determinação de cafeína em bebidas por hplc
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CENTRO PAULA SOUZA
ETEC CONSELHEIRO ANTONIO PRADO
TÉCNICO EM QUÍMICA
ANÁLISE QUÍMICA INSTRUMENTAL
DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (CLAE)
Ana Laura - Nº 02Arnaldo - Nº 04Hosana - Nº 15
Lucas Oliveira - Nº 22Lucas Stefano - Nº 23
3º TD - Noite
CAMPINAS – SP
Maio 2012
CENTRO PAULA SOUZA
ETEC CONSELHEIRO ANTONIO PRADO
TÉCNICO EM QUÍMICA
DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (CLAE)
Requisito para a matériade Análise QuímicaInstrumental, Prof.Paulo Costa
Ana Laura - Nº 02Arnaldo - Nº 04Hosana - Nº 15
Lucas Oliveira - Nº 22Lucas Stefano - Nº 23
3º TD - Noite
CAMPINAS – SP
Maio 20122
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 4
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6
2.1 A Cafeína 6
2.2 O Café 8
2.3 A Coca-Cola 11
2.4 O Refrigerante de Guaraná 13
2.5 Curiosidades: Cafeína 15
2.6 Questão: Por que a cafeína estimula o cérebro humano? 17
2.7 CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) 20
3 PROCEDIMENTO 28
3.1 Determinação de cafeína em bebidas por CLAE 28
4 RESULTADOS 30
5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS 32
6 CONCLUSÃO 34
7 ANEXOS 35
7.1 Figuras e Imagens 35
7.2 Tabelas adicionais 37
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42
3
1 INTRODUÇÃO:
De todas as drogas existentes, a cafeína é a mais consumida no mundo
atualmente. O ser humano aprecia tanto as bebidas que contém esse composto, que uma
das principais refeições diárias foi nomeada em sua homenagem: café da manhã.
As bebidas cafeinadas exercem um fascínio na raça humana desde os primórdios
da civilização. Seus efeitos estimulantes eram conhecidos antes mesmo da invenção da
escrita, e o estudo de seu uso nos remete a uma viagem que vai desde à Pré-História até
a sociedade contemporânea.
A cafeína pode ser encontrada, não somente no café, mas em muitas outras
bebidas como chás, refrigerantes do tipo cola, refrigerantes do tipo guaraná, bebidas
energéticas, chimarrão, milk-shakes, chocolate quente, achocolatados, entre muitas
outras. O consumo da cafeína está de tal forma difundido em nossa sociedade, que a
maioria dos brasileiros adultos consome doses diárias acima de 300 mg, e um grande
número deles são viciados.
Muito se tem discutido sobre o real efeito deste alcaloide no organismo, e muitos
mitos foram criados ao longo dos séculos, muitos advindos da sabedoria popular. Há
algumas questões fundamentais para quem deseja estudar o assunto. Algumas delas são:
o que a ciência sabe atualmente sobre a cafeína? Qual seu efeito no organismo? É
seguro ingerir cafeína? Ela pode causar dependência? Porque essa droga é tão popular?
Qual a quantidade de cafeína presente em alimentos que consumimos diariamente? Essa
quantidade pode causar algum efeito indesejável?
4
Buscar a resposta para essas e muitas perguntas, fornecer dados precisos através
da análise por HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) ou CLAE
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e lançar discussões pertinentes são os
objetivos deste relatório, bem como abordar o real papel da cafeína, descobrindo o
verdadeiro impacto na saúde do ser humano e desmistificando a imagem de vilã
absoluta que foi atribuída a esse composto nas últimas décadas pelos adeptos do viver
saudável, sem contudo subestimar o seu potencial de alcaloide vegetal.
.
5
2 REVISÃO BILBIOGRÁFICA
2.1 A CAFEÍNA
A Cafeína é um alcalóide vegetal presente em plantas do gênero Cola (Cola
nítida, Cola vera, Cola acuminata) plantas da família do café (Coffea arabica e a
Coffea canephora) entre outras.
Entre os vários alcalóides existentes na natureza, encontram-se as metilxantinas,
da qual a cafeína faz parte. Existem 3 metilxantinas particularmente importantes: a
1,3,7-trimetilxantina (cafeína), a 1,3-dimetilxantina (teofilina) e a 3,7-dimetilxantina
(teobromina). Todos são derivados da purina (o grupo xantina é a 2,6-dioxopurina) e
inibem a enzima fosfodiesterase. Teobromina e teofilina são duas dimetilxantinas, com
dois grupos metilas somentes, em contraste à cafeína, que possui três. Ambas têm
efeitos similares à cafeína, porém bem menos acentuados.
A teobromina é encontrada no chocolate, no chá, na noz moscada, mas não no
café. No cacau, a concentração de teobromina é 7 vezes maior do que de cafeína! A
teofilina possui mais efeitos no coração e na respiração, sendo, por isso, mais
empregada em medicamento para asma, bronquite e enfisemas do que a cafeína. É
encontrada, também, no café. No organismo, estes compostos são facilmente oxidados
para o ácido úrico e outros derivados.
A cafeína é um pó branco cristalino muito amargo. Na medicina, esse composto
é utilizado como um estimulante cardíaco e também como um diurético.
A cafeína é conhecida popularmente por fornecer energia rápida, ou uma
acentuação no estado de alerta. Graças a essa fama, milhares de profissionais que
6
travam batalhas contra o sono - motoristas e estudantes, por exemplo - tomam grandes
quantidades de café para permanecerem acordados.
A cafeína é uma droga que causa dependência tanto física como
psicológicamente. Ela opera através de mecanismos similares aos das anfetaminas e da
cocaína. Seus efeitos, entretanto, são mais fracos do que estas drogas, muito embora ela
aje nos mesmos centros receptores do sistema nervoso central (SNC). Sentir
necessidade diária de tomar café pode significar o início do vício.
7
2.2 O CAFÉ
A infusão realizada com as sementes do café torradas é uma das bebidas mais
consumidas no mundo todo. Só no Brasil foram consumidas mais de 17 milhões de
sacas de café em 2007. Mas nem sempre foi assim. No início, até o ano 1.000 d.C., o
café, originário da Etiópia, era usado somente para alimentar os rebanhos durante as
longas viagens, para reduzir a necessidade de descanso que o rebanho possuía. Estava
ali sendo descoberta sua poderosa ação estimulante, conseguida através (entre outros
compostos) da cafeína.
Diz uma das lendas sobre o café que um dia um pastor da Absínia (local que
atualmente chama-se Etiópia), chamado Kaldi, resolveu levar até um monge conhecido
seu, o fruto de uma planta que, segundo ele, deixava o rebanho alegre e disposto quando
a ingeriam, permitindo-os locomover-se por longas distâncias sem descanso. O monge
intrigado resolveu experimentar uma infusão daqueles frutos amarelo-avermelhados e
percebeu que realmente a infusão dos frutos lhe ajudava a ficar mais tempo acordado
durante suas meditações. A partir daí o fruto começou a ser utilizado como alimento cru
e estimulante, mas ainda demoraria um pouco até que seu uso se disseminasse.
Não há corroboração histórica para esse mito, mas o fato é que o café começou a
ser cultivado pela primeira vez em monastérios islâmicos no Yêmen, Península Arábica.
Dali ele foi levado até Constantinopla pelo Império Otomano, local onde foi fundada a
primeira cafeteria do mundo, chamada de Kiva Han.
8
No século XIV, quando chegou ao continente europeu, o café era chamado de
“vinho da Arábia” pois os árabes lhe chamavam de qahwa, que em sua língua significa
“vinho”. Mas o “café torrado como consumimos hoje, só surgiu no século XVI.
O mundo árabe aceitou prontamente a disseminação da nova bebida. Uma vez
que sua religião não permite o consumo de bebidas alcoólicas, o café passou a ser
consumido até mesmo nos cultos religiosos. Desta forma, foram surgindo locais
especializados em servir a bebida, principalmente na cidade de Meca, onde logo foram
surgindo inúmeras Kaveh Kanes, as primeiras cafeterias.
Até o século XVIII o café era considerado uma preciosidade pelos árabes que
sabiam de seu potencial energético e eram os únicos que tinham ciência das técnicas
necessárias para cultivar a planta com sucesso e dominavam a produção da bebida a
partir das sementes.
Mesmo com tanto protecionismo, o café conseguiu romper as barreiras
geográficas e culturais e seu comércio (bebida e grãos) chegou à Europa levada pelos
vienenses que fundaram a Botteghe del Caffé, principal responsável pela popularização
do hábito de torrar e moer o café. Foram os vienenses também, que inventaram o
costume de beber o café coado, adoçado e com leite. Daí vem o nome recebido: café
vienense.
Os habitantes dos Países Baixos foram, contudo, os pioneiros ao levar a planta
até a Europa e a conseguir cultivar as primeiras mudas, vindas de Mokha na Península
Arábica, no jardim botânico de Amsterdã. É igualmente mérito dos holandeses, levar o
café para o novo continente (onde alcançaria sua maior popularidade), para a América
do Norte, na chamada Nova Amsterdã (atual cidade de Nova York) e para o estado da
9
Filadélfia. A partir de então, o café se alastrou rapidamente para o resto do mundo.
Primeiramente para as colônias holandesas em Java, depois, para Sumatra, e então para
as ilhas francesas de Sandwich e Bourbon, até chegar ao Brasil que se tornaria, mais
tarde, o maior produtor mundial de café e um dos maiores consumidores de seus grãos
torrados e moídos.
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2.3 A COCA-COLA
A Coca-Cola foi lançada em 1886, em uma criação de John Pemberton,
farmacêutico de Atlanta, quando ele criou uma bebida com o intuito de curar dores de
cabeça. Levou a bebida a uma farmácia, a Jacob’s Pharmacy, onde o xarope era
misturado com água carbonatada e oferecido pelos clientes pelo valor de US$ 0,05.
Frank Robinson, contador de Pemberton, batizou a bebida de Coca-Cola escrevendo o
nome à mão mesmo.
Cem anos depois, Pemberton vendeu a empresa para Asa Gringgs Candler, sem
ter idéia do sucesso que sua bebida faria. Candler batizou a empresa de “The Coca-Cola
Company” tornando-se o primeiro presidente e o primeiro a dar visibilidade à marca.
Asa Candler rapidamente popularizou a Coca, fornecendo aos farmacêuticos relógios,
balanças e calendários com a marca.
Em 1894, Joseph Biedenharn, tem a brilhante idéia de colocar a bebida em
garrafa, no começo Candler não coloca muita fé, mas anos depois a novidade veio para
ficar até que uma empresa de Indiana inicia a fabricação de garrafas contour
(embalagem de vidro), possibilitando ao consumidor reconhecer a marca até de olhos
vendados.
Robert Woodruff assumiu a presidência da “The Coca-Cola Company” em 1918
quando Candler a vendeu. Ele era um gênio do marketing e fez a bebida se tornar ainda
mais conhecida. Durante a Segunda Guerra Munidal, Woodruff determinou que a Coca-
Cola fosse vendida para todo combatente norte-americano onde quer que ele estivesse a
US$ 0,05. Europeus também experimentaram a bebida, resultando na explosão da
bebida na Europa, logo após a Guerra.
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Até os dias de hoje a Coca-Cola é um sucesso de vendas, com tantas parcerias,
encontra-se em qualquer canto do mundo todo e ainda busca perfeição a cada nova
invenção que cria.
A Coca-Cola tradicional tem em sua composição aromatizantes naturais, água
gaseificada, açúcar, cafeína, extrato de noz de cola, corante caramelo IV, acidulante
ácido fosfórico (INS 338). Não contem glúten e não contém quantidades significativas
de proteínas, gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans e fibras alimentares.
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2.4 O GUARANÁ:
O guaraná, de nome científica Paullinia cupana, é uma fruta típica do estado do
Amazonas. A árvore que dá essa fruta pode chegar à 10m de altura e seus frutos
assumem a forma de cachos.
Desde da época dos índios o fruto era apreciado pelas suas características
estimulantes. Moíam as sementes até virar uma pasta, moldavam em forma de bastão,
deixavam secar até ficar duro e depois raspavam. Obtendo um pó, usado para a
produção de uma bebida. Acreditava-se que essa bebida garantia vida longa.
Refrigerante é produzido industrialmente, a partir de água mineral e açúcar,
podendo conter edulcorantes, extrato ou aroma sintetizado de fruta ou outros vegetais e
gás carbônico.No século XVI, a fabricação e elaboração do mesmo só podia ser feita
por farmacêuticos, pois eram os únicos que tinham conhecimento de química e
medicina.
O processo de processamento de xarope de fruta teve inicio em 1905, e em 1906
foi lançado, pela F. Diefenthaller, uma fábrica de refrigerantes de Santa Maria, no Rio
Grande do Sul, o Guaraná Cyrilla.Em 1921 foi lançado no Brasil Guaraná Champagne
Antártica atualmente o Guaraná Antártica.
Com o passar do tempo os métodos foram aperfeiçoados desde o plantio até a
produção do refrigerante.
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Informação Nutricional: Porção de 200 ml (copo)
Quantidade por porção
% VD*
Valor
Energético80 KCal = 336 KJ 4
Carboidrato 20 g 7
Sódio 11 mg 0
* Valores diários de referência com base em uma dieta de 2000 Kcal ou 8400
KJ. Seus valores diários podem ser maiores ou menores, dependendo de suas
necessidades energéticas.
Não contém quantidades significativas de proteínas, gorduras totais, gorduras
saturadas, gorduras trans e fibra alimentar.
Pesquisas feitas mostram que o venda de refrigerantes cresce a cada ano.
Famílias passaram a consumir os mesmos de forma irregular, causando doenças como
diabetes, aceleração cardiovascular entre outras prejudicando a saúde.
Guaraná Antártica é a segunda marca mais vendida no Brasil e está entre a 15
marcas mais vendidas no mundo.
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2.5 CURIOSIDADES: CAFEÍNA
Retirado do banner “15 Things You Should Know About Caffeine”*
(15 coisas que você deveria saber sobre cafeína – ver anexos)
*Tradução nossa
Isolada do café pela primeira vez em 1820, cafeína é a droga escolhida por um
grande número de pessoas, visto que pode ser encontrada em vários tipos de bebidas e
medicamentos. Não são todos, entretanto, que param para analisar o que ela é e faz ao
nosso organismo.
O delicioso nome químico da cafeína é 1,3,7-trimetilxantina.
A cafeína é encontrada naturalmente em 60 tipos diferentes de plantas,
entre elas: sementes de café (a fonte mais comum na América), folhas de
chá, guaraná (fonte de cafeína para energéticos), erva-mate, noz-de-cola.
A cafeína é extraída através do cozimento das sementes e das folhas em
alta pressão com CO2 para obter o composto em pó.
90% dos americanos consomem cafeína de alguma forma todos os dias.
A cafeína aumenta seus níveis de dopamina, o que faz você se sentir mais
feliz, e bloqueia os receptores de adenosina, o que impede que você fique
sonolento.
A cafeína apresenta uma melhora temporária na capacidade de
aprendizagem. Isso inclui compreensão, memória, reflexos, clareza de
pensamentos.
A cafeína trabalha nas mesmas partes do cérebro que a cocaína, as
anfetaminas e a heroína. Ela apenas tem efeitos mais suaves.
Por outro lado, a cafeína também tem efeitos colaterais:
15
o Insônia: o efeito estimulante da cafeína mantém o cérebro,
evitando assim, o sono.
o Da mesma forma, as propriedades diuréticas da cafeína impedem
você de dormir, pois tem que urinar o tempo todo.
o Diarreia: A cafeína acelera o processo de digestão forçando o
alimento para fora do tubo digestório rápido demais.
A cafeína beneficia os atletas: 5 mg por kg melhora a resistência por
reduzir a queima de glicose e aumentar a queima de gordura.
O Comitê Olímpico Internacional baniu a cafeína das competições.
Uma dose alta de cafeína pode ser letal: a dose letal de cafeína para um
ser humano é algo em torno 150-200 mg por quilograma de massa
corporal. Isso corresponde a 100 xícaras de chá em 4 horas. Em 2007, um
homem morreu após uma overdose de pílulas No-Doz (suplementos de
cafeína. N. do T.).
A cafeína é completamente absorvida depois de 30 a 40 minutos, e seus
efeitos diminuem após 3 horas.
Estima-se que 12.000 toneladas de cafeína são consumidas todo ano,
sendo 54% proveniente de cafés, 43% de chás e 3% de alimentos e outras
fontes. A média de consumo dos americanos é de 280 mg de cafeína por
dia, 2 ou 3 xícaras de café.
A cafeína causa dependência física. O período de abstinência tem inicio
entre 12 e 24 horas e pode durar de 2 a 9 dias. Os sintomas incluem: dor
de cabeça, cansaço, depressão, irritabilidade e perda de energia.
Produtos descafeinados ainda possuem cafeína em sua composição. Nos
Estados Unidos, “Descafeinado” significa que menos de 2,5% do produto
é cafeína.
Hitler recebeu injeções de glicose e cafeína para manter a energia durante
os últimos dias da Segunda Guerra Mundial.
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2.6 QUESTÃO:
POR QUE A CAFEÍNA ESTIMULA O CÉREBRO HUMANO?
Um neurotransmissor natural chamado adenosina, ao ligar-se aos seus
receptores, diminui a atividade neural, dilata os vasos sanguíneos, entre outros. A
cafeína se liga aos receptores da adenosina e impede a ação da mesma sobre o Sistema
Nervoso Central. A cafeína estimula a atividade neural e causa a constrição dos vasos
sanguíneos, pois bloqueia a ação da adenosina. Muitos medicamentos contra a dor de
cabeça, tal como a Aspirina Forte, contém cafeína, que por provocar a constrição dos
vasos sanguíneos, aliviará a dor. Com o aumento da atividade neural, a glândula
pituitária "pensa" que algum tipo de emergência está ocorrendo, e libera grandes
quantidades de adrenalina, que causa uma série de efeitos no corpo humano, como a
taquicardia, aumento da pressão arterial, abertura dos tubos respiratórios (por isso
muitos medicamentos contra a asma contém cafeína), aumento do metabolismo e
contração dos músculos, entre outros.
Outro mecanismo de ação da cafeína atua através do bloqueio da enzima
fosfodiesterase, responsável pela quebra de mensageiros AMP cíclico (monofosfato
cíclico de adenosina) do cérebro, fazendo com que os sinais responsáveis pela excitação
da adrenalina persistem por muito mais tempo, ou seja, demorem mais para serem
degradados pelo organismo. A cafeína, a adenosina e o monofosfato cíclico de
adenosina possuem fórmulas estruturais extremamente similares (ver anexos).
A ingestão da cafeína também é responsável pelo aumento da concentração de
dopamina no sangue (de modo análogo ao das anfetaminas e da cocaína), por provocar
uma diminuição da recaptação desta no Sistema Nervoso Central. A dopamina também
17
é um neurotransmissor (relacionado com o prazer) e médicos e pesquisadores suspeitam
que seja justamente este aumento dos níveis de dopamina que leve o individuo a viciar-
se em cafeína.
A cafeína, em curto prazo, impede que você durma porque bloqueia a recepção
de adenosina; lhe dá mais "energia", pois causa a liberação de adrenalina, e traz uma
sensação de bem estar, devido à manipulação da produção de dopamina.
Os únicos problema decorrentes do consumo de cafeína (excetuando-se os de
grau alérgico) só podem ser observados a longo prazo. O mais importante é o efeito que
a cafeína tem sobre o sono. A recepção de adenosina é muito importante para o sono,
principalmente para o sono profundo. O tempo de meia-vida da cafeína no organismo é
de 6 horas. Portanto, quando uma pessoa bebe uma quantidade x de café (200 mg de
cafeína, por exemplo) por volta das 15:00h, cerca de 100 mg desta cafeína ainda estarão
em seu corpo às 21:00h. Isso não impede que o sono aconteça, mas provavelmente não
haverá proveito integral dos benefícios que somente o sono profundo traz. No dia
seguinte, a quantidade de cafeína necessária para que aconteça o mesmo efeito será
maior, e assim gradativamente, este círculo vicioso continua, dia após dia. Ao tentar
parar o consumo de cafeína, poderão ser observados sintomas de depressão e, em alguns
casos, cefaleia intensa - causada pela excessiva dilatação dos vasos sanguíneos no
cérebro. Estes efeitos colaterais negativos fazem com que o corpo procure consumir
mais cafeína. Esta é a principal razão que leva os fabricantes de refrigerantes a adicionar
cafeína aos seus produtos - o consumidor, caso não controle a ingestão deste tipo de
bebida, se torna viciado, sente necessidade constante de ingerir cafeína, passa a fazer
disto um hábito e, consequentemente, as vendas aumentam exponencialmente.
18
Existem alguns estudos indicam que o consumo de cafeína durante a gravidez
pode ser prejudicial para o feto, porém os cientistas garantem que os males só aparecem
se o consumo for exagerado. A cafeína pode ser letal, se ingerida em grande quantidade.
A dose necessária para matar 50% de certo grupo de indivíduos é de 75mg/kg. As
estatísticas são muitas, e variam bastante, mas para matar um adulto de cerca de 80 Kg,
seriam necessárias mais de 40 xícaras de café.
19
2.7 CLAE (CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA)
ou HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)
INTRODUÇÃO
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um tipo de cromatografia
líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente
preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Ela tem a capacidade de
realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos
presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta
resolução, eficiência e sensibilidade. Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um
avanço considerável da cromatografia líquida moderna que até então era essencialmente
subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no
inicio do século, foi o tipo que é hoje chamado cromatografia líquida clássica. O avanço
foi gradual e atingiu o atual nível de sofisticação que a CLAE apresenta, devido ao
revolucionário desenvolvimento tecnológico da prática deste tipo de cromatografia.
Desde 1968 tornou-se possível rechear colunas com partículas de pequeno tamanho,
necessárias para alta resolução e, também, adquirir equipamentos que funcionam nas
altas pressões necessárias para obter uma boa velocidade de eluição. Nos últimos dez
anos ocorreu o desenvolvimento de vários detectores espectrofotométricos que operam
em comprimentos de onda variável até 190 nm, e houve um aumento na utilização dos
detectores por fluorescência, eletroquímicos, e por fluorescência induzida por laser, bem
como acoplamento com o espectrômetro de massas. Com estes, tornou-se possível a
detecção da maioria dos compostos e a análise de traços em amostras complexas, como
sangue, urina, solo, alimentos, petróleo, etc.
20
Hoje em dia são comuns estudos com partículas pequenas, a execução da CLAE
com fase reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluição
com gradiente, bem como de métodos especiais, tais como a formação de pares iônicos.
Como resultado, dificuldades anteriores ou separações difíceis de compostos como
corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabólitos são agora rotina.
O PROCESSO CROMATOGRÁFICO
O processo cromatográfico consiste na partição dos componentes de uma
mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia gasosa o
fluido é um gás e na cromatografia líquida o fluido é um solvente. Na cromatografia
líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma
coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. São as forças físicas e químicas que atuam
entre os solutos e as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a
coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas forças que determina a
resolução e portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que
agem sobre as moléculas são de cinco tipos:
Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;
Interações de dipolo induzido;
Ligações de hidrogênio;
Interações dielétricas;
Interações eletrostáticas e coulombianas.
As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares iram influenciar o grau
de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.
CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS EM CLAE
21
Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para CLAE podem ser
classificados de acordo com os seguintes aspectos:
a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos;
b) Partículas porosas ou peliculares;
c) Partículas esféricas ou irregulares;
d) Partículas com diferentes diâmetros.
Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Esses
recheios podem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento
estável e colunas eficientes de partículas pequenas.
Sólidos semi-rígidos são geralmente constituídos de partículas porosas de
poliestireno entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rígido tem sido usado para
pressões até 350 bars. O maior interesse no semi-rígido atualmente é para aplicações na
CLAE por exclusão com fase móvel orgânica; contudo eles também são usados na troca
iônica.
Sólidos não rígidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por
exclusão, são aplicados exclusivamente para a separação de moléculas grandes, solúveis
em água, como as proteínas. Contudo, estes sólidos não rígidos não podem resistir as
pressões usadas na CLAE. Os dois tipos de materiais, peliculares e porosos, diferem em
algumas de suas propriedades e têm muitas outras em comum. Ambos podem ser
introduzidos na coluna com certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas
podem ser utilizadas em cromatografia líquido-sólido, dependendo da atividade da sua
superfície ou pode ser recoberto com alguma fase líquida e obter-se uma coluna para
CLAE com fase quimicamente ligada. Além destes tem-se os materiais de recheio do
tipo pelicular ou poroso para cromatografia por troca iônica.
22
Os adsorventes peliculares, com diâmetro de partícula entre 30 e 45 μm,
apresentam eficiência, rapidez, reprodutibilidade e custo similar aos adsorventes
porosos (5 - 10 μm), mas têm menor capacidade e, por isto, o seu emprego tem
diminuído notavelmente nos últimos anos.
Figura 1- Formas mais comuns de partículas para cromatografia de líquidos.
Figura 2- Diferentes formas e tamanhos dos materiais para empacotamento de colunas.
Para obter distribuição homogênea do recheio em toda extensão da coluna, o que
aumenta a eficiência da separação, as partículas devem ter a menor variação de diâmetro
possível. As partículas esféricas são melhores do que as irregulares, mas estas têm
menor custo.
23
O tamanho da partícula controla o processo de difusão das moléculas da amostra
ao penetrar e sair dos poros da partícula. Quanto maior o tamanho da partícula porosa,
mais lento o processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a transferência de
massa entre a fase estacionária e a fase móvel. Isto acontece porque, à medida que
aumenta o tamanho da partícula, aumenta também a profundidade dos poros e
conseqüentemente a amostra demora mais tempo para sair destes poros profundos. Ao
mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazão da fase móvel, para obter-
se análises rápidas, faz com que as moléculas da amostra nesta fase migrem
rapidamente, em comparação com as da fase estacionária (independente dos poros). Isto
resulta no alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partícula, a
profundidade dos poros diminui e a saída dos poros acontece mais rapidamente,
permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência.
Estas explicações justificam porque na CLAE utilizam-se somente materiais
porosos cujas partículas tem tamanho menor do que 30 μm, com exceção da troca
iônica. Outros tipos de materiais utilizados são partículas esféricas, geralmente vítreas,
não porosas, recobertas por uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo
de material e denominado de película de camada porosa, de porosidade superficial ou de
centro não poroso.
AS TÉCNICAS DA CLAE
Há cinco tipos de fases estacionárias com diferentes mecanismos que regem as
separações cromatográficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase móvel
é possível utilizar um deles.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO OU POR ADSORÇÃO
24
O mecanismo de separação da cromatografia líquido sólido (CLS), ou adsorção,
se baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em
ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária).
Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro
uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o
adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina), grupos
apolares (por ex.; hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão
deslocar a molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais
polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e
serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por ex.: moléculas aromáticas) irão
apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a superfície do adsorvente e, portanto,
também serão retidas; o grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou
grupo funcional. É importante que as partículas da fase estacionária apresentem uma
grande área de superfície, isto é, um grande número de sítios ativos.
A atividade da superfície de muitos sólidos (incluindo a sílica e alumina) se
encontra com freqüência afetada pela retenção de certas moléculas de alta polaridade
como álcoois, fenóis, água, etc., e, devido a eles, em determinadas ocasiões, é difícil
reproduzir os resultados obtidos nas análises, porque as propriedades da superfície
sofrem mudanças. Em conseqüência, a superfície da sílica empregada na CLAE é
habitualmente submetida a determinados processos de desativação com o propósito de
diminuir a retenção de moléculas muito polares e, assim, se mantém a superfície em
condições uniformes, o que contribuirá para melhorar a reprodutibilidade das análises.
Muitas vezes, devido a uma forte adsorção ou retenção de alguns componentes da
amostra no sólido ativo, é necessário aumentar a polaridade da fase móvel de uma
25
maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade
dos componentes da amostra na fase móvel. A essa variação dá-se o nome de eluição
por gradiente ou programação da fase móvel.
Para a maioria das separações realizadas por adsorção (CLS) usa-se partículas
porosas, na faixa de 5-10 μm, alem de se empregar, às vezes, os materiais maiores (30-
40 μm), como película porosa. Quase todas estas separações são limitadas a alguns tipos
de adsorventes: sílica e alumina. A retenção e a separação nestes adsorventes são
geralmente similares, os componentes mais polares da amostra serão retidos
preferencialmente.
Na modalidade de cromatografia por partição com fase líquida, é preferível usar
suportes que sejam inertes; mas não existem suportes inertes com rigidez e
uniformidade requeridas pela CLAE. Usa-se a sílica, sabendo-se que tem pontos
adsorventes que necessitam ser completamente cobertos ou inativados, como em CG.
Os poros deverão ser suficientemente grandes para permitir total acesso das moléculas
do soluto à fase estacionária contida dentro da estrutura dos poros, mas suficientemente
pequeno para resistir a remoção do líquido estacionário pelo arraste mecânico da fase
móvel.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO OU POR PARTIÇÃO
A cromatografia líquido-líquido (CLL) foi desenvolvida por Martin e Synge em
1941 para separação de vários aminoácidos, usando fase estacionária de água em sílica e
clorofórmio como fase móvel. 0 mecanismo de separação neste tipo de cromatografia,
ou mecanismo de distribuição como também é chamado, baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase
estacionária. Então, os componentes mais solúveis na fase estacionária são
26
seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solúveis são transportados mais
rapidamente pela fase móvel. 0 maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da
fase estacionária na fase móvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não
reprodutibilidade nas separações repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A
primeira é saturando a fase móvel com a fase estacionária por meio de uma pré-coluna,
colocada antes do injetor, que contenha uma alta percentagem de fase estacionaria. A
segunda é utilizando materiais que contenham a fase estacionária, quimicamente ligada
a um suporte sólido.
27
3 PROCEDIMENTO
3.1 Determinação de cafeína em bebidas por CLAE
O procedimento para realização desse experimento tem início com a preparação
de 5 balões contendo uma quantidade x em mL da Solução de Estoque de Cafeína que
foi devidamente preparada pelo professor. Para cada balão volumétrico, adicionou-se
uma alíquota diferente da solução padrão. Segue abaixo uma tabela com as quantidades
adicionadas em mL e o valor teórico da cafeína contida nessas alíquotas utilizadas nessa
solução:
Padrão Concentração Teórica (μg/mL) mL da solução padrão utilizada
1 10 2
2 20 4
3 30 6
4 40 8
5 50 10
A preparações do padrões foi realizada da seguinte maneira:
Encheu-se uma bureta de 25 mL com a Solução de Estoque de Cafeína e
transferiu a quantidade já descrita na tabela acima para o primeiro balão, repetindo o
procedimento para todos os balões. Após isso, adicionou-se água destilada até atingir o
menisco e homogeneizaram-se as soluções. Com isso, a preparação dos padrões é
finalizada.
Adição dos padrões no HPLC (CLAE – Cromatografia Liquida de Alta
Eficiência).
28
Antes da injeção da primeira alíquota de solução padrão no equipamento foi
necessário criar uma pasta onde as informações de leitura do equipamento estariam
salvas, bem como conferir se as condições do equipamentos estavam corretas para a
analise da cafeína. As condições que devem estar em parâmetros corretos são:
Solução Isocrática – É uma solução que contem dois tipos de solventes mas com
a mesmas concentrações. A solução utilizada para a analise da cafeína é a
solução metanol/Água
Fluxo da fase móvel a 0,6 mL/min – É a quantidade da que o equipamento ira
injetar a solução durante cada minuto da analise.
Detecção em UV a 273 nm – É a onda de comprimento onde o pico da cafeína
ira sair.
Após isso era possível adicionar as alíquotas das soluções padrão no
equipamento, o que é feito através da utilização de uma seringa (de uso específico para
o equipamento). Aspirou-se um volume em torno de 2mL dos padrões e adicionou-se no
injetor. Após essa injeção, análise já poderia ser iniciada.
O mesmo procedimento foi repetido com as amostras diluídas de Coca-Cola,
Café e Guaraná Antártica. O pico das amostras e dos padrões (resultado da análise
pertinente ao nosso estudo) aparece após aproximadamente 9 minutos e com isso
podemos dizer que para cada amostra e padrões foram utilizado cerca de 5,4 mL da
solução Etanol/Água.
29
4 RESULTADOS
Tabela 1 – Resultados da curva de calibração utilizando o padrão cafeína.
Concentração em:
Tabela 2 – Concentração real das soluções padrão em mg
Tabela 3 – Concentração das amostras analisadas em mg/350mL.
(Volume de 1 Latinha)
30
Gráfico 1 –
Gráfico 2 – Curva de calibração do padrão cafeína
31
5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:
Conforme esperávamos, o café apresentou os maiores índices de concentração
de cafeína, visto que a mesma é um composto muito solúvel em água a quente.
Durante a preparação do café por infusão, ocorre uma melhor dissolução do
composto devido à elevada temperatura da água (próxima ao ponto de ebulição, 100ªC).
Como todas as outras amostras de bebidas analisadas são preparadas e consumidas a
frio (entre 8°C e 20°C), o teor de cafeína é menor, já que a faixa térmica não permite
concentrações tão altas do alcaloide.
Pensou-se na possibilidade de as indústrias informarem no rótulo dos produtos a
concentração de cafeína contida, para que o consumidor tenha conhecimento da
quantidade que está ingerindo, pois ainda que seja largamente consumido, o composto
ainda é um alcaloide que, se ingerido em grandes quantidades, trás malefícios à saúde.
Observou-se, porém, que as bebidas a base desse composto apresentam em suas
informações nutricionais, apenas quantidades de carboidratos, sódio, entre outros, não
fornecendo qualquer dado quantitativo ou alerta quanto ao efeito da cafeína no
organismo.
De acordo com estatísticas oficiais, o café está presente em 95% das residências
brasileiras. O consumo médio per capita de café em nosso país atingiu (em 2010) um
recorde de 4,81 kg/ano, o que representa cerca de 81 litros de café por habitante, marca
muito abaixo dos países escandinavos (nórdicos) mas já acima de grandes consumidores
da bebida, como Itália e Estados Unidos, de acordo com o Ministério da Agricultura.
32
Considerando o valor obtido em nossas análise por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) juntamente com estatísticas do Departamento de Química da
Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, observa-se que o brasileiro consome
cerca de 138 mg de cafeína por dia. Nível relativamente alto, embora não totalmente
danoso se considerarmos que está bem distante da quantidade necessária para causar
morte, que é vai de 5 a 10 g, dependendo da massa corporal do indivíduo. Seria
necessário, para isso, tomar mais de 40 xícaras de café em uma única ocasião.
Quando as concentrações de cafeína no plasma sanguíneo atingem níveis acima
de 15 mg/L de sangue podem haver reações tóxicas, e a ingestão de altas doses do
composto (overdoses de cafeína) são uma causa relativamente comum de emergências
de envenenamento, com 4.183 casos relatados em 2007 pela Associação Americana de
Centros de Controle de Venenos. Dentre todos esses casos, houve apenas uma morte.
Logo, concluímos que a cafeína realmente é um potente alcaloide vegetal que
pode trazer inúmeros problemas de saúde se, e somente se, consumido em excesso. O
consumo ocasional, ou mesmo diário em pequenas doses, aparentemente não causa
nenhum efeito colateral permanente, além da excitação temporária do sistema nervoso
central.
33
6 CONCLUSÃO
O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi
extremamente adequado e eficiente para separar e determinar a quantidade de cafeína
presente nas bebidas analisadas: refrigerante do tipo cola (a saber, Coca-Cola),
refrigerante do tipo guaraná (da marca Guaraná Antártica), e infusão de pó de café da
marca Pilão.
As principais vantagens do método são: a simplicidade, as amostras não
precisam ser tratadas e/ou purificadas de uma maneira especial, como na técnica de
Espectroscopia por UV/Visível, e uma certa rapidez: ocorre uma nítida separação em 11
minutos aproximadamente.
A cafeína atua sobre o sistema nervoso central, apresentando sintomas como
excitação, disposição, mas também irritabilidade e ansiedade, por isso é necessário um
controle da quantidade dessa substância nos alimentos e bebidas, como também a
indicação de suas quantidades nos respectivos rótulos. Entretanto, quando ingerida em
quantidade moderada não apresenta riscos à saúde.
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7 ANEXOS
7.1 Figuras e Imagens
FIGURA 1 – Esquema de um cromatógrafo líquido como o utilizado no experimento.
FIGURA 2 – Estrutura molecular da cafeína
FIGURA 3 – Estrutura molecular da adenosina
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FIGURA 4 - Estrutura molecular do Monofosfato cíclico de adenosina
FIGURA 5 - Estrutura molecular da dopamina
FIGURA 6 – Corte de uma semente de café
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7.2 Tabelas Adicionais
37
38
39
40
41
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://g1.globo.com/economia/mercados/noticia/2012/01/consumo-de-cafe-no-
brasil-cresceu-311-em-2011-segundo-abic.html Acesso em 14/05/2012 às 23:53
http://noticias.r7.com/economia/noticias/consumo-de-cafe-no-brasil-bate-
recorde-historico-20110324.html Acesso em 14/05/2012 às 23:58
http://noticias.uol.com.br/ciencia/ultimas-noticias/redacao/2011/01/28/mito-ou-
verdade-cafeina-em-excesso-pode-matar.htm Acesso em 14/05/2012 às 12:17
http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/cafeina.html Acesso em 13/05/2012 às
17:42
http://www.infoescola.com/curiosidades/historia-do-cafe/ Acesso em 11/05/2012
às 10:30
http://analuciacava.files.wordpress.com/2011/04/cafc3a9.jpg Acesso em
13/05/2012 às 15:42
CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, Ed.
Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 1998
COLLINS, C. H. Fundamentos de Cromatografia. Editora Unicamp. Campinas –
SP. 2006
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