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Detección de Salmonella en
alimentosAguirre Coria Claudia Corona Leo Lizbeth Sandra Olvera Rodríguez Carlos Flores Juárez Geovani Espinosa Monsalvo Maribel
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Objetivo:
Conocer las técnicas más comunes para la detección de estos microorganismos patógenos.
Medios que se utilizaran:• Agua peptonada.• Caldo lisina desoxicolato XLD.• Agar verde Rapapport Vassiliadis.• Agar xilosa brillante.
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Medios para la identificación
bioquímica.
• Agar triple azúcar hierro TSI.• Agar lisina descarboxilasada LIA.• Agar citrato de Simmons.• Caldo urea.
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Procedimiento
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1.-Preenriquecimiento:
Transferir 25g o 25ml del matraz con 225ml de agua peptonada, incubar a 35º C durante 24 h.
Agua peptonada
•Asegura a mantener el pH durante 24horas, lo que sumado al período de incubación permite el incremento de células que son sensibles a la disminución del pH. •A éstos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten las sustancias inhibidoras que están presentes en algunos alimentos; asimismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.
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2.-Enriquecimiento:
Transferir 0.1ml del cultivo anterior a un tubo con 9.9ml de caldo Rapapport Vassiliadis. Incubar 24 h a 42 º C.
Caldo Rapapport Vassiliadis
• Las peptonas proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo.
• El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio osmótico. • El verde de malaquita y el cloruro de magnesio, favorecen el
crecimiento de Samonella. • El fosfato de potasio controla el pH del medio.
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3.- Aislamiento:
Sembrar por estría simple dos placas de agar XLD Y BGA. Incubar 24 h a 37 º C.
Precipitado negro en el centro de las colonias
agar XLD
Las colonias típicas de Salmonella son
traslúcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo
brillante.
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• La presencia del desoxicolato de sodio es el agente que inhibe a los microorganismos Gram positivos.
• La xilosa es fermentada por casi todos los microorganismos entéricos a excepción de Shigella.
• La lactosa y la sacarosa inducen la producción de ácido por los coliformes.
• El tiosulfato de sodio y el citrato férrico de amonio constituyen el sistema indicador de la formación de ácido sulfhídrico produciendo un precipitado negro en el centro de las colonias.
• Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter y algunas especies Proteus pueden utilizar mas de un carbohidrato y producen colonias amarillo brillante.
• El género Salmonella desarrolla colonias rojas con centro negro por la producción de ácido sulfhídrico.
• Shigella, Providencia, y algunas especies Proteus no utilizan ningún carbohidrato y desarrollan colonias traslucidas. Citrobacter desarrollas colonias amarillas con centro negro.
Agar xilosa lisina desoxicolato XLD
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Agar verde brillante BGA
• Medio selectivo para el aislamiento de Salmonella (excepto S. Tyfhi y Shigella)• La selectividad de este medio, se basa en la concentración del
verde brillante, que inhibe las bacterias Gram positivas y la gran mayoría de los Gram negativos.
• La lactosa y la sacarosa permiten diferencia la flora acompañante lactosa positiva y lactosa negativa-sacarosa positiva, basándose en características de Salmonella de no degradar dichos carbohidratos.
• Las colonias típicas de Salmonella son traslúcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante.
• Los organismos fermentadores de lactosa y sacarosa que desarrollan en el medio se diferencian fácilmente por la formación de colonias amarillo verdosas rodeadas de una zona amarillo verdosa intensa.
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4.- Identificación bioquímica:
Seleccionar al menos 2 colonias típicas sospechosas que se encuentren bien aisladas de cada placa. Transferir con un asa cada colonia seleccionada a la siguiente serie de tubos.
• Agar TSI: Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.
• Agar LIA: Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.
• Agar Citrato de Simmons: Sembrar por picadura el fondo y por estría el la superficie.
• Caldo urea: Inocular el caldo.
Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas a 35o C por 24 h. comprobar los resultados de las pruebas con la tabla de
resultados de los microorganismos enteropatógenos.
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Agar triple azúcar de hierro TSI
• Para diferenciación de Enterobacterias basándose en las capacidad para utilizar la glucosa, lactosa y sacarosa los cual permite el reconocimiento y exclusión del genero Proteus. Se puede observar formación de sulfuros.
• La fermentación de la lactosa y sacarosa se observa en la superficie y de la glucosa en el fondo, con formación de ácido que se manifiesta por cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo.
• La combinación del citrato férrico de amonio y tiosulfato de amonio permite la detección de sulfuro de hidrogeno por la formación de un precipitado negro.
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Agar lisina descarboxilasa LIA
• La peptona de gelatina funciona como soporte de crecimiento, el extracto de levadura proporciona la fuente de vitaminas necesarias y la dextrosa el carbohidrato fermentable.
• En este medio se observa la fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico, la descarboxilación u desaminación de la lisina.
• Los microorganismos tienen enzima descarboxilasa, descarboxilan el aminoácido lisina a cadaverina (amina primaria, liberando CO2) , debido a la alcalinidad, el pH se modifica con los siguientes resultados: La prueba se considera POSITIVA si la coloración en el fondo se observa morada o violeta-púrpura.
• NEGATIVA si la coloración en el fondo es amarilla y la superficie permanece del color del medio, ya que solo hay fermentación de glucosa.
• La desaminación de la lisina a ácido cetocarbónico, este forma compuestos pardo-rojizos en el pico de flauta del medio con la sal de hierro y por la acción del oxigeno.
• La formación del ácido sulfhídrico da una coloración negra debida al sulfuro de hierro producido.
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Agar Citrato de Simmons
• Para la identificación de Enterobacterias, basándose en el citrato como única fuente de carbono.
• El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico del medio.
• Cuando las bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia de color inicial verde (neutro), que esta dado por la presencia de azul de bromotimol a color azul (alcalino, prueba positiva)
• La reacción negativa se manifiesta por la ausencia de crecimiento y no hay cambio de color.
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Caldo urea• Utilización de urea como fuente de
carbono.• La enzima ureasa hidroliza la urea en
amoniaco y anhídrido carbónico, ante la variación del pH por la alcalinización el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.
• Se utiliza solamente para la detección de la ureasa en especies del género Proteus.
• Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes que la bacteria muestre crecimiento no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar urea.
• Pero si es capaz de hidrolizar la urea, pero no utilizar el amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y puede dar un falso negativo.
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Caldo Rapapport Vassiliadis
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Cloruro de magnesio hexahidratado. 29.0• Peptona de caseína. 4.0• Cloruro de sodio. 8.0• Peptona de soya. 1.0• Fosfato monobásico. 0.4• Verde de malaquita. 0.036
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Agar xilosa lisina desoxicolato XLD
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Agar. 13.5• Citrato férrico.
0.8• Cloruro de sodio. 5.0• Desoxicolato de Na. 2.5• Extracto de levadura 3.0• Lactosa.
7.5
• L-Lisina. 5.0• Rojo fenol. 0.085• Sacarosa. 7.5• Tiosulfato de Na. 6.8• Xilosa. 3.5
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Agar verde brillante BGA
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Agar. 20.0• Cloruro de Na. 5.0• Extracto de carne.3.0• Lactosa. 10.0
• Peptona especial. 10.0• Rojo de fenol. 0.08• Sacarosa. 10.0• Verde brillante. 0.0125
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Agar triple azúcar de hierro TSI
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Agar. 13.0• Cloruro de Na. 5.0• Dextrosa. 1.0• Lactosa. 10.0• Peptona especial. 20.0
• Rojo de fenol. 0.025• Sacarosa. 10.0• Sulfato de hierro y
amonio. 0.2• Tiosulfato de Na. 0.2
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Agar lisina descarboxilasa LIA
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Agar. 13.5• Citrato férrico de amonio. 0.5• Dextrosa. 1.0• Extracto de levadura. 3.0• L-Lisina. 10.0• Peptona de gelatina. 5.0• Púrpura de bromocresol. 0.02• Tiosulfato de Na. 0.04
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Agar Citrato de Simmons
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Agar. 15.0• Azul de bromotimol. 0.08• Citrato de Na. 2.0• Cloruro de Na. 5.0• Fosfato dihidrogenado de amonio. 1.0• Fosfato dipotásico. 1.0• Sulfato de magnesio. 0.2
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Caldo urea
FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA
• Extracto de levadura. 0.10• Fosfato monopotásico. 9.10• Fosfato disódico. 9.50• Rojo de fenol. 0.01• Urea. 20.0