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Artculo de revisinBiologa molecular

Deteccin e identificacin de bacterias causantesde enfermedades transmitidas por alimentos mediante

la reaccin en cadena de la polimerasaRafael Antonio Rojas-Herrera, Tania Gonzlez-Flores*

* Unidad Sureste. Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco, A. C. Av. Normalistas 800 S.H.Colinas de la Normal. Guadalajara, Jalisco, Mxico.

Correspondencia:Dr. Rafael Antonio Rojas-Herrera. Unidad Sureste. Calle 30 Nm. 151 x 7 y 7-A. Colonia Garca Giners. Mrida, Yucatn, Mxico.97070. e-mail: rrojas@ciatej.net.mx

Recibido: 02-06-2005Aceptado: 07-02-2006

RESUMEN

La lucha contra los microorganismos patgenos, causantesde enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) requierede procedimientos adecuados de inspeccin sanitaria, lo queha llevado al desarrollo de mtodos cada vez ms rpidos yefectivos para la deteccin e identificacin de bacterias noci-vas en las reas en las que la seguridad biolgica es de mu-cha importancia. Las tcnicas de identificacin basadas enel cultivo y las caractersticas fenotpicas de las bacteriasson laboriosas y pueden requerir varias semanas para obte-ner resultados, lo cual no resulta viable cuando se analizanalimentos perecederos como los lcteos y la carne fresca. Laaplicacin de mtodos de deteccin independientes de culti-vo, como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) pue-de ayudar a resolver los problemas antes mencionados, auncuando es necesario que estos mtodos cuenten con una va-lidacin internacional. En el presente trabajo se revisa lautilidad, ventajas y desventajas de la PCR como herramien-ta para la deteccin e identificacin de bacterias patgenasen muestras de alimentos, as como las nuevas tendenciasen el uso de estas herramientas moleculares de diagnsticoy los esfuerzos actuales tendientes a su estandarizacin in-ternacional.

Palabras clave: PCR, deteccin, bacterias patgenas, ali-mentos.

INTRODUCCIN

Las bacterias pueden ocasionar enormes prdidas eco-nmicas no slo porque deterioran los productos ali-menticios, sino que, adems, algunas patgenas re-

ABSTRACT

Struggle against food-borne pathogenic microorganismsis based on plausible policies for sanitary inspection, thusleading to the development of faster and more effectivemethods for detecting and identifying hazardous bacteriain those areas where biological hazard pose a securityproblem. Identification techniques based on culture me-thods and phenotypic characteristics of bacteria are tediousand can overtake weeks, making them unpractical for ana-lyzing perishable foodstuff such as dairy, meat, poultryand fish. The application of culture-independent methodssuch as the polymerase chain reaction (PCR) can help tosolve this problem. Current efforts are aimed to the esta-blishment of international standards for the application ofPCR-based methods for the detection of pathogenic bacte-ria in foods. In this paper, the usefulness and advantages/disadvantages of PCR as a tool for the identification ofpathogenic bacteria in foodstuff, as well as the new trendsof its application and current efforts toward internationalstandardization of protocols are reviewed.

Key words: PCR, detection, pathogenic bacteria, food.

sultan extremadamente difciles de eliminar de los ali-mentos, lo que origina diversas enfermedades en losconsumidores.

Una de las principales fuentes de contagio con bac-terias patgenas es el consumo de alimentos contami-

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Rafael Antonio Rojas-Herrera y col. MG

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nados, entre los que se pueden mencionar pescados ymariscos,1-4 productos crnicos y avcolas, productoslcteos, vegetales,5 huevos frescos6 e incluso la miel deabeja.7 Se ha demostrado que los alimentos se puedencontaminar durante su procesamiento o por el empleode materia prima contaminada pues algunas de estasbacterias constituyen parte de la flora normal de aves,cerdos y ganado. Tambin se ha sugerido la posibili-dad de contaminacin en alimentos deshidratados, de-bido a un manejo domstico inadecuado.8

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA)continan siendo una amenaza a la salud pblica entodo el mundo y son una causa importante de morbi-lidad. Aunque la mayora son leves y se asocian a sn-tomas gastrointestinales agudos tales como diarrea yvmito, en algunas ocasiones la ETA es mucho mssevera y peligrosa para la vida, especialmente en ni-os, y la infeccin puede ocasionar enfermedades cr-nicas.5

En el presente trabajo se revisa la utilidad, venta-jas y desventajas de la PCR como herramienta parala deteccin e identificacin de bacterias patgenasen muestras de alimentos, as como las nuevas ten-dencias en el uso de estas herramientas molecularesde diagnstico y los esfuerzos actuales tendientes asu estandarizacin internacional.

ETIOLOGA DE LAS ETA

En aos recientes, la etiologa de las ETA ha cam-biado, a la vez han surgido patgenos nuevos o cepasms agresivas y resistentes a los antibiticos. Entrelas enfermedades que son catalogadas como emergen-tes se incluyen la ocasionada por Escherichia coli en-terohemorrgica (particularmente el serovarO157:H7), Campylobacter jejuni y Salmonella typhi-murium del tipo definitivo (DT) 104.5 Las bacteriasms frecuentemente asociadas a casos de infeccionespor consumo de alimentos contaminados aparecenenlistadas en el cuadro I. La participacin de E. colien las enfermedades humanas ha sido reconocidaprcticamente desde su descubrimiento. En aos re-cientes la industria de alimentos ha reenfocado suatencin sobre este microorganismo como una causade morbilidad y mortalidad significativa y reconocesu valor como un indicador del estado higinico demuchos tipos de alimentos. Por esa razn, E. coli esuno de los patgenos que mayor atencin han recibi-do y hacia las cuales se ha dirigido la mayor parte delas investigaciones.

La cepa de E. coli productora de la toxina Shiga(STEC), tambin conocida como E. coli verotoxigni-

ca, fue descubierta a finales de los aos 70 en Cana-d. Por otra parte, la cepa enterohemorrgica (EHEC)O157:H7 se aisl por primera vez en 1975 y se identi-fic en 1982 como un patgeno importante presenteen los alimentos.9 Estas bacterias, adems de las cito-toxinas, pueden producir otros factores virulentoscomo la intimina, la hemolisina y protenas asocia-das a la virulencia.10,11

De acuerdo al Servicio de Inspeccin y SeguridadAlimenticia (FSIS: Food Safety Inspection Service)del Departamento de Agricultura de los Estados Uni-dos (USDA), la presencia de al menos 1 unidad for-madora de colonias (UFC) de E. coli O157:H7 en lacarne molida de res constituye un factor de riesgopara el consumidor,12 lo que implica entonces dispo-ner de mtodos con niveles de sensibilidad adecuadosa estas exigencias.

Por otra parte, este microorganismo continasiendo un desafo a la seguridad alimenticia debido ala amplia diversidad de tipos dentro de la especie, quevan desde comensales inofensivos hasta patgenoshumanos. Esta misma situacin se observa entre lasespecies del gnero Vibrio con algunas cepas que sonutilizadas como probiticos en la alimentacin de ca-marones,13 mientras que Vibrio cholerae es el agentecausal del clera que puede transmitirse a los huma-nos por el consumo de pescado o mariscos contami-nados. En otros gneros, como Bacillus14 y Enteroc-cocus,15 tambin se incluyen bacterias tiles en laproduccin de alimentos y patognicas para los sereshumanos.

DETECCIN DE PATGENOSEN ALIMENTOS

La deteccin y la enumeracin de microorganismos enalimentos o en superficies que tienen contacto con ali-mentos constituyen una parte importante de cualquieresquema de control de calidad. Debido a esto es nece-sario implementar tcnicas de deteccin para efectuarla vigilancia y el control de dichos microorganismos yprevenir las enfermedades que stos producen. El esta-blecimiento de medidas de control apropiadas requierede mtodos confiables de diferenciacin entre bacteriaspatgenas y no patgenas, as como de bacterias ubi-cuas presentes en el suelo, el agua y el tracto gastro-intestinal,16 lo cual implica que deben ser rpidos ysensibles pero sobre todo altamente especficos.

El inters general en los mtodos alternativos dedeteccin y/o cuantificacin de microorganismos hasido estimulado en parte por el incremento en la pro-duccin de alimentos y por la aplicacin de procedi-

Deteccin e identificacin de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos

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edigraphic.commientos de anlisis de riesgos e identificacin y con-trol de puntos crticos (ARICPC) por parte de las em-presas productoras.17

Los avances en la instrumentacin e implementa-cin de los descubrimientos de la bioqumica y la bio-loga molecular permiten utilizar la informacin ge-ntica de los microorganismos como herramientas de

identificacin y cuantificacin de aqullos de interspara el hombre. Entre estos mtodos destacan la re-accin en cadena de la polimerasa (PCR).

La invencin de la reaccin en cadena de la poli-merasa18 permite la amplificacin selectiva de secuen-cias especficas de ADN que se encuentran en canti-dades muy pequeas. Como su nombre indica, se

Cuadro I. Algunos protocolos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa desarrollados para la deteccin e identificacinde bacterias patgenas en alimentos.

Trastorno que Posible producto MtodoMicroorganismo ocasiona portador utilizado Secuencia blanco Referencia

Arcobacter spp. Diarrea, bacteremia Carne de aves ERIC-PCR, GenesRAPD-PCR 16S y 23S. 50

Bacillus cereus Diarrea, vmitos Arroz, especias, PCR simple Gen gyr B (girasa),productos lcteos y enterotoxinas ycrnicos hemolisina. 35

Campylobacter Diarre