und 3 h bei RT gerührt. Nach
Abziehen des LMs wurde der Rückstand in AcOEt gelöst, 3x mit 5% NaHCO3, 1x
mit 0,5 M HCl und 1x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet
(Na2SO4) und das LM abgezogen. Das Rohprodukt wurde in DIPE suspendiert und
im Ultraschallbad mit einem Tropfen 6 M HCl/Dioxan versetzt. Der NS wurde
abzentrifugiert, mit DIPE nochmals gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 25 mg (65%); HPLC (Gradient A): tR 9,9 min; ESI-MS: m/z = 505,2
(M+H)+; ber. für C29H36N4O4: 504,3
6. Experimenteller Teil 118
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-(4-Cyano)-Benzylamid Hydrochlorid (101):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 96 mit 4-Cyanobenzylamin analog zu
Verbindung 100 synthetisiert und gereinigt.
Ausbeute: 19 mg (51%); HPLC (Gradient A): tR 10,3 min; ESI-MS: m/z = 500,2
(M+H)+; ber. für C29H33N5O3: 499,3
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-(4-N-Hydroxyamidino)-Benzylamid Hydro-
trifluoracetat (102):
Eine Lösung von Verbindung 101 (30 mg; 0,056 mmol),
Hydroxylammoniumchlorid (5,8 mg; 0,084 mmol) und TEA (11,7 µl; 0,084 mmol)
in abs. EtOH (1ml) wurde in einem fest verschlossenen Gefäß über Nacht bei 80 °C
gerührt. Nach Abziehen des LMs wurde das Rohprodukt über präp. HPLC gereinigt
und lyophyllisiert.
Ausbeute: 5 mg (14%); HPLC (Gradient A): tR 8,2 min; ESI-MS: m/z = 533,4
(M+H)+; ber. für C29H36N6O4: 532,6
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Phenylalanin-(4-Amidino)-Benzylamid Hydrotrifluoracetat
(103):
Die Titleverbindung wurde durch katalytische Hydrierung von Verbindung 102 (4
mg; 0,006 mmol) in MeOH (5ml) über Pd/C gewonnen. Nach Abziehen des LMs
wurde das Produkt aus H2O (20 ml) lyophyllisiert.
Ausbeute: 3 mg (90%); HPLC (Gradient A): tR 8,1 min; ESI-MS: m/z = 517,4
(M+H)+ und m/z = 259,2 (M+2H)2+; ber. für C29H36N6O4: 516,4
N-Adoc-D-(3-Amidino)-Pphenylalanin-Glycyl-OBz Hydrochlorid (104):
Die Titelverbindung wurde mit Glycin-Benzylester Toluolsulfonsäuresalz (23 mg;
0,071 mmol) analog zu Verbindung 100 synthetisiert.
Ausbeute: 20 mg (49%); HPLC (Gradient C): tR 6,8 min; ESI-MS: m/z = 533,4
(M+H)+; ber. für C30H36N4O5: 532,3
6. Experimenteller Teil 119
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-(N'-Methoxy-N'-Methyl)-Amid Hydrotrifluor-
acetat (105):
Eine Lösung von N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (80) (100 mg;
0,29 mmol), N,O-Dimethyl-Hydroxylamin Hydrochlorid (28 mg; 0,29 mmol), TEA
(81 µl; 0,58 mmol) und DCC (68 mg; 0,348 mmol) wurde bei RT gerührt. Nach 1 h
wurde nochmals DCC (34 mg; 0,174 mmol) zugegeben. Nach Abfiltrieren des
Dicyclohexylharnstoffs wurde der Rückstand in H2O geöst, mit 1 M HCl auf pH 2,5
angesäuert und 2x mit AcOEt extrahiert. Nach Abziehen des Ethylacetats wurde das
Rohprodukt mittels präparativer HPLC aufgereinigt (Gradient von 5% ACN auf
60% ACN in 60 min.).
Ausbeute: 30 mg (22%); HPLC (Gradient A): tR 5,4 min; ESI-MS: m/z = 351,4
(M+H)+; ber. für C17H36N4O4: 350,2
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-L-Prolyl-OBz Hydrochlorid (106):
Eine Lösung von N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin Hydrochlorid (80) (200 mg;
0,58 mmol), Prolinbenzylester Hydrochlorid (155 mg; 0,64 mmol), TEA (178 µl;
1,28 mmol) TBTU (206 mg; 0,64 mmol) und HOBt (86 mg; 0,64 mmol) wurde bei
RT gerührt. Nach 4 h wurde das LM abgezogen, der Rückstand in AcOEt gelöst
und mit 5% NaHCO3, 0,5 M HCl und H2O gewaschen. Das LM wurde abgezogen
und das Produkt aus iPrOH/DIPE gefällt.
Ausbeute: 170 mg (55%); HPLC (Gradient A): tR 7,8 min; ESI-MS: m/z = 495,4
(M+H)+; ber. für C27H34N4O5: 494,3
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-L-Pro-OH Hydrochlorid (107):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 106 (150 mg; 0,28 mmol) durch
katalytische Hydrierung (10% Pd/C) gewonnen.
Ausbeute: 64 mg (51%); HPLC (Gradient A): tR 5,6 min und 5,9 min
(Diastereomere); ESI-MS: m/z = 405,4 (M+H)+; ber. für C20H28N4O5: 404,2
6. Experimenteller Teil 120
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-D-Pro-OBz Hydrochlorid (108):
Die Titelverbindung wurde analog zu Verbindung 106 mit D-Prolinbenzylester
Hydrochlorid synthetisiert.
Ausbeute: 150 mg (48%); HPLC (Gradient A): tR 9,3 min; ESI-MS: m/z = 495,4
(M+H)+; ber. für C27H34N4O5: 494,3
N-Boc-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-D-Pro-OH Hydrochlorid (109):
Die Titelverbindung wurde aus Verbindung 108 (150 mg; 0,28 mmol) durch
katalytische Hydrierung (10% Pd/C) gewonnen.
Ausbeute: 60 mg (47%); HPLC (Gradient A): tR 7,0 min und 7,3 min
(Diastereomere); ESI-MS: m/z = 405,4 (M+H)+; ber. für C20H28N4O5: 404,2
N-Z-D/L-(3-Amidino)-Phenylalanin-Piperidid Hydrochlorid (110):
Die Synthese und Inhibitionskonstanten der Titelverbindung wurden von Bernhard
Gabriel beschrieben (Gabriel, B. 1998).
Benzamidin Hydrochlorid (111):
Die Titelverbindung wurde von Fluka bezogen.
Benzylcarbamidin Hydrochlorid (112):
Die Titelverbindung wurde aus 2-Phenyl-Acetonitril nach AAV3 synthetisiert.
Ausbeute: (49%); ESI-MS: m/z = 135,2 (M+H)+; ber. für C8H10N2: 134,1
7. Literaturverzeichnis 121
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