detecciÓn de resistencia bacteriana por...
TRANSCRIPT
![Page 1: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/1.jpg)
DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM
POSITIVAS Y NEGATIVAS.POSITIVAS Y NEGATIVAS.
Dra. Norma Velázquez GuadarramaLaboratorio de Investigación en Bacteriología
![Page 2: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/2.jpg)
![Page 3: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/3.jpg)
![Page 4: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/4.jpg)
Antibiótico
Toda sustancia de origen natural osintética con la capacidad de destruir osintética con la capacidad de destruir oimpedir el desarrollo de un organismovivo.
![Page 5: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/5.jpg)
3) Alcanzar el sitio blanco 3) Alcanzar el sitio blanco para ejercer su efecto para ejercer su efecto
1) Concentrarse en el órgano, 1) Concentrarse en el órgano, tejido o células donde se tejido o células donde se encuentren las bacteriasencuentren las bacterias
2) Penetrar en el interior de la2) Penetrar en el interior de labacteria, concentrarse ybacteria, concentrarse ypermanecer activopermanecer activo
![Page 6: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/6.jpg)
• antibióticos naturales: producidos pormicroorganismos (por ejemplo la penicilina)
• antibióticos semi-sintéticos: disponen de unesqueleto producido por microorganismos yesqueleto producido por microorganismos ymodificado químicamente (por ejemplo, laampicilina)
• quimioterápicos: son fármacos totalmente desíntesis creados en el laboratorio (por ejemplo,las sulfamidas)
![Page 7: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/7.jpg)
Clasificación de los antibióticos
• Naturaleza Química
• Mecanismo de Acción
![Page 8: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/8.jpg)
Naturaleza Química
• Beta-lactámicos– Penicilina– Cefalosporinas– Monobactámicos– Monobactámicos– Carbapenems– Inhibidores de Betalactamasas
![Page 9: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/9.jpg)
• Polipéptidos• Aminoglucosidos• Anfenicoles• Tetraciclinas• Macrolidos• Glucopeptidos• Glucopeptidos• Lincosamidas• Sulfonamidas• Inhibidores de la folato redutasa• Quinolonas
![Page 10: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/10.jpg)
En base a su mecanismo de acción
![Page 11: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/16.jpg)
Acción de la Teicoplanina en la Síntesis de Pared Bacteriana
![Page 17: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/17.jpg)
Resistencia Bacteriana
• Pérdida de la sensibilidad de unmicroorganismo a un antimicrobiano alque originalmente era susceptible.que originalmente era susceptible.
• Capacidad de las bacterias dedesarrollar mecanismos para evadirel efecto de los antibióticos a loscuales eran previamente susceptible
![Page 18: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/18.jpg)
• Natural: Cuando todos losintegrantes de una determinadaespecie son resistentes.
• Adquirida: Cuando afecta a algunosintegrantes de una especie pero no ala totalidad.
![Page 19: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/19.jpg)
Resistencia antimicrobiana
Bacteria Susceptible
Bacteria Resistente
Nueva Bacteria Resistente
Transferencia de Genesde Resistance
Centers for Disease Control and Prevention Campaign to Prevent Antimicrobial Resistance in Healthcare Settings
![Page 20: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/20.jpg)
Resistencia adquirida• Cromosómica: se origina por mutaciones
• Extracromosómica
– Plasmidos– Plasmidos
– Trasposones
– Integrones
![Page 21: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/21.jpg)
Mecanismos de transferencia genética
conjugación
Transformación
Transducción
Transformación
![Page 22: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/22.jpg)
The Science Creative Quarterely Jan- March 2007
![Page 23: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/23.jpg)
Disminución de la permeabilidad celular
![Page 24: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/24.jpg)
BOMBAS DE EXPULSIÓN ACTIVA
![Page 25: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/28.jpg)
RESISTENCIA A LA VANCOMICINA EN S. aureus
![Page 29: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/29.jpg)
Identificación y Susceptibilidad
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
![Page 30: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/30.jpg)
Determinación del perfil de susceptibilidad antimicrobiana por la prueba de difusión
con disco
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
![Page 31: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/31.jpg)
Antibióticos activos in vitro sin eficacia clínica
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
![Page 32: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/32.jpg)
Prueba del Doble Disco para determinar Fenotipo “D”
SENSIBLEFENOTIPO cMLS
FENOTIPO iMLSFENOTIPO M
![Page 33: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/33.jpg)
Detección de BLEEs por prueba de doble disco
Disco de la izquierda con 30 µg de CTX y disco central con 20mas 10µg de amoxicilina con ác. clavulánico y a la derechadisco con 30 µg de CAZ, muestran un fenotipo de resistenciaa ambas cefalosporinas
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 1995, p. 557–584
![Page 34: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/34.jpg)
Determinación de la inducción de β-lactamasas AmpC
Cefotaxima
Cefoxitina
![Page 35: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/35.jpg)
E-test para determinación de MBL
Walsh. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2005, p. 306–325
E-test por un extremo imipenem (IP) y en el otro extremo imipenem más EDTA (IPI), reducción de 3 diluciones en la CIM en presencia de EDTA prueba positiva para metalo-ββββ-lactamasa (MBL), recomienda como S. malthophilia
ATCC13636 como control +
![Page 36: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/36.jpg)
Concentración Inhibitoria Mínima
stock
MH
Antibióticos
Solidificar
Inhibición del crecimiento
![Page 37: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/37.jpg)
Lectura e interpretación de Lectura e interpretación de
placasplacas
Oxa 0.25Oxa 0.25µµg/ml Oxa 0.5 g/ml Oxa 0.5 µµg/ml Oxa 1g/ml Oxa 1µµg/mlg/ml
Oxa 2Oxa 2µµg/ml Oxa 4g/ml Oxa 4µµg/mlg/ml
![Page 38: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/38.jpg)
MÉTODOS
Verificaciónde cepas
Susceptibilidad
Método de difusión en disco
• Aislamiento en Gelosa Sangre
• Aislamiento en Gelosa Sal-Manitol
• Catalasa
• Prueba de la Coagulasa
Susceptibilidad Antimicrobiana
Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Prueba del doble disco para determinar Fenotipo “D”
Extracción de DNAIdentificación del gen mecA y
tipificación del SCCmec por PCR-Multiplex
SAMR
Kit de extracción deDNA Genómico Wizard®
![Page 39: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/39.jpg)
Identificación del gen mecA y tipificación del SCCmec por PCR-Múltiplex
Tamaño Amplicón
(pb)Especificidad
613 SCCmec I
398 SCCmec II
280 SCCmec III
776 SCC IVa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tipo II Tipo V776 SCCmec IVa
493 SCCmec IVb
200 SCCmec IVc
881 SCCmec IVd
325 SCCmec V
147 mec A
Tipo IVaGel de agarosa 2%
Tipo II
![Page 40: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/40.jpg)
Claritromicina
Claritromicina
� Mecanismo de acción:� Interfiere en la síntesis de
proteínas, se fija a lasubunidad 50S ribosomal.
� Mutación puntual en elgen 23S rRNA,gen 23S rRNA,principalmente en lasposiciones:
� 2142 (A2142 a G/C/T).� 2143 (A2143 a G/C).
![Page 41: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/41.jpg)
Condiciones de Amplificación gen 23S
PCR
Desnaturalización 94ºC ----- 30s
Alineamiento 50ºC ----- 30s
Extensión 72ºC ----- 60s
30 ciclos
Condiciones de digestión Bsa I
Enzima Bsa I 5U
DNA Amplicon 5µg55ºC / 1 hora
![Page 42: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/42.jpg)
Micromarker DNA
298
434
458
pb15001000
900800700600500
400
300
100 pb promega1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
80
102
174
298200
100
![Page 43: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/43.jpg)
![Page 44: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/44.jpg)
Tetraciclina
� Mecanismo de acción:� Inhibe la síntesis de
proteínas por la unión ala subunidad 30Sribosomal y bloqueandoel sitio de unión deltRNA-aminoacil.
Tetraciclina
tRNA-aminoacil.
� Mutaciones porsustitución y delecionesen el rRNA 16S,involucra lasposiciones:
� AGA 926-928 TTC
![Page 45: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/45.jpg)
Identificación de mutaciones en el gen 16S del rRNA
GEN OLIGONUCLEÓTIDOS AMPLIFICADO
16S 16S-880fw 5-ATAGACGGGGACCCGCACAAG-3
16S-999rv5-TGGCAAGCCAGACACTCCA-3
120 pb.
Condiciones de PCR:
94ºC/ 15 min. preincubación
95ºC/ 10 seg. desnaturalización
56ºC/ 10 seg. alineamiento 30 ciclos
72ºC/ 10 min. extensión
Amplificados se mandaran asecuenciar para determinarlas mutaciones de losnucleótidos 926 a 928 delgen 16S del rRNA.
(Glocker E. et al, 2005)
![Page 46: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/46.jpg)
frxA
Metronidazol
� Mecanismo de acción:� Produce pérdida de la
estructura helicoidal del DNA,inhibición de la síntesis deácidos nucleicos y muertecelular.
� Mutaciones sin sentido(deleciones o inserciones) en(deleciones o inserciones) enel gen rdxA y frxA quecodifican paranitrorreductasas.
� Dos tipos de cepasresistentes aquellas querequieren solo la inactivaciónde rdxA y aquellas querequieren de la inactivaciónde rdxA y frxA
![Page 47: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/47.jpg)
Identificación de los genes rdxA y frxA
GEN OLIGONUCLEÓTIDOS AMPLIFICADO
rdxA
frxA
rdxA-F5-GCAGGAGCATCAGATAGTTCT-3
rdxA-R5-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3
frxA-F5-GGATATGGCAGCCGTTTATCATT -3
frxA-R
886 pb.
780 pb.frxA-R
5-GAATAGGCATCATTTAAGAGATTA-3
Condiciones de PCR:
94ºC/ 2 min. preincubación
95ºC/ 4 seg. desnaturalización
58ºC/ 40 seg. alineamiento 30 ciclos
72ºC/ 1 min. extensión
72ºC/ 10 min. extensión final
Jeong J.Y et al, 2000, Jeong J.Y et al, 2001
Mutación no habrá amplificación de los genes.
Sin mutación amplificación de los genes.
![Page 48: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/48.jpg)
CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS A EMPLEAR
• E. faecalis ATCC 29212• GENTAMICINA 4-16 µg/mL• VANCOMICINA 1-4 µg/mL• OXACILINA 8-32 µg/mL• OXACILINA 8-32 µg/mL• HLRA sensible (gentamicina 500 µg/mL, HLRA estreptomicina 200 µg/mL)
• E. faecalis ATCC 59212• HLRA resistente • VancomicinaR 6 µg/mL en BHI
![Page 49: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/49.jpg)
Oligonucleótidos para la amplificaciónpor PCR de Enterococcus resistentes aelevados niveles de Gentamicina yEstreptomicina
GEN SECUENCIAProducto
amplificado (pb)Referencia
GEN SECUENCIA amplificado (pb)Referencia
aac(6’)-Ie
aph(2’’)-Ia
(Gm)
5´-TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT-3´
5´-CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT-3´1,395
Suk-Kyung Lim,Koichi Tanimoto,
ant(6’) (Sm)5´-ACT GGC TTA ATC AAT TTG GG-3´
5´-GCC TTT CCG CCA CCT CAC CG-3´597
Udo, E. E., N. Al-Sweih,
![Page 50: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/50.jpg)
Ciclo Temperatura Tiempo No. Ciclos
Desnaturalización 94° C 5 min. 1
Condiciones de la PCR para los genes
ant (6’)(Sm) y aac (6’)- aph (2’’) (Gm)
Desnaturalización inicial
94° C 5 min. 1
Desnaturalización 94° C 1min.
30Alineamiento 47° C 1min.
Extensión 72° C 1min.
Extensión final 72° C 5min. 1
**El almacenamiento es a 4°C
![Page 51: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/51.jpg)
Electroferograma de los productos de la PCR para los genes ant (6’) y aac (6’)- aph
(2’’) de cepas HLRA
M C(-) C(+) C(-) C(+) 1 2 3 4 5 6(Sm) (Sm) (Gm) (Gm)
2000
3000
1395 pb1000
500
100
Fig 11. Ensayo de PCR para cepas HLRA. Línea M; MPM; línea C(-) ATCC 59212; línea C(+), ATCC 29212; lineas nones son cepas HRLA aac (6’)- aph (2’’) (+) ; líneas pares son cepas HLRA ant (6’) (+).
597 pb(Sm)
1395 pb(Gm)
![Page 52: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/52.jpg)
• Obtención cepas (gram, catalasa, 6.5%NaCl)
• “over.night”
• Extracción de DNA total (kit Wizard® de Promega)
• Amplificación por PCR
Oligonucleótidos para la amplificación por PCR de los genesvanA y vanB de cepas de enterococos VancomicinaResistentes
GEN SECUENCIAProducto
amplificado (pb)Referencia
Van A5'- CAT GAA TAG AAT AAA AGT TGC AAT A - 3'5'- CCC CTT TAA CGC TAA TAC GAT CAA - 3'
1,030 Clark, N. C.,
Van B5’GTG ACA AAC CGG AGG CGA GGA 3’5’CCG CCA TCC TCC TGC AAA AAA 3’
433 Clark, N. C.,
Resistentes
![Page 53: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/53.jpg)
PROGRAMACIÓN PARA GENES Van A.
Ciclo Temperatura Tiempo No. Ciclos
Desnaturalización inicial
94° C 5 min. 1
Condiciones de la PCR para el gen vanA y vanB
inicial
Desnaturalización 94° C 1min.
30Alineamiento 55° C 1min.
Extensión 72° C 1min.
Extensión final 72° C 5min. 1
**El almacenamiento es a 4°C
![Page 54: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/54.jpg)
Electroferograma de los productos de la Electroferograma de los productos de la amplificación por PCR para los genes amplificación por PCR para los genes vanAvanA y y
vanBvanB
1000
500
200
100
3000
433 pb.
vanB
1 2 3 4 C(+) C(+) 7 8 M
Pie de figura
1,030 pb.
vanA
500
200
100
3000
400
Fig10. Ensayo de PCR para cepas EVR . Línea M; MPM; línea C(+), ATCC 29212; línea 3, capa EVR con vanB (+); lineas 4,7,8 cepas EVR con vanA (+); líneas restantes vanA y vanB (-)
![Page 55: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/55.jpg)
Macrorestricción con enzima NotI empleando PFGE
Cepa microbiana
37°C/ 3 días
Cepa 1. Lavado con sol. salina EDTA,
(1min. 5000 rpm) y decantar
2. Agregar 1ml. de sol. PIV (TRIS-HCl 2M (pH 7.6) + NaCl 5M+ agua destilada estéril)
37°C/ 3 días
Bloques al 2%
Agarosa de bajo punto de
fusión
adicionar a los bloques
Agregar 1ml de sol. de lisis EC
Incubar/ 1 hr.
(Hosaka Y. et al, 2005)
![Page 56: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/56.jpg)
Decantar la solución
agregar 1ml de sol. ES
Sol. ES: EDTA (pH 9-9.5)0.5M + Proteinasa K + sarcosil 20%
Incubar a 50°C/ 48hrs
Decantar la sol. ES
Agregar regulador TEconteniendo sol.fluorada defenilmetilsulfonil.
Incubar a temp. ambiente/ 4 hrs.
Hacer 3 lavados con TE por 10 min. c/u
Incubar a tem. ambiente/20 Decantar la sol.
Corte de los bloques de
agarosa
Sol. Tris-EDTA
ambiente/20 min.
PFGE
fragmentos de 40 a 20 kb a 9 V/cm a 14ºC /30 hrs/ 11 min.
fragmentos de 20 a 10 kb a 9 V/cm a 14ºC /26 hrs/ 3 min.
Buffer TBE 0.5 X
Decantar la sol.
Incubar con regulador de la enzima NotI/ 30 min.
Incubar a 37ºC/ 16 hrs. con 50U de NotI
![Page 57: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/57.jpg)
Pseudomonas aeruginosa
multirresistentes
28H 116D 356H 379U 382D 452H 437H 438H 483H 498H 668H 672H 845H 925H
291
339.5388436.5
48.5
97
145.5
194
242.5
291
Foto gel de agarosa 1.2% de P.ae digeridas con enzima Spe I
![Page 58: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/58.jpg)
![Page 59: DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR …himfg.com.mx/descargas/documentos/epidemiologia/resistenciabac.pdf · MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS. Dra](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022051508/5abec3597f8b9ac0598d9301/html5/thumbnails/59.jpg)
Marcador
397U Liof
397U 4ºC
397U ºT amb
4U ºT amb
197UºT amb
4U 4ºC
4U Liof
197U 4ºC
197U Liof