1. OSTRAVSK UNIVERZITA V OSTRAV FAKULTA PRODOVDECK KATEDRA BIOLOGIE A EKOLOGIE Detekce pokozen DNA pomoc PCR BAKALSK PRCE 2009 Autor prce: Eva KlemensovVedouc prce: RNDr. Petr Peinka, CSc.

2. Obsah

Cle

vod

• Kov struktura DNA

• PCR

• Pirozen metylace DNA

• Alkylan inidla

• Oxidan inidla

Metody

Vsledky

Diskuse

Zvr

Literatura

3. Cle

izolace plasmidov DNA svhodnmi sekvencemi pro metylaci jednoetzcovch nebo dvouetzcovch sek DNA

oven monosti pouit polymerzov etzov reakce pro detekci DNA pokozen metylanmi inidly

pokusit se optimalizovat podmnky pro detekci pokozen DNA

4. vod

pPGM1 a pPGM2 vytvoeny vloenmpalindromatick nukleotidov sekvencedo pBluescript II SK (-) do msta vzniklho tpenmHindIII

pBluescript II SK (-) slou jako kontrola pro srovnn

palindromatick sekvence m schopnost tvoit kovou strukturu u pPGM2, u pPGM1 mn ochotn

Kov struktura DNA

jednoetzcov sek vlsenku(hairpin loop), kde se nave metylov skupina MMS

pi polymerzov etzov reakci dochz v mst metylace kblokaci syntzy DNA

Polymerzov etzov reakce (PCR)

zmnoen DNA nebo jen jej sti

cyklick denaturace pvodnch a syntza novch etzc vybranch sek dvouetzcov DNA prostednictvm termostabiln DNA-polymerzy ztermostabilnch mikroorganism nap.TaqDNA-polymerza

vymezen danho seku dvmaprimery(stejn Tm)

pstrojtermocykler

exponenciln roste (2 n , n = poet cykl) poet kopi vybranho seku

AG A CATG C CTAGGCATGTCT Amp r pPGM2 AG G CATG T CTAGGCATGTCT Amp r pPGM1 - Amp r pBluescript II SK- vloen s ekvence rezistence plasmid 5. Alkylan inidla

metylmetansulfont, etylmetansulfont,

N-metyl-N-nitrosomoovina

Metylmetansulfont (MMS)

inidlo pokozujc DNA, mutagen, karcinogen

vznikN7-metylguaninu a N3-metyladeninu

blokace syntzy DNA pi PCR

vt reaktivita s jednoetzcovou DNA

Pirozen metylace DNA

• bakterie- oznaen vlastn DNA a krozpoznn cizorod DNA (C5- metylcytosin), regulace replikace a postreplikan opravy(N6-metyladenin)

• obratlovci- regulace genov exprese (C5-metylcytosin v CGdubletech)

• rostliny- triplety CNG

6. Oxidan inidla

manganistan draseln, hydroxylov radikly

dvouetzcov DNA oxidovan velmi pomalu, jednoetzcov DNA snadnji

pedevm reakce s thyminem, vsledn produkt m naC5 a C6 navzny hydroxylov skupiny

fagocytujc buky obsahuj OH , m mikrobicidn inek

7.

Pprava bunk pro izolaci plasmidov DNA

Alkalick lyze bunk

odstrann chromozomln DNA a protein vysrenm, centrifugace, slit pes gzu

Nanesen roztoku plasmidov DNA na kolonu QIAGEN

zachycen zporn nabitch nukleovch kyselin na kladn nabitch koncch DEAE (pH 7) vkolon

Modifikace s plasmidov DNA s MMS

vechny koncentrace byly zastoupeny paraleln a inkubovny pi teplot37 C :

• • jedna koncentran ada po dobu5 minut

• • druh po dobu30 minut

Peitn plasmidov DNA

Metody 8. PCR modifikovan plasmidov DNA

Nastaven teplot vtermocykleru:

• poten denaturan fze5 minpi94 C

• dal denaturan fze30 s pi94 C

• hybridizan fze30 s pi60 C

• syntetick60 s pi72 C

Agarzov gelov elektroforza

Obsah PCR zkumavky: 1 lplasmidov DNA (0,3 g/ml pPGM1; 0,4 g/ml pPGM2; 0,8 g/ml pBSK-) 6,5 ldestilovan voda 1 l10x koncentrovanho pufru proTaqDNA-polymerzu 0,5 lTaqDNA-polymerza (5000 U/ml) 0,25 lbu primer T7 nebo B500for +0,25 lbu primer SK nebo B900rev (100M) 0,125 l dATP;0,125 l dGTP;0,125 ldCTP;0,125 ldTTP (10 mM) 9. Vsledky 10. Drha:123456789101112131415 Konc. MMS (mM):01,211,8119,20,65,959,3621,3 0,65,959,3621,31,211,8119,2 Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 10 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drha 1 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-8 : stoupajc koncentrace (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut,drhy 9-15 : stejn stoupajc koncentrace MMS po inkubaci 30 minut. 11. Drha:123456789101112131415 Konc. MMS (mM):01,211,8119,20,65,959,3621,3 0,65,959,3621,31,211,8119,2 Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 15 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drha 1 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-8 : stoupajc koncentrace (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM) MMS po inkubaci 5 minut,drhy 9-15 : stejn stoupajc koncentrace MMS (0,005-5% neboli 0,6-621,3 mM)po inkubaci 30 minut. 12. Drha:1234567891011121314Konc. MMS (M):00,121,312,950,121,312,95 0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 10 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 : stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut, drhy8-13 : stejn stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 13. Drha:1234567891011121314Konc. MMS (M):00,121,312,950,121,312,95 0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 min Modifikace pPGM2 sMMS po 15 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu.Drhy 1,14 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 : stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut,drhy 8-13 : stejn stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 14. Drha:123456789101112131415Konc. MMS (M):00,121,312,950,121,312,95 0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 minModifikace pPGM1 sMMS po 10 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu.Drhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 : stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut,drha 8 : standard (100 bp),drhy 9-14 : stejn stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 15. Drha:123456789101112131415Konc. MMS (M):00,121,312,950,121,312,95 0,060,622,080,060,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 minModifikace pBluescript II SK (-) sMMS po 10 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod, na 1% gelu. Drhy 1,15 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-7 : stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 5 minut,drha 8 : standard (100 bp+1 kb),drhy 9-14 : stejn stoupajc koncentrace MMS (0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3500 bp 3000 bp 2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 750 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 250 bp 200 bp 100 bp 16. Drha:12345678910111213Konc. MMS (mM):0,121,312,950,121,312,95 00,622,080,622,080 Inkubace 5 minInkubace 30 minModifikace pBluescript II SK (-) sMMS po 10 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu.Drhy 1,13 : plasmid bez MMS jako kontrola,drhy 2-6 : stoupajc koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 5 minut,drha 7 : standard (100 bp),drhy 9-12 : stejn stoupajc koncentrace MMS (1-20 % neboli 0,12-2,95 M) po inkubaci 30 minut. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 17. Drha:123456789 Zkouka zneitn na pBluescript II SK(-) a pPGM1 po 30 cyklech PCR Elektroforza probhla pi 80 V, 1 hod a 40 min, na 1% gelu.Drhy 1-4 : pBluescript II SK(-),drha 5 : standard (100 bp),drhy 6-9 : pPGM1.Drhy 1 a 6obsahuj ve (plasmid,TaqDNA-polymerza, pufr, dest.voda, primery, dNTP),drhy 2 a 7 : ve bez primer,3 a 8 : ve bez plasmidu,4 a 9 : ve bezTaqDNA-polymerzy. Neustle byla zjiovna pina krtkch sek, nakonec je vysvtleno, e dvodem je zneitn primer. Ve drhch 2 a 7, kde nejsou obsaeny primery se neobjevuje zneitn. 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp pBluesript II SK(-)pPGM1 18. Diskuse

pPGM2 - sekvence schopn vytvoit kovou strukturu->mon detekce pokozen DNA s MMS

• • metylace vlsenky-> blokace syntzy DNA pi PCR->snen intenzity DNA se zvyovnm koncentrace MMS ve vzorcch

pPGM1 - men schopnost tvorby kov struktury->nezaznamenno pokozen DNA pomoc PCR

• • mal rozestupy mezi koncentracemi a nzk koncentrace MMS nebo nen identifikace pomoc PCR mon

psoben MMS zvisl na ase

• • inkubace 5 minut sMMS pi 37 C - intenzita nasyntetizovanch sek DNAklesala mrnji

• • 30ti minutov inkubace pi 37 C - vt pokles intenzity DNA

u primer vymezujcch krat seky pi stejnch koncentracch MMS nasyntetizovno vce sek DNA - del seky obsahuj vce mst pro metylaci

vpt prci:

• • detekce pokozen DNA s MMS pomoc vce rznch primer vymezujcch rzn dlouh seky DNA a srovnat mezi sebou

• • vt rozestupy mezi koncentracemi MMS a vy koncentrace MMS sclem pokusu o detekci pokozen DNA u pPGM1

• • optimalizace hybridizan teploty

• • proeten metylace udvouetzcovch sek

19. Zvr

izolovny plasmidy pPGM1 a pPGM2, pBluescript II SK(-) pro srovnn

pomoc PCR bylo detekovno pokozen metylmetansulfontem u pPGM2, ne u pPGM1

podmnky pi detekci:

• • primery vymezujc krat seky 140 bz - koncentrace 0,005-5% MMS a tmto koncentracm odpovdajc molrn koncentrace 0,6-621,3 mM MMS

• • pro primery vymezujc del seky 474 bz u pPGM2 - koncentrace MMS 0,5-20 % neboli 0,06-2,95 M

• • inkubace s MMS 5 a 30 minut pi 37 C

• • 10 a 15 cykl pi PCR

• • elektroforetick separace pi 80 Vpo dobu 1 hodiny nebo 1 hodiny a 40 minut na 1 % agarzovm gelu

20. Literatura

Molekulrn biologie 1-7. Metylace, reparace, rekombinace DNA, http://www. google . cz / search ?q=7.%09POSTREPLIKA%C4%8CN%C3%8D+MODIFIKACE+DNA& ie = utf -8& oe = utf -8& aq =t& rls = org . mozilla : cs : official & client = firefox -a , 11. ervna 2009.

WIKIPEDIA The Free Encyclopedia,

http://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_methanesulfonate, 12. ervna 2009.

Lundin, C., North, M., Erixon, K., Walters, K., Jenssen, D., Goldman, A.S.H. and Helleday, T., Methyl methanesulfonate (MMS) produces heat-labile DNA damage but no detectable in vivo DNA double-strand breaks,Nucleic Acids Research, 33, 2005 3799-3811.

WIKIPEDIA The Free Encyclopedia,

http://en.wikipedia.org/wiki/Ethyl_methanesulfonate, 26. dubna 2009.

Rhaese, H.J., Boetker, N.K., The Molecular Basis of Mutagenesis by Methyl and Ethylsulfonates,Eur. J. Biochem., 1973, 32, 166-172.

Wurdeman, R.L., Douskey, M.C. and Gold, B., DNA methylation by N-methyl-N-nitrosourea: methylation pattern changes in single- and double-stranded DNA, and in RNA with mismatched or bulged guanines,Nucleic Acids Research, 1993, 21 4975-4980.

Bui, C.T., Rees, K., Cotton R.G.,Permanganate oxidation reactions of DNA: perspective in biological studies,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22 (9), 2003, 1835-1855.

Peinka, P.,Pouit chemickch sond pi studiu loklnch struktur DNA in vitro a in

situ, kandidtsk disertan prce,Brno, 1993.

Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W., DNA Repair and Mutagenesis . ASM Press, 1995. ISBN 1-55581-088-8.

Peinka, P., Laboratorn cvien zmolekulrn biologie,Ostrava, 2007. ISBN 978-80-7368-414-3.

Paleek, E., Local Supercoil-Stabilized DNA Structures,Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, 1991, 151-226.

Kogo, H., Inagaki, H., Ohye, T., Kato, T., Emanuel, B.S., and Kurahashi, H., Cruciform extrusion propensity of human translocation-mediating palindromic AT-rich repeats.Nucleic Acids Research. 35, 2007, 1198-1208.

Structure of nucleic acids, http:// images . google . cz / imgres ? imgurl =http://web. virginia . edu / Heidi /chapter12/ Images /8883n12_27. jpg & imgrefurl =http://web. virginia . edu / Heidi /chapter12/chp12. htm & usg =__hvefvvfO03eb7LwyYMgRkIUrIcY=&h=189&w=343& sz =10& hl = cs &start=9&um=1& tbnid =x4qpPQQPYqUJHM:& tbnh =66& tbnw =120& prev =/ images %3Fq%3DDNA%2Bcruciform%2Bstructure%26hl%3Dcs%26lr%3D%26client%3Dfirefox-a%26channel%3Ds%26rls%3Dorg. mozilla : cs : official %26sa%3DN%26um%3D1 , 20. dubna 2009.

Vierstraete A. Department of Biology, Faculty of Science, University of Ghett .1999.

Citovno z:Linhartov, P., Molekulrn genetick metody pro studium pbuznosti kmen Acidothiobacillus ferrooxidans, Bakalsk prce,Brno, 2006.

marda, J., Doka, J., Pantek, R., Rikov V., Koptkov, J., Metody molekulrn biologie,Brno, Vydavatelstv MU, 2005. ISBN 80-210-3841-1.

Fermentas LIFE SCIENCES, http://www. fermentas . com / techinfo / nucleicacids / mappbluescriptiiskks . htm , 8. dubna 2009.

WIKIPEDIA The Free Encyclopedia,

http://en.wikipedia.org/wiki/PCR, 19. ervna 2009.

NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/58062?report=genbank, 20. dubna 2009.