Deteccin de virus entricos en muestras de aguaMateriales NaOH 0.05 M Compresor (TOOLCRAF ) Tanque Cornelius Mangueras (Parker Parflex series U 12 mm OD x 2 mm wall, 8.6 Bar). Porta filtros de 47 mm de dimetro (Millipore) Membrana electropositiva Virocap de 47 mm caja petri eluyente (extracto de carne 1%, glicina 0.5M, Tween 80 0.1M a pH 9) centrifuga amortiguador PBS 1X trizol cloroformo Isopropanol Etanol absoluto Agua inyectable bromuro de etidio agarosa

MetodologaMuestreoLa muestra se toman a una profundidad de 15 a 30 cm de la superficie del agua con las manos lavadas con agua y jabn hasta la altura del codo; en envases estriles de vidrio o plstico que se abrirn hasta sumergirse dentro del agua y se cerrarn antes de sacarse del agua. Los envases se colocarn en hielo para mantener la temperatura baja y evitar la reproduccin de bacterias y se trasladarn a las instalaciones del laboratorio, donde se mantendrn en refrigeracin (4C 1C) hasta su anlisis. Cada muestra se filtrara antes de analizar cada punto de la toma de muestra.

Sanitizacin y acoplamiento del sistema de filtracinAplicar un flujo de desinfeccin con 500 ml de NaOH 0.05 M y lavar el sistema con cinco Litros de agua destilada. Los portafiltros (Millipore) y los conectores metlicos deben ser tratados en autoclave al comienzo de la filtracin (Soto. 2012). El sistema filtracin-captura de manufactura domestica se fabricara utilizando un compresor (TOOLCRAF ) a un tanque Cornelious mediante mangueras (Parker Parflex series U 12 mm OD x 2 mm wall, 8.6 Bar). En el otro extremo de la parte superior del tanque se acoplara a un porta filtros de 47 mm de dimetro (Millipore) Captura y concentracin viral Para la captura de partculas virales cada muestra se agitara y se filtrara travs de una membrana electropositiva Virocap de 47 mm (Scientific Methods) de acuerdo al procedimiento descrito por Soto, 2012 y Moreno, 2014. El porta filtro se desacoplara del sistema de filtracin y se pasara la membrana a una caja de petri. Se agregara un volumen de 15 mL de eluyente (extracto de carne 1%, glicina 0.5M, Tween 80 0.1M a pH 9) que retenga las partculas. La caja se sometera a una agitacin por diez min a 60 rpm, para posteriormente ajustar el pH de 3.5 y se agregaran 0.3g de extracto de carne para precipitar los virus (Katzenelson, 1976). La suspensin se agitara por 20 min, para pasarlo a tubo cnico y centrifugarlo a 4C a 12000 rpm por 30 min, posteriormente decantar y se Resuspender la pastilla con un ml de amortiguador PBS 1X y se congelo a -0C.

Extraccin de RNA por el mtodo de Trizol EL concentrado se descongela y se centrifuga a 12, 000 rpm por 5 minutos a 4C, se toman 300 L y se transfirieren a un tubo nuevo. S le agregaran 700 L de trizol y se homogeniza en lapsos de 3 a 5 seg 10 veces. Se deja reposar en hielo durante 5 min y se le adicionan 200 L de cloroformo. Posteriormente se homogeniza y se deja reposar en hielo por 3 min para luego centrifugarse a 4 C por 15 minutos a 12,000 rpm. La fase acuosa se transfirie a un tubo nuevo y se le adiciono 400 L de isopropanol y se dejo toda la noche en congelacin. Luego se centrifug a 4 C por 15 minutos a 12,000 rpm, se descarta el sobrenadante, se lava con un ml de etanol absoluto, finalmente se seca en la campana de flujo laminar por 15 minutos. Se re suspende la pastilla en 20 L de agua inyectable y se guarda a -20 C. (Chomezynsky y col. 1987).

PCR mltiple para Norovirus y Rotavirus Para la PCR se agreg 0.5 L de cDNA de Rotavirus con 2.5 de Norovirus a una mezcla de reaccin (15 L) que contena amortiguador para PCR 1X (Bioline), MgCl2 (Bioline) a 1.6mM, 0.5M de cebador FW para Rotavirus y 0.75 M de cebador FW para Norovirus (tabla II) ,0.04 mM de Desoxinucleosidos de trifosfato (dNTP), 25 U de Taq polimerasa (Promega) y agua. Los ciclos se realizaron de la siguiente forma; 5 min a 94 C para desnaturalizacin inicial, 40 ciclos de 1 min a 94 C, 30 s 40 C y 1 min 72 C; para extensin final 5 min a 72 C. Electroforesis en gel de agarosa 1% Se disolvi 0.6 gr de agarosa en 60 mL de buffer TBE 1X. Se calent para clarificarlo y al enfriarse se le adiciono 6 L de bromuro de etidio (1 mg/mL). Se vaci la agarosa en el portagel, se le coloc el peine y se dej polimerizar alrededor de 30 minutos. La cmara de electroforesis se llen con buffer TBE 1X. Se coloc el gel en la cmara y se carg cada pozo con tres L de muestra y dos L de buffer de carga 5X. Se corri el gel a 70 volts durante 70 minutos para finalmente visualizarse en el programa KODAK 1D 3.6.