determinación de compuestos bioquímicos y su relación con
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UNIVERSIDAD CENTRAL“MARTA ABREU” DE LAS VILLAS
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS
Tesis presentada para optar por el grado académico deMaster en Biotecnología Vegetal
Determinación de compuestos bioquímicos y su relacióncon la respuesta de plantas de Musa spp. inoculadas
artificialmente con Mycosphaerella fijiensis, en casa decultivo
Autora: Cynthia Sánchez García
Tutora: Dra. Yelenys Alvarado Capó
Santa Clara2010
Que sirvan estas cortas líneas para expresar todo mi agradecimiento a las personas queme han ayudado y han hecho posible este trabajo:
- En primer lugar quiero agradecer a mi tutora la Dra. Yelenys Alvarado Capó, por su
ayuda, su preocupación y por haberme enseñado y guiado en estos años de vida
laboral.
- A mis padres, por ser mi mayor inspiración tanto personal como profesionalmente,
por su apoyo incondicional y sobre todo por su cariño infinito.
- A mi esposo por ser mi buen compañero en las buenas y en las malas, por su
positivismo, su apoyo, su paciencia y sobre todo por su amor.
- A mis amigos y compañeros del laboratorio, Mileidy, Mayra, Michel y Berkys, por su
disposición y gran ayuda en todo momento, sin la cual no hubiera podido lograrlo.
- A mi amigo Pepín, por su apoyo imprescindible y su paciencia
- A Ángel Mollineda por su amistad sincera, su disposición y su ayuda incondicional.
- Al Dr. Orelvis Portal, al Dr. Elio Jiménez, a Aminael Sánchez y a la Dra. Novisel
Veitía por su ayuda y sus acertados consejos.
- A los integrantes del laboratorio de Biología Molecular: Miladys, Luis, Baby, Neyda
y María Ileana por su apoyo y disposición en todo momento.
- A Amado y los demás trabajadores de la fase de aclimatización, por su labor
silenciosa pero esencial.
- Al Dr. Raúl Barbón, a Martha y Osmildo por su apoyo.
- A todos los profesores de la Maestría en Biotecnología Vegetal por su peso
decisivo en mi formación profesional
A todos aquellos que de una forma u otra han tenido que ver con esta
investigación. A todos, muchas gracias.
RESUMEN
La enfermedad denominada Sigatoka negra, causada por el hongo Mycosphaerella
fijiensis es clasificada como la enfermedad foliar de plátanos y bananos más devastadora
en todo el mundo. Aún es muy limitado el conocimiento de los eventos bioquímicos
involucrados en la interacción Musa spp.-M. fijiensis, por lo que el estudio de este
patosistema brinda nuevas herramientas para los programas de mejoramiento genético
para el control de la enfermedad. Es por esto que el objetivo de este trabajo fue determinar
compuestos bioquímicos y su relación con la respuesta de plantas de Musa spp.
inoculadas artificialmente con M. fijiensis, en casa de cultivo. Para esto, se detectó la
presencia de dichos compuestos en los diferentes estados de síntoma en hojas de los
genotipos de Musa ‘Grande naine’ (susceptible) y ‘Calcutta 4’ (resistente) y se cuantificó su
acumulación en el tiempo, después de la inoculación. Como resultado, se observó un
incremento significativo en la actividad peroxidasa, fenilalanina amonio liasa y β-1,3
glucanasa, así como en el contenido de fenoles totales, anión superóxido y antocianinas,
en plantas de ‘Calcutta 4’ inoculadas, respecto a las no inoculadas. Resultados similares
se observaron en el genotipo ‘Grande naine’, con excepción en la actividad β-1,3
glucanasa, donde no se encontraron diferencias entre las plantas inoculadas y los
controles. Se demostró la relación entre el aumento de estos compuestos bioquímicos y la
respuesta de la planta ante la inoculación del patógeno, en ambos genotipos. Además,
que la inducción de la mayoría de ellos estuvo relacionada directamente con la aparición
de los primeros síntomas, la que ocurrió más tempranamente en el genotipo resistente.
Estos resultados ofrecen nuevas evidencias de los mecanismos de respuesta defensiva de
las plantas de Musa spp ante la infección con M. fijiensis, a la vez que brindan nuevas
herramientas para los programas de mejoramiento para el control de la enfermedad.
1. INTRODUCCIÓN
Los bananos y plátanos constituyen la principal fuente de alimentos para más de 400
000000 de personas en el mundo y son además, un renglón fundamental en la economía
de muchos países tropicales (Martín et al., 2006).
Entre la enfermedades que atacan a estos cultivo se encuentra la denominada Sigatoka
negra, causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet (anamorfo:
Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton), la cual es considerada la enfermedad foliar
más destructiva y costosa de los plátanos y bananos a nivel mundial (Arzanlou et al.,
2008).
La Sigatoka negra causa una reducción significativa en el área fotosintética de la hoja y la
madurez prematura de los frutos durante su transportación y almacenaje, lo que ocasiona
grandes pérdidas en la exportación de este cultivo (Cañas-Gutiérrez et al., 2006). Esta
enfermedad, desde que fue descrita su presencia en Cuba (Vidal, 1992), ha tenido un alto
impacto en el aumento de los costos de producción de los plátanos y bananos (Pérez,
2002).
La Sigatoka negra se controla fundamentalmente mediante la aplicación de fungicidas
químicos, ya que las restantes alternativas no han brindado un control aceptable en el
contexto productivo (Henderson et al., 2006). En este sentido, las labores culturales juegan
un papel importante para eliminar o reducir las condiciones óptimas para que se desarrolle
la enfermedad. Sin embargo, estas medidas son insuficientes cuando no se complementan
con el uso de fungicidas (Cho et al., 2008).
Algunos géneros y especies bacterianas tales como: Pseudomonas, Serratia entomophyla,
Serratia marcescens y Bacillus cereus han sido utilizados para el control de M. fijiensis
(Riveros et al., 2003). No obstante, los resultados han sido discretos en el control de la
enfermedad.
Debido al alto costo de los fungicidas, a la existencia de especies resistentes, así como a
los daños medioambientales que provocan su utilización, los genotipos resistentes ofrecen
el único método de control viable y durable, sin cambiar las técnicas tradicionales de
manejo que utilizan los productores (Raut y Ranade, 2004). A pesar de esto, aún se
consideran insuficientes los resultados en el mejoramiento genético en plantas de Musa
spp. ante esta enfermedad, es por esto que las investigaciones encaminadas a la
obtención de genes candidatos para ser utilizados en la transformación genética, cobran
cada vez una mayor relevancia.
Se conoce muy poco acerca de la filogenia y la biología molecular de los bananos, a pesar
de ser el cultivo frutal número uno en el mundo (Thomas-Hall et al., 2007) y aun son
escasas las evidencias experimentales de lo que constituye la respuesta defensiva de la
planta, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis. No obstante, se han realizado estudios
genómicos en Musa spp., por ejemplo, en Musa acuminata subsp. burmannicoides
'Calcutta 4' (Vilarinhos et al., 2003), en Musa balbisiana 'Pisang Klutuk Wulung' (Šafá et
al., 2004) y en Musa acuminata 'Tuu' (Ortiz et al., 2005). De igual forma, Portal (2008)
identificó genes involucrados en la respuesta defensiva de Musa spp. ante M. fijiensis, en
plantas del cultivar ‘Grande naine’ (AAA).
Aunque se ha avanzado en el estudio de los genes involucrados en la interacción Musa
spp.-M. fijiensis, este conocimiento aun es limitado e insuficiente, por lo que es necesario
aumentar el conocimiento relacionado con la respuesta de la planta a otros niveles
moleculares, con el fin de lograr un entendimiento global de esta interacción planta-
patógeno.
La interacción planta-patógeno desencadena una compleja red de eventos moleculares y
citológicos, los cuales proveen al hospedero de resistencia o susceptibilidad frente al
patógeno (Garcion et al., 2007). La defensa constitutiva o pasiva constituye el primer
obstáculo que tiene que evadir un patógeno y está representada por elementos
morfológicos, estructurales y químicos. Estas barreras las constituyen características
estructurales tales como: presencia de apéndices epidérmicos, espesor, dureza y
composición química de los tejidos, cantidad y calidad de la cera y cutícula, tamaño y
frecuencia de estomas y lenticelas, lignificación y suberificación de zonas abiertas por
daños mecánicos o heridas, etc. (Ferreira et al., 2007).
Tras el ataque de los patógenos a la planta, ésta pone en marcha mecanismos de
respuesta inducida como son la lignificación, la formación de papilas, el enriquecimiento de
la pared celular con glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, o la oclusión vascular. Junto al
desarrollo de estructuras locales para bloquear la entrada de los patógenos, también se
acumulan sustancias alrededor del lugar de la infección, conocidas como fitoalexinas
(fenoles, terpenoides, poliacetilenos y derivados de ácidos grasos), que incluyen una
variedad de productos naturales que se producen en mayor cantidad tras la entrada de un
patógeno y poseen capacidad antimicrobiana, así como la síntesis de proteínas
relacionadas con la patogénesis PR (del inglés: Pathogenesis Related) (Montesinos,
2000).
Se han encontrado evidencias de la existencia de tales mecanismos defensivos en las
plantas ante el ataque por el patógeno en varios patosistemas como: Cucumis sativus-
Pythium aphanidermatum (Chen et al., 2000), Triticum spp.-Fusarium graminearum
(Mohammadi y Kazemi 2002), Sorghum vulgare-Sclerotium rolfsii (Maurya et al., 2007);
Oryza sativa L.-Pyricularia grisea (Sundravadana et al., 2007; Bhadauria et al., 2010), sin
embargo, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis tales evidencias se desconocen o son
muy limitadas. Es por ello, que el análisis bioquímico de esta interacción, resulta necesario
para lograr un entendimiento global de este complejo proceso.
En este trabajo, por primera vez se determinarán compuestos bioquímicos relacionados
con la respuesta de plantas de los genotipos de Musa ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ ante la
inoculación artificial con M. fijiensis.
Para esto, se trazaron los objetivos siguientes:
Objetivo general:
Determinar compuestos bioquímicos y su relación con la respuesta de plantas de Musa
spp. inoculadas artificialmente con Mycosphaerella fijiensis, en casa de cultivo.
Objetivos específicos:
1. Caracterizar fenotípicamente plantas de ‘Grande naine’ y ’Calcutta 4’ en casa de
cultivo.
2. Detectar la presencia de compuestos bioquímicos en los diferentes estados de
síntoma en hojas de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ inoculadas
artificialmente con M. fijiensis.
3. Cuantificar compuestos enzimáticos y no enzimáticos en diferentes tiempos
después de la inoculación en hojas de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’
inoculadas artificialmente con M. fijiensis.
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Generalidades del cultivo de Bananos y Plátanos
Los bananos y plátanos constituyen la principal fuente de alimentos para más de 400
000000 de personas en el mundo y son además, un renglón fundamental en la economía
de muchos países tropicales (Martin et al., 2006). Países de Asia, India y algunos países
latinoamericanos lideran la producción de bananos; solamente en la India se produjeron
más de 20 mil millones de toneladas en el año 2007 (FAOSTAT, 2008).
Entre las enfermedades más importantes que afectan a los bananos y plátanos está el Mal
de Panamá causado por Fusarium oxysporum f. sp. var. cubense, la enfermedad causada
por el virus Bunchy Top del banano (BBTV) y la enfermedad del Moko causada por
Ralstonia solanacaearum (Marín et al., 2003). Sin embargo, ninguna de estas
enfermedades ha producido daños tan severos a la producción mundial de bananos y
plátanos, como las manchas foliares de Sigatoka causadas por Mycosphaerella spp., la
cual es conocida como Sigatoka negra o Rayado negro de la hoja (Mourichon y Fullerton,
1990; Carlier et al., 2000).
2.2 La Sigatoka negra en Musa spp.
La Sigatoka negra o Rayado negro de la hoja es considerada la enfermedad foliar más
destructiva y costosa de los plátanos y bananos a nivel mundial (Arzanlou et al., 2008).
Esta enfermedad fue observada por primera vez en el valle de Sigatoka en Fiji en el año
1963 y subsecuentemente se ha detectado desde el Pacífico al Sudeste asiático.
Posteriormente fue identificada en Honduras en 1972, en Zambia en 1973 y en varias
regiones productoras de bananos y plátanos de América Latina, África y Australia
(Stansbury et al., 2006).
La Sigatoka negra tiene poco efecto sobre el comportamiento vegetativo de la planta:
emergencia de nuevas hojas, altura de la planta, etc.; sin embargo, tiene un efecto
significativo sobre el rendimiento del cultivo: peso del racimo, cantidad de racimos por
hectárea y por ciclo de cultivo (Valerio et al., 2002). Además, causa una reducción
significativa en el área fotosintética de la hoja y provoca madurez prematura de los frutos
durante su transportación y almacenaje, lo que ocasiona grandes pérdidas en la
exportación de este cultivo (Cañas-Gutiérrez et al., 2006).
Esta enfermedad, desde que fue descrita su presencia en Cuba (Vidal, 1992), ha tenido un
alto impacto en el aumento de los costos de producción de los plátanos y bananos (Pérez,
2002).
2.2.1 Agente causal
La Sigatoka negra es causada por el hongo heterotálico Mycosphaerella fijiensis Morelet
(Mourichon et al., 1990; Conde-Ferraéz et al., 2007), su ciclo de vida está caracterizado
por dos estados: perfecto (teleomorfo) e imperfecto (anamorfo) (Alexoupoulos y Mims,
1979).
Estado perfecto: (Teleomorfo): Clase: Ascomycetae, Subclase: Euascomyceta, Orden:
Pseudospaeriles, Familia: Mycosphaerellaceae, Género: Mycosphaerella, Especie: fijiensis
Estado imperfecto: (Anamorfo): Clase: Deuteromycetae, Subclase: Hyphomycetae, Orden:
Hyphomycetales, Familia: Dematiaceae, Género: Pseudocercospora, Especie: fijiensis
Los estudios citológicos realizados por Lepoivre et al. (2002) demuestran que M. fijiensis
es un parásito biotrófico en los primeros estados, que coloniza inicialmente los espacios
intercelulares sin la formación de haustorios. Posterior a la penetración a través de los
estomas, las hifas crecen entre las células dentro del tejido, que se torna necrótico,
momento en que el hongo crece saprofíticamente en el tejido muerto; por esto es
clasificado con un hongo hemibiótrofico, por su compleja interacción con el hospedante
(Lepoivre et al., 2002).
Sintomatología
La Sigatoka negra fue descrita por primera vez en 1964 por Rhodes, pero fueron Meredith
y Lawrence (1969) quienes realizaron la descripción detallada de los síntomas basándose
en sus observaciones. Fouré (1985), redefinió los síntomas y propuso seis estadios de
desarrollo de la enfermedad, acorde con la evolución de los síntomas en plantas adultas
cultivadas en condiciones naturales (Tabla 1).
Tabla 1. Estado de desarrollo de los síntomas de la enfermedad Sigatoka negra en condiciones decampo (Marín et al., 2003)
Meredith y Lawrence(1969)
Fouré(1985)
Descripción
........ Estado 1a Marcas despigmentadas (blanquecinas o amarillas)solo observadas por la parte abaxial de la hoja
Estado inicial de pecas Estado 1b Pecas rojo parduzcas en la parte abaxial de la hoja
Primer estado de raya Estado 2 Pecas rojo parduzcas en la parte abaxial y adaxialde la hoja
Segundo estado deraya
Estado 3 Rayas que cambian de rojizas a pardo oscuro
Primer estado demancha
Estado 4 Rayas pardo oscuras en la parte abaxial de la hojay negras en la adaxial
Segundo estado demancha
Estado 5 Manchas pardo oscuras a negras con halo clorótico
Tercer (maduro)estado de manchas
Estado 6 Manchas pardo oscuras a negras con centrossecos de color gris
Fullerton y Olsen (1995) establecieron una escala para la evaluación de la enfermedad,
utilizando la inoculación artificial en casa de cultivo. Estos autores solo reconocieron cinco
estados, los cuales difieren de los descritos por Fouré (1985). Posteriormente esta escala
fue redefinida por Alvarado et al. (2003), como se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Escala descriptiva para la evaluación del desarrollo de los síntomas en hojas de Musa spp.inoculadas con M. fijiensis Morelet en casa de cultivo (Alvarado et al., 2003)
Estado Descripción
Estado 0 Hoja sin síntoma
Estado 1 Hojas con pequeñas lesiones puntiformes de coloración rojiza por la parte abaxial y sinsíntoma la adaxial
Estado 2 Hoja con manchas de contornos regulares o irregulares de coloración pardo-rojiza por ella parte abaxial y sin síntoma la adaxial
Estado 3 Hoja con manchas de contornos regulares o irregulares de coloración pardo-rojiza por laparte adaxial
Estado 4 Hojas con manchas negras (elípticas o circulares) con bordes cloróticos y halo acuoso.La hoja mantiene áreas de tejido verde
Estado 5 Hojas con manchas negras con centros secos grises, las hojas pueden estarcompletamente necrosadas y colgar del pseudotallo
Epifitiología
Aunque M. fijiensis se disemina básicamente por ascosporas (estructuras de reproducción
sexual), los conidios (estructuras de reproducción asexual) juegan un papel importante en
la diseminación de la enfermedad, a pesar de encontrarse en cantidades inferiores (Burt,
2003) (Figura 1). Las ascosporas son producidas en el pseudotecio, en las lesiones
maduras de las hojas más viejas o muertas de la planta y se producen en la parte adaxial
y abaxial de las hojas (Meredith y Lawrence, 1969), no obstante Gaulh et al. (2000)
encontraron que existen mayor número de pseudotecios y ascosporas en la parte abaxial
de las hojas.
Algunos factores climáticos como la temperatura y la humedad, son determinantes en la
velocidad de evolución de los síntomas de la enfermedad (Porrás y Pérez, 1997). El viento
se ha considerado como el principal medio de transportación de los conidios y ascosporas
hacia las plantas de Musa spp. cercanas (Burt, 2003).
Figura 1. Ciclo infeccioso de M. fijiensis en Musa spp. (tomado de Bennet y Arneson, 2003)
2.2.2 Medidas de control
Uso de fungicidas
La Sigatoka negra se controla fundamentalmente mediante la aplicación de fungicidas
químicos, ya que las restantes alternativas no han brindado un control aceptable en el
contexto productivo (Henderson et al., 2006). El manejo de esta enfermedad basado
solamente en el uso de productos químicos es posible, pero implica un costo muy elevado,
especialmente para los pequeños y medianos productores que son los más afectados
(Marín et al., 2003).
Pseudotecio
Las ascosporas sondiseminadas por el viento alargas distancia hasta una
nueva planta
Las ascosporas infectan las hojas através de los estomas
Los conidióforos emergen através del estoma y producen
conidios
Los conidióforos infectan lashojas a través de los estomas
Los espermogonios fertilizanhifas vecinas para producir
pseudotecios
espermogonioespermacios
La infección produce rayasestrechas de color marrón las
cuales se oscurecen yexpanden formando grandes
áreas de tejido necrótico
Se producenestructuras sexuales
en las lesionesmaduras
Ascosporas
Labores culturales
Las labores culturales juegan un papel importante en eliminar o reducir las condiciones
óptimas para que se desarrolle la enfermedad. Estas comprenden la eliminación de las
hojas infectadas, la existencia de un espacio adecuado entre las plantas y un eficiente
drenaje en las plantaciones. Sin embargo, estas medidas son insuficientes cuando no se
complementan con el uso de fungicidas (Cho et al., 2008).
Control biológico
La aparición de cepas de M. fijiensis resistentes a los fungicidas químicos usados
tradicionalmentes, así como el incremento mundial de las demandas por lograr mayor
limpieza en la producciones, ha propiciado un aumento en el interés de encontrar
alternativas biológicas para el control de la Sigatoka negra (Marín et al., 2003).
Algunos géneros y especies bacterianas tales como: Pseudomonas, Serratia entomophyla,
Serratia marcescens y Bacillus cereus han sido utilizados para el control de M. fijiensis
(Riveros et al., 2003). Serenade® es un producto de AgraQuest Inc., elaborado a partir de
Bacillus subtilis, el cual posee tres grupos de metabolitos conocidos como lipopéptidos que
actúan de manera sinérgica para destruir el tubo germinativo del patógeno y las
membranas miceliales (Edgecomb y Manker, 2006).
No obstante, los resultados con la aplicación del control biológico han sido discretos en el
control de la enfermedad.
Uso de genotipos resistentes
Debido al alto costo de los fungicidas, a la existencia de especies resistentes a estos, así
como por los daños medioambientales que provoca su utilización, los genotipos
resistentes ofrecen el único método de control viable y duradero, sin cambiar las técnicas
tradicionales de manejos que utilizan los productores (Raut y Ranade, 2004).
Los bananos y plátanos son cultivos difíciles de mejorar genéticamente, debido a que la
mayoría de las variedades importantes y populares son estériles, no producen semillas y
en su mayoría son partenocárpicas (Heslop-Harrison y Schwarzacher, 2007). A pesar de
esto, han tenido éxito los programas de mejoramiento genético mediante hibridación
llevados a cabo en el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA), en Nigeria (Ortiz
y Vuylsteke, 1997) y la Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA), donde se
han desarrollado híbridos resistentes (FHIA-01, FHIA-03, FHIA-18, FHIA-21, FHIA-25) a la
Sigatoka negra (FHIA, 2007).
La transformación genética se ha convertido en una herramienta importante para el
mejoramiento de plátanos y bananos, lo que ha permitido la obtención de plantas
transgénicas de banano que expresan proteínas antifúngicas (Remy et al., 1998) y
péptidos antimicrobianos (Pérez-Hernández, 2000).
A pesar de esto, aún se consideran insuficientes los resultados en el mejoramiento
genético en plantas de Musa spp. ante esta enfermedad. Es por esto, que las
investigaciones encaminadas a la obtención de genes candidatos para ser utilizados en la
transformación genética cobran cada vez una mayor relevancia.
2.3 Interacción Musa spp.-Mycosphaerella fijiensis
2.3.1 Tipos de interacción
La interacción entre plantas de Musa spp. y M. fijiensis permaneció desconocida por un
largo período de tiempo (Lepoivre et al., 2003). Un estudio en condiciones naturales, con
alrededor de 50 especies de Musa, pertenecientes a diferentes grupos genéticos e
infectadas con M. fijiensis, permitió la agrupación de genotipos de banano en tres
categorías: altamente resistente (interacción incompatible), parcialmente resistente y
susceptible (interacción compatible) (Carlier et al., 2002).
Los cultivares de banano interactúan con el patógeno M. fijiensis en una de las dos formas
distintas, ya sea mediante una interacción compatible o una incompatible (Hoss et al.,
2000). En el caso de la interacción compatible, ocurre el desarrollo completo de la
enfermedad y está asociada a la necrosis de los tejidos y la esporulación del hongo. Un
ejemplo de este tipo de interacción ocurre en plantas del Subgrupo Cavendish (Musa
acuminata cv ‘Grande naine’, AAA). En la interacción incompatible, se observa una
resistencia a la enfermedad, el desarrollo de los síntomas se bloquea y no ocurre la
esporulación sexual o asexual del hongo (Hoss et al., 2000). Un ejemplo de este tipo de
interacción ocurre en Musa acuminata L.A. Colla subsp. burmannicoides E.A. (‘Calcutta 4’,
AA) (De Langhe, 1996). Este fenotipo es muy similar a la respuesta de hipersensibilidad
observada en otras interacciones planta-patógeno (Hoss et al., 2000).
2.3.2 Bases moleculares de la interacción
El largo periodo de co-evolución entre las plantas y los microorganismos ha conducido a la
existencia de complejos mecanismos de defensa y ataque, los cuales comprenden un
sistema de defensa innato en las plantas y la presencia de factores de virulencia en los
patógenos (Stahl y Bishop, 2000).
Este sistema defensivo comienza con el reconocimiento por parte de la planta, de
moléculas microbianas conservadas. Este mecanismo puede suprimirse por la presencia
de factores de virulencia (efectores), codificados por genes avr (del inglés: Avirulence
genes) en el patógeno, ante lo cual las plantas responden mediante un mecanismo
defensivo que involucra los genes de resistencia R (del inglés: Resistance). Estos genes R
codifican proteínas que reconocen los denominados efectores del patógeno, lo que
consecuentemente activa la respuesta defensiva en la planta a través de complejas
cascadas de señalización (Bent y Mackey, 2007).
Mediante el empleo de marcadores moleculares se han realizado estudios acerca de la
diversidad genética de M. fijiensis, sin embargo, se conoce muy poco acerca de los
mecanismos moleculares involucrados en la interacción hospedero-patógeno en este
patosistema (Cho et al., 2008).
No obstante, autores como Pei et al. (2007) señalaron la presencia de regiones
conservadas de sitios de unión a nucleótido (NBS) (del inglés: Nucleotide-Binding Sites) y
de repeticiones ricas en leucina (LRR) (del inglés: Leucine-Rich Repeat), en genes R del
genoma de cinco cultivares de banano (AAA, AAB, ABB, AA y BB) y específicamente en el
genotipo ‘Calcutta 4’ resistente a la Sigatoka negra.
Además, se han identificado transcriptos de ARNm descubiertos a partir de bibliotecas
EST (del inglés: Expressed Sequence Tags) en M. fijiensis, en donde se han identificado
genes potenciales involucrados en la interacción compatible de Musa spp.-M. fijiensis, los
cuales poseen homología con genes de virulencia de otros patógenos (Cho et al., 2008).
En este sentido, Portal (2008) identificó genes involucrados en la respuesta defensiva de
Musa spp. ante M. fijiensis, en el cultivar ‘Grande naine’ (interacción compatible) mediante
la construcción de una biblioteca de ADN complementario (ADNc). Este autor identificó
genes involucrados en la ruta de los fenilpropanoides, en el mecanismo de transducción
de señales vía ácido jasmónico y etileno, varias proteínas relacionadas con la patogénesis
así como otras enzimas relacionadas con la síntesis de compuestos detoxificantes.
Además, Cruz-Cruz et al. (2009) encontraron una fitoanticipina con actividad antifúngica in
vitro contra M. fijiensis en una infusión de hojas de plantas del cultivar ‘Grande naine’ de
cuatro meses de crecidas
Aunque se ha avanzado principalmente en el estudio de los genes involucrados en el
patosistema Musa spp.-M. fijiensis, el conocimiento de los mecanismos moleculares que
se desencadenan tanto el la interacción compatible como incompatible aun es limitado e
insuficiente. Es por ello, que los estudios a nivel de proteínas y de otros compuestos
bioquímicos relacionados con la respuesta de la planta ante el patógeno, juegan un papel
importante para lograr un entendimiento global de esta interacción.
2.3.3 Respuesta de defensa de la planta
Las plantas poseen varias líneas de defensa contra la invasión de patógenos, las cuales
incluyen barreras preexistentes y la respuesta inducida. La interacción planta-patógeno
desencadena una compleja red de eventos moleculares y citológicos, los cuales proveen
al hospedero de resistencia o susceptibilidad frente al patógeno. Usualmente existe una
distinción entre barreras preexistentes y defensa inducida en la planta, lo cual conduce a
los conceptos de defensa constitutiva (pasiva) o inducida (activa) (Garcion et al., 2007).
Defensa constitutiva
La defensa constitutiva o pasiva constituye el primer obstáculo que tiene que evadir un
patógeno antes de colonizar el tejido vegetal y está representada por elementos
morfológicos, estructurales y químicos (Ferreira et al., 2006). Estas barreras las
constituyen características estructurales tales como: presencia de apéndices epidérmicos
(pelos, escamas, papilas, etc.); espesor, dureza y composición química de los tejidos
epidérmicos; cantidad y calidad de la cera y cutícula que recubre las células epidérmicas;
tamaño y frecuencia de estomas y lenticelas; lignificación y suberificación de zonas
abiertas por daños mecánicos o heridas. Además de estas barreras, las plantas acumulan
metabolitos secundarios, que en muchos casos poseen propiedades antimicrobianas y que
van a actuar en el lugar de penetración del patógeno (Ferreira et al., 2007).
Respuesta defensiva inducida
Tras el ataque del patógeno a la planta, ésta pone en marcha mecanismos de respuesta
local como son la lignificación, la formación de papilas, el enriquecimiento de la pared
celular con glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, o la oclusión vascular. Junto al desarrollo
de estructuras locales para bloquear la entrada de los patógenos, también se acumulan
sustancias alrededor del lugar de la infección, conocidas como fitoalexinas (fenoles,
terpenoides, poliacetilenos y derivados de ácidos grasos), que incluyen una gran cantidad
de compuestos constitutivos que se producen en mayor cantidad tras la entrada de un
patógeno y poseen capacidad antimicrobiana; así como la síntesis de proteínas
relacionadas con la patogénesis PR (del inglés: Pathogenesis Related) (Montesinos,
2000).
Lignificación
Debido a sus propiedades químicas y mecánicas, la lignina representa una importante
barrera contra los patógenos (Humphreys y Chapple, 2002). La lignina es un polímero
complejo formado por cadenas largas de ácidos fenólicos, este es un componente
estructural principal de la pared celular de las plantas. Tanto la lignina como sus
precursores fenólicos son de por sí tóxicos a la mayoría de los patógenos (Basha et al.,
2006) y su polimerización hace a la pared celular más gruesa y resistente, lo que restringe
la penetración y la degradación de esta ante el ataque de patógenos (Ferreira et al., 2007).
La lignina relacionada con la defensa de la planta ante la infección por patógenos puede
estar depositada sobre toda la pared de la célula o grupo de células afectadas, o
solamente alrededor del sitio de infección. Algunos artículos científicos reseñan la
evidencia de la correlación entre la inducción de la formación de la lignina y el proceso de
defensa de la planta (Moersbacher y Mendgen, 2000; Smith et al., 2007). Se ha
demostrado además, que la lignina de defensa depositada en respuesta a estrés biótico o
abiótico, posee una composición diferente a la lignina depositada durante el proceso de
crecimiento y desarrollo de la planta (Garcion et al., 2007).
Aunque no existen evidencias experimentales de eventos relacionados con la inducción de
deposición de lignina en plantas de Musa spp. ante la infección por M. fijiensis, estos han
sido descritos en otros patosistemas.
En este sentido, autores como Smith et al. (2007) utilizando técnicas histoquímicas,
observaron la inducción de lignificación en el sitio de penetración en dos especies de
Eucalipto (Eucalyptus globulus y Eucalyptus nitens) frente a la infección por
Mycosphaerella spp. De igual forma, Sundravadana et al. (2007) observaron un
incremento en la producción de enzimas relacionadas con el proceso de lignificación en
plantas de Oryza sativa L. contra el patógeno Pyricularia grisea.
Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos se inducen en la mayoría de los tejidos vegetales brindando
resistencia a la planta. Este es considerado uno de los eventos moleculares más
importantes como parte del proceso defensivo ante el ataque por patógenos (Walters et
al., 2005).
La acumulación de compuestos fenólicos es un proceso muy controlado y su nivel de
expresión y composición varía considerablemente entre los organismos, tejidos, etapas de
desarrollo y con las condiciones medioambientales (Winkel-Shirley, 2002).
Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios antimicrobianos encontrados en
las plantas, que en algunos casos son directamente tóxicos a patógenos como:
Colletotrichum falcatum Went (Ramesh et al., 2001) y Rhizoctonia solani Kuhn (Kalim et
al., 2003).
Los niveles de expresión de varios genes que codifican las enzimas clave en la biosíntesis
de los fenoles, en la ruta de los fenilpropanoides, se incrementan en respuesta a factores
tanto abióticos como bióticos. Estas enzimas incluyen la fenilalanina amonio-liasa (PAL, de
sus siglas en inglés: Phenylalanine ammonia-lyase), la cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y la
4-cumarato coenzima A ligasa (4CL) (Clé et al., 2008).
El incremento en la producción de compuestos fenólicos y su papel en el proceso de
defensa de las plantas ha sido observado en varios patosistemas como: Cucumis sativus-
Pythium aphanidermatum (Chen et al., 2000), Triticum spp.-Fusarium graminearum
(Mohammadi y Kazemi 2002), Sorghum vulgare-Sclerotium rolfsii (Maurya et al., 2007),
entre otros. Sin embargo, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis dicho mecanismo de
respuesta no ha sido descrito.
Especies reactivas de oxígeno
Las Especies Reactivas del Oxígeno (ROS) se forman por la sucesiva reducción de un
electrón del oxígeno molecular (O2). Entre ellas se incluyen el anión superóxido (O2-), el
peróxido de hidrógeno (H2O2), el radical hidroxilo (OH.) y el radical hidroperoxil (HO2.). Las
ROS se generan durante el proceso de desarrollo de la planta y además, por una gran
cantidad de factores ambientales (Shetty et al., 2008).
Durante la interacción planta-patógeno, la generación y acumulación de las ROS coincide
con la inducción de muerte celular, como parte de la respuesta hipersensible en las
plantas (Grant y Loake, 2000) y se ha demostrado que se producen principalmente en la
membrana plasmática (Sagi y Fluhr, 2001). Incluso en condiciones normales, las plantas
superiores producen a menudo especies reactivas de oxígeno durante los procesos
metabólicos, por la vía de la reacción de Mehler en los cloroplastos, el transporte
electrónico en la mitocondria y la fotorespiración en los peroxisomas (Neil et al., 2002).
El papel de estas especies reactivas de oxígeno en la respuesta de plantas de Musa spp.
ante la infección por M. fijiensis, todavía se desconoce, no obstante, Leiva et al., 2004
evaluaron el patrón de expresión de la enzima superóxido dismutasa (SOD), la cual esta
directamente relacionada con el estrés oxidativo y las ROS, en plantas de los cultivares
‘Grande naine’ y ‘Fougamou’ inoculados con una toxina de M. fijiensis (juglone). Estos
autores observaron una variación en el patrón de expresión de esta enzima, la cual fue
mayor en las plantas inoculadas respecto a los controles.
Además, existen evidencias del papel de estas ROS en la defensa de la planta en otros
patosistemas. En este sentido, Patykowski y Urbanek (2003) informaron acerca del
aumento en el contenido del anión superóxido, el radical hidroxilo, así como de la actividad
de enzimas relacionadas con las ROS en la fracción apoplástica de hojas de tomate ante
la infección por Botrytis cinerea. Estos autores señalan que el aumento de estas moléculas
se produce en la fase temprana de la infección y que ocurre en plantas con cierta
resistencia a la enfermedad, en comparación con las plantas susceptibles.
Igualmente, Davies et al. (2006) observaron un aumento en la producción de especies
reactivas de oxígeno en suspensiones celulares de Arabidopsis thaliana en respuesta a la
aplicación de un elicitor de F. oxysporum y resaltaron su implicación en la resistencia basal
de la planta.
Compuestos enzimáticos
El desarrollo de un sistema de defensa antioxidante en las plantas, las protege contra el
daño oxidativo, debido a la supresión parcial de la producción de las especies reactivas de
oxígeno, a la vez que detoxifican la célula de los residuos producidos por estas (Murgia et
al., 2004). En esta tarea participan tanto compuestos enzimáticos como no enzimáticos
(Yoshimura et al., 2004).
El aumento en el nivel de la actividad de enzimas como peroxidasa, fenilalanina amonio-
liasa, lipooxigenasas, superóxido dismutasa, glutatión reductasa, catalasa, entre otras, se
usan frecuentemente como indicador de estrés oxidativo en las plantas (Tan et al., 2006;
Sundravadana et al., 2007).
La enzima peroxidasa pertenece al grupo de las enzimas hemoproteicas, la cual cataliza la
oxidación de un electrón en varios sustratos tanto orgánicos como inorgánicos, que utiliza
el oxígeno del peróxido de hidrógeno como aceptor de hidrógeno. Este tipo de enzimas
están involucradas en varios procesos como la elongación celular, a través de las
peroxidasas unidas a la pared celular, en el proceso de lignificación (Cai et al., 2006) y en
los mecanismos de defensa de la planta (Morkunas y Gmerek, 2007). Es por esto, que las
peroxidasas sirven como parámetro de la actividad metabólica durante alteraciones
producidas durante el crecimiento, condiciones de estrés ambiental, aumento de la rigidez
de la pared celular, la formación de lignina, entre otros procesos.
En el patosistema Triticum sp.-F. graminearum, Mohammadi y Kazemi (2002) describieron
un aumento en la actividad de las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa en plantas
infectadas, al compararlas con las plantas no inoculadas, lo que demuestra su papel en
esta interacción. En hojas de plantas de Musa spp. infectadas con filtrado de cultivo de F.
oxysporium f. sp. cubense raza 1 se ha observado que la actividad peroxidasa aumentó en
genotipos resistentes respecto a genotipos susceptibles, como respuesta de la planta ante
la infección (Companioni et al., 2005). Además, autores como Sundaravadana et al. (2007)
observaron un aumento en la actividad peroxidasa en plantas de O. sativa infectadas con
P. grisea, así como de otras enzimas relacionadas con los mecanismos de defensa de la
planta, específicamente con el proceso de lignificación y acumulación de compuestos
fenólicos, donde esta enzima juega un papel importante.
Aunque el rol de la peroxidasa en la interacción planta-patógeno ha sido estudiado en
varios patosistemas, en Musa spp.-M. fijiensis, no existen evidencias de estudios que
vinculen dicha enzima con la respuesta de la planta ante la infección del patógeno.
La ruta metabólica secundaria de los fenilpropanoides, donde se ubican enzimas como la
PAL, la C4H y la 4CL, entre otras, constituye una de las principales en las plantas, que
resulta en la síntesis de una variedad de compuestos como flavonoides, fitoalexinas,
lignina, etc. (Winkel-Shirley, 2001).
La enzima fenilalanina amonio-liasa es una enzima crucial en el metabolismo de
numerosos compuestos, que cataliza la formación del ácido trans-cinámico por L-
desaminación de la fenilalanina. Estudios en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum
que expresan un gen de esta enzima de Phaseolus vulgaris, revelaron que la regulación
de la actividad de esta enzima era uno de los pasos importantes de la ruta de los
fenilpropanoides (Howles et al., 1996).
La actividad de la PAL parece ser extremadamente sensible al estado fisiológico de la
planta. Los cambios en la actividad de esta enzima pueden ocurrir durante el crecimiento o
frente a eventos traumáticos o patológicos, o por la acción de la luz (Sreelakshmi y
Sharma, 2008).
Se ha planteado que en la interacción Musa spp.-M. fijiensis, la infección causada por el
patógeno es capaz de inducir un incremento en la actividad de la enzima fenilalanina
amonio-liasa (Hoss et al., 2000). En este sentido, Luis et al. (1994) plantearon que la
resistencia en Musa spp. frente a M. fijiensis parece estar estrechamente relacionada con
mecanismos de activación post-transcripcional, así como por la inducción de fitoalexinas
como productos de la ruta de los fenilpropanoides.
En plantas de Musa spp. se han encontrado principalmente dos tipos de fitoalexinas frente
al ataque por patógenos: 4-fenilfenalenonas (Luis et al., 1994) y 9-fenilfenalenonas o
musalonas (Luis et al., 1996) . Algunos de estos fenilfenalenonas poseen una fuerte
actividad antifúngica (Quiñones et al., 2000).
Recientemente, en el cultivar resistente ‘Yangambi km5’ se encontraron cuatro fitoalexinas
del tipo fenilfenalenonas y dos nuevos compuestos del tipo perinaftenona, los cuales
mostraron actividad in vitro contra M. fijiensis (Otálvaro et al., 2007).
Aunque se ha avanzado en el conocimiento de compuestos involucrados en la ruta
metabólica de los fenilpropanoides en la interacción Musa spp.-M. fijiensis y su papel en la
defensa de la planta, el conocimiento general de los mecanismos involucrados en dicha
interacción es aun muy limitado.
Un mecanismo importante como parte de la respuesta defensiva lo constituye la inducción
de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR). Estas proteínas son producidas
durante el desarrollo normal de las plantas o como parte de la defensa inducida por
patógenos fúngicos. La proteínas PR se agrupan en 17 familias numeradas de acuerdo
con el orden en que fueron descubiertas, de la PR-1 a la PR-17 (Ferreira et al., 2007).
Las β-1,3 glucanasas de plantas pertenecen al grupo de las proteínas PR-2. Esta hidroliza
uniones de β-1,3 glucanos, los cuales constituyen los componentes principales de la pared
celular en la mayoría de los hongos y en unión con la enzima quitinasa producen un efecto
sinérgico que aumenta de la resistencia de las plantas frente a los patógeno (van Loon et
al., 2006).
Estas enzimas se dividen en tres clases. Las glucanasas clase I, son proteínas básicas de
aproximadamente de 33 kDa y se localizan en las vacuolas. Las clase II y III incluyen
proteínas extracelulares ácidas, de aproximadamente 36 kDa (Theis y Stahl, 2004). Estas
enzimas participan en varios procesos fisiológicos y del desarrollo de la planta.
Se ha señalado el papel de estas proteínas en la defensa de las plantas frente a los
patógenos, en este sentido, se ha observado que la acumulación de proteínas PR, como
PR-2, PR-5 (proteínas tipo taumatina), PR-9 (peroxidasa) y PR-10 (proteínas inducidas por
Probenzol), así como proteínas tipo isoflavona reductasa y proteínas inducidas por estrés
salino, se inducen durante la interacción tanto compatible como incompatible en el
patositema O. sativa-P. grisea (Bhadauria et al., 2010).
En el mecanismo defensivo de las plantas de Musa spp. frente a M. fijiensis se ha
señalado que la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis tiene una
estrecha relación con la resistencia de las plantas ante el patógeno (Lepoivre et al., 2003),
pero aun es limitado el conocimiento del papel de estas proteínas en la interacción planta-
patógeno. No obstante, autores como Dagert et al. (2002) realizaron una biblioteca
substractiva en el cultivar ‘Yangambi km5’ (AAA, resistente a la enfermedad) infectado con
M. fijiensis y encontraron la expresión diferencial de una glucanasa, lo que demuestra su
relación con el proceso de respuesta de la planta ante el patógeno.
Se conoce muy poco acerca de la filogenia y la biología molecular de los bananos, a pesar
de ser el cultivo frutal número uno en el mundo (Thomas-Hall et al., 2007) y aun son
escasas las evidencias experimentales de lo que constituye la respuesta defensiva de la
planta, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis. Es por esto que el análisis bioquímico de
esta interacción, resulta necesario para lograr un entendimiento global de este complejo
proceso, a la vez que brinda nuevas herramientas para los programas de mejoramiento
genético en plantas de Musa spp.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron plantas de ‘Grande naine’ (Musa AAA) y ‘Calcutta 4’ (Musa AA) propagadas
in vitro vía organogénesis según el protocolo descrito por Orellana (1994).
El material vegetal para el establecimiento in vitro de ‘Grande naine’ provino de la empresa
¨La Cuba¨, Ciego de Ávila y del Banco de Germoplasma del INIBAP (ITC 0249, Bélgica) se
obtuvieron plantas in vitro de ‘Calcutta 4’ en fase de multiplicación.
Las plantas se sembraron en bolsas de polietileno con sustrato compuesto por 50% de
casting, 30% de compost y 20% de zeolita y se mantuvieron en fase de aclimatización
durante 45 días. Posteriormente, se transfirieron a macetas plásticas de 20 cm de
diámetro con 1L de capacidad con igual sustrato por 45 días (en los períodos de febrero-
marzo y junio-julio) hasta alcanzar como mínimo 20 cm de altura y tres hojas activas
(Figura 2).
Las plantas se colocaron en una casa de cultivo con luz solar, con una media en la
intensidad luminosa de 3 841 µmol.m2.s (medido con Extech Light Meter 401025, USA) y
riego tres veces al día.
Figura 2. Plantas de ‘Grande naine y ‘Calcutta 4’ aclimatizadas durante tres meses en casa decultivo
Inoculación artificial
La preparación de la suspensión micelial de M. fijiensis así como el proceso de inoculación
artificial se llevaron a cabo según el protocolo descrito por Alvarado et al. (2003), que se
describe brevemente.
Aislado del hongo
Se empleó la cepa CCIBP-Pf83 de M. fijiensis procedente de la Colección de Cultivos
Microbianos del Laboratorio de Microbiología Aplicada del Instituto de Biotecnología de las
Plantas, Cuba.
Preparación de la suspensión micelial
Se tomó un fragmento de micelio de la cepa CCIBP-Pf83 crecida en tubos de ensayo en
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA, del inglés: Potato Dextrose Agar),
conservados a 4ºC y se inoculó en frascos Erlenmeyer (250 mL de volumen) con 100mL
de medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (PDB) (Difco), pH 5,6. Los frascos se colocaron
en una zaranda orbital (Retomed), a 120 rpm durante 14 días, a temperatura ambiente.
Después de transcurrido este tiempo se eliminó el medio de cultivo por decantación, se
tomó 1g de micelio y se homogeneizó con 30 mL de agua destilada estéril en tubos
plásticos de 45 mL (FALCON) utilizando una batidora (Ultraturrax T25), durante 1 min.
Posteriormente se filtró (40 μm), se determinó la concentración mediante observación en
un microscopio óptico Olympus (100x), usando una cámara de Neubauer y se ajustó la
concentración con agua destilada estéril hasta aproximadamente 5,7.105 fragmentos de
micelio/mL. Finalmente se le adicionó gelatina al 1% (p/v) para aumentar la adhesión del
inóculo a la superficie de la hoja. La inoculación se realizó por la parte abaxial de las hojas
y con la ayuda de un pincel (Figura 3).
Figura 3. Procedimiento general para la inoculación artificial de plantas de Musa spp. en casa decultivo empleando suspensiones miceliales de M. fijiensis (Alvarado et al., 2003)
Se inocularon las tres primeras hojas de 30 plantas con suspensión micelial del hongo e
igual número de plantas con gelatina al 1% (p/v), las cuales se usaron como controles. Las
plantas se ubicaron completamente al azar en casa de cultivo.
Procesamiento estadístico
El procesamiento estadístico de los datos de las variables estudiadas se realizó con el
paquete estadístico Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 16 para Windows.
En cada acápite se detalla el procedimiento utilizado para el análisis de las diferentes
variables. En todos los casos se utilizó la posibilidad de generar hasta 10 000 muestras
con distribución similar a la real mediante la técnica de Monte Carlo, con una significación
del 99% de confianza.
3.1 Caracterización fenotípica de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ en casa de
cultivo
Con el objetivo de caracterizar fenotípicamente plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’,
estas se describieron morfológicamente y se determinó el grosor, a sí como la densidad
estomática de las hojas.
3.1.1 Descripción morfológica de las plantas
Con el fin de describir las plantas según sus características fenotípicas en condiciones de
casa de cultivo, se emplearon los siguientes descriptores para plantas de Musa spp.
adultas en condiciones de campo y se utilizó como referencia la tabla de colores adjunta
(IPGRI-INIBAP/CIRAD, 1996):
- Hábito foliar
- Altura del pseudotallo (cm)
- Color del pseudotallo
- Apariencia del pseudotallo
- Color de la savia
- Canal del peciolo de la hoja 3
- Longitud de la lámina (cm)
- Ancho de la lámina (cm)
- Color de la cara superior de la lámina
- Aspecto de la cara superior de la lámina
- Color de la cara inferior de la lámina
- Aspecto de la cara inferior de la lámina
- Presencia de cera en la lámina
- Forma de la base de la lámina
Se observaron y registraron estas características en 20 plantas de ‘Grande naine’ e igual
número de plantas de ‘Calcutta 4’ y se organizaron en una tabla resumen.
3.1.2 Determinación del grosor de la hoja
Para comparar el grosor de las hojas de ambos genotipos, se colectó la tercera hoja de
diez plantas seleccionadas al azar. Se realizaron cortes transversales a mano, con la
ayuda de una cuchilla afilada, a partir de fragmentos foliares de 5 cm2 de área fijados en
alcohol al 70% (v/v), los cuales fueron coloreados con azul de toluidina al 0,5% (v/v) y
colocados en glicerina acuosa 1:1(v/v). Las observaciones se realizaron empleando un
microscopio óptico Olympus con un aumento de 200x. Se determinó el grosor de las hojas
utilizando un micrómetro ocular. En total se realizaron 50 mediciones en cada genotipo.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
3.1.3 Determinación de la densidad estomática
La densidad estomática fue determinada en la parte abaxial de la hoja, en las tres
primeras hojas de diez plantas, de ambos genotipos. Se tomaron tres fragmentos (2 cm2
de área) de cada sección de la hoja (basal, media y apical), por cada hoja. Posteriormente,
se colocaron en un portaobjetos con una gota de agua, se colocó un cubreobjeto y se
observó al microscopio óptico Olympus (200x). Se contó el número de estomas en diez
campos (0,58 mm2) del microscopio óptico, por cada segmento de la hoja analizado, para
un total de 90 mediciones en cada genotipo. Los resultados fueron expresados como
densidad estomática (número de estomas/mm2).
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Kruskal-Wallis, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
3.1.4 Determinación del contenido de lignina
Para comparar el contenido de lignina constitutiva en las hojas de ambos genotipos, se
colectaron las tres primeras hojas de cinco plantas seleccionadas al azar. Se cuantificó el
contenido de lignina según el protocolo descrito por Kirk y Obst (1988). Las muestras se
procesaron inmediatamente después de colectadas y se homogeneizaron en nitrógeno
líquido usando un mortero y pistilo preenfriados. Posteriormente, se extrajeron en metanol
y fueron secadas en campana, proceso que se repitió cuatro veces. De cada muestra se
tomaron 200 mg y se hidrolizaron en 4 mL de H2SO4 al 72% (v/v) a 30ºC durante 1 h. El
hidrolizado fue diluido en 112 mL de agua y mantenido en autoclave a 121ºC y 1,2 atm,
durante 1 h. La solución fue filtrada utilizando papel de filtro Whatman No. 41 y el residuo
sólido fue lavado con abundante agua, posteriormente secado en campana y luego se
pesó en balanza analítica (Sartorius) y se determinó el porcentaje de residuos de la pared
celular con respecto a los 200 mg para cada muestra. El contenido de lignina se expresó
como porcentaje de residuos de la pared celular.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
3.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos en los diferentes estados
de síntoma en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta 4‘ inoculadas
artificialmente con M. fijiensis
Con el objetivo de detectar la presencia de compuestos bioquímicos tales como: lignina,
fenoles y peróxido de hidrógeno, se evaluó el desarrollo y evolución de los síntomas en
ambos genotipos y se emplearon técnicas histoquímicas.
3.2.1 Evaluación del desarrollo y evolución de los síntomas
Se inocularon plantas según el procedimiento descrito (Inoculación artificial) y se
observaron cada tres días para describir la evolución de los síntomas desde el día tres
hasta los 63 días posteriores a la inoculación (dpi). La evaluación cualitativa de los
síntomas en las tres hojas inoculadas por planta se realizó según la escala propuesta por
Alvarado et al. (2003).
Además, se utilizaron variables epifitiológicas que permitieron comparar la evolución de los
síntomas en ambos fenotipos de la resistencia. Para esto se determinó el período de
incubación definido como el número de días desde el momento de la inoculación hasta la
aparición de los primeros síntomas (Molina y Castaño, 2003) y el tiempo de evolución de
los síntomas definido como la duración en días de la evolución de los síntomas desde el
estado 1 al 6 propuestos por Fouré (1985) (Hernández y Pérez, 2001).
3.2.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos por estado de síntoma
Colecta de las muestras
Para el análisis histoquímico se colectaron al azar tres lesiones por estado de síntoma de
tres plantas inoculadas, para un total de nueve lesiones por estado de síntoma, de ambos
genotipos. Se colectaron además, igual número de fragmentos de tejido sin síntomas de
plantas controles.
Deposiciones de lignina
Las deposiciones de lignina en las paredes celulares se visualizaron utilizando una tinción
con solución de fluoroglucina al 1% (p/v) en etanol al 70% (v/v), durante 5 minutos
(Southerton y Deverall, 1990). Se adicionaron dos gotas de ácido clorhídrico (HCl)
concentrado, se enjuagó, se colocó un cubreobjeto y se observó utilizando un microscopio
Olympus (400x). Ante la presencia de lignina se observan áreas de color rojo/rosado
(Gahan, 1984). Las observaciones fueron fotografiadas inmediatamente.
Acumulación de peróxido de hidrógeno
Las muestras se sumergieron durante 30 min en una solución de 1 mg/mL de 3,3’
diaminobenzidina en HCl, pH 4, con el fin de detectar la presencia de peróxido de
hidrógeno (H2O2) en el tejido vegetal (Thordal-Christensen et al., 1997) y se observaron a
través de un microscopio óptico (400x). La diaminobenzidina se polimeriza y forma un
color marrón intenso como producto de la reacción con H2O2 en presencia de la enzima
peroxidasa. Esta pigmentación se observa al remover la clorofila del tejido vegetal
hirviéndolo en una solución de etanol al 95% (v/v), durante 5 min. Las observaciones
fueron fotografiadas inmediatamente.
Acumulación de compuestos fenólicos
Para la detección de compuestos fenólicos se empleó el método colorimétrico descrito por
Reeve (1951). Se agregó una gota de nitrato de sodio acuoso al 10% (v/v), una gota de
ácido acético acuoso al 10% (v/v) y luego una gota de urea acuosa al 20% (p/v). Después
de 3 min, se adicionaron dos gotas de NaOH 2N. Los fragmentos vegetales se colocaron
en un portaobjetos y se cubrieron con un cubreobjetos, para ser observados al
microscopio óptico (200x). En presencia de los compuestos fenólicos se observa una
coloración roja intensa. Las observaciones fueron fotografiadas inmediatamente.
3.3 Cuantificación de compuestos enzimáticos y no enzimáticos en diferentes
tiempos después de la inoculación en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta
4‘ inoculadas artificialmente con M. fijiensis
Para comparar la respuesta en el tiempo de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’
inoculadas artificialmente con M. fijiensis se determinó la actividad de tres enzimas y se
cuantificó la presencia de otros tres compuestos no enzimáticos relacionados con la
respuesta defensiva de la planta. La inoculación de las plantas se llevó a cabo según el
procedimiento descrito (Inoculación artificial). Las muestras se colectaron a los 3, 6, 8, 10,
14 y 16 días posteriores a la inoculación (dpi) y se conservaron a -80ºC hasta su
procesamiento.
3.3.1 Determinación de actividad enzimática
Para determinar la actividad enzimática peroxidasa, fenilalanina amonio-liasa y β-1,3
glucanasa se utilizaron las tres primeras hojas de tres plantas inoculadas y no inoculadas
(control) de ‘Grande naine’ y ’Calcutta 4’. Se homogeneizaron (0,5 g) en nitrógeno líquido
usando un mortero y pistilo preenfriados. Se extrajeron en 2 mL de solución tampón de
Sodio-fosfato 0,1 M (pH 7,0), con la adición de inhibidor de proteasa (Protease Inhibitor
Cocktail for General Use. Sigma-Aldrich). El homogenizado fue centrifugado a 10 000 g
durante 20 min, a 4ºC y el sobrenadante (SN) fue usado como extracto enzimático para las
determinaciones de la actividad enzimática. Se utilizaron tres réplicas de cada muestra, en
ambos genotipos.
Se compararon además, los resultados obtenidos de la cuantificación de las distintas
actividades enzimáticas, entre las plantas inoculadas de ambos genotipos.
Peroxidasa (EC 1.11.1.7)
La actividad peroxidasa fue determinada mediante un ensayo colorimétrico según Cakmak
et al. (1993). La mezcla de reacción consistió en 1,5 mL de guayacol al 0,05% (v/v), 0,5
mL del extracto enzimático y 0,5 mL de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 1% (v/v). La
mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se registró el
incremento en la Densidad Óptica (DO) debido a la oxidación del guayacol a 470 nm (ξ =
26,6 mM-1 cm-1), a intervalos de 20 segundos durante 3 min utilizando un
espectrofotómetro UV-visible (Genesys 6, Thermo Electron Corporation, USA). El extracto
enzimático fue calentado en agua hirviendo durante 5 min y fue usado como blanco
(Hammerschmidt et al., 1982). La actividad enzimática (AE) se expresó como µmol/min/g
de masa fresca.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
Fenilalanina amonio-liasa (EC 4.3.1.24)
La actividad enzimática fenilalanina amonio-liasa se cuantificó mediante el método descrito
por Ross y Sederoff (1992). La mezcla de reacción contuvo 100 µL de extracto enzimático,
500 µL de solución tampón Tris-HCl a 50 mM (pH 8,8) y 600 µL de L-fenilalanina a 1mM,
luego fue incubada a temperatura ambiente por 30 min. La reacción se detuvo adicionando
HCl a 2 N. Posteriormente, se agregaron 1,5 mL de tolueno, se mezcló vigorosamente
durante 30 s, se centrifugó (1 000 g, 5 min) y se separó la fracción de tolueno que contenía
el ácido trans-cinámico. Se registró la lectura de la DO en espectrofotómetro (Genesys 6,
Thermo Electron Corporation, USA) a una longitud de onda de 290 nm contra un blanco de
tolueno. Se utilizó una curva patrón con concentraciones conocidas de ácido cinámico en
tolueno, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. La actividad enzimática se
expresó como nmoles de ácido cinámico liberado/min/g de masa fresca.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
β-1,3 glucanasa (EC 3.2.1.39)
La actividad enzimática β-1,3 glucanasa se cuantificó mediante un ensayo colorimétrico
(Pan et al., 1991), a través de la determinación de los residuos de azúcares reducidos
liberados. Se utilizó laminarin como sustrato y glucosa como estándar. La mezcla de
reacción consistió en 62,5 µL de extracto enzimático y 62,5 µL de laminarin al 4% (p/v),
posteriormente se incubó a 40ºC, durante 10 min. La reacción se detuvo con la adición de
375 µL de ácido dinitrosalicílico (300 mL de NaOH al 4,5% en 880 mL que contenían 8,8 g
de ácido dinitrosalicílico y 22,5 g de tartrato de sodio-potasio) y se calentó por 5 min en
baño de agua hirviendo. La solución coloreada resultante se diluyó con agua destilada, se
mezcló vigorosamente y se registró la DO a 500 nm en espectrofotómetro UV-visible
(Genesys 6, Thermo Electron Corporation, USA). El extracto enzimático mezclado con el
laminarin al tiempo cero, se usó como blanco. La actividad enzimática se expresó como µg
de glucosa liberada/min/g de masa fresca.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
3.3.2 Cuantificación de compuestos no enzimáticos
Para cuantificar el contenido de fenoles totales, del anión superóxido y de antocianinas, se
utilizaron las tres primeras hojas de tres plantas inoculadas y no inoculadas (control) de
ambos genotipos. Se utilizaron tres réplicas de cada muestra, en ambos genotipos.
Se compararon, además, entre las plantas inoculadas de ambos genotipos, los resultados
de la cuantificación de los tres compuestos.
Fenoles totales
El contenido de compuestos fenólicos totales se determinó según procedimiento descrito
por Bray y Thorpe (1954). Las muestras (0,5 g) se homogeneizaron en nitrógeno líquido
usando un mortero y pistilo preenfriados, se mezclaron con 5 mL de etanol al 80% (v/v) y
posteriormente se calentaron a 50ºC, por 30 min. El extracto se centrifugó a 8 000 g por 10
min. Se tomó una alícuota de 1 mL del sobrenadante y se enrasó hasta 3 mL con agua
destilada, se agregó 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 2 mL de carbonato de sodio al
20% (p/v). Las muestras se calentaron durante 1 min en baño de agua hirviendo y
posteriormente se enfriaron en agua corriente. La solución se diluyó hasta 10 mL con agua
destilada y la densidad del color azul se midió a 750 nm en espectrofotómetro (Genesys 6,
Thermo Electron Corporation, USA) contra el blanco (1mL de etanol al 80 % en lugar del
extracto y se siguió todo el procedimiento descrito anteriormente).
Se empleó ácido gálico como estándar a partir del cual se calculó la concentración de
fenoles totales de la muestra. El contenido de fenoles se expresó como mg de fenoles
totales/g de masa fresca.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
Anión superóxido
Se midió la reducción del Nitroblue tretazolium (NBT) (Sigma-Aldrich) utilizando el método
descrito por Doke (1983) para la determinación del anión superóxido (O*-2). Las muestras
se homogeneizaron en nitrógeno líquido usando un mortero y pistilo preenfriados, se
adicionaron 2 mL de solución tampón de Sodio-fosfato 0,1 M (pH 7). El homogenizado fue
centrifugado a 10 000 g durante 20 min, a 4ºC y el sobrenadante (SN) fue usado como
extracto vegetal. El extracto vegetal (30 µL) se incubó con 3 mL de tampón fosfato de
potasio 0,01 M, pH 7,8, que contenía 0,05 % (p/v) de NBT y NaN3 (azida sódica) a 10 Mm,
durante 30 min. Posteriormente la mezcla se calentó a 85ºC por 15 min y luego se enfrió a
temperatura ambiente. El contenido del anión susperóxido se expresó como el Incremento
de la DO a 580 nm (1h)/g de masa fresca.
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
Antocianinas
Las muestras se procesaron inmediatamente después de colectadas y se homogeneizaron
usando nitrógeno líquido con la ayuda de un mortero y pistilo preenfriados. La extracción
se realizó con 10 mL de metanol acidificado (40 mL H2SO4, 1 760 mL de metanol, pH 1).
Las muestras se calentaron en baño de agua hirviendo, durante 1,5 min y luego se
mantuvieron en la oscuridad durante 24 h, a 4ºC. Posteriormente se centrifugaron (699 g;
10 min) y se midió la DO a 530 y 657 nm, utilizando un espectrofotómetro UV-visible
(Genesys 6, Thermo Electron Corporation, USA). La concentración de antocianinas se
corrigió para los productos de degradación de la clorofila utilizando la fórmula:
DO 530nm-0,25 * DO 657nm (Mancinelli et al., 1975).
El resultado se expresó como contenido de antocianinas (mg/g de masa fresca).
Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no
paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Caracterización fenotípica de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ en casa de
cultivo
4.1.1 Descripción morfológica de las plantas
Las características fenotípicas de las plantas de ambos genotipos en casa de cultivo
coinciden en su mayoría con las descritas en el Catálogo de Germoplasma de Musa spp.
(Daniells et al., 2001), para plantas crecidas en condiciones de campo.
En cuanto al color del pseudotallo, se observaron diferencias entre ambos genotipos; en el
caso de ‘Grande naine’, esta característica difiere además, de la descrita para las plantas
adultas en condiciones de campo. En las plantas analizadas de dicho cultivar, se observó
un color verde-rojizo, mientras que en las plantas adultas el pseudotallo es de color verde-
amarillo. En las plantas de ‘Calcutta 4’ el color verde-amarillo del pseudotallo coincide con
el descrito para plantas adultas.
Sin embargo, en cuanto a la apariencia del pseudotallo, en las plantas evaluadas de
ambos genotipos, las características coinciden con las descritas para plantas adultas en
campo: brillante (no ceroso) y opaco (ceroso) para ‘Grande naine y ‘Calcutta 4’,
respectivamente. Las características evaluadas se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Características morfológicas de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ crecidas durantetres meses en condiciones de casa de cultivo
Descriptores de la planta ‘Grande naine’ ‘Calcutta 4’
Hábito foliar
Normal Decumbente
Altura del pseudotallo (cm) 14,16 14,93
Color del pseudotallo
Verde-rojizo Verde-amarillo
Apariencia del pseudotallo Brillante (no ceroso) Opaco (ceroso)Color de la savia Lechoso Lechoso
Canal del peciolo de la hoja 3
Abierto con márgenes alados Estrecho con márgenes erectos
Longitud de la lámina (cm) 22,96 21,25Ancho de la lámina (cm) 9,78 7,69
Color de la cara superior de lalámina
Verde oscuro con rojo violáceo(presencia de machas grandes rojo
violáceo)Verde medio
Aspecto de la cara superior dela lámina
Opaco Opaco
Color de la cara inferior de lalámina
Verde plateado Verde claro
Aspecto de la cara inferior dela lámina
Opaco Brillante
Presencia de cera en la lámina Muy ceroso Poca cera
Forma de la base de la lámina
Ambas afiladas Una redondeada y una afilada
Se observó la presencia de cera en las hojas de las plantas de ‘Grande naine’ y fue mayor
en la parte abaxial de la hoja respecto a la adaxial, mientras que en plantas de ‘Calcutta 4’,
se observó la presencia de muy poca cera en las hojas, tanto por la parte adaxial como por
la abaxial.
La presencia de cera en las hojas de plantas de Musa spp. ha sido descrita por Sandoval
(1989) en plantas de tres meses de aclimatización en invernadero. Este autor planteó
además, que la cera presente en las plantas crecidas en estas condiciones es mucho
menor que la observada en plantas de campo, como consecuencia de la alta humedad
relativa y alta temperatura que se genera.
4.1.2 Determinación del grosor de la hoja
No se encontraron diferencias significativas en cuanto al grosor de las hojas entre ambos
genotipos a nivel de casa de cultivo; los valores medios obtenidos fueron de 33,11 µm y
32,75 µm en ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’, respectivamente.
Las características morfológicas de las hojas, en cuanto a la composición y distribución de
las distintas capas celulares, fueron semejantes en ambos genotipos y coinciden además
con las descritas por Sandoval (1989) en plantas de diferentes genotipos de Musa,
aclimatizadas durante tres meses en invernadero.
Se observó, además, la presencia de cutícula en la superficie adaxial de las hojas en
ambos genotipos.
Aunque en este trabajo no se observaron diferencias significativas, autores como Valerio
et al. (2002) encontraron diferencias significativas en el grosor de la hoja de varios
genotipos de Musa con diferente grado de susceptibilidad a la Sigatoka negra, los mayores
valores se observaron en los cultivares resistentes de FHIA y el somaclón ‘CIEN BTA-03’ y
estos fueron bajos en el cultivar ‘Yangambí km5’, también resistente. Esto evidencia que
aunque estos caracteres constituyen barreras mecánicas en los órganos vegetales que
dificultan el contacto o entrada de los agentes patógenos, la resistencia a la enfermedad
no está ligada directamente a los caracteres anatómicos en algunos cultivares.
4.1.3 Determinación de la densidad estomática
En este estudio se observó que la densidad estomática entre ambos genotipos fue
significativamente diferente; en el genotipo resistente ‘Calcutta 4’ (AA) el valor medio fue
de 224,54 estomas/mm2, mientras que en el genotipo susceptible ‘Grande naine’ (AAA) fue
de 154,80 estomas/mm2, (Figura 4). Se ha planteado que estas diferencias en cuanto a la
ploidía afectan la expresión fenotípica de caracteres cuantitativos en plantas de Musa spp.,
según han señalado autores como Vandenhout et al. (1995), los cuales plantean que bajos
niveles de ploidía están significativamente correlacionados con altas densidades
estomáticas.
Figura 4. Densidad estomática en la zona abaxial de hojas de A) ‘Grande naine’ (baja densidadestomática) y B) ‘Calcutta 4’ (alta densidad estomática), a: zona apical, m: zona media y b: zonabasal de la hoja (200x)
A a m b
B a m b
En ambos genotipos, la densidad estomática fue significativamente mayor en la zona
apical respecto a las zonas media y basal de la hoja (Tabla 4). Al respecto, se ha
identificado que la densidad de los estomas en hojas de musáceas es mayor en la parte
abaxial y en la zona apical de la hoja, sitios donde el tubo germinativo del hongo tiene una
mayor probabilidad de penetrar (Sandoval y Muller, 1999).
Tabla 4. Densidad estomática (No. de estomas/mm2) en las distintas zonas de la hoja de plantas de‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’
‘Grande naine’ ‘Calcutta 4’Zona Media Rangos
medios Media Rangosmedios
Apical 235,31 202,30 a 163,16 177,85 aMedia 231,19 143,59 b 155,33 166,59 bBasal 207,51 65,12 c 145,71 66,56 c
Rangos medios con letras diferentes en una misma columna difieren por Prueba no paramétrica deKruskal-Wallis para p<0,01
Estos resultados coinciden con los informados por Valerio et al. (2002), los cuales
observaron una mayor densidad estomática en el cultivar resistente ‘Yangambí km5’, que
en otros híbridos de mayor ploidía analizados. Sin embargo, autores como Hernández et
al. (2006) observaron que los cultivares de plátano FHIA 20, FHIA 21 y topocho ‘Pelipita’,
caracterizados como resistentes a la Sigatoka negra, presentaron una densidad
estomática mucho menor respecto a la de los clones de plátano ‘Hartón’ y ‘África’
clasificados como susceptibles a la enfermedad.
Se ha planteado, que la densidad estomática es uno de los mecanismos de resistencia
estructural que actúan como barreras físicas que impiden la penetración del patógeno en
la planta. Además, el número de estomas puede indicar la eficiencia de determinada
especie vegetal en el proceso de respiración y fotosíntesis, que contribuyen, entre otras
funciones, en la formación de sustancia químicas capaces de frenar el avance del
patógeno en la hoja (Beveraggi et al., 1995). No obstante, algunos estudios realizados en
evaluaciones sobre las características morfológicas y fisiológicas de los estomas en hojas
de plantas de Musa spp., mostraron que la resistencia a la Sigatoka negra, no está
determinada por este elemento morfológico (Vuylsteke et al., 1998).
Es por esto que, a pesar de que la densidad estomática constituye una barrera mecánica
que dificulta el contacto o entrada del patógeno, no constituye un elemento determinante
en el fenotipo de la resistencia de algunos genotipos, lo que se cumple para los dos
genotipos analizados en este trabajo.
4.1.4 Determinación del contenido de lignina
En este estudio no se encontraron diferencias significativas en cuanto al contenido de
lignina constitutiva en las hojas de las plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ analizadas;
la media de los valores obtenidos fue de 14,06 y 13,78 (% de residuos de la pared celular),
respectivamente.
El contenido de lignina constitutiva se ha relacionado con el mecanismo de defensa de la
planta, como parte de la respuesta constitutiva de esta ante la infección del patógeno. En
este sentido, se ha demostrado que en plantas de O. sativa infectadas con P. grisea la
penetración del patógeno es principalmente a través de la lignina de la pared celular
(Schaffrath et al., 1996).
Se conoce además, que la lignina, los flavonoides, la dopamina, el ácido ferúlico, entre
otros, son componentes constitutivos que pueden estar involucrados en los mecanismos
de defensa constitutiva o pasiva en las plantas, actuando como barreras físicas y químicas
ante la penetración del patógeno (Valette et al., 1998). Debido a la compleja naturaleza de
los polímeros de lignina, es difícil su degradación, por lo cual este constituye uno de los
prerrequisitos para la patogénesis en la interacción planta-patógeno.
En general, aunque se ha planteado que la resistencia de algunas variedades de Musa sp.
a la Sigatoka negra está relacionada directamente a la presencia de barreras físicas
asociadas a la anatomía foliar (Valerio et al., 2002), en el caso de los genotipos ‘Grande
naine’ y ‘Calcutta 4’, características como el grosor de la hoja, la densidad estomática y el
contenido de lignina constitutiva en las hojas, no parecen ser determinantes en el tipo de
respuesta susceptible o resistente que se establece en este patosistema. Es por esto que,
se requiere el estudio de la respuesta inducida de la planta ante la infección del patógeno
para lograr un mayor entendimiento de esta interacción.
4.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos en los diferentes estados
de síntoma en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta 4‘ inoculadas
artificialmente con M. fijiensis
4.2.1 Evaluación del desarrollo y evolución de los síntomas
Las características de los síntomas y su evolución pudieron observarse en ambos
genotipos utilizando el método de inoculación artificial descrito previamente. El período de
incubación en plantas infectadas de ‘Grande naine’ fue de 14 días, mientras que en
plantas infectadas de ‘Calcutta 4’ fue de seis días aproximadamente (Figura 5A y B). En
plantas infectadas del cultivar susceptible ‘Grande naine’ se observó la evolución completa
de los síntomas desde el estado 1 hasta el 5. El tiempo de evolución de estos fue de 52
días, lo que coincide con los resultados descritos por Alvarado et al. (2003) y Leiva (2008)
en dicho cultivar, bajo condiciones experimentales similares.
En el genotipo resistente ‘Calcutta 4’ se observaron síntomas que solo evolucionaron
hasta el estado 3 de la enfermedad, resultados similares fueron descritos por Leiva (2008)
en el genotipo resistente ‘Yangambí km5’ en condiciones similares.
Figura 5. Evolución de los síntomas en plantas de A) ‘Grande naine’ y B) ‘Calcutta 4’ inoculadas conM. fijiensis, en casa de cultivo
En las plantas inoculadas de ‘Grande naine’, se observó la presencia de lesiones
puntiformes de color pardo-rojizo por la parte abaxial de las hojas alrededor de los 14 dpi
(Figura 5A y 6A a). Dichas lesiones evolucionaron hacia la formación de manchas de
contornos irregulares de coloración pardo-rojizas alrededor de los 21 dpi (Figura 5A y 6A
b), los cuales fueron visibles por la parte adaxial de las hojas (Figura 5A y 6A c) a los 30
dpi aproximadamente. A partir de los 38 dpi se observaron manchas negras con bordes
cloróticos y halos acuosos (Figura 5A y 6A d). Posteriormente, al cabo de los 52 dpi, se
observó la presencia de manchas grises circulares o elípticas con centros secos (Figura
5A y 6A e), las cuales en su mayoría, se unieron y formaron manchas necróticas. La
evolución de los síntomas en el genotipo ‘Grande naine’ así como sus características
coinciden con lo descrito por Leiva (2008) en dicho cultivar bajo condiciones similares.
En plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ los primeros síntomas se observaron a los 6 dpi
(Figura 5A y 6B a) y estos presentaron las mismas características observadas en las
plantas infectadas de ‘Grande naine’, igualmente ocurrió con los síntomas en estado 2, los
cuales se observaron alrededor de los 14 dpi (Figura 5A y 6B b) y con los síntomas en
estado 3, los cuales se observaron a los 21 dpi (Figura 5A y 6B c).
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
14 17 21 24 30 38 45 52 60
Días posteriores a la inoculación
Frec
uenc
ia d
e ap
aric
ión
de lo
ssí
ntom
as543210
A
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
6 10 14 21 24 30 38 45 60
Días posteriores a la inoculación
Frec
uenc
ia d
e ap
aric
ión
de lo
ssí
ntom
as
543210
B
Figura 6. Síntomas en hojas de plantas de A) ‘Grande naine’ y B) ‘Calcutta 4’ en diferentes estados,causados por la inoculación artificial de M. fijiensis., en casa de cultivo. (a) Lesiones puntiformesrojizas (estado 1), (b) manchas con contornos irregulares de coloración pardo-rojiza por la parteabaxial de la hoja (estado 2), (c) manchas con contornos irregulares de coloración pardo-rojiza porla parte adaxial de la hoja (estado 3) y (d) mancha negra con borde clorótico y halo acuoso (estado4) y (e) mancha negra con centro gris seco (estado 5)
4.2.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos por estado de síntoma
Se detectó la presencia de lignina, fenoles y peróxido de hidrógeno, como respuesta de la
planta ante el ataque del patógeno, mediante las técnicas histoquímicas empleadas.
Deposiciones de lignina
Se observó la presencia de deposiciones de lignina en las paredes de las células cercanas
al posible sitio de penetración del patógeno en ambos genotipos, solo en el tejido vegetal
con síntomas.
Tanto en el genotipo susceptible como en el resistente, en los primeros estados de
síntomas las deposiciones de lignina se presentaron de forma más localizada, mientras
que a medida que estos evolucionaron estas aumentaron gradualmente involucrando un
mayor número de células dañadas, lo que estuvo en correspondencia con la evolución de
los síntomas observada macroscópicamente (Figura 7A y B).
a b c d e
a b c
A
B
Figura 7. Deposiciones de lignina en las paredes celulares en hojas de plantas inoculadas con M.fijiensis, de A) ‘Grande naine’, en tejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-5) yde B) ‘Calcutta 4’, en tejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-3), (400 x)
Al respecto, autores como Smith et al. (2007) observaron que en lesiones de plantas de
Eucalyptus globulus (susceptible) y Eucalyptus nitens (resistente), infectadas naturalmente
con Mycosphaerella spp., ocurrieron deposiciones de lignina en las paredes celulares, las
cuales se incrementaron a medida que evolucionaron los síntomas y fueron mayores en el
genotipo resistente.
Igualmente, la acumulación de lignina y compuestos fenólicos ha sido relacionada con la
resistencia a enfermedades en otros patosistemas, tales como: Tricuticum aestivum-
Puccinia graminis f. sp. tritici (Beardmore et al.,1983), S. lycopersicum-Verticillium
alboatrum (Robb et al., 1987) y O. sativa-Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Reimers y
Leach, 1991). Estos autores observaron deposiciones de lignina en el tejido de plantas
4321 50
0 1 2 3
A
B
infectadas como respuesta al ataque del patógeno y en algunos casos estas deposiciones
fueron mayores en las plantas con resistencia al patógeno, respecto a las susceptibles.
Se ha demostrado además, que después que ocurre la infección por parte del patógeno la
planta responde rápidamente mediante la acumulación de fitoalexinas en el sitio de
penetración y produce lignina y otros productos con el fin de frenar el crecimiento del
patógeno. Esto evidencia el papel de la lignificación de las células en el incremento de la
resistencia en la planta frente al ataque fúngico (Ferreira et al., 2007).
En este sentido, existen varios informes en plantas de cereales tratadas con enzimas
inhibidoras de la formación de lignina, en las cuales se favoreció la penetración del
patógeno en el tejido vegetal (Zeyen et al., 1995). Igualmente, se ha planteado que la
lignina juega un papel importante en el mecanismo de respuesta hipersensible (HR). En
plantas de Hordeum vulgare, Triticum spp. y Avena sativa tratadas con inhibidores de
precursores de la lignina, la HR se suprimió y la infección del patógeno fue exitosa (Zeyen
et al., 1995; Khurana et al., 2005; Vianello et al., 2007).
Acumulación de peróxido de hidrógeno
Se observó la acumulación de peróxido de hidrógeno en los tejidos de hojas analizados,
tanto en el genotipo susceptible como en el resistente. La acumulación de peróxido se
observó en los fragmentos foliares correspondientes a todos los estados de síntomas, la
cual aumentó a medida que estos evolucionaron como se observa en las figuras 8A y B.
Esta acumulación de peróxido no se observó en el tejido sin síntomas analizado.
Figura 8. Acumulación de peróxido de hidrógeno en hojas de plantas inoculadas con M. fijiensis, deA) ‘Grande naine’, en tejido sin inocular (0) y en diferentes estados de síntomas (1-5) y de B)‘Calcutta 4’, en tejido sin inocular (0) y en diferentes estados de síntomas (1-3), (400 x)
En las muestras de ‘Calcutta 4’, se observó una mayor intensidad en la coloración
respecto a las muestras de ‘Grande naine’, lo cual está relacionado directamente con una
mayor acumulación de peroxido de hidrógeno alrededor del posible sitio de infección.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Asselbergh et al. (2007) en plantas de
S. lycopersicum, quienes observaron una rápida y mayor acumulación de peróxido de
hidrógeno en el sitio de inoculación del patógeno en un mutante resistente al hongo B.
cinerea, al compararlo con el genotipo silvestre.
Igualmente, la acumulación de peroxido de hidrógeno alrededor del sitio de infección ha
sido observado como mecanismo de defensa en plantas en otros patosistemas como:
Sorghum vulgare-Sclerotium rolfsii (Maurya et al., 2007) y Lactuca sativa- Bremia lactucae
43210 5
0 1 2 3
A
B
(Lebeda et al., 2008). Estos autores observaron la acumulación de peróxido de hidrógeno
solo en las plantas inoculadas y en una mayor proporción en las plantas resistentes
respecto a las susceptibles.
El papel del H2O2 en la defensa de la planta frente al patógeno ha sido demostrado
además por autores como Cohen et al. (2009), los cuales observaron en plantas de
Lactuca sativa L. tratadas con DL-β- ácido amino-butírico, con resistencia a Bremia
lactucae, un aumento de la acumulación de peróxido de hidrógeno en el sitio de
penetración del patógeno, mientras que en plantas no tratadas, no se observó dicha
acumulación en el tejido vegetal.
Se ha planteado que el incremento en los niveles de H2O2 y de otras especies reactivas del
oxígeno desencadena la respuesta hipersensible, así como la rápida muerte celular en el
sitio de infección, lo que se traduce en la formación de lesiones visibles en las plantas
(Mateo et al., 2004). Además, se ha señalado que el H2O2 tiene un importante papel en la
restricción de la penetración de los patógenos, así como en la activación de varios genes
relacionados con el proceso de defensa de la planta (Apel y Hirt, 2004).
Acumulación de compuestos fenólicos
En este trabajo se observó que las células cercanas al posible sitio de penetración de M.
fijiensis se modificaron con la acumulación de compuestos fenólicos, la cual aumentó
gradualmente en la medida en que evolucionaron los síntomas en ambos genotipos. La
acumulación de fenoles solo se observó en el tejido foliar correspondiente a las lesiones
de plantas inoculadas, no siendo así en el tejido sin síntomas de plantas controles (Figura
9A y B).
Figura 9. Acumulación de fenoles en hojas de plantas inoculadas con M. fijiensis, de A) ‘Grandenaine’, en tejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-5) y de B) ‘Calcutta 4’, entejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-3), (200 x)
Este resultado concuerda con lo informado por varios autores en otros patosistemas,
quienes observaron la acumulación de fenoles en el tejido foliar de plantas inoculadas con
el patógeno (Maurya et al., 2007; Asselbergh et al., 2007; Cohen et al., 2009).
Igualmente, Chen et al. (2000) y Mohammadi y Kazemi (2002), en plantas de Cucumis
sativus infectadas con Pythium aphanidermatum y en plantas de T. sativum inoculadas con
F. graminearum, respectivamente, observaron la acumulación de fenoles en el tejido
vegetal en las plantas inoculadas respecto a los controles.
En este sentido, se ha señalado que la acumulación de fenoles cercano al sitio de
penetración es una evidencia del desencadenamiento de la respuesta defensiva en las
43210 5
0 1 2 3
A
B
plantas y se ha descrito como uno de los eventos moleculares más importantes como
parte del proceso defensivo ante el ataque por patógenos (Walters et al., 2005).
Además, los compuestos fenólicos se inducen en la mayoría de los tejidos vegetales como
respuesta de defensa en la interacción con el patógeno y al igual que la lignina, los fenoles
son de por sí tóxicos a los patógenos (Basha et al., 2006) y su polimerización hace a la
pared celular más gruesa y fuerte (Ferreira et al., 2006).
Se ha demostrado a través de observaciones microscópicas, que justo después de que el
hongo penetra a través de los estomas, se producen reacciones químicas de
hipersensibilidad que evitan la expansión del patógeno por el tejido vegetal. No obstante,
en muchos casos, el patógeno supera rápidamente esta resistencia química y por
consiguiente no es duradera (Hernández et al., 2006).
Además, existen evidencias substanciales de que la rapidez de la respuesta histoquímica
está relacionada directamente con la resistencia ante la infección en otras interacciones
planta-patógeno como son S. lycopersicum-Cladosporium fulvum (Lazarovits y Higgins,
1976) y S. lycopersicum-F. oxysporum (Beckman et al., 1982).
En general, en ambos genotipos se observó una respuesta histoquímica local, cercana al
posible sitio de penetración de M. fijiensis, evidenciada por la acumulación de lignina,
peróxido de hidrógeno y compuestos fenólicos. Esta respuesta estuvo relacionada
directamente con la aparición de los primeros síntomas observados a simple vista; en
‘Calcutta 4’ ocurrió en los primeros días después de la inoculación (6 dpi) mientras que en
‘Grande naine’ ocurrió en días posteriores (14 dpi).
Además, en ambos genotipos las deposiciones de lignina y la acumulación de peróxido de
hidrógeno y compuestos fenólicos, solo se observaron en el tejido foliar correspondiente a
las lesiones de plantas inoculadas, lo que relaciona directamente estos eventos entre sí y
con la respuesta de defensa de la planta ante la infección del patógeno.
La diferencia en cuanto al tiempo de aparición de los síntomas entre ambos genotipos
pudiera estar relacionada con el fenotipo de la resistencia que presentan ambos ante la
enfermedad. Es por esta razón que se requiere evaluar el comportamiento en el tiempo
(antes de la aparición de los primeros síntomas), de varios compuestos bioquímicos
resultantes de las principales rutas metabólicas, descritas como parte de los mecanismos
de defensa en plantas ante el ataque por patógeno.
4.3 Cuantificación de compuestos enzimáticos y no enzimáticos en diferentes
tiempos después de la inoculación en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta
4‘ inoculadas artificialmente con M. fijiensis
Se pudo determinar la actividad de las enzimas analizadas, así como los compuestos no
enzimáticos relacionados con la respuesta defensiva en las plantas de ambos genotipos
utilizando la metodología descrita.
4.3.1. Determinación de actividad enzimática
Peroxidasa
Se observó que en las plantas infectadas de ambos genotipos, la actividad de esta enzima
varió significativamente en los días posteriores a la inoculación respecto a los controles, a
diferentes tiempos después de la inoculación (Figuras 10A y B).
En las plantas inoculadas de ‘Grande naine’ la actividad peroxidasa fue significativamente
mayor respecto a las plantas controles al día 14 dpi el cual corresponde con el día de
aparición de los primeros síntomas (Figura 10A).
En las plantas de ‘Calcutta 4’, se observó un aumento significativo en la actividad
peroxidasa en las plantas inoculadas respecto a los controles, a partir del día 6 dpi
(momento en que se observaron los primeros síntomas) y hasta el día 14. El mayor valor
se observó al día 10 dpi (Figura 10B).
Figura 10. Efecto de la infección con M. fijiensis en la actividad peroxidasa, en plantas de A)‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc). Valoresmedios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitneypara p <0,01
La actividad peroxidasa ha sido vinculada con la respuesta de la planta ante el patógeno
en otros patosistemas como son: Solanum tuberosum-Phytophthora infestans, Ipomoea
batatas-Ceratostomella fimbriata, Gossipium arboreos-Verticillium sp., Vicia faba-
Uromyces faba y Vigna sinensis-Pseudocercospora sp. (Mohammadi y Kazemi, 2002). En
todos los casos, estos autores observaron mayores valores de la actividad peroxidasa en
las plantas inoculadas respecto a las plantas sin inocular.
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Al comparar las plantas inoculadas de ambos genotipos, se pudo apreciar un
comportamiento similar en la variación de la actividad peroxidasa en el tiempo. La principal
diferencia lo constituyó la velocidad en el incremento de dicha actividad enzimática, la cual
ocurrió antes en el genotipo resistente respecto al genotipo susceptible (Figura 11).
Figura 11. Actividad peroxidasa en plantas inoculadas con M. fijiensis de A)‘Grande naine‘ (gi) y B)‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difierenpor prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
En este sentido, el aumento en la actividad de esta enzima ha sido relacionado con la
resistencia a patógenos en plantas de T. sativum (Flott et al., 1989), H. vulgare (Kerby y
Somerville, 1989), O. sativa (Reimers et al., 1992; Young et al., 1995) y Saccharum
officinarum (McGhie et al., 1997). Estos autores observaron el incremento de la actividad
peroxidasa en las plantas infectadas, respecto a las no infectadas y además, que durante
la interacción compatible en las plantas susceptibles, la actividad peroxidasa fue tardía o
no varió al compararlas con las plantas resistentes.
Al respecto, se ha señalado que las peroxidasas son un grupo de enzimas oxido-
reductoras que participan en la respuesta de defensa de la planta en procesos como la
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formación de la pared celular a través de la oxidación de fenoles, la suberización y la
lignificación de las paredes de las células vegetales durante la respuesta de defensa ante
agentes patogénicos (Aguiar et al., 2000; Horling et al., 2002). Además, varios estudios
han indicado que las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa participan en la respuesta
defensiva en general y en la reacción de hipersensibilidad en plantas resistentes a virus,
bacterias y hongos (Mohammadi y Kazemi, 2002).
Fenilalanina amonio-liasa
Se observó un aumento significativo de la actividad PAL a partir del día 8 hasta el 16 dpi
en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas respecto a las no inoculadas, el mayor valor se
obtuvo a los 14 dpi, momento en el que aparecieron los primeros síntomas en las plantas
infectadas (Figura 12A).
En las plantas de ‘Calcutta 4’, el valor de la actividad PAL fue mayor en las plantas
inoculadas respecto a las plantas controles a partir del día 8 hasta el 14 dpi y el mayor
valor se observó al día 10 dpi (Figura 12B).
Estos resultados coinciden con lo planteado por autores como Hoss et al. (2000), en
plantas de Musa spp. inoculadas con toxinas del patógeno, quienes afirmaron que en la
interacción Musa spp.-M. fijiensis el patógeno es capaz de inducir un incremento en la
actividad PAL en las planta infectada respecto a los controles.
Figura 12. Efecto de la infección con M. fijiensis en la actividad fenilalanina amonio-liasa en plantasde A) ‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc).Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
Estos resultados coinciden además, con lo informado por autores como Chen et al. (2000),
quienes observaron altos niveles de esta enzima en las raíces de plantas de Cucumis
sativus inoculadas con Pythium aphanidermatum.
La relación de esta enzima con la respuesta defensiva de la planta ha sido señalada
además por Way et al. (2002), quienes encontraron que una sobrexpresión del gen que
codifica para la enzima PAL en plantas de tabaco transgénico, produjo una disminución en
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el tamaño de las lesiones después de cinco inoculaciones con Phytophthora parasitica pv.
nicotianae y Cercospora nicotianae.
Al comparar el aumento de la actividad enzimática en ambos genotipos se observó que
aunque tienen una tendencia similar, en las plantas inoculadas del genotipo resistente los
mayores valores ocurrieron en los primeros días después de la inoculación, mientras que
en las plantas del genotipo susceptible ocurrió en días posteriores (Figura 13).
Figura 13. Actividad fenilalanina amonio-liasa en plantas inoculadas con M. fijiensis de A) ‘Grandenaine‘ (gi) y B) ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cadatiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
Al respecto, autores como Anand et al. (2007) observaron un aumento en la actividad de
esta enzima en plantas de S. lycopersicum tratadas con elicitores y con resistencia a
Alternaria solani, al compararlas con los controles y las plantas susceptibles. Además, Shi
et al. (2007) señalaron un comportamiento similar en plantas de Cucurbita spp. tratadas
con elicitores, con resistencia a Sphaerotheca fuliginea y Erysiphe cichoracearum.
La enzima fenilalanina amonio-liasa cataliza la conversión de la fenilalanina a ácido
cinámico, el cual constituye el primer paso en la ruta general de los fenilpropanoides.
Como ha sido señalado, esta ruta de síntesis provee a las plantas de compuestos como
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antocianinas, flavonoides así como flavonas con acción fotoprotectiva ante los daños
causados por varios tipos de estrés (Ferrer et al., 2008).
β-1,3 glucanasa
Como resultado de este trabajo se observó que en el genotipo ‘Grande naine’ la acción de
la actividad β-1,3 glucanasa no varió en el tiempo en las plantas inoculadas respecto a las
no inoculadas (Figura 14A). En el genotipo ‘Calcutta 4’ se observó un rápido y significativo
aumento en la actividad de esta enzima, desde los primeros días después de la
inoculación (entre los 3 y 8 dpi), en las plantas inoculadas respecto a las plantas controles.
El mayor valor de la actividad enzimática correspondió al día 6 dpi, momento en el que
fueron observados los primeros síntomas en este genotipo (Figura 14B).
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Figura 14. Efecto de la infección con M. fijiensis en la actividad β-1,3 glucanasa en plantas de A)‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc). Valoresmedios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitneypara p <0,01
Se ha señalado el papel de esta enzima en la defensa de la planta en varios patosistemas.
Por ejemplo, Joosten y De Wit (1989) observaron el aumento de la actividad β-1,3
glucanasa en hojas de plantas de tomate inoculadas con C. fulvum, así como Zareie et al.
(2002) en hojas de plantas de H. vulgare L. infectadas con Rhynchosporium secalis.
Igualmente, Castro y Bach (2004) en plantas de cebada infectadas con Bipolaris
sorokiniana y Anand et al. (2007) en el patosistema S. lycopersicum-Pseudomonas
fluorescens, observaron el aumento de la actividad β-1,3 glucanasa en las plantas
infectadas, al compararlas con las plantas sin inocular y señalaron su posible papel en la
defensa de la planta en la interacción con el patógeno.
Aunque se ha señalado la presencia de la enzima β-1,3 glucanasa en varias especies de
hongos entre los que se encuentra M. fijiensis (Cho et al., 2008), en este caso, el aporte al
aumento significativo de la actividad de dicha enzima, en las plantas de ‘Calcutta 4’
inoculadas respecto a las no inoculadas, es insignificante, debido a que solo se observó en
los primeros días posteriores a la inoculación donde hay poco crecimiento del patógeno.
Otro hecho que respalda esta afirmación, es que en las plantas de ‘Grande naine’, no hubo
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diferencias significativas entre las plantas inoculadas con el hongo y los controles. Por lo
que se puede relacionar el aumento de dicha enzima con la respuesta de las plantas ante
la inoculación del patógeno, en el genotipo resistente.
Como resultado de la comparación entre las plantas inoculadas de ambos genotipos, se
observó que la actividad β-1,3 glucanasa en las plantas de ‘Calcutta 4’ fue
significativamente superior respecto a las plantas de ‘Grande naine’, en los primeros días
después de la inoculación (Figura 15).
Figura 15. Actividad β-1,3 glucanasa en plantas inoculadas con M. fijiensis de A) ‘Grande naine‘ (gi)y B) ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempodifieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
Estos resultados coinciden con lo informado por Joosten y De Wit (1989), quienes
observaron en hojas de plantas de tomate inoculadas con C. fulvum que el incremento en
la actividad de esta enzima y de la enzima quitinasa, ocurrió más rápidamente y fue mayor
en plantas del cultivar resistente respecto al cultivar susceptible, dichos autores plantearon
además, que esto pudiera ser resultado de la velocidad en el reconocimiento por el
hospedero de elicitores específicos producidos por el patógeno.
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Se conoce que la enzima β-1,3 glucanasa hidroliza uniones de β-1,3 glucanos, los cuales
constituyen los componentes principales de la pared celular de la mayoría de los hongos
(Datta et al., 2001) y en unión con la enzima quitinasa producen un efecto sinérgico que
aumenta la resistencia de las plantas frente a los patógeno (van Loon et al., 2006).
En la interacción Musa spp.-M. fijiensis se ha señalado que la inducción de proteínas PR
tiene una estrecha relación con la resistencia de las plantas ante la infección por
patógenos, pero el conocimiento del papel exacto de estas proteínas en este patosistema
es aun limitado (Lepoivre et al., 2003). No obstante, autores como Dagert et al. (2002)
realizaron una biblioteca susbstractiva en el cultivar resistente 'Yangambí km5' en plantas
infectadas con M. fijiensis y encontraron la expresión diferencial de secuencias con
homología a genes de glucanasas.
La actividad de esta enzima no está vinculada solamente a la acción directa sobre el
patógeno sino que al igual que la enzima peroxidasa está relacionada con el proceso de
ensamblaje de los componentes de la pared celular en las plantas, así como la
polimerización de monómeros de lignina y suberina con la subsecuente resistencia a los
patógenos, lo cual se ha señalado en varios patosistemas (Ferreira et al., 2007).
En general, se observó que la actividad de las enzimas peroxidasa, PAL y β-1,3
glucanasa, varió significativamente en las plantas inoculadas respecto a los controles en el
genotipo ‘Calcutta 4’, igualmente ocurrió en el caso de ‘Grande naine’, excepto en el caso
de la actividad β-1,3 glucanasa. Además, se observó que en las plantas inoculadas de
‘Calcutta 4’ la variación significativa de dicha actividad ocurrió antes en el tiempo, respecto
a las plantas inoculadas de ‘Grande naine’. Es por esto, que en ambos genotipos, el
aumento en la actividad de estas enzimas se puede relacionar directamente con la
respuesta de defensa de la planta ante la inoculación del patógeno, así como con su
posible influencia en el fenotipo de resistencia que presentan estos.
4.3.2 Cuantificación de compuestos no enzimáticos
Fenoles totales
Se observó un incremento significativo en el contenido de fenoles totales en las plantas
inoculadas del genotipo susceptible al compararlas con las no inoculadas, a partir del día
14, el cual fue el tiempo de aparición de los primeros síntomas; este incremento se
mantuvo hasta los 16 días después de la inoculación (Figura 16A).
En el genotipo resistente, se observó un aumento significativo en la acumulación de
fenoles en las plantas inoculadas, respecto a las no inoculadas a partir del día 6 dpi,
momento en que se observaron los primeros síntomas, esta diferencia significativa en el
contenido de fenoles entre las plantas inoculadas y los controles se mantuvo en todo el
período de tiempo evaluado (Figura 16B).
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Figura 16. Efecto de la infección con M. fijiensis en el contenido de fenoles totales en plantas de A)‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc). Valoresmedios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitneypara p <0,01
En este sentido, el incremento en la producción de compuestos fenólicos y su papel en el
proceso de defensa de las plantas ha sido informado en varios patosistemas, como: T.
aestivum-Puccinia graminis f. sp. tritici (Beardmore et al., 1983), S. lycopersicum-
Verticillium alboatrum (Robb et al., 1987), O. sativa-X. oryzae pv. oryzae (Reimers y
Leach, 1991), C. sativus-Pythium aphanidermatum (Chen et al., 2000), Triticum spp.-F.
graminearum (Mohammadi y Kazemi 2002), S. vulgare-S. rolfsii (Maurya et al., 2007) y O.
sativa-P. grisea (Sundravadana et al., 2007). Estos autores observaron un aumento
significativo en los compuestos fenólicos en las plantas infectadas respecto a las no
infectadas. En este sentido, autores como Bélanger et al. (2003) vinculan la acumulación
de estos compuestos con la supresión directa del crecimiento de los patógenos fúngicos.
Al comparar la variación del contenido de los compuestos fenólicos totales en las plantas
inoculadas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’, se observó que en el genotipo resistente, la
acumulación de estos compuestos ocurrió antes y fue significativamente mayor que en el
genotipo susceptible. Además, en ambos casos, el mayor valor coincidió con el momento
de aparición de los primeros síntomas (Figura 17).
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Figura 17. Contenido de fenoles totales en plantas inoculadas con M. fijiensis de ‘Grande naine‘ (gi)y ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difierenpor prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
Anión superóxido
La cantidad de Nitroblue tetrazolium reducido es equivalente a la producción del anión
superóxido. En este sentido, en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas, la producción del
O2.- fue significativamente mayor que en los controles a partir del día 8 dpi. El mayor valor
se observó a los 10 dpi, el cual fue disminuyendo gradualmente en el tiempo (Figura 18A).
En las plantas de ‘Calcutta 4’ inoculadas se observaron fluctuaciones en la producción del
anión superóxido. A los seis días después de la inoculación se obtuvo el valor más alto, el
cual fue significativamente mayor que en las plantas controles, dicho valor disminuyó
drásticamente en el día 8 dpi; posteriormente se observó un nuevo aumento significativo
respecto a las plantas sin inocular, alrededor del día 10 posterior a la inoculación (Figura
18B).
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Figura 18. Efecto de la infección con M. fijiensis en la producción del anión superóxido (O2.-) en
plantas de A) ‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control(cc). Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica deMann-Whitney para p <0,01
En ambos genotipos se observó la disminución de la producción de dicho anión en un
corto período de tiempo, lo cual pudiera estar asociado al hecho de que el anión O2.- es un
radical libre relativamente inestable y que se reconvierte fácilmente en oxígeno molecular
(O2) y en H2O2, mediante reacciones espontáneas o catalizadas por la enzima superóxido
dismutasa (SOD). En contraste con el anión O2.-, el H2O2 pertenece a las ROS de tipo no-
radical el cual no pose carga neta, por lo que posee una vida media más larga que el
radical superóxido y constituye además una molécula de señalización de más larga
distancia (Vranová et al., 2002).
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Se ha planteado que la acción de las O2.-/ROS está directamente relacionada con la
respuesta de la planta ante el patógeno; se ha vinculado además, con la protección celular
ante el estrés oxidativo causado por el patógeno, así como con la inducción de otros
mecanismos antioxidantes como la actividad peroxidasa (Ferreira et al., 2007), la cual
como se señaló anteriormente en este trabajo, se incrementó en las plantas inoculadas
respecto a las no inoculadas en ambos genotipos.
Al comparar los dos genotipos, se observó que en las plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ a
los 6 dpi ocurrió un pico en la acumulación del anión superóxido el cual fue antes y
significativamente mayor que en las plantas de inoculadas de ‘Grande naine’. En las
plantas del cultivar susceptible, el incremento en la acumulación de este anión ocurrió más
tarde, sobre el día 10 posterior a la inoculación. Se observó además, que a partir del día
ocho, dicha acumulación presentó una tendencia muy similar durante el período de tiempo
evaluado, en ambos genotipos (Figura 19).
Figura 19. Acumulación del anión superóxido (O2.-) en plantas inoculadas con M. fijiensis de
‘Grande naine‘ (gi) y ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales encada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
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Estos resultados coinciden con los obtenidos por Patykowski y Urbanek (2003), los cuales
informaron acerca del aumento significativo de la acumulación de superóxido en plantas
de tomate infectadas con B. cinerea, respecto a las plantas controles. Dichos autores
también observaron que el aumento en la producción de O2.- fue mayor y más rápido en
las plantas del cultivar más resistente en comparación con el susceptible.
Antocianinas
Como resultado de la cuantificación en el tiempo del contenido de antocianinas, se
observó que este varió entre las plantas inoculadas y los controles, en ambos genotipos.
En plantas inoculadas del genotipo susceptible hubo un aumento abrupto a partir del día
ocho después de la inoculación, el cual fue significativamente mayor que en las plantas
controles y se mantuvo durante todo el período de tiempo analizado (Figura 20A).
En las plantas inoculadas del genotipo resistente se observó un comportamiento distinto;
el contenido de antocianinas fue significativamente mayor entre plantas inoculadas y los
controles entre los días 6 y 8 dpi, a partir del momento en que se observaron los primeros
síntomas en las hojas y posteriormente este disminuyó durante el tiempo evaluado (Figura
20B).
La relación entre el aumento del contenido de antocianinas y el proceso de respuesta de la
planta ante el patógeno, ha sido planteado por autores como Neil et al. (2002) quienes
además, vinculan el incremento de la concentración de antocianinas a la protección por
parte de estos compuestos, de las estructuras celulares ante el daño fotooxidativo.
En este sentido, se ha señalado que los síntomas causados por M. fijiensis, en plantas de
Musa spp., se caracterizan por lesiones pronunciadas con la presencia de halos cloróticos
y con el consecuente daño fotooxidativo, lo cual sugiere la liberación de toxinas por parte
del patógeno (Carlier et al., 2000). Ha sido referido además, que los cloroplastos son el
sitio de acción específico de estas toxinas, las cuales juegan un importante papel en el
desarrollo de la enfermedad (Busogoro et al., 2004).
Figura 20. Efecto de la infección con M. fijiensis en la concentración de antocianinas en plantas deA) ‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc).Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
Estos resultados concuerdan además, con lo informado por autores como Grayer y
Kokubun (2001), en varias interacciones planta-patógeno, así como con estudios
realizados por Smith et al. (2007), en hojas de plantas de dos especies de Eucalipto
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infectadas con Mycosphaerella spp., quienes observaron un aumento significativo en las
plantas infectadas, respecto a las plantas controles.
Al comparar ambos genotipos, se observó que en los primeros días después de la
inoculación hubo un aumento en el contenido de antocianinas en las plantas inoculadas
del genotipo resistente, el cual fue significativamente mayor que en las del susceptible. No
obstante, a partir del día 8 dpi, se observó un gran aumento de dicho contenido en las
plantas inoculadas de ‘Grande naine’, el cual se mantuvo durante todo el período evaluado
y fue significativamente mayor que en las plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ (Figura 21).
Figura 21. Contenido de antocianinas en plantas inoculadas con M. fijiensis de ‘Grande naine‘ (gi) y‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difierenpor prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01
Sin embargo, autores como Roux et al. (2003), encontraron que en mutantes del cultivar
‘Grande naine’, seleccionados por su tolerancia a la toxina de M. fijiensis: juglone, el
contenido de antocianinas fue significativamente mayor que en las plantas no tolerantes a
la enfermedad.
A partir de los resultados de este trabajo, se puede afirmar que aunque existen diferencias
en cuanto a las características fenotípicas entre las plantas de los genotipos de Musa spp.
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de m
asa
fresc
a)
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gia
b
a
b
a
b
a
b
a
b
analizados, estas no son determinantes en el tipo de interacción que se establece entre la
planta y el patógeno. Además, se puede corroborar que en ambos genotipos, la
acumulación de compuestos como lignina, fenoles y peróxido de hidrógeno que ocurre en
el tejido vegetal con síntomas de plantas inoculadas, está relacionada entre sí y con la
respuesta de la planta ante el patógeno. Igualmente, el aumento en la actividad de las
enzimas peroxidasa, β-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio-liasa, así como la acumulación
de fenoles, del anión superóxido y de antocianinas, está directamente relacionada con la
respuesta de la planta ante el patógeno. Se observó además, que en ambos genotipos, la
mayor acumulación de estos compuestos relacionados con la defensa ocurrió
generalmente antes de la aparición de los primeros síntomas y que en las plantas
inoculadas de ‘Calcutta 4’ esta ocurrió, en todos los casos, antes que en las plantas
inoculadas de ‘Grande naine’.
Los resultados de este trabajo constituyen además, los primeros estudios sobre la
caracterización bioquímica de la respuesta de plantas de Musa spp. inoculadas
artificialmente con suspensiones miceliales de M. fijiensis, a la vez que brindan nuevos
aportes en el estudio de los mecanismos involucrados en la interacción planta-patógeno,
en este importante patosistema.
5. CONCLUSIONES
1 A partir de la caracterización fenotípica de plantas de ‘Grande naine’ y ’Calcutta 4’
en casa de cultivo, se demostró que aunque existen diferencias entre las plantas
de ambos genotipos, estas no son determinantes en el fenotipo de la resistencia a
la infección por M. fijiensis.
2 Mediante la detección histoquímica de lignina, fenoles y peróxido de hidrógeno en
hojas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’, con diferentes estados de síntoma, se
comprobó que su acumulación estaba relacionada con la respuesta de la planta
ante la inoculación artificial con M. fijiensis.
3 Se demostró que el incremento de la actividad enzimática peroxidasa, fenilalanina
amonio-liasa y β-1,3 glucanasa, así como del contenido de fenoles, anión
superóxido y antocianinas, estuvo relacionado con la respuesta defensiva de
plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ inoculadas artificialmente con M. fijiensis.
4 A través de la determinación de compuestos bioquímicos en plantas de dos
genotipos de Musa inoculados artificialmente con M. fijiensis fue posible establecer,
que estos intervienen en su respuesta defensiva ante el patógeno, que en ambos
se inicia generalmente antes de la aparición de los primeros síntomas y que en las
plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ tuvo lugar antes que en las plantas inoculadas de
‘Grande naine’.
6. RECOMENDACIONES
1 Realizar estudios de histología en plantas inoculadas de ambos genotipos con
cepas de M. fijiensis transformadas con la proteína verde fluorescente para
observar el desarrollo y evolución de la enfermedad a partir de la inoculación.
2 Continuar los estudios para la caracterización molecular de la interacción tanto
compatible como incompatible, antes de la aparición de los primeros síntomas de la
enfermedad.
3 Cuantificar otros compuestos bioquímicos relacionados con la respuesta de la
planta ante el patógeno, descritos en otros patosistemas.
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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