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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

Departamento de Química Agrícola, Geología y Geoquímica

DETERMINACIÓN, PERSISTENCIA Y DISTRIBUCIÓN DE

INSECTICIDAS DE USO AGRÍCOLA EN EL MEDIO AMBIENTE

TESIS DOCTORAL

Javier Castro Jiménez

Madrid, 2002

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ÍNDICE

ÍNDICE

RESUMEN........................................................................................................................i

ABSTRACT.....................................................................................................................v

INTRODUCCIÓN GENERAL..........................................................................................1

Utilización de los plaguicidas y problemas derivados de su uso.....................................1

Tipos de plaguicidas........................................................................................................3

El tomate. Plagas del cultivo y su control........................................................................7

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS....................................................................................9

I. METODOLOGÍA ANALÍTICA....................................................................................11

1. INTRODUCCIÓN.......................................................................................................11

1.1. Determinación de plaguicidas en el suelo........................................................14

1.2. Determinación de plaguicidas en el agua.........................................................15

1.3. Determinación de plaguicidas en el aire...........................................................16

1.4. Determinación de plaguicidas en el material vegetal.......................................17

2. MATERIALES Y MÉTODOS.....................................................................................18

2.1. Materiales........................................................................................................18

2.1.1. Patrones...................................................................................................18

2.1.2. Formulaciones comerciales de plaguicidas.............................................18

2.1.3. Disolventes..............................................................................................18

2.1.4. Reactivos y adsorbentes..........................................................................19

2.1.5. Suelos......................................................................................................19

2.1.6. Material vegetal........................................................................................19

2.1.7. Columnas de extracción y purificación y fibras de SPME........................19

2.2. Aparatos..........................................................................................................20

2.2.1. Equipo de laboratorio...............................................................................20

2.2.2. Sistema de análisis cromatográfico A......................................................20

2.2.3. Sistema de análisis cromatográfico B......................................................21

2.2.4. Sistema de análisis cromatográfico C......................................................21

2.2.5. Sistema de análisis cromatográfico D......................................................22

2.3. Métodos analíticos.........................................................................................22

2.3.1. SUELO.....................................................................................................22

2.3.1.1. Preparación de las muestras.......................................................22

2.3.1.2. Extracción de los plaguicidas del suelo.......................................24

2.3.1.3. Determinación cromatográfica.....................................................26

2.3.2. AGUA.......................................................................................................26

2.3.2.1. Extracción líquido-líquido de los plaguicidas...............................26


2.3.3. AIRE.........................................................................................................27

2.3.3.1. Micro extracción en fase sólida (SPME)......................................27

2.3.3.1.1. Preparación de las muestras........................................28

2.3.3.1.2. Extracción de los plaguicidas de la fase aérea.............29

2.3.3.1.3. Determinación cromatográfica......................................31

2.3.3.2. Adsorción en columnas de Florisil...............................................31

2.3.3.2.1. Extracción de los plaguicidas de la fase aérea.............32

2.3.3.2.2. Determinación cromatográfica......................................33

2.3.4. MATERIAL VEGETAL.............................................................................34

2.3.4.1. Preparación de las muestras.......................................................34

2.3.4.2. Extracción de los plaguicidas del material vegetal......................34


3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................35

3.1. SUELO.............................................................................................................35

3.1.1. Recuperaciones.......................................................................................35

3.1.1.1. Influencia del contenido de humedad..........................................37

3.1.1.2. Influencia del material de la columna...........................................38

3.1.1.3. Influencia del tiempo de residencia..............................................39

3.1.2. Límite de detección y linealidad...............................................................41

3.1.3. Muestras reales.......................................................................................42

3.1.4. Confirmación GC-MS...............................................................................43

3.2. AGUA...............................................................................................................44

3.2.1. Recuperaciones.......................................................................................44


3.3. AIRE.................................................................................................................45

3.3.1. Micro extracción en fase sólida...............................................................45

3.3.1.1. Evaluación de las fibras de SPME...............................................45

3.3.1.2. Calibración del método................................................................47

3.3.1.3. Limite de detección y linealidad...................................................48

3.3.1.4. Confirmación GC-MS...................................................................50

3.3.2. Adsorción en columnas de Florisil...........................................................50

3.3.2.1. Recuperaciones...........................................................................50

3.3.2.2. Eficacia del adsorbente...............................................................51

3.3.2.3. Límite de detección y linealidad...................................................52

3.3.2.4. Estabilidad durante el almacenamiento.......................................54

3.3.2.5. Confirmación GC-MS...................................................................55

3.4. MATERIAL VEGETAL.....................................................................................55

3.4.1. Recuperaciones.......................................................................................55


3.4.3. Confirmación GC-MS...............................................................................58

3.4.4. Muestras reales.......................................................................................58

4. CONCLUSIONES......................................................................................................60

II. PERSISTENCIA EN CONDICIONES DE LABORATORIO......................................63

1. INTRODUCCIÓN.......................................................................................................63

1.1. Principales procesos que influyen en la persistencia de los plaguicidas.........63

1.1.1. Degradación............................................................................................63

1.1.1.1. Tipos de degradación..................................................................63

1.1.1.2. Factores que afectan a los procesos de degradación.................66

1.1.1.3. Métodos experimentales en el estudio de la degradación...........68

1.1.2. Volatilización............................................................................................69

1.1.2.1. Factores que afectan a la volatilización.......................................70

1.1.2.2. Volatilización desde el suelo........................................................72

1.1.2.3. Volatilización desde superficies foliares......................................73

1.1.2.4. Métodos experimentales en el estudio de la volatilización..........74

1.1.3. Adsorción.................................................................................................75

1.1.3.1. Mecanismos de adsorción..............................................................77

1.1.3.2. Isotermas de adsorción...................................................................77

1.1.3.3. Métodos experimentales en el estudio de la adsorción..................78

2. MATERIALES Y MÉTODOS.....................................................................................80

2.1. Materiales........................................................................................................80

2.1.1. Patrones..................................................................................................80

2.1.2. Formulaciones comerciales de plaguicidas.............................................80

2.1.3. Disolventes y reactivos............................................................................80

2.1.4. Suelo........................................................................................................81

2.1.5. Columnas de extracción .........................................................................81

2.1.6. Material vegetal.......................................................................................81

2.2. Aparatos..........................................................................................................82

2.2.1. Equipo de laboratorio...............................................................................82

2.2.2. Sistema de análisis cromatográfico A......................................................82

2.2.3. Cámara climática y estufas de incubación..............................................82

2.3. Métodos...........................................................................................................83

2.3.1. Ensayos de degradación en suelo...........................................................83

2.3.1.1. Degradación a distintas humedades y temperaturas...................83

2.3.1.2. Degradación en la rizosfera.........................................................84

2.3.1.3. Medida de la biomasa del suelo..................................................85

2.3.2. Ensayos de volatilización en planta.........................................................87

2.3.3. Ensayos de adsorción.............................................................................89

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................89

3.1. Ensayos de degradación en suelo...................................................................89

3.1.1. Influencia de la humedad y la temperatura..............................................89

3.1.1.1. Variación de las concentraciones con el tiempo..........................89

3.1.1.2. Ajuste a cinética de primer orden y cálculo de vidas medias......92

3.1.1.3. Influencia de la temperatura en la degradación...........................95

3.1.1.4. Influencia de la humedad en la degradación...............................96

3.1.2. Influencia de la rizosfera..........................................................................97

3.1.2.1. Vidas medias en los suelos estudiados.......................................97

3.1.2.2. Biomasa de los suelos estudiados...............................................99

3.2. Ensayos de volatilización en planta................................................................101

3.3. Ensayos de adsorción....................................................................................104

3.3.1. Isotermas de adsorción. Determinación de Kd y Kf................................104

3.3.2. Determinación del coeficiente Koc..........................................................109

4. CONCLUSIONES....................................................................................................111

III. PERSISTENCIA Y DISTRIBUCIÓN EN CONDICIONES DE CAMPO..................114

1. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................114

1.1. Persistencia y distribución de un plaguicida en el medio ambiente.....................114

1.2. Determinación de vidas medias en condiciones de campo..................................116

2. MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................118

2.1. Materiales......................................................................................................118

2.1.1. Patrones, disolventes y reactivos..........................................................118

2.1.2. Suelos....................................................................................................118

2.2. Aparatos........................................................................................................120

2.3. Métodos.........................................................................................................120

2.3.1. Ensayos de campo................................................................................120

2.3.2. Extracción y determinación de los insecticidas.....................................121

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...............................................................................122

3.1. Estudio de los insecticidas en el suelo...........................................................122

3.1.1. Niveles durante el ciclo de cultivo..........................................................122

3.1.2. Determinación de las vidas medias.......................................................126

3.1.3. Niveles residuales después del ciclo de cultivo.....................................130

3.2. Estudio de los insecticidas en hojas...............................................................131

3.2.1. Niveles durante el ciclo de cultivo..........................................................131

3.2.2. Determinación de las vidas medias.......................................................134

3.3. Distribución de endosulfan.............................................................................136

3.4. Predicción de la distribución ambiental del endosulfan (hoja de cálculo)......138

4. CONCLUSIONES....................................................................................................142

CONCLUSIONES GENERALES................................................................................144

DIFUSIÓN DE RESULTADOS....................................................................................148

BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................151

RESUMEN

Resumen

i

RESUMEN

La lucha química contra las plagas de los cultivos agrícolas ha prestado, y sigue

haciéndolo, magníficos servicios al agricultor y a la sociedad. La continua necesidad

de producir más alimentos ha hecho que la demanda de productos fitosanitarios siga

aumentando, por lo que la utilización de los plaguicidas agrícolas es, en el momento

actual, importante y necesaria. Sin embargo, el uso de estos compuestos no está

exento de problemas, ya que sus residuos, además de potencialmente tóxicos para el

ser humano, pueden constituir en ciertos casos una importante fuente de

contaminación en las zonas donde se emplean durante tiempos más o menos largos.

Cuando se aplica un plaguicida al cultivo se produce directamente un depósito en

la planta e indirectamente otro depósito en el suelo. Los residuos de plaguicida así

acumulados son susceptibles de sufrir diferentes procesos (degradación, volatilización,

adsorción, lixiviación, etc.) que determinarán su destino en el medio ambiente. La gran

cantidad de residuos de productos fitosanitarios encontrados en las diferentes matrices

medioambientales, como consecuencia de estos procesos, hace necesario el

desarrollo de métodos analíticos capaces de determinar estos residuos de una manera

fiable, con procedimientos de extracción efectivos y rápidos que requieran volúmenes

mínimos de disolventes tóxicos. Mediante estos sistemas de análisis se podrá,

además, acometer el estudio de los diferentes procesos que van a determinar el

comportamiento ambiental de los plaguicidas después de su aplicación.

Dentro de la amplia variedad de plaguicidas utilizados con diversos fines, se han

seleccionado como objeto de estudio en este trabajo compuestos con acción

insecticida / acaricida debido a su extenso uso en los cultivos hortícolas en España. Se

ha profundizado en el estudio de los insecticidas clorpirifos (utilizado para el control de

un amplio numero de insectos del suelo y otros artrópodos) y endosulfan (utilizado

para el control de los insectos chupadores y masticadores en las frutas y hortalizas)

debido a su extensa utilización en el cultivo del tomate. España ocupa el tercer lugar

entre los países productores de esta hortaliza en Europa, siendo aproximadamente el

85% dedicado a la elaboración de triturados y concentrados, localizándose la mayor

parte de esta producción en los regadíos del Guadiana en Extremadura. Asimismo, se

Resumen

ii

ha estudiado con mas detalle el insecticida endosulfan debido a su mayor persistencia

y la posibilidad, por tanto, de contaminar aquellas matrices en las que se encuentre.

Por otra parte, su elevada toxicidad para algunos organismos acuáticos hace

necesario el estudio en profundidad de su comportamiento ambiental y de la

posibilidad de transferencia de este compuesto a otros compartimentos, especialmente

a los ecosistemas acuáticos.

Los objetivos de este trabajo son, por lo tanto, el desarrollo de la metodología

analítica necesaria para la determinación de los insecticidas seleccionados en las

distintas matrices medioambientales estudiadas: suelo, agua (disolución del suelo),

aire y material vegetal. Mediante los métodos de extracción y análisis desarrollados se

ha realizado el estudio de los procesos de degradación y adsorción para el insecticida

organofosforado clorpirifos y el organoclorado endosulfan, así como el estudio de la

volatilización del endosulfan. Una vez conocidos estos procesos se ha estudiado la

distribución del endosulfan en el cultivo del tomate y en el medioambiente en la región

de Badajoz, zona en la que se aplica este insecticida ampliamente.

El método analítico desarrollado para la determinación multi-residuo de

diferentes tipos de insecticidas en el suelo está basado en la extracción, asistida por

ultrasonidos, de estos compuestos en muestras de suelo contenidas en columnas y

utilizando pequeños volúmenes de acetato de etilo. Este método ha permitido obtener

unas recuperaciones medias entre el 90 y el 108 % con una desviación estándar

relativa (DER) entre el 1 y el 11 % y un límite de detección de 0,01 µg/g. Por su parte,

el análisis de los residuos de clorpirifos y endosulfan en muestras de agua basado en

la extracción líquido-líquido de sus residuos con pequeños volúmenes de hexano ha

permitido obtener una recuperaciones entre el 87 y el 110 % con una DER entre el 1 y

el 13 % y un límite de detección de 0,05 µg/ml.

El método de análisis de plaguicidas volatilizados desde muestras de suelo y

desde las plantas basado en la técnica de microextracción en fase sólida del espacio

de cabeza (HS-SPME), ha permitido la determinación de sus residuos en muestras de

aire utilizando diferentes tipos de fibras: polidimetilsiloxano (PDMS) y poliacrilato (PA)

de una forma precisa, siendo algo superior la respuesta obtenida con la fibra de

PDMS. El límite de detección del método estuvo comprendido entre 1-8 ng/L.

Resumen

iii

Asimismo, se ha desarrollado otro método para la determinación de los residuos de los

isómeros del endosulfan (I y II) y de su principal metabolito, el endosulfan-sulfato, en

muestras de aire basado en la retención de estos compuesto en columnas de Florisil.

Las recuperaciones obtenidas estuvieron comprendidas entre el 85 y el 101 % con una

DER entre el 3 y el 10 %, y el límite de detección fue de 0,3 ng/L.

El método desarrollado para el análisis de los isómeros del endosulfan y del

endosulfan-sulfato en muestras vegetales permitió obtener unas recuperaciones

comprendidas entre el 79 y el 93 % con una DER entre el 4 y el 13 %, obteniéndose

un limite de detección de 0,02 µg/g.

La metodología desarrollada se utilizó en el estudio de los procesos de

degradación y de adsorción de los insecticidas clorpirifos y endosulfan en el suelo, así

como en el estudio de la volatilización del endosulfan desde las superficies foliares. La

degradación del clorpirifos y del endosulfan en el suelo puede ser descrita por una

cinética de primer orden. Se determinó que la temperatura ambiental y la humedad del

suelo fueron factores que afectan a la degradación del clorpirifos mientras que, en

general, la humedad no fue un factor de importancia en la degradación del endosulfan,

siendo la temperatura ambiental el factor que más afectó a la degradación del

insecticida. Asimismo, no se observo ningún efecto de aumento de la degradación en

la zona de la rizosfera para ninguno de los dos compuestos en las condiciones

ensayadas, habiéndose obtenido vidas medias similares a las calculadas en los

ensayos de degradación a distintas humedades y temperaturas.

Las vidas medias calculadas en condiciones de campo para el clorpirifos variaron

entre 14 y 17 días, mientras que el valor calculado para el endosulfan varió entre 28 y

40 días. Por otra parte, las vidas medias obtenidas para estos insecticidas en el suelo

en condiciones de laboratorio fueron mayores que las calculadas en condiciones de

campo. Se encontraron vidas medias entre 25 y 32 días para el clorpirifos y entre 46 y

56 días para el endosulfan. Este hecho pone de manifiesto que además de la

degradación, existen otros procesos que tienen lugar en condiciones de campo tales

como la volatilización, la fotodegradación y el transporte, que junto con las condiciones

climatológicas de la zona (precipitación, viento, ciclos de temperatura, etc) aumentan

la disipación de los insecticidas estudiados.

Resumen

iv

Cuando se examinaron los dos isómeros del endosulfan independientemente, el

endosulfan-II fue el isómero más persistente en el suelo. Asimismo, el clorpirifos fue el

insecticida que más rápido se degradó. Los coeficientes de adsorción determinados

para el clorpirifos (Koc = 3872-14398) y el endosulfan (Koc = 5662-25911) indican que la

adsorción de ambos compuestos en los suelos de las parcelas investigadas es, en

general, elevada siendo más alta la adsorción del endosulfan. Por otra parte, los

ensayos de volatilización en condiciones de laboratorio junto con las vidas medias

calculadas en condiciones de campo (5-6 días) ponen de manifiesto la rápida

desaparición del endosulfan de las superficies foliares. Asimismo, los resultados

mostraron que el endosulfan-I contribuye con más de un 70 % al total volatilizado por

lo que este será el isómero predominante en el aire, mientras que el endosulfan-II será

el isómero predominante en las hojas.

Por ultimo, el tratamiento del cultivo del tomate con el insecticida endosulfan a

una dosis normal recomendada, en torno a 1 kg/ha, produce un depósito en las hojas

que varía entre el 40 y el 50 % de la cantidad aplicada y un depósito en el suelo que

varía entre un 10 y un 20 % de la cantidad inicialmente aplicada. Por lo tanto, un

porcentaje medio del 64 % de la cantidad aplicada se encuentra en las hojas y en el

suelo del cultivo después del tratamiento, mientras que aproximadamente el 35 % de

la dosis utilizada se pierde durante el proceso de aplicación.

Por otra parte, dos meses después de la cosecha no se encontraron residuos de

clorpirifos en el suelo mientras que aparecieron residuos de endosulfan-II y

endosulfan-sulfato fundamentalmente, a niveles en torno a 0,01 µg/g.

ABSTRACT

Abstract

v

ABSTRACT

Different pests causing serious damage to plants and consequently significant

yield reductions may affect a large number of crops. The increasing necessity of food

production to supply the population makes the use of pesticides as a regular

agricultural practice necessary. Therefore, pesticides are widely used to control pests

in these crops. However, the use of these compounds is not exempt from problems

since pesticide residues are potentially toxic for humans and the environment.

In the application of pesticides one part of the amount used reaches the target

while other part is deposited on the soil. The variable amount deposited in those

compartments is subjected to different transformations (degradation, volatilisation,

adsorption, leaching, etc.) that will determine the fate of the agrochemicals used. The

large number of pesticide residues found in different environmental compartments

requires the development of analytical methodologies that allow the determination of

different pesticides with effective and fast extraction procedures, using minimum clean-

up steps and low volumes of toxic solvents. Furthermore, these methodologies can be

employed in the study of the processes that determine the environmental behaviour of

pesticides after their application.

Insecticide / acaricide action compounds were selected for this work due to their

wide use in horticultural crops in Spain. Further studies were performed with

chlorpyrifos (organophosphorous insecticide used to control a wide range of soil

insects and other arthropods) and endosulfan (organochlorine insecticide used to

control the sucking and chewing insects in fruits and vegetables). These two

insecticides are widely used in tomato crops in Spain, the third largest producer of

tomato for preserved food in Europe. Likewise, endosulfan has been studied in more

detail due to its higher persistence and toxicity, specifically for some aquatic

organisms. Thus, a deeper understanding of its environmental behaviour and the

potential transport to another compartments is necessary.

Abstract

vi

The aim of this work was, therefore, the development of a suitable methodology

required for the determination of the selected insecticides in the various environmental

matrixes studied: soil, water (soil solution), air and vegetal material. A study of the

degradation and adsorption processes for the insecticides chlorpyrifos and endosulfan

were performed by developed methods for the extraction and analysis of its residues.

The volatilisation of endosulfan was also studied. Once these processes were

determined, the distribution of endosulfan in tomato crop in the region of Badajoz was

studied.

The proposed method of extraction by sonication of soil samples placed in small

columns using ethyl acetate as extracting solvent provided a rapid and sensitive

procedure for the simultaneous determination of the selected insecticides. The method

was simple and with a low solvent consumption. Pesticide recoveries through the

method were in the range of 90 to 108 % with a relative standard deviation (RSD)

between 1 and 11 %. The limit of detection for all compounds was 0.01 µg/g. On the

other hand, the determination of chlorpyrifos and endosulfan residues in water samples

was accomplished by means of the liquid-liquid extraction of their residues with low

volumes of hexane. Recoveries in the range of 87 to 110 % with a RSD between 1 and

13 % were obtained. The limit of detection of this method was 0.05 µg/ml.

The headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) procedure allowed the

successful determination of pesticides volatilised from soil and plant. Good results were

obtained with the assayed fibres, polidimethylsiloxane (PDMS) and polyacrilate (PA),

the response obtained with the PDMS fibre being somewhat better. The detection limit

of the proposed method varied from 1 to 8 ng/L for the selected pesticides. A method

for the determination of the endosulfan isomers (I and II) and its metabolite,

endosulfan-sulfate, in air samples, based on the retention of their residues in Florisil

placed in columns was also developed. Recoveries obtained varied from 85 to 101 %

with a RSD between 3 and 10 % and the detection limit was 0.3 ng/L.

The proposed method for the analysis of endosulfan isomers and endosulfan-

sulfate in vegetal samples allowed their residue determination with a detection limit of

Abstract

vii

0.02 µg/g. Recoveries obtained varied from 79 to 93 % with a RSD between 4 and 13

%.

The developed methodology was applied to the study of the degradation and

adsorption of the insecticides chlorpyrifos and endosulfan in soil, as well as to the study

of the volatilisation of endosulfan from foliage. The degradation of chlorpyrifos and

endosulfan can be described by a first order kinetic. Temperature and soil moisture

content were determined as factors affecting the degradation of chlorpyrifos while soil

moisture content did not have as much influence in the degradation of endosulfan.

Therefore, environmental temperature was the factor that most affected the

degradation of endosulfan in the soils studied. Likewise, no increase of insecticide

degradation in the rizosphere was observed in the conditions assayed and the half-

lives obtained were similar to those obtained in the assays at various temperatures and

soil moisture contents.

Field half-lives obtained for chlorpyrifos in soil varied from 14 to 17 days while

those calculated for endosulfan varied from 28 to 40 days. On the other hand, soil half-

lives obtained under laboratory conditions were higher for both compounds and ranged

from 25 to 32 days for chlorpyrifos and from 46 to 56 days for endosulfan. This fact

pointed out that other processes than degradation take place in real conditions. These

processes such as volatilisation, fotodegradation, and transport, together with the

climatic conditions (rain, wind, temperature cycles, etc.) produce an increase in the

dissipation of the studied insecticides.

When endosulfan isomers were considered separately, endosulfan-II was the

most persistent in soil. Likewise, chlorpyrifos was the insecticide that degraded fastest.

The sorption coefficients determined for endosulfan and chlorpyrifos pointed out that

the adsorption of these insecticides was high in the soils studied. Endosulfan

adsorption (Koc = 5662-25911) was higher than chlorpyrifos adsorption (Koc = 3872-

14398).

Volatilisation assays under laboratory conditions together with the field half-lives

obtained for endosulfan (5-6 days) pointed out the fast volatilisation of endosulfan from

foliage. The results also indicated that endosulfan-I is the isomer contributing around

Abstract

viii

70 % to the total volatilised endosulfan and therefore the dominant isomer in air while

endosulfan-II is the dominant isomer in leaves.

The distribution study of endosulfan after its application to tomato crops, indicated

that the treatment, at a regular dose around 1 kg/ha, yielded a deposit on leaves that

ranged from 40 to 50 % of the amount applied, while the deposit on soil varied from 10

to 20 %. Therefore, around 64 % of the total amount applied is deposited on soil and

leaves after treatment, while around 35 % of the dose is lost during the application

process. On the other hand, no chlorpyrifos residues were found two months after

harvest while residues of endosulfan, mainly endosulfan-II and endosulfan-sulfate,

were found at a concentration around 0.01 µg/g.

INTRODUCCIÓN GENERAL

Introducción general

1

INTRODUCCIÓN GENERAL

Utilización de los plaguicidas y problemas derivados de su uso

La lucha química contra las plagas de los cultivos agrícolas ha prestado, y sigue

haciéndolo, magníficos servicios al agricultor y a la sociedad. Los resultados obtenidos

en el mantenimiento y aumento de las cosechas, fundamentalmente a partir de la

década de los cuarenta gracias al descubrimiento y aplicación de los plaguicidas

orgánicos de síntesis, han hecho que su empleo en la actualidad sea de gran

magnitud.

La continua necesidad de producir más alimentos ha hecho que su demanda

siga aumentando, por lo que la utilización de los plaguicidas agrícolas, entendidos

como agentes químicos para proteger los cultivos, es en el momento actual importante

y necesaria. Sin esta defensa es indudable que se produciría una disminución drástica

de los rendimientos. La Organización para la Alimentación y la Agricultura de Naciones

Unidas (FAO) ha calculado que el cese del empleo de los plaguicidas en EE.UU.,

reduciría el rendimiento de las cosechas y del ganado en un 30-40 % y aumentaría el

precio de los productos agrícolas en un 50-70 % (Green, 1984).

En la Figura 1, se muestran los gráficos correspondientes al mercado mundial de

productos fitosanitarios por países (A) y al mercado por familias de productos

fitosanitarios en la Unión Europea y EFTA (Asociación Europea de Comercio Libre,

comprende los estados de Islandia, Liechtenstein, Noruega y Suiza)(B).

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A

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Figura 1. Mercado mundial de productos fitosanitarios (A) y mercado occidental europeo (EU+EFTA) por familias de productos (B). Los datos corresponden al año 1999, según AEPLA.


2

Como se aprecia en la Figura 1 (A), EE.UU, Asia y la UE son los lugares en los

que el mercado de productos fitosanitarios es mayor, siendo en la UE donde más se

utilizan. Por otra parte, se aprecia que los herbicidas y los funguicidas son los

plaguicidas más utilizados en Europa Occidental. En la Figura 2, podemos ver el

mercado español de productos fitosanitarios.

Como se puede ver en el diagrama, en España los insecticidas son los productos

más utilizados, seguidos por los herbicidas y fungicidas.

Sin embargo, también es cierto que el uso de plaguicidas no está exento de

problemas, ya que estos productos químicos se preparan deliberadamente para ser

tóxicos frente a determinados organismos, y al existir cierta homogeneidad entre

muchas formas de vida, pueden ser tóxicos para los seres humanos, si llegasen a

incorporarse al organismo por accidente (ingestión, inhalación, contacto, etc).

Por otra parte, los residuos de plaguicidas, además, pueden constituir en ciertos

casos una importante fuente de contaminación en las zonas donde se emplean

durante tiempos más o menos largos. Su movilidad a través del aire o del agua, su

acumulación o transformación en el medio donde se aplican y finalmente su

biomagnificación, dado que pueden introducirse en la cadena alimentaria, aumentando

su concentración al pasar de un eslabón a otro, constituyen otros riesgos que deben

��

��

��

��

Figura 2. Mercado español de productos fitosanitarios por familias correspondiente al año 2000. Los datos han sido obtenidos de AEPLA.


3

ser comparados con los posibles beneficios que pueden producir (Briggs, 1981, Jury et

al., 1987-a y Spear, 1991).

Durante muchos años se ha prestado una atención preferente a conocer la

dinámica de estos productos en plantas y animales, así como a establecer los

principios generales de los métodos y técnicas utilizables para el control de sus

residuos en alimentos, pero en las últimas décadas y debido a la mayor preocupación

por sus repercusiones en el medio ambiente, la investigación se ha orientado en gran

parte a conocer también su comportamiento en otras matrices ambientales como el

suelo, aire, agua y plantas. Los plaguicidas tienen una gran capacidad de interacción

con el suelo, por ejemplo, debido a que tienden a permanecer mucho más tiempo en

este compartimento ambiental que en las plantas o animales, ya que

comparativamente los seres vivos provocan su metabolización o dilución de forma más

rápida.

Debido al amplio uso de estos productos y a que los procesos de aplicación a los

cultivos originan depósitos de plaguicida en el suelo y en las plantas, susceptibles de

sufrir numerosos procesos de transformación y transporte, la aparición de residuos

tóxicos en los diferentes compartimentos ambientales es inevitable y constituye un

problema importante.

Tipos de Plaguicidas

Los plaguicidas se pueden clasificar según su utilización en tres grandes grupos,

herbicidas, insecticidas y fungicidas. En el presente trabajo se han estudiado

fundamentalmente los insecticidas, por lo que se enumeran a continuación los

principales grupos de insecticidas:

Insecticidas Organoclorados. Estos productos constituyen algunas familias de

compuestos de importancia histórica, desarrollados poco antes y durante la segunda

Guerra Mundial. Cuando Müller descubrió las propiedades del DDT inició una

revolución en el campo de los plaguicidas, desencadenando la incorporación de

productos derivados de síntesis orgánica a la lucha contra plagas y enfermedades

(Barberá, 1989).


4

Dentro de los insecticidas organoclorados se pueden distinguir

fundamentalmente tres familias: la del DDT y análogos, la del Hexaclorociclohexano

(HCH), también conocido como Lindano y la de los ciclodienos clorados. En la Figura

3, se muestran las estructuras químicas de compuestos representativos de cada una

de las familias mencionadas anteriormente.

Carbamatos. Este grupo presenta un gran interés en el campo de los plaguicidas

por su gran actividad biológica. Todos estos productos derivan del ácido carbámico, de

formula HO-CO-NH2. Podemos distinguir tres grandes grupos: los Aril-N-

metilcarbamatos, los carbamatos heterocíclicos y las oximas. En la Figura 4, se

muestras las estructuras químicas de insecticidas carbámicos de cada familia.

Cl CH

CCl3

Cl

Cl Cl

Cl

ClCl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

O

SO

O

γγγγ-HCH Endosulfan

p,p´-DDT

Figura 3. Estructuras químicas del HCH, del endosulfan (derivado del biciclohepteno) y del DDT en su configuración más activa.

OCH3

CH3

OCONHCH3

Carbofurano Carbaril

OCONHCH 3

Aldicarb

Figura 4. Estructuras químicas del Carbaril (Aril-N-metilcarbamato), del Carbofurano (carbamatos heterocíclicos) y del Aldicarb (oxima).

CH3SCCH

CH3

CH3

NOCONHCH3


5

Piretroides. El pelitre ha sido uno de los derivados vegetales más empleado

como insecticida, especialmente en aplicaciones domésticas, pero su utilización en

agricultura ha sido mas bien escasa por carecer de la requerida estabilidad.

La investigación realizada sobre los constituyentes del pelitre (las denominadas

piretrinas, en general) en el transcurso de los últimos quince años ha conducido al

desarrollo de una serie de nuevos productos, a los que se ha denominado de forma

genérica piretroides, de manera que podríamos decir que existen piretroides naturales

y sintéticos.

Las características más favorables de estos compuestos son las de ser

fácilmente degradables en el suelo y no presentar efectos tóxicos notables sobre la

salud humana. En general son moléculas bastante estables en la atmósfera y a la

exposición solar (Pramauro,1990). En la Figura 5, se recoge la estructura química del

la Acrinatrin.

Insecticidas organofosforados. Los derivados fosfóricos ocupan hoy en día un

lugar preponderante entre los plaguicidas más conocidos y utilizados, ya que

constituyen un grupo muy efectivo. Su actividad fue descubierta por el químico alemán

Gerhard Schrader, quien durante la segunda Guerra Mundial sintetizó unos trescientos

compuestos organofosforados con fines militares. Junto a su toxicidad para los

mamíferos pronto se descubrió su interesante actividad como insecticidas.

Los insecticidas organofosforados pueden considerarse como derivados del

ácido fosfórico, expresado por su formula desarrollada:

PO

OHHOHO

OCCO2

H3C CH3

HC

H

HC

(CF3)2CHOCO H

CN

Figura 5. Estructura química del acrinatrin (piretroide sintético).


6

Según se reemplacen los distintos sustituyentes, se van construyendo los

distintos tipos de insecticidas organofosforados, que son ortofosfatos, tiofosfatos,

tiolfosfatos, ditiofosfatos, fosfonatos y pirofosforamidas. En la Figura 6, se muestran

las estructuras químicas de insecticidas organofosforados pertenecientes a algunas de

las familias anteriormente mencionadas.

Este grupo de insecticidas está constituido por compuestos solubles en agua, en

general, y fácilmente hidrolizables, por lo que presentan una baja persistencia en el

medio ambiente, normalmente no superior a unas semanas. Debido a ello, se utilizan

bastante a menudo para atacar insectos adultos, parásitos de plantas y animales, y en

parte, para tratamientos preliminares de semillas y de terrenos antes de la siembra

(Metcalf, 1971, Pramauro, 1990 y Primo Yúfera y Carrasco Dorrién, 1990).

Los insecticidas tiofosfatos constituyen un grupo importante en esta familia,

presentando la siguiente estructura química:

Clorfenvinfos Clorpirifos

Cl

CC

Cl

O Cl

H

(CH3CH2O)2P

O

NCl

Cl Cl

OP(OCH2CH3)2

S

(CH3O)2PSCHCH2CO2CH2CH3

S

CO2CH2CH3

Malation

Cl3CCHP(OCH3)2

O

OH

Triclorfon

Figura 6. Estructuras químicas de los insecticidas clorfenvinfos (ortofosfato), clorpirifos (tiofosfato), malation (ditiofosfato) y triclorfon (fosfonato).


7

la presencia de un átomo de azufre ligado al fósforo (en lugar del oxígeno) confiere a

estas moléculas una mayor estabilidad química, por lo que se hidrolizan mucho menos

y pueden ser utilizados en medio acuoso.

El tomate. Plagas del cultivo y su control

El tomate es la hortaliza más importante en numerosos países. Con el nombre

científico de Lycopersicon esculentum Mill., es una planta dicotiledónea perteneciente

a la familia de las solanáceas. Dependiendo de las condiciones climáticas, el tomate

es cultivado en muy diversos ciclos, según las fechas de producción, cultivares

empleados y destino del fruto (mercado en fresco o industria). Según datos de

producción de tomate destinado a transformación industrial entre 1990-91 y 1993-94

en todo el mundo excepto en China y los países de la antigua Unión Soviética, la

producción mundial se sitúa en torno a los 21 millones de toneladas. De la producción

total, algo más del 85% está repartida entre América del Norte (46%) y la Cuenca del

Mediterráneo (40%). En América del Norte, la mayor producción se sitúa en el estado

de California (EE.UU) con un 38 % de la producción mundial. En la Cuenca del

Mediterráneo la mayor producción se sitúa en los países productores de la Unión

Europea. España ocupa el tercer lugar de los países productores de la Cuenca del

Mediterráneo después de Italia y con un nivel muy próximo a Grecia y Turquía.

De la producción española, aproximadamente el 85% se dedica a la elaboración

de triturados y concentrados, localizándose la mayor parte de esta producción en los

regadíos del Guadiana en Extremadura (Rodríguez del Rincón, 1999).

En la Figura 7, se pueden ver las parcelas de seguimiento utilizadas en este

trabajo, situadas en Extremadura, en las que se aprecian los distintos sistemas de

riego utilizados, por goteo (A) y por gravedad (B). También se muestran las fotografías

de la planta de tomate cultivada (A), y del tomate, utilizado para conserva, después de

la cosecha (B).

S P R O

R O O R


8

El cultivo del tomate puede ser atacado por diversas plagas como los ácaros, la

mosca blanca, los pulgones, las chinches, los minadores de hojas, las orugas aéreas y

los trips. En el control de estas plagas se utilizan fundamentalmente insecticidas y

acaricidas, aunque en algunos casos también se utilizan los enemigos naturales de las

plagas. Numerosos insecticidas, de distintas familias químicas, son aplicados al cultivo

del tomate en la región de Extremadura. De entre ellos, el insecticida organofosforado

clorpirifos, utilizado para el control de un amplio numero de insectos del suelo y otros

artrópodos, y el organoclorado endosulfan, utilizado para el control de los insectos

chupadores y masticadores en las frutas y hortalizas, se aplican ampliamente,

especialmente este último para el control de las plagas más frecuentes.

Figura 7. Parcelas en las que se estudió la evolución de los insecticidas endosulfan y clorpirifos. Parcela de Gévora (A) y parcela de Badajoz (B). Detalle de la planta de tomate cultivada en estas parcelas (C) y detalle del fruto después de la cosecha (D).

A B

C D

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

Justificación y Objetivos

9

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

La contaminación de los diferentes compartimentos ambientales por residuos de

plaguicidas constituye un problema actual de gran importancia. El estudio de la

distribución y comportamiento de estos compuestos desde que se realiza su aplicación

permite analizar su persistencia en una matriz determinada y su capacidad de

transferencia a otras matrices. Procesos tales como la degradación, la volatilización y

la adsorción, junto con otros procesos de transporte, como la escorrentía y lixiviación,

son los responsables de la aparición de residuos de plaguicidas en la atmósfera,

aguas superficiales y subterráneas, suelo, plantas, etc.

Por otra parte, el análisis de los plaguicidas en las matrices ambientales requiere

el empleo de disolventes caros y tóxicos, y en muchas ocasiones los métodos

utilizados son lentos y laboriosos, por lo que es de gran interés realizar estos análisis

de una manera rápida y sencilla y empleando el volumen mínimo requerido de dichos

disolventes.

De entre los numerosos plaguicidas utilizados, se han seleccionado como objeto

de estudio en este trabajo compuestos con acción insecticida / acaricida debido a su

amplio uso en los cultivos hortícolas en España. Se profundizará en el estudio de los

insecticidas clorpirifos y endosulfan debido a su extensa utilización en el cultivo del

tomate en la provincia de Badajoz, importante zona productora de tomate para

conserva. Asimismo, se estudiará con más detalle el insecticida endosulfan debido a

su mayor persistencia y la posibilidad, por tanto, de contaminar aquellas matrices en

las que se encuentre. Por otra parte, su elevada toxicidad para algunos organismos

acuáticos hace necesario un estudio mas detallado de su comportamiento ambiental y

de la posibilidad de transferencia de este compuesto a otros compartimentos,

especialmente a los ecosistemas acuáticos.

Los objetivos generales propuestos en este trabajo se presentan a continuación

agrupados por capítulos:

Justificación y Objetivos

10

Metodología analítica

• Desarrollo de la metodología analítica para la determinación simultánea en

diversas matrices medioambientales [suelo, agua (disolución del suelo), aire y

plantas] de los residuos de diferentes insecticidas utilizados en el cultivo del

tomate. Los insecticidas seleccionados para ser determinados en el suelo

pertenecen a diferentes familias químicas: clorpirifos (organofosforado), lindano,

tetradifon, heptacloro, endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato

(organoclorados) y cihalotrin y acrinatrin (piretroides). Por otra parte se

determinarán los residuos de clorpirifos y de endosulfan en la disolución del suelo

y en el aire, así como los residuos de endosulfan en el material vegetal.

Persistencia en condiciones de laboratorio

• Estudio de la degradación en el suelo, en condiciones de laboratorio, de los

insecticidas clorpirifos y endosulfan, así como la determinación de la influencia

de la temperatura ambiente, la humedad del suelo y la presencia de

microorganismos en la zona de la rizosfera del suelo en este proceso.

• Determinación de la adsorción de los insecticidas clorpirifos y endosulfan en

diferentes suelos procedentes de parcelas comerciales dedicadas al cultivo del

tomate en la región de Badajoz.

• Determinación de la tasa de volatilización del endosulfan en condiciones

controladas de temperatura.

Persistencia y distribución en condiciones de campo

• Estudio de la persistencia en condiciones de campo de los insecticidas clorpirifos

y endosulfan, así como de sus niveles residuales a lo largo del ciclo de cultivo y

después de la cosecha.

• Estudio la distribución en el medio ambiente del insecticida endosulfan después

de su aplicación al cultivo del tomate.

I. METODOLOGÍA ANALÍTICA


11

CAPITULO I. METODOLOGÍA ANALÍTICA

1. INTRODUCCIÓN

El descubrimiento del DDT como insecticida de contacto, en los primeros años

de la década de los cuarenta, marcó el principio de la era de los plaguicidas orgánicos

de síntesis y pronto emergió una gran variedad de plaguicidas organoclorados. Sin

embargo, debido a su amplio uso, la efectividad de estos compuestos empezó a

disminuir en algunos casos, y a partir de 1950 nuevos plaguicidas de síntesis

(organofosforados y carbamatos) fueron desarrollados para ser usados como

complemento o sustitutos. Hoy en día se siguen aplicando a los cultivos una amplia

variedad de productos fitosanitarios. La utilización de estos compuestos origina la

aparición de sus residuos en los distintos compartimentos ambientales. En algunos

casos estos residuos permanecen en concentraciones elevadas y durante tiempos

prolongados en la matriz donde han sido aplicados o transportados, ocasionado la

contaminación del medio ambiente.

El análisis de los residuos de los plaguicidas consiste en la cuantificación, a nivel

de trazas, de estos compuestos en diferentes matrices y generalmente consta de las

etapas de extracción, purificación y determinación. En la extracción de los plaguicidas

de las matrices en las que se encuentran, se utilizan diferentes técnicas dependiendo

de las condiciones. Los sistemas tradicionales de extracción, que se siguen

empleando hoy en día en algunas ocasiones, son la extracción líquido-líquido (LLE), la

extracción Soxhlet (SOX) y la extracción sólido líquido (SLE). Estás técnicas requieren

el uso de grandes volúmenes de disolventes tóxicos, son laboriosas, y en algunos

casos lentas, como la extracción Soxhlet, que requiere al menos 24 h.

En las modernas metodologías de extracción se pretende minimizar el uso de

disolventes, se trata de conseguir una mayor automatización del proceso además de

una mayor rapidez. Algunos de estos métodos implican la utilización de fases sólidas,

como la extracción en fase sólida (solid-phase extraction, SPE), técnica que consiste

en la adsorción de los analitos en un adsorbente sólido y en la posterior desorción de

los compuestos mediante la utilización de un pequeño volumen de disolvente orgánico

(Font et al., 1993). Los adsorbentes utilizados pueden ser no selectivos, como las

fases de sílice enlazadas o derivatizadas con cadenas C8 o C18 y diversos polímeros,


12

o selectivos como los inmunoadsorbentes o los polímeros con impresión a nivel

molecular (molecularly imprinted polymers, MIP) (Bertoncini-Delaunay et al., 2001 y

Ensing, et al., 2002). Está técnica, aunque permite realizar extracciones selectivas, no

se puede utilizar para la extracción de muestras con un alto grado de viscosidad. Para

este tipo de muestras, se lleva a cabo la dispersión de las mismas en una matriz sólida

(matrix solid-phase dispersión, MSPD). Se utilizan como matrices sólidas diversos

componentes, entre otros, Florisil, fases de sílice derivatizada o sin derivatizar y

alúmina, para su posterior empaquetamiento en una columna y elución con el

disolvente apropiado (Sicbaldi et al. 1997 y Barker, 1998). La micro extracción en fase

sólida (solid-phase microextraction, SPME) constituye otra alternativa interesante ya

que no se utiliza ningún tipo de disolvente durante el proceso de extracción, sino que

los compuestos son adsorbidos de la matriz por las fibras de extracción y

posteriormente desorbidos térmicamente en el instrumento donde se efectúa la

determinación. La extracción de los compuestos se puede realizar sumergiendo la

fibra en la matriz, lo que se conoce como extracción directa o exponiendo la fibra al

espacio de cabeza del recipiente que contiene la muestra, técnica conocida como

headspace SPME (HS-SPME) (Pawliszyn, 1997).

Existen otras técnicas de extracción aplicadas al análisis de residuos de

plaguicidas que implican el uso de equipamiento más complejo como es el caso de la

extracción mediante fluidos supercríticos (supercritical fluid extraction, SFE), técnica

en la que un fluido supercrítico es utilizado como disolvente extractante (Capriel et al.,

1986, Valverde-García et al., 1996, Pearce et al., 1997, Erstfeld y Chen, 1998 y Berset

y Holzer, 1999). El dióxido de carbono, con o sin otro disolvente modificador, es el

fluido supercrítico más utilizado (Hawthorne, 1990). Este tipo de extracción presenta la

ventaja de que el fluido supercrítico es un gas en condiciones normales de presión y

temperatura. Existe otra técnica similar (accelerated solvent extraction, ASE) en la que

en lugar de un fluido supercrítico se utiliza un líquido, a elevada temperatura y presión,

como agente extractante (Richter, B.E., et al., 1995 y 1996). Los líquidos utilizados son

los disolventes que se emplean normalmente en la extracción líquido-líquido. Por

último, se emplea la técnica de la extracción en horno de microondas (microwave-

assisted solvent extraction, MAE), la cual utiliza la radiación de microondas para

calentar los disolventes que están en contacto con las muestras sólidas y facilitar la

extracción de los analitos (Majors, 1996).


13

En la purificación de los extractos conseguidos, en caso de que sea necesaria,

se utilizan diferentes técnicas, como el reparto líquido-líquido seguido de la

concentración de los extractos por medio de la evaporación del disolvente con distintos

gases (aire o nitrógeno) y la cromatografía en columna utilizando un adsorbente sólido

(Florisil, Alúmina) en la que el extracto pasa a través del adsorbente produciéndose un

fraccionamiento por polaridad. Otro tipo de separación es en base al peso molecular o

tamaño de la molécula, utilizando la cromatografía de permeación sobre gel (gel

permeation cromatography, GPC) (Gelsomio et al., 1997). Mediante algunas de las

técnicas de extracción mencionadas anteriormente, como la SPE o SPME, se puede

conseguir la extracción y purificación de los plaguicidas en el mismo proceso (Fifield y

Haines, 1998).

En el proceso de determinación de los residuos de plaguicidas se han utilizado

distintas técnicas. Desde 1946 hasta 1955 las determinaciones de residuos de

plaguicidas estaban restringidas a métodos específicos colorimétricos y a algunos

procedimientos no específicos, como determinaciones de cloro y fósforo total, la

inhibición de la colinesterasa y a los bioensayos.

En 1954 se empieza a aplicar la cromatografía de gases (gas chromatography,

GC), presentando una gran sensibilidad y selectividad para el análisis de los

plaguicidas. Durante los años de 1956 a 1962 se sientan las bases de esta técnica y

en años posteriores se va perfeccionando notablemente con el uso de columnas

capilares, técnicas de derivatización y los detectores específicos, por lo que se hace

posible la detección de muchos compuestos difíciles de analizar, así como la

determinación de sus residuos (Littlewood, 1970, y Anson Moye, 1981). Los detectores

de GC más utilizados en el análisis de residuos de plaguicidas son el detector de

captura de electrones (electron-capture detector, ECD) y el detector de nitrógeno y

fósforo (nitrogen-phosphorous detector, NPD).

Otra técnica utilizada en la determinación de residuos de plaguicidas es la

espectrometría de masas (mass spectrometry, MS) (Davis y Frearson, 1987 y

Silverstein et al., 1991). La utilización de esta técnica tiene una gran importancia

debido a la alta sensibilidad que presenta, capaz de obtener espectros de masas con

cantidades inferiores a un nanogramo, por lo que este sistema se ha constituido como

una herramienta de gran interés en la identificación de los compuestos orgánicos. Para


14

poder utilizar este sistema, se necesita un aislamiento previo muy eficiente, por lo que

una aplicación de gran importancia es la identificación de residuos de plaguicidas por

medio del acoplamiento cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS). El

detector de masas, que usualmente se utiliza en el análisis de residuos de plaguicidas

es un cuadrupolo, puede funcionar en el modo de barrido completo del espectro, que

se utiliza para la confirmación de los residuos, pero la mayor sensibilidad se consigue

cuando funciona en el modo de selección de iones (selected ion monitoring, SIM). En

esta técnica no se realiza un barrido completo del espectro, sino que se registran sólo

los iones preseleccionados, por lo que aumenta el tiempo disponible para registrar

cada señal, y con ello la sensibilidad.

La cromatografía de líquidos de alta resolución (high performance liquid

chromatography, HPLC) es una alternativa interesante para el análisis de plaguicidas

que no pueden ser analizados por cromatografía de gases debido a que son lábiles a

altas temperaturas, a que son poco volátiles o a que poseen gran polaridad y

presentan problemas de elución en la determinación por cromatografía de gases

(Braithwaite y Smith, 1999). La mayoría de los análisis realizados por esta técnica son

llevados a cabo con columnas de fase estacionaria C8 o C18 y utilizando detectores de

UV trabajando con una longitud de onda fija o variable y detectores de fluorescencia.

La cromatografía en capa fina (thin-layer chromatography, TLC) también se ha

utilizado en la determinación de residuos de plaguicidas, aunque en menor medida

(Sherma, 1999-a) así como otras técnicas como la electroforesis capilar (capillary

electrophoresis, CE) y métodos inmunoquímicos, dentro de los cuales el análisis de

plaguicidas mediante inmuno-ensayos (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

es el más ampliamente utilizado (Marco et al., 1993, Lee et al., 1997 y Sherma, 1999-

b).

1.1. Determinación de plaguicidas en el suelo

El análisis de residuos de insecticidas en el suelo se realiza comúnmente por

GC-NPD (Magdic et al., 1996) por GC-ECD (Miglioranza et al., 1999) y por GC-MS

(Papadopoulou-Mourkidou et al., 1997 y Mogadati et al., 1999). En estos métodos, los

insecticidas son fundamentalmente extraídos de los distintos suelos utilizando técnicas


15

convencionales como extracción por agitación o extracción Soxhlet (Aigner et al.,

1998). En los últimos años se han empleado otros métodos de extracción como SFE

(Snyder et al., 1994 y Khan, 1995), ASE (Ezzell et al., 1995) y MAE, obteniéndose

buenos resultados (Lopez-Avila et al., 1995 y Lopez-Avila y Benedicto, 1998). El uso

de SFE en los análisis de muestras de suelo parece ser una buena alternativa, aunque

la optimización de las condiciones de operación sigue siendo un punto crítico en el

desarrollo de un método rutinario de extracción de plaguicidas de muestras reales por

SFE (Snyder et al., 1992 y Santos et al., 1998). Por otra parte, el uso de la extracción

en horno de microondas requiere el uso de equipos especiales de microondas y el

posterior enfriamiento de los vasos de extracción a temperatura ambiente, con el

consiguiente aumento en el tiempo total de extracción.

La extracción con disolventes en baño de ultrasonidos se ha aplicado con

buenos resultados a la extracción de muestras de suelo, presentando algunas ventajas

sobre los sistemas anteriores. La sonicación proporciona un contacto más eficiente

entre el suelo y el disolvente extractante, traduciéndose en una mayor recuperación de

los analitos (Johnsen y Starr, 1972 y Babi� et al., 1998). Recientemente, se ha

aplicado un método basado en la extracción por sonicación de muestras de suelo

contenidas en pequeñas columnas (sonication-assisted extraction in small columns,

SAESC) y utilizando volúmenes pequeños de disolventes, como una metodología

rápida y sensible para la determinación simultanea de diferentes herbicidas (Sánchez-

Brunete et al., 1998).

1.2. Determinación de plaguicidas en el agua

Tradicionalmente la extracción líquido-líquido ha sido el método más utilizado

para la recuperación de los plaguicidas de las matrices acuosas. En este proceso se

han utilizado distintos disolventes tales como n-hexano, diclorometano y acetato de

etilo, entre otros (Potter et al., 1991, García C. et al., 1992 y Kenneth et al., 1992). Otra

técnica utilizada es la extracción sólido-líquido (Fernández, et al., 1996). Mediante el

empleo de estos métodos, frecuentemente se hace necesaria la purificación de los

extractos y además se suelen utilizar volúmenes grandes de disolventes orgánicos.

Para tratar de solventar estos problemas se han introducido modificaciones en las


16

técnicas anteriores y desarrollado nuevas metodologías. De esta manera, se ha

utilizado la micro extracción líquido-líquido, donde se requieren volúmenes muy

pequeños de disolvente (Zapf et al., 1995). Una variante de la extracción sólido-líquido

es la SPE. Esta técnica se ha convertido en un procedimiento muy utilizado en este

tipo de análisis debido a que la purificación de los extractos no es necesaria ya que se

consigue en el mismo proceso de extracción, teniendo lugar además una

concentración de los analitos. El adsorbente más utilizado para análisis de plaguicidas

en agua por SPE es la sílice-C18 (Colina et al., 1993, Font et al., 1993, Albanis y Hela,

1995, y Albanis et al., 1998). Otra técnica que se está empleando últimamente debido

a sus ventajas, como la no utilización de disolvente alguno, es la SPME (Eisert y

Levsen, 1995, Magdic et al., 1996, Magdic y Pawliszyn, 1996, Aguilar et al., 1998 y

Lambropoulou y Albanis, 2001).

La determinación de residuos de plaguicidas en agua, se realiza

fundamentalmente por GC-ECD, GC-NPD y GC-MS (Okumura y Nishikawa, 1995,

Miliadis, 1998, y Martínez Vidal et al. 2000), aunque otras técnicas como HPLC y CE

son también utilizadas (Parrilla et al., 1993, Colina et al., 1994 y Hinsmann et al.,

2000).

1.3. Determinación de plaguicidas en el aire

La determinación de plaguicidas en el aire ha implicado la utilización de diversos

sistemas capaces de extraer de esta matriz los analitos de interés. Se han utilizado

algunas fases líquidas, como etilen glicol y tolueno (Farmer et al., 1972, Grover, 1975

y Singh N.C. et al.,1991), diferentes adsorbentes como el Tenax, rellenos para

columnas cromatografícas, resinas y espumas de poliuretano (PUF) (Russell, 1975,

Thomas et al., 1980, González et al., 1997, Clément et al., 2000 y Tabernero et al.,

2000). Asimismo, otros adsorbentes como filtros de fibra de vidrio (Gudéhn y

Kolmodin-Hedman, 1987), carbón activo (Kawata et al., 1995) y Florisil (Martínez et al.,

1994 y Swami et al., 1997) también han sido empleados.

Una vez que los analitos han sido extraídos de la fase aérea, se lleva a cabo la

desorción de los mismos, utilizando diferentes métodos. En general, la extracción de

los analitos de los adsorbentes mediante sistemas clásicos requiere bastante tiempo y


17

gran cantidad de material de vidrio y de disolventes orgánicos, como por ejemplo en la

extracción Soxhlet. Recientemente se han utilizado otros métodos alternativos como la

SFE (Swami et al., 1997) y la sonicación (González et al., 1997 y Martínez Vidal et al.,

1997), pero la utilización de SFE requiere equipos especiales y caros y la sonicación,

generalmente, implica también la utilización de volúmenes considerables de

disolventes orgánicos.

El análisis de endosulfan en el aire, por ejemplo, está normalmente basado en la

retención por un adsorbente y en la subsiguiente extracción mediante los disolventes

orgánicos apropiados (Martínez Vidal et al., 1997). La determinación de sus residuos

se realiza, generalmente, mediante GC-ECD (Singh P.P. et al.,1991, Gopal y

Mukherjee, 1993, y Aguilera-del Real et al., 1997), aunque algunos análisis se han

realizado por GC-MS (Antonious et al., 1998).

1.4. Determinación de plaguicidas en el material vegetal

En los métodos de análisis de residuos de plaguicidas en materiales vegetales la

purificación de los extractos después de su extracción juega un papel muy importante,

debido a la gran cantidad de compuestos coextraidos que pueden presentar este tipo

de matrices. El método normalmente empleado para la extracción de los residuos de

plaguicidas de la muestra vegetal es la desintegración de la matriz utilizando un

homogenizador de alta velocidad en presencia del disolvente o la mezcla de

disolventes extractantes. Los disolventes más utilizados son acetona y acetonitrilo,

aunque otros disolventes como acetato de etilo y metanol también se han utilizado

(Liao et al., 1991 Cai et al., 1995 y Molinari et al., 1998). Asimismo, otras técnicas de

extracción como MSPD, SFE y SPME han sido también aplicadas (Kadenczki et al.,

1992, Lehotay y Eller, 1995, Lingh y Huang, 1995 y Volante et al., 2000).

La mayoría de los métodos multiresiduo incluyen alguna etapa de purificación

utilizando columnas que contienen algún adsorbente, como el Florisil, el oxido de

aluminio (alúmina) y la gel de sílice. El Florisil es muy utilizado debido a su capacidad

de retener algunos lípidos por lo que se emplea en la purificación de muestras con alto

contenido en grasas. Este adsorbente presenta el inconveniente de que su actividad

puede variar de un lote a otro, por lo que en ocasiones es sustituido por la alúmina.


18

(Tekel y Hatrík, 1996 y Morelli-Cardoso, 1999). Otros métodos de purificación de

muestras vegetales están basados en la SPE, mediante la que se puede conseguir

tanto la extracción como la purificación de los extractos (Hsu et al., 1991) y la GPC,

muy utilizada en la eliminación de los lípidos que pudieran interferir en el análisis

(Gelsomio et al., 1997).

La determinación de residuos de plaguicidas en muestras vegetales se realiza

fundamentalmente por GC o LC con detectores específicos (Motohashi, 1996 y Tekel y

Hatrík, 1996).

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales

2.1.1. Patrones

Los productos a partir de los cuales se elaboraron los patrones fueron obtenidos

de distintas casas comerciales: lindano, heptacloro, endosulfan-I, endosulfan-II,

endosulfan-sulfato, tetradifón y clorpirifos fueron obtenidos de Reidel-de Häen

(Alemania), cihalotrin de Zeltia Agraria (España) y acrinatrin de Roussel Uclaf (EE.UU).

2.1.2. Formulaciones comerciales de plaguicidas

Se utilizaron las siguientes formulaciones: Thimul (endosulfan-I + endosulfan-II,

70:30, 35 % p/v, como líquido emulsionable), Dursban (clorpirifos 48 % p/v, líquido

emulsionable) obtenidas de Rhône Poulenc (España) y Stomp (Pendimetalina 33 %

p/v) obtenida de Cyanamid Ibérica (España).

2.1.3. Disolventes

Se utilizó hexano en el proceso de extracción líquido-líquido del agua, y acetato

de etilo en las extracciones del plaguicida del suelo y de los adsorbentes, ambos

obtenidos de Panreac (España).


19

2.1.4. Reactivos y adsorbentes

Florisil (60-100 mallas), activado a 180 ºC durante una noche antes de su uso, se

obtuvo de Aldrich (Alemania). El sulfato sódico anhidro y el óxido de aluminio (0,063-

0,200 mm), actividad II, fueron obtenidos de la casa comercial Merck (Alemania).

2.1.5. Suelos

Los suelos se obtuvieron de la capa superficial del terreno (0-10 cm) de dos

parcelas del Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA), se dejaron secar a

temperatura ambiente, posteriormente se cribaron a través de un tamiz de 2 mm y

fueron almacenados a temperatura ambiente hasta su ajuste de humedad y

fortificación. Las características fisico-químicas de estos suelos, se resumen en la

Tabla 1.

Tabla 1. Características de los suelos empleados.

Suelo % Arena % Arcilla % Limo % M.O.a pH b C.C. (% a -33 Kp)

A 44,3 37,4 18,2 1,0 7,7 14,8

B 64,8 11,5 23,7 1,8 6,7 13,3 a Se midió el carbono total por combustión en un analizador CHN (% M.O. = % C.O. x 1,724). b pH calculado en suspensión suelo:agua (1:2,5).

2.1.6. Material vegetal

Se utilizaron plantas de tomate que se mantuvieron bajo condiciones controladas

en una cámara de cultivo (24 ºC y 70 % de humedad relativa) durante 2 meses hasta

el comienzo de los ensayos.

2.1.7. Columnas de extracción y purificación y fibras de SPME

En los procesos de extracción en baño de ultrasonidos se utilizaron columnas de

polipropileno de 20 ml obtenidas de Becton-Dickinson (España), de 12 ml de Supelco,

(España) y columnas de vidrio de 20 ml de Afora (España). Las placas (Frits) de


20

polietileno utilizados se obtuvieron de Supelco (España). Las columnas de vidrio

utilizadas en la purificación de los extractos vegetales fueron obtenidas de Pobel

(España).

En el análisis por SPME, se utilizaron aplicadores manuales con una fibra de

polidimetilsiloxano (PDMS) de un espesor de 100 µm o con una fibra de poliacrilato

(PA) de un espesor de 85 µm, ambas obtenidas de Supelco (España). En el análisis

directo del espacio de cabeza se utilizó una jeringuilla de vidrio de 10 ml, Hamilton

sampleblock (España).

2.2. Aparatos

2.2.1. Equipo de Laboratorio

En la extracción de los plaguicidas de las muestras, se utilizó un equipo

ultrasónico de baño de agua Raypa (España) con un generador de 150 W y una

frecuencia de 35 kHz. El proceso de filtrado se llevó a cabo en un equipo de vacío con

un colector múltiple de 12 salidas, Supelco (España). Para la determinación de los

plaguicidas en el aire se utilizaron una bomba de muestreo de aire Q-Max y un puerto

de muestreo con dos canales Q-max, obtenidos de Supelco (España). Para la

homogenización de material vegetal se utilizó un homogenizador DI 148 obtenido de

Schott Ibérica (España).

2.2.2. Sistema de análisis cromatográfico A: Cromatógrafo de gases HP con detector

de captura de electrones (GC-ECD)

Se utilizó un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard modelo 5890, con un

detector de captura de electrones y con inyector automático. Se empleó una columna

capilar HP-1 (30 m x 0,25 mm d.i. y 0,25 µm de espesor). Se estableció un programa

de temperatura diferente para la columna dependiendo del tipo de análisis. El gas

portador fue helio, con un flujo de 1 ml/minuto. Se inyectó un volumen de 2 µl de todas

las muestras y patrones en el modo sin división de flujo (splitless). Para conocer la


21

concentración de los plaguicidas en la matriz estudiada se utilizó un patrón externo,

mezcla de los compuestos a analizar.

2.2.3. Sistema de análisis cromatográfico B: Cromatógrafo de gases Varian con

detector de captura de electrones (GC-ECD)

Se utilizó un cromatógrafo de gases Varian modelo 3700 equipado con un

detector de captura de electrones y con una columna de vidrio de relleno (2 m x 6,35

mm d.i.) Sugelabor (España) empaquetada con un 3% de fase OV-17 en chromosorb

W-HP (80-100 mallas). Se utilizó nitrógeno como gas portador a un flujo de 40 ml /min.

2.2.4. Sistema de análisis cromatográfico C: Cromatógrafo de gases con detector de

trampa de iones (GC-ITD)

Se utilizó un cromatógrafo de gases Perkin-Elmer modelo 8500 equipado con un

detector de trampa de iones (Finnigan, Perkin-Elmer, EE.UU.), operando en el modo

de impacto de electrones. Se empleó una columna capilar de sílice fundida BP-1 (12 m

x 0,22 mm d.i.) y una película de 0,25 µm, y como gas portador se utilizó helio a 10

p.s.i. y con un flujo de 0,9 ml/minuto. Se estableció un programa de temperatura

diferente para la columna dependiendo del tipo de análisis. Los parámetros de

adquisición del espectrómetro de masas fueron los siguientes:

La temperatura de la línea de transferencia de 250 ºC, el rango de masas entre

40-350 daltons, la velocidad de escáner 0,5 s/scan, 3-µscan, la radiofrecuencia de 1,1

MHz y el voltaje de 0-7,5 kV, el control de ganancia automático de 78 µs a 25 µs y el

retardo del disolvente de 3 minutos. La confirmación de la identidad de los compuestos

se realizó mediante la selección de los iones mayoritarios de los espectros de masas

de cada compuesto a cuantificar, después de la adquisición de los cromatogramas

totales de iones de las muestras.


22

2.2.5. Sistema de análisis cromatográfico D: Cromatógrafo de gases con detector

selectivo de masas (GC-MSD)

Se utilizó un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard modelo 6890 equipado con

un detector selectivo de masas HP5973 y un inyector automático. Se empleó una

columna capilar de sílice fundida no polar, HP-1 (30 m x 0,25 mm d.i. y 0,25 µm de

espesor), y como gas portador se utilizó helio a un flujo de 1 ml/minuto. Se inyectó un

volumen de 2 µl de todas las muestras y patrones en el modo sin división de flujo. Los

parámetros de adquisición del espectrómetro de masas fueron los siguientes:

Modo de ionización de impacto electrónico con una energía de 70 eV, un rango

de masas de 50-450 (m/z). La fuente de iones se mantuvo a una temperatura de 230

ºC, la temperatura del cuadrupolo fue de 150 ºC, la velocidad de escáner fue de 3,62

s/escan, 2 µescanes, el voltaje del multiplicador electrónico de 1000 y el retardo del

disolvente de 5 minutos. La confirmación de la identidad de los compuestos se realizó

mediante la selección de los iones mayoritarios de los espectros de masas de cada

compuesto a cuantificar, después de la adquisición de los cromatogramas totales de

iones de las muestras.

2.3. Métodos analíticos

2.3.1. SUELO

Se ha desarrollado un método de determinación multi-residuo en el suelo de los

insecticidas: lindano, heptacloro, endosulfan-I, endosulfan-II, endosulfan-sulfato,

tetradifon, clorpirifos, cihalotrin y acrinatrin. En la Tabla 2 se presentan las estructuras

químicas de los compuestos estudiados.

2.3.1.1. Preparación de las muestras

Se han estudiado 2 tipos de suelos con distintas características fisico-químicas

(Tabla 1), así como la influencia de distintas variables en la recuperación y

cuantificación de dichos compuestos por el método utilizado (contenido de humedad

del suelo, tiempo de residencia de los insecticidas en el suelo antes de su extracción y


23

naturaleza del material de las columnas empleadas en la etapa de extracción de los

compuestos del suelo).

Para estudiar la influencia de los distintos contenidos de humedad del suelo en la

recuperación de los insecticidas estudiados se fortificaron 5 g de suelo tamizado

contenidos en una columna de polipropileno de 20 ml.

Tabla 2. Insecticidas analizados en este estudio.

Compuestos Fórmula Estructura

Lindano C6H6Cl6

Tetradifon C12H6Cl4O2S

Heptacloro C10H5Cl7

Endosulfan C9H6Cl6O3S

Endosulfan-sulfato C9H6Cl6O4S

Clorpirifos C9H11Cl3NO3PS

Cihalotrin C23H19ClF3NO3

Acrinatrin C26H21F6NO5

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

O

SO

O

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

Cl Cl

Cl

ClCl

Cl

Cl SO2

Cl

Cl

Cl

OCCO2

H3C CH3

HC

H

HC

(CF3)2CHOCO H

CN

H

OCCO2

H3C CH3

HCC

F3C

ClH H

CN

H

N OP(OCH 2CH3)2

ClCl

Cl

S

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

O

SO2

O


24

Las muestras de suelo fueron fortificadas con 1 ml de disoluciones stock que

contenían una mezcla de los insecticidas a estudiar para alcanzar unas

concentraciones finales en el suelo de 0,1, 0,5, y 1 µg/g. La humedad fue ajustada al 5

% (correspondiente al 34 % y al 38 % de la capacidad de campo de los suelos A y B,

respectivamente) y al 10 % (correspondiente al 68 % y al 75 % de la capacidad de

campo de los suelos A y B, respectivamente) mediante la adición de la cantidad de

agua correspondiente al suelo situado ya en la columna. La extracción de las muestras

se llevó a cabo después de 25 minutos (tiempo que se dejó transcurrir para permitir la

evaporación del disolvente).

Para investigar la influencia del tiempo de residencia de los insecticidas en el

suelo en el proceso de recuperación, se utilizaron también columnas de polipropileno,

pero en este caso los 5 g de suelo fueron fortificados para alcanzar una concentración

de 0,5 µg/g. El ensayo se realizó con suelos ajustados tanto al 5% como al 10 % de

humedad. Se realizó la extracción de una parte de las muestras al cabo de 25 minutos

y las muestras restantes fueron almacenadas, en las columnas tapadas, a 4 ºC hasta

el análisis a diferentes tiempos (1, 15 y 30 días).

Para investigar la influencia del material de la columna, 5 g de suelo fueron

colocados en las columnas de polipropileno y otros 5 g en columnas de vidrio de 20 ml

siguiendo el procedimiento anteriormente indicado, y los suelos fueron fortificados para

obtener una concentración de 0,5 µg/g. El ensayo también se realizó ajustando la

humedad de los suelos al 5 % y al 10 %. Las columnas fueron almacenadas en una

cámara a 4 ºC hasta la extracción de los plaguicidas que se realizó a los 15 y 30 días.

2.3.1.2. Extracción de los plaguicidas del suelo

El proceso de extracción se llevó a cabo en las columnas de 20 ml (polipropileno

y vidrio), dentro de las cuales se acoplaron en la parte inferior, al final de la columna, 2

filtros circulares de papel de 2 cm de diámetro (Whatman No.1). Sobre este sistema se

añadieron 2 g de Na2SO4 anhidro y a continuación los 5 g de suelo, preparado según

se ha descrito anteriormente para cada tipo de estudio. La sal se adicionó para retener

las partículas del suelo y los posibles restos de humedad que pudiera contener el

eluato. La extracción se realizó utilizando un equipo ultrasónico de baño de agua.


25

Primeramente se añadieron 5 ml de acetato de etilo a las columnas y se sonicó

durante 15 minutos, siendo el nivel de agua del baño ajustado al mismo nivel que el

disolvente tenía dentro de la columna. Después se llevaron las columnas al sistema de

filtrado a vacío (Figura 2), recogiéndose el líquido resultante en tubos graduados de

vidrio, y posteriormente se realizó un segundo paso de extracción con 4 ml de acetato

de etilo, y se llevó nuevamente al baño de ultrasonidos durante 15 minutos, para

después filtrar a vacío y recolectar el líquido junto con el anterior. Finalmente se

lavaron las columnas con 1 ml de acetato de etilo y se procedió análogamente. Los

extractos totales recolectados se enrasaron a 10 ml con acetato de etilo. En la Figura

1, se muestra de manera esquematizada el proceso descrito.

Figura 2. Detalle del sistema de filtrado a vacío utilizado en el proceso de extracción de los insecticidas de las muestras de suelo.

Figura 1. Esquema del proceso de extracción de los insecticidas estudiados en muestras de suelo.

Extracción

Baño ultrasonidos

1-5 ml AcOEt

2g Na2SO4 anhidro 2 Filtros

5g Suelo

Filtración


26

Finalmente, las muestras fueron almacenadas en nevera a una temperatura de 4

ºC, hasta el momento del análisis cromatográfico.

2.3.1.3. Determinación cromatográfica

Todas las medidas se realizaron mediante cromatografía gaseosa, utilizando el

sistema de análisis cromatográfico A. La temperatura de la columna se mantuvo a 150

ºC durante 1 minuto, luego fue aumentando a una velocidad de 25 ºC/minuto hasta

230 ºC y se mantuvo 0,5 minutos, luego fue aumentando a una velocidad de 12 ºC/min

hasta 280 ºC donde se mantuvo 8 minutos. También se utilizó un programa alternativo

de temperatura más largo donde la temperatura de la columna se mantuvo a 80 ºC

durante 1 minuto, luego fue aumentando a una velocidad de 8 ºC/minuto hasta 220 ºC

y se mantuvo 10 minutos, y finalmente fue aumentando a una velocidad de 10 ºC/min

hasta 270 ºC donde se mantuvo 15 minutos. La temperatura del inyector fue de 270 ºC

y la del detector de 300 ºC para ambos programas.

La confirmación de la identidad de los residuos de los insecticidas investigados

se realizó mediante cromatografía gaseosa, utilizando el sistema de análisis

cromatográfico C. La temperatura del horno se mantuvo a 110 ºC durante 1 minuto,

para aumentar a una velocidad de 30 ºC/minuto hasta 220 ºC donde se mantuvo 0,5

minutos y después aumentó a una tasa 15 ºC/minuto hasta alcanzar 270 ºC donde se

mantuvo 5 minutos. La temperatura del inyector fue de 270 ºC y la del detector de

250 ºC.

2.3.2. AGUA

Se desarrolló un método de extracción y determinación de los insecticidas

endosulfan y clorpirifos, a partir de formulaciones comerciales, en agua.

2.3.2.1. Extracción liquido-liquido de los plaguicidas

Se realizaron dos pasos de extracción con 2,5 ml de n-hexano, mediante un

proceso de reparto líquido-líquido. Los tubos fueron agitados, durante 1 minuto, en un

agitador vibrador (Vortex). Después de esperar a que se separasen las fases, se retiró


27

cuidadosamente y mediante pipeta Pasteur la fase superior, que contenía el

insecticida, y se transfirió a otro tubo de ensayo. A continuación se secaron las

muestras añadiendo una pequeña cantidad de Na2SO4 anhidro en esos mismos tubos,

y tras una pequeña agitación en el Vortex se transfirió el contenido a tubos graduados.

Los tubos anteriores, que quedaron con un remanente de Na2SO4, fueron lavados 3

veces con una pequeña cantidad de n-hexano, que fue a su vez transferida a los tubos

graduados, y finalmente las muestras fueron llevadas al volumen final adecuado para

su determinación cromatográfica.


Todas las medidas se realizaron mediante cromatografía gaseosa, utilizando el

sistema de análisis cromatográfico A. La temperatura de la columna se mantuvo a 150

ºC durante 1 minuto, luego fue aumentando a una velocidad de 25 ºC/minuto hasta

230 ºC y se mantuvo 0,5 minutos, luego fue aumentando a una velocidad de 12 ºC/min

hasta 280 ºC donde se mantuvo 8 minutos. La temperatura del inyector fue de 270 ºC

y la del detector de 300 ºC para ambos programas.

2.3.3. AIRE

Se han desarrollado 2 métodos de determinación de residuos de plaguicidas en

aire basados en diferentes técnicas analíticas:

2.3.3.1. Micro extracción en fase sólida

Se ha desarrollado un método para análisis de endosulfan y clorpirifos, junto con

pendimetalina y lindano, en muestras de aire utilizando la técnica de micro extracción

en fase sólida para extraer los compuestos volatilizados en el espacio de cabeza de

distintos recipientes (HS-SPME) que contenían muestras de suelo y muestras

vegetales.

En la Tabla 3 se presentan las estructuras y propiedades fisico-químicas de los

compuestos estudiados.


28

Tabla 3. Propiedades físico-químicas de los plaguicidas estudiados.

Compuesto Fórmula Estructura Pv (mPa) Log P

Endosulfan C9H6Cl6O3S

0,83 (20ºC) 4,74

Clorpirifos C9H11Cl3NO3PS

2,7 (25ºC) 4,69

Pendimetalina C13H19N3O4

4,0 (25ºC) 5,18

Lindano C6H6Cl6

5,6 (20ºC) 3,76

2.3.3.1.1. Preparación de las muestras

Muestras de suelo

Se colocaron 30 g de suelo B (Tabla 1) en un recipiente de vidrio de 120 ml de

volumen. El contenido de humedad del suelo se ajustó al 10 % añadiendo agua y las

muestras fueron fortificadas con 0,5 ml de las correspondientes disoluciones de los

compuestos estudiados para obtener una rango de concentración en el suelo de 0,1-

2,1 µg/g.

NCl

Cl Cl

OP(OCH2CH3)2

S

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

O

SO

O

NO2

NHCH(CH2CH3)2

NO2H3C

H3C

Cl Cl

Cl

ClCl

Cl


29

Muestras vegetales

Se utilizaron como muestras hojas de plantas de tomate tratadas con la

correspondiente disolución, que contenía una mezcla de los compuestos a estudiar,

para conseguir una cantidad entre 0,15-7,5 µg de plaguicida por hoja.

2.3.3.1.2. Extracción de los plaguicidas de la fase aérea

Extracción de los compuestos volatilizados desde el suelo

Se cerró el recipiente en el que se encontraba el suelo con un tapón que

contenía un septum de silicona y se mantuvo el sistema en estas condiciones durante

2 h a una temperatura de 30 ºC para que se alcanzara el equilibrio. Transcurrido ese

tiempo, se introdujo el aplicador de la fibra, a través de una perforación en el tapón, y

se expuso la fibra, previamente acondicionada de acuerdo con las especificaciones del

fabricante, en el espacio de cabeza y se dejó muestreando durante 1 h (Figura 3). A

continuación se efectuó la desorción térmica de los compuestos en el cromatógrafo de

gases durante 5 minutos. Por último se analizaron los compuestos por GC-ECD y se

confirmaron mediante GC-MS.

Figura 3. Montaje utilizado en el análisis de muestras de suelo mediante HS-SPME.

Aplicador de la fibra de SPME

Tapón con septum de silicona

Suelo fortificado


30

Extracción de los compuestos volatilizados desde la planta

Se introdujo una hoja tratada en un matraz de fondo redondo con 2 bocas, a

través de una de éstas, como se muestra en la Figura 4. El montaje se mantuvo 1 h a

30 ºC sometido a agitación magnética para que el sistema alcanzara el equilibrio y

luego se introdujo el aplicador, a través de un septum de silicona perforado, por la otra

boca del matraz y la fibra se expuso al espacio de cabeza durante 1 h. El análisis

cromatográfico se realizó de la misma manera que para las muestras procedentes del

suelo.

Medida directa en el espacio de cabeza

Se siguió el mismo procedimiento descrito para el análisis de muestras

volatilizadas desde el suelo, pero en este caso el muestreo se realizó después de 3 h

de equilibrado. Se tomó un volumen predeterminado de aire del espacio de cabeza,

entre 2 y 5 ml, con la jeringa Hamilton y se inyectó en el cromatográfo de gases. El

análisis cromatográfico se realizó de la misma manera que para las muestras

procedentes del suelo.

Figura 4. Montaje utilizado en el análisis de muestras de planta mediante HS-SPME.

Aplicador de la fibra de SPME

Hoja tratada

Planta de tomate

Agitador magnético


31

Los ensayos con muestras de suelo y muestras vegetales se realizaron con las

dos fibras estudiadas (PDMS y PA).

2.3.3.1.3. Determinación cromatográfica

Todas las muestras fueron determinadas utilizando el sistema de análisis

cromatográfico B, la temperatura de la columna se mantuvo a 130 ºC durante 1

minuto, luego fue aumentando a una velocidad de 30 ºC/minuto hasta 250 ºC

donde se mantuvo 10 minutos. La temperatura del detector fue de 300 ºC. La

temperatura del inyector fue de 250 ºC para la fibra PDMS y de 270 ºC para la fibra

PA.

La confirmación de los residuos de los compuestos estudiados se realizó con el

sistema de análisis cromatográfico C. La temperatura de la columna se mantuvo a 130

ºC durante 2 minutos, luego fue aumentando a una velocidad de 20 ºC/minuto

hasta 180 ºC donde se mantuvo 0,5 minutos y después aumentó a una tasa

20 ºC/minuto hasta alcanzar 250 ºC donde se mantuvo 5 minutos. La temperatura del

inyector fue de 250 ºC para la fibra PDMS y de 270 ºC para la fibra PA y la

temperatura del detector fue de 280 ºC.

2.3.3.2. Adsorción en columnas con Florisil

Se desarrolló un método de análisis de endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-

sulfato en el aire basado en la retención de estos compuestos en columnas que

contenían Florisil. En la Figura 5, se presentan las estructuras tridimensionales de los

dos isómeros del endosulfan así como de su principal metabolito (endosulfan-sulfato).

Cl

ClCl

Cl

ClCl

O

OS

O

H

H

HH

H

H

Cl

ClCl

Cl

ClCl

O

OS

O

H

H

HH

H

H

O

Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato

Figura 5. Estructuras 3D de los compuestos estudiados.

Cl

ClCl

Cl

Cl

Cl

H

H

H H

H H

OS

OO


32

2.3.3.2.1. Extracción de los plaguicidas de la fase aérea

El análisis de endosulfan en el aire se llevo a cabo utilizando un matraz de fondo

redondo de dos bocas, en una de las cuales se acopló una columna de polipropileno

de 12 ml, a través de una pequeña perforación realizada en el septum de silicona del

tapón. Se colocó un Frit en la base de la columna, se añadieron 2 g de Florisil y a

continuación otro Frit, de manera que el adsorbente quedo empaquetado entre los dos

Frits y se acopló una bomba en la parte superior de la columna a un flujo constante de

0,5 L/min. La muestra se introdujo por la otra boca del matraz (Figura 6). Se realizaron

diferentes periodos de muestreo comprendidos entre 1 h y 24 h a temperatura

ambiente (22 ºC).

La extracción de los plaguicidas de la columna se efectuó mediante sonicación,

siguiendo los pasos explicados para la extracción de plaguicidas de muestras de

suelo, en el apartado 2.3.1.2., pero utilizando únicamente 3 ml de acetato de etilo en

cada paso de extracción y enrasando directamente los extractos a 10 ml con hexano.

Finalmente se efectuó la determinación cromatográfica de los plaguicidas estudiados

en los extractos obtenidos.

Figura 6. Montaje para la determinación de endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato en muestras de aire.

Columna con Florisil (entre Frits)

Bomba de vacío

Muestra


33

Para estudiar la estabilidad de los compuestos, una vez retenidos en el Florisil,

se fortificaron los 2 g de adsorbente con 0,1 µg de cada compuesto y se conectó la

bomba, a un flujo constante de 1 L/min, a una de las bocas del matraz de fondo

redondo. En la otra boca se ensambló el puerto de muestreo de dos canales con una

columna acoplada a cada canal (Figura 7). El sistema se ajustó de manera que pasara

un flujo constante de 0,5 L/min por cada uno de los canales. En primer lugar se

recogieron un par de columnas fortificadas después de 1 h de muestreo. En una de

esas columnas se realizó la extracción de los plaguicidas en el mismo día y la otra

columna del par se almacenó a 4 ºC y en condiciones de oscuridad durante 1 día,

periodo después del cual fue analizada. Posteriormente se realizó el mismo ensayo

con otra pareja de columnas analizando la columna, almacenada a 4 ºC y en

oscuridad, al cabo de una semana. Se analizaron cuatro parejas de columnas en cada

periodo de tiempo estudiado (1 días y 1 semana).

2.3.3.2.2. Determinación cromatográfica

Para el análisis de todas las muestras se utilizó el sistema de análisis

cromatográfico A. La temperatura de la columna se mantuvo a 130 ºC durante 1

Figura 7. Montaje utilizado para el estudio de estabilidad de los compuestos en el Florisil.

Placas (Frits)

Columnas con Florisil fortificado (entre Frits)

Bomba de vacío

Puerto de muestreo (dos canales)


34

minuto, luego fue aumentando a una velocidad de 15 ºC/minuto hasta 220 ºC y se

mantuvo 0,5 minutos, luego fue aumentando a una velocidad de 8 ºC/min hasta 280 ºC

donde se mantuvo 5 minutos. La temperatura del inyector fue de 270 ºC y la del

detector de 300 ºC.

Para la confirmación de los residuos se utilizó el sistema de análisis

cromatográfico D donde la temperatura de la columna se mantuvo a 120 ºC durante 1


donde se mantuvo 0,5 minutos y después aumentó a una tasa 15 ºC/minuto

hasta alcanzar 280 ºC donde se mantuvo 1 minuto. La temperatura del inyector fue de

270 ºC.

2.3.4. MATERIAL VEGETAL

Se desarrolló un método de análisis rápido para la determinación de endosulfan-

I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato en muestras vegetales procedentes de plantas de

tomate.

2.3.4.1. Preparación de muestras

Se utilizaron hojas de tomate, procedentes de dos parcelas comerciales de la

provincia de Badajoz, que se mantuvieron congeladas a –18 ºC hasta el análisis. El

material vegetal se descongeló a temperatura ambiente, fue troceado con unas tijeras

e introducido en un tubo de ensayo de vidrio para la posterior extracción de los

plaguicidas.

2.3.4.2. Extracción de los plaguicidas del material vegetal

Los fragmentos de hojas fueron homogeneizados dos veces con 4 ml de acetato

de etilo en el tubo de ensayo y se utilizaron otros 2 ml adicionales para lavar el

vástago del equipo en cada proceso de trituración. Las muestras homogeneizadas se

centrifugaron durante 10 minutos a 4600 r.p.m. Los extractos totales fueron

transferidos a tubos graduados y concentrados con aire a un volumen de 1 ml. La

purificación de los extractos se efectuó mediante cromatografía en columna de vidrio,

que contenía una pequeña cantidad de lana de vidrio en la base, 3,5 g de alúmina y


35

una fina capa de sulfato sódico anhidro sobre ésta. Para la elución de los plaguicidas

de la columna se utilizó una mezcla de hexano/acetato de etilo (80:20, v/v). Finalmente

los extractos fueron enrasados al volumen correspondiente (2-10 ml) y analizados por

GC-ECD.


Para el análisis de todas las muestras se utilizó el sistema de análisis

cromatográfico A. La temperatura de la columna se mantuvo a 130 ºC durante 1

minuto, luego fue aumentando a una velocidad de 15 ºC/minuto hasta 220 ºC y se

mantuvo 0,5 minutos, luego fue aumentando a una velocidad de 8 ºC/min hasta 280 ºC

donde se mantuvo 5 minutos. La temperatura del inyector fue de 270 ºC y la del

detector de 300 ºC.

Para la confirmación de los residuos se utilizó el sistema de análisis

cromatográfico D, donde la temperatura de la columna se mantuvo a 120 ºC durante 1


donde se mantuvo 0,5 minutos y después aumentó a una tasa 15 ºC/minuto

hasta alcanzar 280 ºC donde se mantuvo 1 minuto. La temperatura del inyector fue de

270 ºC.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. SUELO

3.1.1. Recuperaciones

Se consiguió una buena separación de los compuestos estudiados, utilizando el

programa corto de temperatura, en 15 minutos, Figura 8. Para el estudio de las

recuperaciones del método, se fortificaron muestras de suelo con los nueve

insecticidas estudiados para alcanzar las concentraciones de 0,1, 0,5 y 1 µg/g.


36

En la Tabla 4 se presentan las recuperaciones obtenidas a través del método

propuesto siguiendo el procedimiento de extracción anteriormente explicado y

utilizando el programa de temperatura corto en la determinación cromatográfica.

Tabla 4. Recuperaciones de los insecticidas en muestras de suelo fortificadas (5 % de humedad).

% Recuperación (media ± DER)*

0,1µµµµg/g 0,5 µµµµg/g 1 µµµµg/g Compuestos Suelo A Suelo B Suelo A Suelo B Suelo A Suelo B

Lindano 101,6 ± 7,7 105,0 ± 8,6 96,2 ± 2,4 97,2 ± 7,7 93,9 ± 3,5 93,1 ± 5,6

Heptacloro 99,3 ± 8,2 108,5 ± 7,6 93,6 ± 3,2 97,5 ± 9,3 94,2 ± 4,0 90,4 ± 5,0

Clorpirifos 108,3 ± 5,4 95,8 ± 7,3 97,5 ± 2,5 97,3 ± 5,4 96,7 ± 1,9 96,4 ± 4,1

Endosulfan-I 99,7 ± 1,6 102,2 ± 5,7 97,9 ± 2,0 98,7 ± 5,9 96,6 ± 2,0 95,5 ± 3,7

Endosulfan-II 100,2 ± 0,9 100,6 ± 5,4 97,2 ± 1,9 98,0 ± 6,9 96,1 ± 2,0 95,6 ± 3,0

Endosulfan-sulfato 100,9 ± 6,4 96,8 ± 10,2 95,1 ± 1,2 97,4 ± 6,7 97,2 ± 2,1 96,0 ± 7,5

Tetradifon 98,2 ± 4,0 100,5 ± 11,3 95,2 ± 2,7 96,4 ± 6,9 98,3 ± 2,3 104,0 ± 3,7

Cihalotrin 99,7 ± 1,5 94,7 ± 7,5 94,6 ± 3,9 96,8 ± 7,2 98,1 ± 1,7 101,1 ± 7,3

Acrinatrin 99,7 ± 1,9 98,9 ± 9,4 97,5 ± 4,5 96,2 ± 7,0 98,7 ± 1,9 102,0 ± 7,9

* Los resultados son la media de cuatro replicados ± desviación estándar relativa (DER).

min0 5 10

0

50000

100000

150000

200000

250000

1

23

4

5

6

789

Res

pues

ta d

el d

etec

tor

Tiempo de retención (min)

Figura 8. Cromatograma obtenido, utilizando el programa de temperatura corto, de una mezcla de concentración 0,1 µg/ml de los insecticidas estudiados, donde: (1) lindano, (2) heptacloro, (3) clorpirifos, (4) endosulfan-I, (5) endosulfan-II, (6) endosulfan sulfato, (7) tetradifon, (8) cihalotrin y (9) acrinatrin.


37

La humedad de los suelos se ajustó al 5 % (p/p), nivel que correspondía al 34 %

y al 38 % de la capacidad de campo de los suelos A y B, respectivamente. Las

recuperaciones obtenidas variaron desde el 90,4 % hasta el 108,5 % con una

desviación estándar relativa comprendida entre 0,9 % y el 11,3 %.

3.1.1.1. Influencia del contenido de humedad del suelo

En la Figura 9 se presentan los resultados obtenidos para los dos niveles de

humedad ensayados.

Figura 9. Recuperaciones de los compuestos estudiados en los suelos A y B a diferentes contenidos de humedad (5 % y 10 %) y en los tres niveles de concentración ensayados (0,1, 0,5 y 1 µg/g). Los resultados son la media de 4 replicados en cada nivel de humedad.

Su e lo A

0

20

40

60

80

100

120

Lind

ano

Tetra

difo

nH

epta

clor

oEn

dosu

lfan-

IEn

dosu

lfan-

II

Endo

sulfa

n-su

lfC

lorp

irifo

sC

ihal

otrin

Acrin

atrin

Lind

ano

Tetra

difo

nH

epta

clor

oEn

dosu

lfan-

IEn

dosu

lfan-

II

Endo

sulfa

n-su

lfC

lorp

irifo

sC

ihal

otrin

Acrin

atrin

Lind

ano

Tetra

difo

nH

epta

clor

oEn

dosu

lfan-

IEn

dosu

lfan-

II

Endo

sulfa

n-su

lfC

lorp

irifo

sC

ihal

otrin

Acrin

atrin

Rec

up

erac

ión

(%

)

5% Hum edad 10% Hum edad

0,1 µ µ µ µ g/g 0,5 µ µ µ µ g/g 1 µ µ µ µ g/g

Su e lo B

0

20

40

60

80

100

120

Lind

ano

Tetra

difo

nH

epta

clor

oEn

dosu

lfan-

IEn

dosu

lfan-

II

Endo

sulfa

n-su

lfC

lorp

irifo

sC

ihal

otrin

Acrin

atrin

Lind

ano

Tetra

difo

nH

epta

clor

oEn

dosu

lfan-

IEn

dosu

lfan-

II

Endo

sulfa

n-su

lfC

lorp

irifo

sC

ihal

otrin

Acrin

atrin

Lind

ano

Tetra

difo

nH

epta

clor

oEn

dosu

lfan-

IEn

dosu

lfan-

II

Endo

sulfa

n-su

lfC

lorp

irifo

sC

ihal

otrin

Acrin

atrin

Rec

up

erac

ión

(%

)

5% H um e dad 10% H um edad

0,1 µ µ µ µ g/g 0,5 µ µ µ µ g/g 1 µ µ µ µ g/g


38

Para estudiar la influencia del contenido de humedad del suelo en las

recuperaciones de los insecticidas, distintas muestras de los suelos A y B se

fortificaron para alcanzar concentraciones de 0,1, 0,5 y 1 µg/g y el contenido de

humedad de los suelos se ajustó al 10 %. Los resultados se compararon con los que

se obtuvieron cuando el contenido de humedad de los suelos se ajustó al 5 %. Se

obtuvieron siempre buenas recuperaciones, con valores comprendidos entre el 86 % y

el 111 % y con una desviación estándar relativa que varió entre el 0,9 % y el 12,1 %.

Los resultados fueron comparados estadísticamente mediante la prueba t, en un

ensayo de dos colas, y no se encontraron diferencias significativas (α=0,05) en las

recuperaciones de los compuestos de los suelos con distintos contenidos de humedad.

3.1.1.2. Influencia del material de la columna

Se estudió la influencia de dos materiales, vidrio y plástico (polipropileno), en la

recuperación de los plaguicidas de los suelos estudiados. En la Tabla 5 se muestran

los resultados obtenidos para el suelo A y en la Tabla 6 los correspondientes para el

suelo B.

Tabla 5. Recuperaciones de los insecticidas utilizando columnas de vidrio y de plástico.

% Recuperación (media ± DER)

Suelo A

15 días 30 días Compuestos

Plástico Vidrio Plástico Vidrio

Lindano 95,3 ± 4,4 98,5 ± 3,8 92,2 ± 4,6 96,2 ± 3,8

Tetradifon 100,4 ± 5,1 99,9 ± 5,8 94,9 ± 4,4 98,6 ± 8,4

Heptacloro 93,2 ± 5,5 93,1 ± 4,5 93,4 ± 4,3 95,0 ± 5,1

Endosulfan-I 92,9 ± 5,3 90,3 ± 6,3 92,4 ± 5,0 94,5 ± 3,0

Endosulfan-II 97,9 ± 4,0 98,9 ± 2,6 93,2 ± 4,3 96,8 ± 7,1

Endosulfan-sulfato 94,5 ± 6,4 96,6 ± 7,0 95,0 ± 4,0 98,4 ± 2,7

Clorpirifos 97,8 ± 5,6 97,5 ± 3,4 95,2 ± 2,8 99,2 ± 5,5

Cihalotrin 102,1 ± 6,0 100,5 ± 5,7 96,4 ± 10,3 100,8 ± 8,3

Acrinatrin 98,6 ± 6,9 100,0 ± 7,0 95,9 ± 9,2 98,1 ± 8,3

* Los resultados son la media de 8 replicados ± desviación estándar relativa (DER).


39

Tabla 6. Recuperaciones de los insecticidas utilizando columnas de vidrio y de plástico.

% Recuperación (media ± DER)*

Suelo B

15 días 30 días Compuestos

Plástico Vidrio Plástico Vidrio

Lindano 100,7 ± 1,6 101,0 ± 3,9 95,2 ± 9,4 95,7 ± 5,8

Tetradifon 99,6 ± 1,3 102,4 ± 3,8 101,4 ± 7,9 97,8 ± 7,2

Heptacloro 103,2 ± 2,7 103,4 ± 4,6 97,0 ± 9,7 96,4 ± 3,9

Endosulfan-I 90,8 ± 2,8 93,2 ± 2,7 90,3 ± 7,0 94,0 ± 6,6

Endosulfan-II 100,2 ± 2,0 101,6 ± 3,2 93,6 ± 6,8 92,8 ± 5,5


Clorpirifos 100,8 ± 1,9 103,1 ± 3,6 102,1 ± 7,1 97,9 ± 5,8

Cihalotrin 104,5 ± 2,1 105,3 ± 4,7 106,7 ± 11,5 97,6 ± 7,3

Acrinatrin 103,4 ± 1,4 103,3 ± 4,4 105,3 ± 9,6 97,2 ± 4,3

* Los resultados son la media de 8 replicados ± desviación estándar relativa (DER).

Los análisis se realizaron a los 15 y a los 30 días después de la fortificación de

los suelos a una concentración final de 0,5 µg/g. Las recuperaciones obtenidas

utilizando ambos tipos de columna variaron desde el 90,3 % hasta el 106,7 %, con

unas desviaciones estándar relativas comprendidas entre el 1,3 % y el 11,5 %. Los

resultados fueron comparados estadísticamente utilizando la prueba t como en el caso

anterior. Los dos periodos de tiempo fueron examinados individualmente. No se

encontraron diferencias significativas (α=0,05) entre la recuperación de los

compuestos de los suelos contenidos en columnas de vidrio y la recuperación en los

suelos contenidos en las columnas de plástico.

3.1.1.3. Influencia del tiempo de residencia

Para estudiar el efecto del tiempo de residencia de los plaguicidas en los dos

suelos ensayados en las recuperaciones de estos compuestos, los análisis se

realizaron transcurridos distintos periodos de tiempo (25 minutos, 1, 15 y 30 días). Las

muestras de suelo fueron fortificadas a una concentración de 0,5 µg/g. Los resultados

se muestran en la Figura 10.


40

Figura 10. Influencia del tiempo de residencia de los insecticidas en el suelo en la recuperación. Los resultados son la media de 8 replicados obtenidos después de la fortificación del suelo a 0,5 µg/g y utilizando columnas de polipropileno.

0102030405060708090

100110

Rec

uper

ació

n (%

)

25 min 1 día 15 días 30 días

Tiempo de residencia

Lindano

Tetradifon

Heptacloro

0102030405060708090

100110

Rec

uper

ació

n (%

)



0102030405060708090

100110

Rec

uper

ació

n (%

)



Endosulfan-I

Endosulfan-II

Endosulfan-sulf

0102030405060708090

100110

Rec

uper

ació

n (%

)



010

2030

40

5060

70

8090

100

110

25 min 1 días 15 días 30 días


Clorpirifos

Cihalotrin

Acrinatrin

0102030405060708090

100110

Rec

uper

ació

n (%

)



Suelo A Suelo B

Rec

uper

ació

n (%

)


41

Se puede observar que las recuperaciones de los insecticidas son muy similares

para los diferentes tiempos estudiados, tanto para el suelo A como para el suelo B, y

siempre mayores del 90 % con una desviación estándar relativa menor del 12 % en

todos los casos

3.1.2. Limite de detección y linealidad

En la Figura 11, se presentan diferentes cromatogramas obtenidos con el

programa de temperatura largo.

Res

pues

ta d

el d

etec

tor min 0 10 20 30 40

10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

100000 1 2

A 3

4 5

6

7

8 9


min 10 20 30 40 10000

20000

30000

40000

50000 B1

1

2 3

4

5

6 7 8 9

min 10 20 30 40 10000

20000

30000

40000

50000 B2

Figura 11. Cromatograma de una mezcla de insecticidas de concentración 0,1 µg/ml (A), de una muestra de suelo fortificada a 0,02 µg/g (B1) y de una muestra de suelo sin fortificar (blanco) (B2). Todos los cromatogramas fueron obtenidos usando el programa largo de temperatura.


42

El limite de detección, utilizando el programa corto de temperatura propuesto, es

de 0,1 µg/g. Sin embargo, se pueden conseguir menores limites de detección

utilizando el programa largo de temperatura, debido a la mejor resolución

cromatográfica obtenida. El primer cromatograma presentado en la Figura 11 fue

obtenido a partir de una disolución estándar, mezcla de los insecticidas estudiados, de

concentración 0,1 µg/ml (A), el segundo pertenece a una muestra de suelo fortificada a

0,02 µg/g (B1) y en tercer lugar se presenta un cromatograma perteneciente a un

blanco de suelo (B2). En estas condiciones el límite de detección alcanzado para

todos los compuestos estudiados es de 0,01 µg/g, considerando que la señal es, al

menos, 3 veces mayor que el ruido.

La respuesta del detector fue lineal en el intervalo de concentraciones

ensayadas. La linealidad del método se comprobó analizando diferentes disoluciones

patrón de los insecticidas estudiados de concentraciones comprendidas entre 0,05

µg/ml y 0,5 µg/ml.

3.1.3. Muestras reales

El método desarrollado fue aplicado al análisis de muestras reales de suelo

procedentes de 10 parcelas comerciales dedicadas al cultivo del tomate localizadas en

la provincia de Badajoz. Los resultados de los análisis se recogen en la Tabla 7.

Tabla 7. Niveles residuales en las muestras de suelo de parcelas comerciales (µg/g)*.

Parcela Endosulfan-II Endosulfan-sulfato Tetradifon

1 nd 0,024 ± 0,002 nd

3 nd 0,022 ± 0,006 nd

4 nd 0,020 ± 0,002 nd

6 0,035 ± 0,030 0,162 ± 0,135 nd

7 nd 0,074 ± 0,112 nd

9 0,030 ± 0,029 0,022 ± 0,006 0,017 ± 0,013

10 nd 0,022 ± 0,009 nd

* Los resultados son la media de 4 muestras analizadas en cada parcela ± desviación estándar.

nd: por debajo del límite de detección (0,01 µg/g).


43

Se puede observar que de las 10 parcelas analizadas con el método propuesto

en 7 se encontraron alguno de los insecticidas estudiados (endosulfan-II, endosulfan-

sulfato y tetradifon). Estos compuestos fueron detectados a niveles comprendidos en

el intervalo entre 0,02 y 0,16 µg/g. En la Figura 12, se muestran cromatogramas

representativos de las muestras de suelo obtenidas de dos de las parcelas

comerciales estudiadas.

3.1.4. Confirmación GC-MS

Los tiempos de retención de los compuestos y los iones seleccionados para su

identificación se presentan en la Tabla 8. Los iones seleccionados están de acuerdo

con los que han sido propuestos por otros autores para los espectros de masas de

Figura 12. Cromatogramas obtenidos de dos muestras de suelo de dos parcelas comerciales muestreadas después de la cosecha. (A) No se detectó ninguno de los compuestos estudiados. (B) Se detectaron 3 insecticidas: (1) endosulfan-II (0,060 µg/g), (2) endosulfan-sulfato (0,028 µg/g) y tetradifon (0,027 µg/g).

min 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 A

min 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000

B

1

2

3


Res

pues

ta d

el d

etec

tor


44

estos compuestos (Agüera et al., 1993, Fernández-Alba et al., 1994 y Papadopoulou et

al., 1997). La ausencia de interferencias que pudieran aparecer a los tiempos de

retención de los insecticidas estudiados fue comprobada mediante el análisis de

blancos.

Tabla 8. Tiempos de retención, iones principales y su abundancia relativa (entre paréntesis) en el espectro de masas de los insecticidas estudiados.

Compuestos tr (min) m/z (%)

Lindano 4,05 109 (100), 181* (85), 217 (33)

Heptacloro 4,43 100 (100), 272* (98), 337 (10)

Clorpirifos 5,00 97 (100), 197* (80), 258 (30), 352a (8)

Endosulfan-I 5,42 160 (100), 195* (80), 237 (59), 267 (58)

Endosulfan-II 6,14 195* (100), 162 (99), 243 (57), 267 (50)

Endosulfan-sulfato 6,40 274* (100), 239 (69), 387 (30)

Tetradifon 7,40 111 (100), 159* (77), 229 (25), 356a (15)

Cihalotrin 8,09 181* (100), 197(41), 225 (14)

Acrinatrin 8,24 93 (100), 181* (78), 357 (41)

* ión seleccionado para la cuantificación. a ión molecular.

Todos los insecticidas estudiados pueden ser identificados por su espectro de

masas en la librería NBS a niveles cercanos a 1 ng por compuesto.

3.2. AGUA


Se realizó la extracción y el análisis de endosulfan y clorpirifos, añadidos al agua

como formulaciones comerciales Thimul y Dursban, respectivamente. En la Tabla 9 se

recogen las recuperaciones obtenidas para los dos insecticidas estudiados. Las

recuperaciones variaron entre el 110 % y el 88 % para el endosulfan y entre el 105 % y

el 87 % para el clorpirifos. Este método permite realizar la extracción y la cuantificación

de clorpirifos y endosulfan en la disolución del suelo con fiabilidad.


45

Tabla 9. Recuperaciones obtenidas de los insecticidas estudiados *.

% Recuperación (media ± DER) Concentración (µg/ml)

Thimul (Endosulfan I+II) Dursban (Clorpirifos)

0,2 110,6 ± 5,7 105,6 ± 13,1

0,5 91,1 ± 6,3 88,5 ± 4,7

1,0 88,1 ± 1,1 87,0 ± 12,7

* Los resultados son la media de tres replicados ± desviación estándar relativa.

3.2.2. Límite de detección y linealidad

El método fue lineal en el intervalo de concentraciones estudiado y se obtuvo un

límite de detección de 0,05 µg/ml para el endosulfan y el clorpirifos, considerando que

la señal fuera, al menos, 3 veces mayor que el ruido.

3.3. AIRE

3.3.1. Micro Extracción en Fase Sólida

3.3.1.1. Evaluación de las fibras de SPME

Se utilizaron dos tipos de fibras de SPME en los experimentos realizados: una de

polidimetilsiloxano (PDMS), una de las fases no polares mas comúnmente utilizada, y

otra de poliacrilato (PA), fase polar. En la Figura 13, se muestran las cantidades de

plaguicida extraídas con estas fibras del espacio de cabeza de las muestras de suelo y

planta. Se obtuvieron buenos resultados con ambas fibras en el intervalo de

concentraciones estudiado. Los valores obtenidos para el análisis de las muestras de

aire procedentes de la volatilización desde la superficie foliar de la planta indicaron, en

general, que la fibra PDMS fue capaz de extraer una mayor cantidad de plaguicida que

la fibra PA (Figura 13-A). Las cantidades extraídas por la fibra PDMS variaron desde

1,6 ng hasta 8,3 ng, mientras que las extraídas con la fibra PA variaron desde 1,5 ng

hasta 5,0 ng.


46

Fibra PDMSFibra PA

0

2

4

6

8

10

7,5 µg/hoja 0,15 µg/hoja

lindano

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10


clorpirifos

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10


pendimetalina

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10


endosulfan

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

Planta

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

lindano

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

clorpirifos

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

pendimetalina

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

endosulfan

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

Suelo

A

B

Fibra PDMSFibra PAFibra PDMSFibra PA

0

2

4

6

8

10


lindano

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10


clorpirifos

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10


pendimetalina

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10


endosulfan

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

Planta

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

lindano

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

clorpirifos

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

pendimetalina

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

0

2

4

6

8

10

2,1 µg/g 0,1 µg/g

endosulfan

Can

tidad

ext

raid

a (n

g)

Suelo

A

B

Figura 13. Cantidades de plaguicida extraídas por las fibras PDMS y PA del espacio de cabeza de las muestras de suelo y planta.


47

Los resultados obtenidos del análisis de las muestras de aire provenientes de la

volatilización desde el suelo fueron similares y la fibra PDMS mostró un mayor

capacidad para extraer los plaguicidas estudiados de la fase aérea que la PA (Figura

13-B). Las cantidades extraídas por PDMS variaron desde 1,2 ng hasta 7,3 ng

mientras que las extraídas por la fibra PA variaron desde 0,5 ng hasta 6,2 ng.

Los resultados obtenidos para el suelo ponen de manifiesto que la máxima

cantidad de plaguicida que se extrae por las fibras corresponde al lindano y la mínima

cantidad a la pendimetalina. Este hecho fue también observado en los análisis de

muestras de aire obtenidas en el ensayo con planta. El fenómeno podría ser explicado

por la afinidad de la fibra por estos compuestos junto con las propiedades fisico-

químicas de los plaguicidas, especialmente la presión de vapor y el reparto octanol-

agua, expresado como log P, (Tabla 3) como ha sido indicado en trabajos anteriores

(Eisert y Levsen, 1996, Pawliszyn, 1997 y Rüdel, 1997).

3.3.1.2. Calibración del método de HS-SPME

Para calibrar el método de análisis por HS-SPME, diferentes muestras de suelo

fueron fortificadas para alcanzar unas concentraciones en el suelo de 0,1 µg/g y 2,1

µg/g, que es el intervalo de concentración de plaguicida frecuentemente encontrado en

los cultivos de campo. Se realizaron los análisis por triplicado a cada nivel de

concentración y los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 10. Se puede

observar que se obtuvieron buenos coeficientes de correlación para todos los

compuestos estudiados. Se calculó además el factor de calibración (K), que es la

cantidad de analito absorbida por la fibra en condiciones de equilibrio del sistema

dividida por la concentración de este analito, en el espacio de cabeza. Se utilizó la

siguiente ecuación:

K = nf Vf / no-nf

donde no es la cantidad inicial de analito, nf es la cantidad absorbida por la fibra y V es

el volumen del recipiente usado en el análisis. Este factor indica la afinidad de la fibra

por un compuesto determinado (Bartelt, 1997). Los valores de K obtenidos para ambas


48

fibras se muestran en la Tabla 10, y variaron, para los plaguicidas investigados, desde

12 ml hasta 33 ml con la fibra PDMS y desde 9 ml hasta 26 ml con la fibra PA.

Tabla 10. Datos de calibración para los plaguicidas analizados por HS-SPME en muestras de suelo a.

Coeficiente correlación ( r )b K (ml) Plaguicidas

PDMS PA PDMS PA

Lindano 0,950 0,958 33 26

Clorpirifos 0,999 0,995 19 9

Pendimetalina 0,999 0,996 12 10

Endosulfan 0,997 0,996 23 20

a Las muestras fueron analizadas por GC-ECD; b Dosis aplicadas = 0,1 y 2,1 µg/g, n=3.

3.3.1.3. Limite de detección y linealidad

La reproducibilidad y el límite de detección del método propuesto fueron

estudiadas con muestras de suelo fortificadas al nivel más bajo, 0,1 µg/g. En la Figura

14 se muestra una cromatograma de muestras de suelo fortificadas a este nivel.

A B


Res

pues

ta d

el d

etec

tor

Figura 14. Cromatogramas obtenidos por GC-ECD correspondientes al análisis de plaguicidas extraídos por HS-SPME de muestras de suelo utilizando una fibra de PDMS (A) y otra de PA (B). Las muestras de suelo fueron fortificadas al nivel más bajo estudiado (0,1 µg/g). Ver Tabla 11 para la identificación de las señales.


49

Se realizaron tres medidas con ambas fibras de SPME bajo las mismas

condiciones. Los valores obtenidos de desviación estándar relativa y límite de

detección se presentan en la Tabla 11.

Tabla 11. Reproducibilidad y limite de detección de los compuestos estudiados.

DER (%)* LD (ng/L) Señal Plaguicidas

PDMS PA PDMS PA

1 Lindano 13 13 1 1

2 Clorpirifos 13 14 4 8

3 Pendimetalina 19 18 2 6

4 Endosulfan 12 6 1 2

* DER: Desviación estándar relativa de la media obtenida al nivel de fortificación más bajo, 0,1 µg/g (n=3).

La DER varió entre el 6 % y 19 %, estando dentro del intervalo de valores

aceptables de DER para el análisis de residuos de plaguicidas (DER < 20%). Los

límites de detección de los plaguicidas estudiados, utilizando las fibras PDMS y PA,

fueron calculados considerando que la señal fuera, al menos, 3 veces mayor que el

ruido, y fueron expresados como la concentración de plaguicida en el espacio de

cabeza que producía esa respuesta (Tabla 11). Se observa que se obtienen límites de

detección más bajos cuando se utiliza la fibra PDMS, con valores comprendidos entre

1 ng/L y 4 ng/L, mientras que los valores obtenidos con la fibra PA son algo más altos,

estando comprendidos entre 1 ng/L y 8 ng/L. Los límites de detección más bajos

alcanzados con la fibra PDMS están de acuerdo con los factores de calibración más

altos obtenidos para esta fibra (Tabla 10).

El mejor límite de detección corresponde al lindano debido a la alta respuesta

que presenta en el detector ECD como consecuencia de tener seis átomos de Cl en su

molécula y además debido a su alto factor de calibración.


50

3.3.1.4. Confirmación GC-MS

La confirmación de la identidad de los compuestos estudiados se realizó por GC-

MS. Los iones seleccionados para la identificación de estos compuestos se muestran

en la Tabla 12.

Tabla 12. Iones principales y su abundancia relativa (entre paréntesis) en el espectro de masas obtenido por IE de los insecticidas investigados.

Plaguicidas P.M. m/z (%)

Lindano 291 109 (82), 181(100), 219 (27), 254 (19)

Clorpirifos 350,6 109 (40), 197 (100), 258 (47), 314 (34), 350 (10)

Pendimetalin 281,3 162 (25), 252 (100), 281 (20)

Endosulfan 407 109 (69), 160 (72), 195 (100), 241 (90), 339 (36)

Estos iones están de acuerdo con los que han sido publicados por otros autores

para la identificación por masas de estos compuestos (Miyahara et al., 1994, Sannino

et al., 1996, García-Valcarcel et al., 1996 y Papadopoulou-Mourkidou et al., 1997). La

ausencia de interferencias que pudieran aparecer a los tiempos de retención de los

insecticidas investigados fue comprobada mediante el análisis de extractos

procedentes de blancos. Todos los plaguicidas estudiados pueden ser identificados

por su espectro de masas en la librería NBS a niveles del orden de 1 ng por

compuesto.

3.3.2. Adsorción en columnas con Florisil

3.3.2.1. Recuperaciones

Para evaluar la recuperación de los plaguicidas estudiados del adsorbente se

fortificaron 2 g de Florisil colocados en una columna de polipropileno, con un Frit en su

base, con 0,1 µg, 0,5 µg o 1 µg de los plaguicidas estudiados, posteriormente se

realizó la extracción con acetato de etilo y los extractos fueron analizados por GC-ECD

siguiendo el procedimiento descrito en el apartado de materiales y métodos. Los

resultados obtenidos se muestran en la Tabla 13.


51

Las recuperaciones obtenidas, en el intervalo de concentraciones estudiado, de

endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato fueron siempre superiores al 85 % con

una desviación estándar relativa menor del 11 %.

3.3.2.2. Eficacia del adsorbente

Para medir la eficacia de retención de las columnas utilizadas en este

experimento, 2 g de Florisil fueron fortificados con las mismas cantidades de

plaguicida que en el ensayo anterior pero en este caso se conectó una bomba al final

de la columna, a un flujo constante de 0,5 L/min. Se estudiaron dos periodos de

muestreo, 1 h y 24 h, transcurridos los cuales se realizó la extracción de los

plaguicidas y su determinación cromatográfica.

En la Tabla 14 se muestran los resultados obtenidos. La eficacia de retención de

los compuestos estudiados por parte del adsorbente después de 1 h de muestreo varió

desde el 80 % al 95 % con una desviación estándar relativa comprendida entre el 3 %

y el 9 %, mientras que la eficacia observada después de 24 h de muestreo varió desde

el 78 % y el 90 % con una desviación estándar relativa comprendida entre el 3 % y el

11 %. Inicialmente, se utilizó una mezcla de hexano/acetato de etilo (80:20, v/v) para la

extracción de los plaguicidas estudiados de las columnas con Florisil, pero se

obtuvieron eficacias de retención menores del 70 % en algunos casos, especialmente

después de un muestreo del aire de 24 h, por lo tanto, se seleccionó acetato de etilo

como disolvente extractante.

Tabla 13. Recuperaciones de los plaguicidas estudiados *.

% Recuperación (media ± DER) Cantidad de plaguicida (µg)


0,1 100,8 ± 3,9 101,9 ± 6,0 95,2 ± 6,8

0,5 90,7 ± 8,4 89,9 ± 8,7 85,1 ± 10,2

1,0 89,1 ± 6,7 89,8 ± 2,9 88,5 ± 3,3



52

3.3.2.3. Limite de detección y linealidad

Los límites de detección obtenidos en el análisis por GC-ECD fueron de 9 ng/ml

para el endosulfan-I, el endosulfan-II y para el endosulfan-sulfato, considerando que la

señal fuera, al menos, 3 veces mayor que el ruido (Tabla 15).

Tabla 15. Limite de detección (LD) y datos de calibración.

Datos de calibración LD (ng/L) Compuesto

Ecuación r 1h x 0,5 L/mina 24h x 0,5 L/minb

Endosulfan-I y = 3,3·106x + 11655 0,997 0,3 0,01

Endosulfan-II y = 2,6·106x + 12840 0,995 0,3 0,01

Endosulfan-sulfato y = 1,7·106x + 10763 0,992 0,3 0,01 a El LD corresponde al menor volumen de aire muestreado, 30 L. b El LD corresponde a un volumen de aire muestreado de 720 L.

Estos valores de límite de detección corresponden a 0,3 ng de cada compuesto

por litro de aire para el menor volumen de aire muestreado, 30 L (1 h de muestreo a un

Tabla 14. Eficacia de retención de las columnas con Florisil a.

% Eficacia de retención (media ± DER) b

1 h de muestreo

Cantidad de plaguicida (µg) Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato

0,1 94,7 ± 7,7 90,7 ± 8,1 89,9 ± 8,9

0,5 86,3 ± 3,6 86,4 ± 3,8 86,2 ± 3,9

1,0 80,2 ± 3,5 88,7 ± 2,8 88,1 ± 2,9

24 h de muestreo

Cantidad de plaguicida (µg) Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato

0,1 83,7 ± 6,6 81,3 ± 4,9 82,9 ± 4,8

0,5 78,4 ± 8,0 80,7 ± 2,8 81,0 ± 3,4

1,0 85,5 ± 7,5 89,4 ± 10,7 87,6 ± 10,7 a Los resultados son la media de cuatro replicados ± desviación estándar relativa (DER). b Resultados obtenidos después de 1 h o 24 h de muestreo con una bomba a un flujo de 0,5 L/min.


53

flujo constante de 0,5 L/min). Cuando se consideran mayores volúmenes de aire

muestreados, los límites de detección pueden ser más bajos, por ejemplo, se obtienen

limites de detección de 0,01 ng/L cuando se muestrea aire durante 24 h a un flujo

constante de 0,5 L/min (Tabla 15).

En la Figura 15, se muestran los cromatogramas correspondientes al límite de

detección, a una disolución de los compuestos estudiados y a un blanco de aire.

La respuesta del detector fue lineal en el intervalo de concentraciones ensayado.

La linealidad del método se comprobó analizando disoluciones de concentraciones

comprendidas entre 0,01 µg/ml y 0,2 µg/ml.

A

B

C

1 2 3

1 2 3

Res

pues

ta d

el d

etec

tor


min 2 4 6 8 10

counts

2000 4000 6000 8000

10000 12000

min 2 4 6 8 10

counts

2000 4000 6000 8000

10000 12000

min 2 4 6 8 10

counts

2000 4000 6000 8000

10000 12000

Figura 15. Cromatograma de una disolución, mezcla de los compuestos estudiados de concentración 0,01 µg/ml (A), de una muestra de aire que contiene 0,3 ng de cada plaguicida por litro de aire muestreado (B) y de un blanco de aire (C), donde: (1) endosulfan-I, (2) endosulfan-II y (3) endosulfan-sulfato.


54

3.3.2.4. Estabilidad durante el almacenamiento

La estabilidad de los plaguicidas adsorbidos en el Florisil fue determinada

fortificando el adsorbente con 0,1 µg de cada compuesto y haciendo pasar aire a

través de las columnas con la bomba a un flujo de 0,5 L/min durante 1 h. La mitad de

las columnas fueron extraídas y analizadas en el mismo día (día 0). Las columnas

restantes se colocaron en un recipiente de plástico tapado y se almacenaron durante 1

día en una cámara a 4 ºC y en condiciones de oscuridad, período después del cual se

realizó la extracción y análisis de las mismas. También se estudió la estabilidad de los

compuestos después de estar almacenados, en las mismas condiciones que se han

indicado anteriormente, durante 1 semana. En la Tabla 16 se muestran los resultados

obtenidos en este ensayo.

Se obtuvieron buenos resultados después del almacenaje de las columnas. Las

recuperaciones obtenidas después de los distintos periodos de almacenaje,

expresadas como porcentaje recuperado con respecto al día 0, variaron desde el 97 %

al 100 % después de 1 día de almacenaje y desde el 89 % al 95 %, después de 1

semana de almacenaje. Estos valores son similares a las eficacias de retención

obtenidas para estos compuestos con el método propuesto y por lo tanto las muestras

pueden ser almacenadas hasta una semana, a 4 ºC y en condiciones de ausencia de

luz, hasta su análisis.

Tabla 16. Estabilidad de los compuestos estudiados, después de 1 día o 1 semana, a 4 ºC y en condiciones de oscuridad.

% Recuperación (media ± DER) *

1 día de almacenaje 1 semana de almacenaje Compuestos

Día 0 Día 1 Día 0 Semana 1

Endosulfan-I 88,4 ± 3,8 88,9 ± 5,3 91,1 ± 6,0 80,8 ± 6,7

Endosulfan-II 88,2 ± 2,2 85,8 ± 4,5 87,3 ± 4,8 79,6 ± 6,6




55

3.3.2.5. Confirmación GC-MS

La confirmación de la identidad de los plaguicidas investigados se realizó por

GC-MS. Los iones principales obtenidos para cada plaguicida, sus abundancias

relativas y sus tiempos de retención se presentan en la Tabla 17.

Tabla 17. Iones mayoritarios y su abundancia relativa (entre parentesis) en los espectros de masas obtenidos.

Nº compuesto Plaguicida t R (min) m/z (%)

1 Endosulfan-I 6,94 195 (100), 241 (70), 339 (40)

2 Endosulfan-II 7,56 195 (100), 241 (70), 339 (40)

3 Endosulfan-sulfato 7,99 272 (100), 229 (80), 387 (80)

Estos datos están de acuerdo con los que han sido publicados por otros autores

(Liao et al., 1991, Lehotay y Eller, 1995 y Gelsomio et al., 1997). La ausencia de

interferencias que pudieran aparecer a los mismos tiempos de retención que los

plaguicidas fue confirmada mediante el análisis de blancos. Los insecticidas

estudiados pueden ser confirmados al nivel de los límites de detección indicados

anteriormente (0,3 ng/L) utilizando sus respectivos iones principales.

3.4. MATERIAL VEGETAL


Para estudiar las recuperaciones de los insecticidas seleccionados se fortificaron

diferentes hojas de tomate, procedentes de plantas que se desarrollaron en cámaras

de cultivo, para alcanzar unas concentraciones de 0,1, 1 y 3 µg/g de hoja. Los

resultados obtenidos se muestran en la Tabla 18. Las recuperaciones conseguidas

para el endosulfan-I estuvieron comprendidas entre el 79 % y el 93 % con una DER

entre el 5 % y el 9 %, para el endosulfan-II estuvieron entre el 84 % y el 92 % con una

DER entre el 4 % y el 13 %, y para el endosulfan-sulfato variaron entre el 82 % y el 91

% con una DER entre el 6 % y el 13 %.


56

Tabla 18. Recuperaciones de los insecticidas estudiados en hojas de tomate.

% Recuperación (media ± DER) * Concentración (µg/g)


0,1 79,1 ± 8,3 84,4 ± 13,4 81,6 ± 12,6

1,0 88,0 ± 6,3 88,9 ± 4,1 90,7 ± 8,9

3,0 92,8 ± 5,5 91,8 ± 5,4 91,0 ± 6,0


En la Figura 16 se muestra un cromatograma representativo del análisis de una

muestra vegetal.

3.4.2. Limite de detección y linealidad

Los límites de detección obtenidos en el análisis por GC-ECD para el endosulfan-

I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato fueron de 0,02 µg plaguicida/g de hoja,

considerando que la señal fuera, al menos, 3 veces mayor que el ruido. La respuesta

del detector fue lineal en el intervalo de concentraciones ensayado. En la Tabla 19 se

Res

pues

ta d

el d

etec

tor


1 2

3

Figura 16. Cromatograma de los plaguicidas recuperados de una hoja de tomate fortificada a 0,6 µg/g, donde: (1) endosulfan-I, (2) endosulfan-II y (3) endosulfan-sulfato.


57

muestran los resultados obtenidos en la calibración y los límites de detección de los

insecticidas investigados.

Tabla 19. Limites de detección obtenidos en el análisis de muestras vegetales y linealidad.

t R (min) Datos de calibración Plaguicidas

GC-ECD Ecuación r

LD (µg/g hoja)

Endosulfan-I 6,85 y = 3,3·106x + 11655 0,997 0,02

Endosulfan-II 7,52 y = 2,6·106x + 12840 0,995 0,02

Endosulfan-sulfato 8,09 y = 1,7·106x + 10763 0,992 0,02

En la Figura 17, se presentan los cromatogramas de una muestra vegetal sin

fortificar y del límite de detección.

min5 10 15

counts

2000

4000

6000

8000

10000

min5 10 15

counts

2000

4000

6000

8000

10000

A

B1

2

3

min5 10 15

counts

2000

4000

6000

8000

10000

min5 10 15

counts

2000

4000

6000

8000

10000

A

B1

2

3Res

pues

ta d

el d

etec

tor


Figura 17. Cromatograma de una muestra vegetal sin fortificar (A) y de una muestra vegetal fortificada a 0,02 µg/g (B), donde: (1) endosulfan-I, (2) endosulfan-II y (3) endosulfan-sulfato.


58

La linealidad del método se comprobó, al igual que en el método de análisis de

estos tres mismos compuestos en el aire, analizando las mismas disoluciones de los

plaguicidas, de concentraciones comprendidas entre 0,01 µg/ml y 0,2 µg/ml.

3.4.3. Confirmación GC-MS

La confirmación de la identidad de los plaguicidas investigados se realizó por

GC-MS y los iones principales obtenidos para cada plaguicida fueron los mismos que

los obtenidos para el análisis de endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato en

muestras de aire, Tabla 17. Estos insecticidas pueden ser confirmados al nivel de los

límites de detección indicados anteriormente (0,02 µg/g) utilizando sus respectivos

iones principales.

3.4.4. Muestras reales

Se realizó un muestreo de dos parcelas comerciales, una en la localidad de

Gévora y otra en Badajoz, tomando 10 puntos de muestreo y dos foliolos de hojas de

tomate en cada uno de ellos. Las hojas se recogieron a distintas alturas de la planta

para estudiar la variación de los niveles después de la aplicación. Se utilizó el método

descrito anteriormente para el análisis de las mismas. Los resultados del análisis se

presentan en la Tabla 20.

En las dos parcelas muestreadas se realizó una aplicación de unos 30 kg/ha de

Tiagrex, que contiene un 3% de endosulfan. En la parcela de Gévora se muestreó un

día después de la aplicación y en la parcela de Badajoz tres días después. Se observa

que los valores encontrados para ambas parcelas son similares, siendo algo mayor la

concentración total de endosulfan, considerada como la suma de los tres compuestos,

en la parcela de Badajoz. Además, en esta parcela se observa una mayor

concentración de endosulfan-sulfato, principal metabolito de degradación del

endosulfan, debido a que han pasado más días desde la aplicación que en la parcela

de Gévora donde la concentración de este compuesto es menor. Se observó una gran

variabilidad en los resultados del análisis de las muestras de cada parcela debido

probablemente a la variación de los niveles de los plaguicidas (heterogeneidad de la


59

aplicación) tanto entre distintas plantas como dentro de la misma planta a diferentes

alturas.

Tabla 20. Niveles residuales encontrados en hojas de tomate procedentes de parcelas comerciales.

Concentración en (µg/g) * Parcela Nivel

Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato Total

Superior 29,01 ± 20,19 17,53 ± 11,49 2,14 ± 0,56 48,68 ± 31,90 GEVORA

Inferior 10,34 ± 6,16 7,34 ± 3,81 0,62 ± 0,40 18,30 ± 9,91

Superior 21,99 ± 17,74 24,52 ± 16,73 5,93 ± 3,31 52,44 ± 36,08 BADAJOZ

Inferior 14,37 ± 17,76 15,25 ± 15,88 4,75 ± 4,26 34,37 ± 37,40

* Los resultados son la media de 10 hojas analizadas en cada nivel y en cada parcela ± desviación estándar.

En la Figura 18, se muestran dos cromatogramas representativos del análisis de

muestras de hojas de tomate en las parcelas estudiadas. Se puede apreciar que se

identificaron y cuantificaron los tres compuestos estudiados en las muestras

analizadas.

2.5 5 7.5 10 12.5

counts

250005000075000

100000125000150000

2.5 5 7.5 10 12.5

counts

250005000075000

100000125000150000

min

min

2.5 5 7.5 10 12.5

counts

250005000075000

100000125000150000

2.5 5 7.5 10 12.5

counts

250005000075000

100000125000150000

min

min

1

3

2 1

3

2 A

B


Res

pues

ta d

el d

etec

tor

Figura 18. Cromatogramas correspondientes al análisis de muestras foliares de las parcelas de Gévora (A) y de Badajoz (B), donde (1):endosulfan-I, (2):endosulfan-II y (3): endosulfan-sulfato.


60

4. CONCLUSIONES

Análisis de los plaguicidas en el suelo

Los resultados de este estudio ponen de manifiesto que el método propuesto

para la extracción, asistida por ultrasonidos, de los insecticidas en muestras de suelo

contenidas en pequeñas columnas, utilizando acetato de etilo como disolvente

extractante, proporciona un procedimiento rápido y sensible para la determinación

simultánea de los insecticidas estudiados.

El método es sencillo y requiere cantidades pequeñas de disolventes orgánicos,

reduciendo, por lo tanto, el riesgo para la salud humana y el medio ambiente. Esto

representa una mejora en comparación con otros métodos multiresiduo tradicionales.

Las recuperaciones de los insecticidas obtenidas con el método propuesto no se

vieron afectadas ni por la humedad del suelo ni por el tiempo de residencia de estos

compuestos en el suelo. Asimismo, no se encontraron diferencias significativas en las

recuperaciones de los plaguicidas utilizando columnas de polipropileno o de vidrio. Las

recuperaciones obtenidas en cualquiera de las condiciones ensayadas siempre fueron

superiores al 86 %.

Se obtuvieron buenos resultados cuando el método se aplicó al análisis de rutina

de muestras reales, confirmando su reproducibilidad y eficacia para el análisis de

residuos de insecticidas en el suelo. El método fue lineal en el intervalo de

concentraciones estudiado (0,05-0,5 µg/ml), obteniéndose un límite de detección de

0,1 µg/g utilizando el programa corto y de 0,01 µg/g utilizando el programa largo de

temperatura. Todos los insecticidas estudiados pueden ser identificados por GC-MS a

un nivel de cerca de 1 ng por compuesto.


61

Análisis de los plaguicidas en el agua

El análisis de los insecticidas clorpirifos (Dursban) y endosulfan (Thimul), en

muestras de agua mediante extracción liquído-líquido utilizando bajos volúmenes de

hexano, como disolvente extractante, permite obtener porcentajes altos de

recuperación (� 87 %) y un límite de detección de 0,05 µg/ml. El método desarrollado

permite la determinación de estos insecticidas en la disolución del suelo.

Análisis de los plaguicidas en el aire

Análisis por HS-SPME

El procedimiento descrito de micro extracción en fase sólida en el espacio de

cabeza permite la determinación de los plaguicidas volatilizados desde el suelo y

superficies foliares. Se obtuvieron buenos resultados con las dos fibras ensayadas,

PDMS y PA, siendo mejor la respuesta obtenida con la fibra PDMS.

El método es preciso y la respuesta es lineal en el intervalo de concentraciones

investigado. El límite de detección del método varió desde 1 hasta 8 ng/L para los

plaguicidas seleccionados y estos compuestos pueden ser identificados por GC-MS a

un nivel de cerca de 1 ng por compuesto.

Análisis en columnas de Florisil

Los resultados obtenidos en este estudio ponen de manifiesto que el método

propuesto proporciona un procedimiento rápido y fiable para la determinación de los

dos isómeros del endosulfan, así como de su principal metabolito, endosulfan sulfato,

en aire a bajos niveles. El límite de detección obtenido para los tres compuestos es de,

al menos, 0,3 ng/L. El método fue lineal en el intervalo de concentraciones ensayado

(0,01-0,2 µg/ml).


62

Se obtuvieron buenas recuperaciones de los compuestos estudiados, superiores

al 85 %, y se comprobó que el adsorbente utilizado, Florisil, tiene una buena

capacidad de retención de los mismos.

Se comprobó que las muestras pueden estar almacenadas una semana a 4 ºC

en ausencia de luz antes de su análisis, sin que las recuperaciones de los compuestos

se vean afectadas.

Análisis de los plaguicidas en las hojas

El método propuesto para el análisis de endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-

sulfato en hojas es sencillo y requiere un bajo uso de disolventes orgánicos. Asimismo,

se han obtenido buenas recuperaciones de los compuestos estudiados, comprendidas

entre el 79 % y el 93 %.

El límite de detección obtenido para los tres plaguicidas es de 0,02 µg de

plaguicida / g de hoja. El método se ha aplicado satisfactoriamente al análisis de estos

compuestos en muestras reales de campo, permitiendo la determinación de sus

residuos a bajos niveles.

II. PERSISTENCIA EN CONDICIONES DE LABORATORIO


63

CAPITULO II. PERSISTENCIA EN CONDICIONES DE LABORATORIO

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Principales procesos que influyen en la persistencia de los plaguicidas

De entre los distintos procesos responsables de la persistencia de los plaguicidas

en el medio ambiente, la degradación, la volatilización y la adsorción por los distintos

componentes del suelo, son los de mayor relevancia, estando todos ellos, en ultima

instancia, relacionados.

1.1.1. Degradación

1.1.1.1. Tipos de degradación

La degradación de los plaguicidas se origina como consecuencia de la actuación

de diferentes procesos bióticos y abióticos, que junto con las propiedades moleculares

de los plaguicidas, las propiedades específicas de las superficies en las que se

deposita el fitofármaco, las condiciones ambientales, así como la presencia de otros

plaguicidas en el medio, van a determinar la extensión del proceso de degradación.

Procesos de degradación abióticos

Los procesos abióticos incluyen todas aquellas reacciones que no están

catalizadas enzimáticamente, aunque pueden ser iniciadas por especies químicas

reactivas, tales como radicales libres y grupos funcionales nucleófilos de la materia

orgánica. Estos procesos también pueden ser catalizados por los constituyentes no

vivos del suelo, como cationes polivalentes, óxidos e hidróxidos metálicos y superficies

orgánicas e inorgánicas. Los procesos de degradación abióticos comprenden las

siguientes reacciones:


64

• Reacciones de oxidación: Los plaguicidas que están en el suelo pueden

reaccionar con oxígeno molecular (autooxidación) o con especies oxigenadas

reactivas, tales como átomos de óxigeno, ozono, óxigeno singlete y radicales

peróxido. En estas reacciones se forma como producto final CO2.

• Reacciones de reducción: Se producen en zonas del suelo que presentan

condiciones anaeróbicas. Los plaguicidas se pueden reducir por sistemas

redox Fe2+/Fe3+ o por la actuación de porfirinas, que quedan en libertad en el

medio debido a la degeneración del material biológico. Una de las reacciones

más importantes es la deshalogenación reductora, caso que se presenta con el

insecticida DDT, que sufre una descloración transformándose en el DDD

(Glass, 1972).

• Reacciones de deshidrocloración: Es otro mecanismo de eliminación de

átomos de cloro de las moléculas de plaguicidas. Esta reacción progresa más

rápidamente a pH elevados y es catalizada por metales y ciertos minerales

como las arcillas.

• Reacciones de hidrólisis: Las reacciones de hidrólisis de los plaguicidas

progresan mejor a pH y temperaturas elevados y son catalizadas por algunos

cationes metálicos, como Cu2+ y Mn2+. Un caso bastante frecuente es la

hidrólisis de insecticidas organofosforados. (Mingelgrin et al., 1977 y Yaron,

1978).

• Reacciones de conjugación: Son reacciones que se producen entre los

plaguicidas y los constituyentes naturales del suelo. Se pueden dar con la

materia orgánica humificada y con diferentes tipos de arcillas.

• Reacciones fotoquímicas: Son importantes en la transformación y degradación

de plaguicidas que están presentes en las superficies del suelo y hojas. En

principio, la fotólisis de un plaguicida sólo se puede producir cuando la

molécula es capaz de absorber la luz ultravioleta con una λ >290 nm. Esta

reacción se denomina fotólisis directa. Sin embargo, en numerosas ocasiones

los plaguicidas se encuentran parcialmente adsorbidos en las superficies

activas del suelo o formando parte de la disolución del suelo, por lo que en esta

situación concreta existen más rutas de reacción que producen la degradación

de fitofármacos que normalmente no son capaces de reaccionar. En el caso de


65

los plaguicidas adsorbidos, se puede producir la fotomineralización y en el caso

de plaguicidas en disolución se pueden dar reacciones de fotólisis indirecta, en

la que están implicados otros compuestos además del plaguicida y el agua.

Procesos de degradación bióticos

Las transformaciones bióticas son todas aquellas que ocurren en los organismos

vivos o que son catalizadas por enzimas en el interior o en el exterior de las células.

En un proceso biótico de degradación de un plaguicida existen dos posibilidades. El

primer mecanismo es el metabolismo, cuando el plaguicida es degradado a productos

de bajo peso molecular. Esta degradación tiene lugar junto con un aumento en

biomasa del organismo en cuestión, poniendo de manifiesto que se obtiene energía y

carbono para la biosíntesis. El segundo mecanismo es el co-metabolismo, en el que se

producen transformaciones químicas de los plaguicidas sin que los productos

resultantes promuevan el crecimiento del microorganismo. (Scheuter, 1992-a). Los

principales procesos bióticos son los siguientes:

• Reacciones de oxidación: Existen numerosas reacciones de oxidación

catalizadas por enzimas, algunas de ellas son la C-hidroxilación, C-

carboxilación, la epoxidación, la N-desalquilación, la S-oxidación, etc. Una de

las reacciones mejor estudiadas consiste en la introducción de grupos hidroxilo

en un anillo aromático, y el sistema enzimático implicado se denomina

oxidasas de función mixta. Estas enzimas son abundantes en los

microorganismos presentes en los suelos así como en mamíferos y plantas.

Las peroxidasas también están involucradas en las reacciones de oxidación

enzimática.

• Reacciones de reducción: Los procesos de reducción enzimática son

característicos de las zonas anaeróbicas del suelo, por ejemplo, son

característicos de suelos inundados, donde proliferan determinados

microorganismos anaeróbicos. Algunos de los procesos son, la reducción de

dobles y triples enlaces, la reducción del grupo nitro, la reducción de grupos

sulfóxidos, la reducción de puentes disulfuro, etc. La deshalogenación


66

reductora es la reacción más importante desde el punto de vista

ecotoxicológico.

• Reacciones de hidrólisis: Este tipo de reacciones, en general, producen la

ruptura de moléculas dando lugar a estructuras más pequeñas. Están

implicados los enzimas del tipo hidrolasas y deshalogenasas. La reacción de

descloración hidrolítica, que permite la liberación de iones halogenados, es una

de las más importantes.

• Reacciones de conjugación: También llamadas reacciones secundarias ya que

la asociación con otros constituyentes se produce, generalmente, después de

cambios primarios producidos por procesos de oxidación, reducción o hidrólisis

de la molécula inicial. Estos cambios generan sustituyentes reactivos capaces

de reaccionar con los constituyentes del suelo o con la microflora del mismo.

La conjugación de plaguicidas o de sus metabolitos primarios con grupos

moleculares pequeños, aumenta el carácter lipofílico de la molécula, mientras

que la conjugación con moléculas más grandes, como carbohidratos o

aminoácidos, resulta en un aumento de la solubilidad en agua de la molécula.

Los principales procesos implicados en la degradación de plaguicidas

depositados en el suelo, con independencia de su origen biótico o abiótico, son la

oxidación, la reducción, la hidrólisis, las reacciones de conjugación y los procesos

fotolíticos o de fotodegradación (García N.S. et al., 1992 y Scheuter, 1992-b). Por otra

parte, el proceso fundamental por el que se produce la degradación de los plaguicidas

que se han depositado en las superficies foliares es la fotodegradación (Bentson,

1990).

1.1.1.2. Factores que afectan a los procesos de degradación

Las reacciones producidas por procesos bióticos y abióticos están íntimamente

relacionadas y en muchos casos, parte del producto de reacción es originado por un

proceso enzimático y parte por un proceso abiótico. Por lo tanto, a la hora de estudiar

los factores condicionantes de estas reacciones se consideran ambos procesos


67

globalmente. Se enumeran a continuación los principales factores que influyen en las

reacciones de degradación de los plaguicidas:

Cantidad y tipo de microorganismos presentes en el suelo

No sólo es importante la cantidad sino también el tipo de microorganismos

presentes en un medio determinado. Se conocen diferentes géneros de

microorganismos que están presentes en los suelos agrícolas y que son capaces de

contribuir a la degradación de los plaguicidas en ese medio, como por ejemplo

Pseudomonas, Bacillus, Micoplasma, Agrobacterium, Arthrobacter, etc. En concreto,

se han encontrado diferentes microorganismos que son capaces de degradar los

insecticidas endosulfan y clorpirifos depositados en el suelo así como otros

compuestos organoclorados y organofosforados (Martens, 1976, Katayama y

Matsumura, 1993, Kullman y Matsumura, 1996 y Mallick et al., 1999).

Contenido y naturaleza de los coloides del suelo

La capacidad de adsorción de los coloides del suelo, que viene determinada por

la cantidad y la naturaleza de los mismos en un medio concreto, afecta a la

degradación de los fitofármacos que pudieran encontrarse en ese medio. Los

plaguicidas que son adsorbidos fuertemente al suelo suelen ser los más persistentes,

ya que están protegidos frente a la evaporación y la degradación, tanto química como

biológica, debido a sus uniones con los coloides del suelo (Heuer et al., 1976). No

obstante, algunos autores sugieren, en el caso de plaguicidas organofosforados, que

estos compuestos sufren hidrólisis en la superficie de las arcillas debido a la

interacción con las moléculas de agua que forman parte de la esfera de hidratación de

los cationes adsorbidos en ellas (Mingelgrin et al., 1977 y Soma y Soma, 1989).

pH del suelo

El pH del suelo puede afectar la degradación de los plaguicidas directamente si

la estabilidad del compuesto depende del pH del medio. Por otra parte, también puede


68

afectar al proceso de adsorción, por ejemplo, minimizando la adsorción de algunos

compuestos en unas condiciones de pH determinadas, facilitándose así su

degradación. Una tercera vía de influencia es afectando a la población microbiana en

un entorno concreto.

Humedad y temperatura

La humedad y la temperatura del suelo afectan particularmente a las reacciones

de degradación bióticas. Esta influencia puede ser de una forma directa, aumentando

la actividad de los microorganismos y de una forma indirecta, aumentando la tasa de

crecimiento de los mismos.

1.1.1.3. Métodos experimentales en el estudio de la degradación

La degradación de los plaguicidas en el suelo se estudia, en general, mediante

ensayos de laboratorio o de campo. Los ensayos de laboratorio se realizan en

condiciones de humedad y temperatura controladas. El método más frecuentemente

utilizado es la incubación de muestras de suelo, previamente tamizadas y tratadas con

los plaguicidas objeto de estudio, en recipientes determinados. Se realizan muestreos

periódicamente y se determina la evolución de la concentración del plaguicida a lo

largo del tiempo. La incubación de las muestras se ha realizado en distintos

recipientes, como bolsas de polietileno (Hance y Haynes, 1981 y Sahid y Teoh, 1994),

tarros de polipropileno de diferente capacidad (Walker, 1987, Blair et al., 1990 y

Jurado-exposito y Walker, 1998) y recipientes de vidrio (Capri et al., 1995). También

se han incubado columnas de suelo sin alterar y columnas empaquetadas en cilindros

de PVC, con objeto de mantener la estructura natural del suelo (Topp et al., 1994 y

Lechón et al., 1997).

Otro método ampliamente utilizado está basado en la utilización de un Biómetro,

sistema que, en su versión básica, consiste en un erlenmeyer con un tubo de vidrio

lateral que contiene una disolución capaz de retener el CO2 que se genera en el

sistema como consecuencia de la degradación de los plaguicidas estudiados. Con


69

este método también se puede determinar la volatilización de los compuestos, al ser

un entorno cerrado (Avidov et al., 1985, Cheah et al., 1998 y Blumhorst et al., 1992).

En condiciones de campo, intervienen diferentes procesos distintos a la

degradación que también afectan a la disipación de los compuestos estudiados. Estos

procesos, como la volatilización, la fotodegradación, el lavado por escorrentía, la

lixiviación, etc., junto con las condiciones climáticas existentes determinan las vidas

medias de los plaguicidas. El ensayo de campo más ampliamente utilizado se basa en

la realización de un seguimiento periódico de la concentración de los plaguicidas

sujetos a estudio en el suelo, mediante la toma y análisis de muestras en las parcelas

tratadas. Numerosos estudios de campo de diferente duración se han realizado para

distintos tipos de compuestos en estas condiciones (Nearpass et al., 1978, Mudd et al.,

1983, Frank et al., 1991, Martijn et al., 1993 y Di et al., 1998). La persistencia de los

insecticidas clorpirifos y endosulfan también ha sido estudiada mediante este tipo de

ensayos (Stewart y Cairns, 1974, Davis y Kuhr, 1976, Rao y Murty, 1980, Suri y Joia,

1996 y Kathpal et al., 1997).

Asimismo, se han realizado estudios de persistencia de plaguicidas en lisímetros

expuestos a las condiciones climáticas de la zona. En estos sistemas, se han colocado

columnas no perturbadas de suelo (Rüdel et al., 1993) o han sido rellenados con

horizontes de suelo natural, obtenidos previamente, colocados de acuerdo con la

secuencia y densidad en la que aparecen en condiciones reales (Scheunert, et al,

1993). Este tipo de ensayos permiten hacer un seguimiento de los lixiviados así como

muestrear periódicamente el suelo para determinar la concentración de plaguicida

presente.

Por otra parte, se han realizado ensayos de persistencia de plaguicidas en suelo

en invernadero, aunque en menor medida (Rhodes, 1980).

1.1.2. Volatilización

La volatilización de un plaguicida desde el suelo o desde la superficie de las

plantas es la transferencia del plaguicida, en estado gaseoso, a través de la interfase

suelo-aire o planta-aire bajo las condiciones ambientales presentes. El proceso de


70

volatilización es importante para el conocimiento del destino de los residuos de

plaguicidas tanto en los ecosistemas terrestres como en los demás compartimentos

ambientales. En el caso de los plaguicidas más estables y por lo tanto persistentes,

con una tasa de degradación baja en el suelo, la volatilización se establece como la

principal ruta de desaparición de estos compuestos en el ecosistema terrestre,

facilitando además su transporte a largas distancias a través del aire.

1.1.2.1. Factores que afectan a la volatilización

La volatilidad potencial de un plaguicida está relacionada con la presión de vapor

del compuesto, pero la tasa real de volatilización dependerá de las condiciones

ambientales y de todos los factores que modifiquen o atenúen la presión de vapor del

plaguicida. La presión de vapor efectiva puede diferir de la presión de vapor

característica del compuesto puro como resultado de procesos tales como la adsorción

en el suelo o en otras superficies, la disolución del compuesto en la solución del suelo,

la disolución del compuesto en las superficies, con alto contenido en aceites y ceras,

de las hojas o frutos y la penetración del compuesto en las superficies de la planta.

Los factores que afectan a la volatilización de los plaguicidas desde el suelo y

desde superficies foliares están controlados por variables similares que se pueden

separar en tres grupos: las que afectan al movimiento del plaguicida desde la

superficie de evaporación hacia la atmósfera, las que afectan a la presión de vapor del

plaguicida y las variables que afectan al desplazamiento del plaguicida hacia la

superficie de evaporación.

Variables que afectan al movimiento del plaguicida desde la superficie de evaporación

La volatilización de un plaguicida desde la superficie del suelo está controlada

por un proceso de difusión. Cerca de la superficie de evaporación se puede considerar

que no existe movimiento de aire y esta condición ocasiona la formación de una capa

de aire estancado (capa de flujo laminar) inmediatamente encima de la superficie del

suelo. La sustancia vaporizada es transportada a través de esta capa de flujo laminar

por difusión molecular únicamente. El grosor de la capa de aire estancado dependerá


71

del flujo de aire y de la turbulencia circundante. El proceso de difusión estará

influenciado por la presión de vapor del plaguicida, por su peso molecular y por la

temperatura, que afectará tanto a la presión de vapor como al proceso de difusión en

sí mismo.

Variables que afectan a la presión de vapor del plaguicida

Todos los plaguicidas tienen una presión de vapor de saturación característica

que varía con la temperatura y además por la influencia de otros factores tales como la

adsorción del plaguicida en el suelo u otras superficies. La adsorción reduce la

actividad química por debajo de la del compuesto puro y esto se traduce en una

modificación de la presión de vapor de la sustancia. Para plaguicidas débilmente

polares y no iónicos la cantidad de materia orgánica del suelo es el factor más

importante relacionado con la adsorción y por lo tanto importante en la disminución de

la presión de vapor o volatilidad potencial de un plaguicida en el suelo. Cuando los

compuestos son más polares o iónicos, los minerales de la arcilla son determinantes a

efectos de adsorción y reducción de la presión de vapor.

La relación entre la adsorción de un plaguicida y su volatilización depende

además de otros factores tales como la concentración de plaguicida en el suelo, el

contenido de agua del suelo, la humedad relativa del aire, la temperatura y otros

factores relacionados con el reparto del plaguicida entre el aire, el agua y el suelo.

Variables que afectan al movimiento del plaguicida hacia la superficie de evaporación

En el desplazamiento de un plaguicida hacia la superficie de evaporación del

suelo están involucrados dos procesos, la difusión y el flujo de masa en el agua que se

desplaza hacia la superficie (flujo de masa convectivo). En condiciones de campo,

estos dos mecanismos actúan simultáneamente ya que el agua presente en el suelo y

los plaguicidas se volatilizan al mismo tiempo (Taylor y Glotfelty, 1988).

• Difusión: El proceso de difusión tiene lugar siempre que existe un gradiente de

concentración. El movimiento se produce desde las regiones en las que el


72

plaguicida está más concentrado hacia las que está en menor concentración.

El proceso de volatilización de un plaguicida implica el consumo del plaguicida

que está en la superficie del suelo, por lo que esta disminución de

concentración produce un movimiento ascendente de plaguicida para

reemplazar al que se ha volatilizado. En general, la tasa de difusión del

fitofármaco está controlada por los mismos factores que controlan su presión

de vapor y que han sido expuestos anteriormente.

• Flujo de masa convectivo: Cuando el agua se evapora de la superficie del

suelo, el agua que asciende para reemplazar la evaporada transporta

plaguicidas en disolución hacia la superficie de evaporación. El aumento del

desplazamiento de los plaguicidas hacia la superficie del suelo para su

posterior volatilización, debido a este fenómeno, se conoce como “Efecto

mecha (wick effect)”. La magnitud de este efecto está relacionada con la tasa

de evaporación del agua, la presión de vapor del plaguicida y la concentración

del plaguicida en la disolución del suelo. La concentración del plaguicida en la

disolución del suelo depende, a su vez, de las características de la adsorción

coloidal, la solubilidad en agua del plaguicida y de otros factores que afectan al

reparto del compuesto entre el agua, el aire y las fases sólidas en el suelo

(Spencer y Cliath, 1973).

1.1.2.2. Volatilización desde el suelo

Las superficies de los suelos son muy heterogéneas, presentando una geometría

compleja que va a influir en el proceso de volatilización de los plaguicidas que se

encuentren en este medio. En el estudio de la volatilización de un plaguicida en el

suelo, se pueden distinguir tres situaciones:

Volatilización desde superficies secas: Cuando un suelo está seco, la

volatilización se produce directamente desde las superficies en las que el plaguicida

está adsorbido. En condiciones de baja humedad, la adsorción de los plaguicidas en

los coloides del suelo es intensa y reduce la presión de vapor de los residuos de

plaguicida hasta valores prácticamente despreciables.


73

Volatilización desde superficies húmedas: En este caso el proceso de

volatilización es más complejo ya que la evaporación del plaguicida tiene lugar desde

la disolución del suelo, después de haberse producido la desorción del compuesto

(Hamaker, 1972). En este caso, el conocimiento de la constante de Henry (KH) y de la

velocidad de transferencia a través de la fase líquida son importantes para el

entendimiento del proceso.

Volatilización de plaguicidas incorporados al suelo: Cuando un plaguicida es

incorporado al suelo, la volatilización de este compuesto implica, en primer lugar, la

desorción desde los coloides del suelo, en segundo lugar, el desplazamiento del

fitofármaco hasta la superficie del suelo y por último, la volatilización a la atmósfera.

En este caso, el transporte del plaguicida desde las capas del suelo más profundas

hasta la superficie de evaporación es un factor muy importante.

La volatilización desde superficies secas es menor que desde las superficies con

mayor contenido en humedad. Este fenómeno es debido a que, por una parte, en los

suelos con mayor contenido de agua existe una competencia por los sitios activos de

los adsorbentes entre las moléculas de agua y las moléculas del plaguicida, además el

agua podría producir la desorción de moléculas de plaguicida adsorbidas. Por otra

parte, existe un transporte de más moléculas de plaguicida hacía la superficie con

motivo del movimiento ascendente del agua. La pérdida de agua, por lo tanto,

magnifica la pérdida de plaguicida pero sólo a través del fenómeno de aceleración del

desplazamiento del plaguicida hacia la superficie del suelo para su posterior

volatilización. Una vez que el agua y el plaguicida alcanzan la superficie, sus

moléculas se difunden y volatilizan independientemente (Spencer et al., 1973 y

Spencer y Cliath, 1973).

1.1.2.3. Volatilización desde superficies foliares

En el caso de la volatilización de los plaguicidas desde las superficies foliares, se

pueden considerar dos situaciones atendiendo a la homogeneidad de la aplicación.

Cuando la aplicación del fitofármaco se ha distribuido homogéneamente sobre la

superficie foliar, formando una capa que cubre toda la superficie, la transferencia de


74

vapor de plaguicida desde la superficie de la hoja, a través de la capa de flujo laminar,

hasta la zona de turbulencia, está controlada por difusión molecular. Éste es un

periodo de volatilización rápida y constante.

En el caso de que la aplicación no sea homogénea, y no se produzca una

cobertura total de la hoja, el proceso de volatilización será más lento. En la práctica,

cuando los plaguicidas son aplicados como sprays con base de agua o como polvos

mojables, ésta será la situación más probable. Por último, siempre existirá una fracción

de plaguicida que quedará retenida en las cavidades de las hojas de difícil acceso o

que se absorberá en la cutícula de la hoja (penetración foliar), produciendo una

disminución en la volatilización (Taylor, 1978 y Kirkwood, 1999).

1.1.2.4. Métodos experimentales en el estudio de la volatilización

Los métodos de estudio de la volatilización de diferentes plaguicidas están

basados en la medida de la pérdida de los compuestos a estudiar de las

correspondientes superficies. Esta pérdida puede ser medida indirectamente,

mediante un análisis del plaguicida en la matriz desde la que se evapora, de manera

que lo que se cuantifica es la cantidad de plaguicida que permanece en la superficie

de volatilización durante y después del proceso de volatilización, o puede ser medida

directamente. Los métodos más utilizados están basados en la medida directa del

plaguicida volatilizado utilizando diferentes medios de retención del compuesto

volatilizado. En el estudio de la volatilización de plaguicidas, se realizan ensayos de

laboratorio y ensayos de campo:

En los ensayos de laboratorio, el ritmo de volatilización se establece cuando la

temperatura, humedad ambiente, humedad del suelo y la velocidad del flujo de aire

son variables controladas a lo largo del experimento. La ventaja de estos métodos

radica en la facilidad con la que pueden ser aplicados para comparar el

comportamiento de diferentes compuestos bajo las mismas condiciones ambientales y

a su vez, proporcionar datos para la valoración de las posibles diferencias en

condiciones de campo.

Se han utilizado diferentes montajes (cámaras de volatilización) en laboratorio

para medir la volatilización de los compuestos estudiados (Grover, 1975, Senders y


75

Seiber, 1983, Dörfler et al., 1991, Martínez et al., 1994, y Rüdel, 1997 y Kuo y Lee,

1999). Todos estos sistemas integran algún tipo de fase encargada de la retención de

los compuestos volatilizados que ,en general, han sido expuestas en el apartado 1.3.

de la Introducción del Capítulo I.

Los ensayos de campo están generalmente basados en la medida de los flujos

de plaguicida volatilizado en el plano horizontal, por encima de la capa de flujo laminar

(zona de turbulencia), durante diferentes periodos de tiempo. Esto implica la medida

del gradiente de concentración del plaguicida con la altura, en la capa de aire sobre el

campo. Esto se realiza muestreando el aire a diferentes alturas, generalmente hasta 2

metros (Taylor, 1978). La principales desventajas de estos experimentos son la

elaborada instrumentación requerida, el elevado número de muestras que deben ser

analizadas, así como la dependencia estacional de los ensayos.

Existen otro tipo de ensayos en los que las condiciones se asemejan más a las

de campo pero distintas variables siguen estando controladas. Algunos investigadores

han utilizado cámaras de volatilización para medir la pérdida de los compuestos en

campos reales, en sitios pequeños, donde los métodos de medición de flujo no se

podrían aplicar (Sanders et al., 1985). Los estudios en invernadero y en

microagroecosistemas (microcosmos) pueden solucionar alguno de los inconvenientes

que presentan los estudios de campo, ya que todos los residuos de volatilización

pueden ser capturados y las condiciones meteorológicas y de aplicación de los

compuestos pueden ser controladas. Los estudios con microagroecosistemas, en

particular, pueden controlar y monitorizar distintos parámetros que pueden ser muy

útiles para la elaboración de modelos ambientales. Estos sistemas permiten el estudio

de volatilización de plaguicidas en los distintos compartimentos ambientales (planta,

suelo, agua y aire) considerados conjuntamente (Nash, 1983).

1.1.3. Adsorción

Las características físicas y químicas del suelo condicionan, en gran parte, la

actividad del plaguicida y su posible comportamiento como contaminante ambiental. La


76

cantidad del producto en disolución es determinante y, en consecuencia, todos los

factores que puedan hacerla variar tienen una gran influencia en el comportamiento

del plaguicida. Desde este punto de vista, el proceso de adsorción se considera el más

importante. Un plaguicida que entra en contacto con el suelo puede ser adsorbido por

los distintos constituyentes del mismo:

Constituyentes inorgánicos del suelo

Las arcillas son los constituyentes inorgánicos del suelo más importantes desde

el punto de vista de la adsorción de compuestos orgánicos debido a su abundancia y

las propiedades específicas de sus superficies. Los óxidos e hidróxidos metálicos

también tienen capacidad de adsorción de moléculas orgánicas, aunque en menor

proporción que las arcillas.

Constituyentes orgánicos del suelo

La fase orgánica sólida del suelo está constituida por la materia orgánica no

humificada (biomasa vegetal y animal senescente) y por la materia orgánica

humificada. La materia orgánica humificada se divide en sustancias no húmicas y en

sustancias húmicas. Las primeras están compuestas por materiales orgánicos

sencillos, como azúcares y aminoácidos y por materiales orgánicos de elevado peso

molecular, como polisacáridos y proteínas. Las segundas, proceden de los procesos

de degradación química y biológica de residuos y restos de plantas y animales así

como de las actividades de síntesis llevadas a cabo por los microorganismos del

suelo. Las sustancias húmicas presentan una amplia variedad de grupos funcionales

así como una gran superficie específica y son las responsables de la adsorción de las

moléculas orgánicas.

Los compuestos orgánicos humificados están frecuentemente asociados a los

constituyentes inorgánicos del suelo, como las arcillas, formando complejos arcillo-

húmicos.

El conocimiento de algunas propiedades fisico-químicas de los plaguicidas,

puede permitir una estimación de su comportamiento frente a la adsorción. Entre las


77

distintas propiedades, las más importantes son el grado de polaridad, la solubilidad en

agua y el coeficiente de reparto octanol-agua (Kow). Otras características, como el

tamaño molecular del compuesto, también pueden ayudar a predecir el

comportamiento de un determinado plaguicida frente a la adsorción en el suelo.

1.1.3.1. Mecanismos de adsorción

Los procesos de adsorción pueden ser clasificados en función de la energía que

interviene, de esta manera, cuando los enlaces que se establecen entre adsorbente y

adsorbato son débiles (de baja energía), se habla de adsorción física. Los principales

mecanismos de adsorción física son la adsorción por puentes de hidrógeno, por

transferencia de carga, por las interacciones ión-dipolo y dipolo-dipolo y finalmente por

fuerzas de Van de Waals y efecto hidrófóbico.

Cuando los enlaces que se establecen en el proceso de adsorción son de mayor

fortaleza (alta energía), se habla de adsorción química. Típicos mecanismos de

adsorción química son la adsorción por intercambio iónico (Weber, 1970-a y 1970-b,

Aharonson y Kafkaki, 1975-a y 1975-b, Hayes et al., 1975, Fruhstorfer et al., 1993 y

Gilchrist et al., 1993) y la adsorción por intercambio de ligandos (Hance, 1971,

Hamaker y Thompson, 1972 y Calvet, 1980). El valor de 10 kcal/mol (80 kJ/mol) es

normalmente utilizado como frontera para diferenciar estos dos tipos de adsorción,

aunque los límites no están claramente definidos (Hance, 1988).

1.1.3.2. Isotermas de adsorción

La isoterma de adsorción se define como la relación existente entre la cantidad

de soluto adsorbida por la matriz del suelo (x/m) a una determinada temperatura

constante y la concentración del soluto en la disolución (C).

La forma de las isotermas de adsorción proporciona información acerca de los

mecanismos de adsorción. La clasificación de Giles es ampliamente utilizada en los

trabajos que tratan de la adsorción de plaguicidas en suelos (Giles et al., 1960). Esta

clasificación está basada en la pendiente inicial de la curva, que determina la afinidad

del soluto o del adsorbato por las posiciones activas disponibles. Como se aprecia en

la Figura 1, se diferencias cuatro tipos de isotermas. Las isotermas tipo S reflejan que


78

la adsorción es más fácil cuando la concentración de soluto en la fase líquida

aumenta. En general aparece cuando existe una competencia muy grande entre el

adsorbato y el disolvente por ocupar las posiciones activas en la superficie del

adsorbente. Las isotermas tipo L corresponden a una disminución de la disponibilidad

de sitios activos al aumentar la concentración de soluto. No existe gran competencia

con el disolvente.

Las curvas tipo H son casos especiales de las isotermas tipo L y se observan

cuando la superficie del adsorbente tiene una gran afinidad por el soluto adsorbido.

Por último, las isotermas tipo C se dan cuando aparece un reparto constante del soluto

entre el disolvente y el adsorbente.

1.1.3.3. Métodos experimentales en el estudio de la adsorción

Diferentes procedimientos han sido empleados en el estudio del equilibrio de

distribución de un soluto entre adsorbente y disolución, perteneciendo,

fundamentalmente, a métodos de agitación o métodos de flujo. Varios estudios valoran

las ventajas y desventajas de los mismos (Green et al., 1980, Johnson y Farmer, 1993

y Lechón et al., 1997).

El más ampliamente utilizado es el método de agitación, en el cual se añade a

una cantidad de suelo una disolución de plaguicida y el conjunto es agitado durante un

tiempo determinado, después del cual, el suelo es retirado por filtración o

centrifugación. La adsorción puede determinarse midiendo la concentración de

plaguicida que queda en disolución. La principal desventaja que presenta este método

es que la cantidad de plaguicida adsorbida es estimada por diferencia entre la

x/m

Figura1. Tipos de isotermas de adsorción.

C C C C

S L C H

x/m x/m x/m


79

concentración inicial y la concentración en equilibrio, por lo que si la adsorción es baja,

esta diferencia será pequeña en comparación con el error analítico y la medida de

adsorción tendrá poca precisión (Hance, 1988). Además las pérdidas de plaguicida por

volatilización o degradación y el porcentaje no recuperado se asignarán

automáticamente a la cantidad adsorbida por lo que se puede sobrestimar la

adsorción. Sin embargo, es un método sencillo con un bajo coste, ya que no requiere

equipamiento sofisticado, que permite una estimación rápida del proceso de adsorción

con un grado de fiabilidad aceptable.

Un procedimiento alternativo para calcular la adsorción es usar un método de

balance de masas, en el cual tanto la concentración en la disolución como la

concentración adsorbida son medidas independientemente (Singh et al., 1990-a y

Lechón et al., 1997).

En todos los demás métodos, se utiliza alguna especie de sistema de flujo. En

uno de ellos, la disolución de plaguicida se hace pasar a través de una columna de

suelo permitiendo el flujo a través de la columna hasta que el efluente tenga la misma

concentración que la solución de entrada (Green y Corey, 1971). Este método tiene la

ventaja de tener una buena precisión a niveles de adsorción bajos y evita los

problemas originados por la destrucción de agregados, aunque presenta el

inconveniente de que el estudio requiere más tiempo ya que de cada columna sólo se

puede extraer un dato. Para tratar de solventar este problema, se ha desarrollado otro

método en columna, en el que usando una columna muy pequeña, variando el

gradiente de entrada de soluto y monitorizando la concentración del efluente

continuamente, se puede calcular la adsorción a diferentes concentraciones en cada

ensayo (Burchill et al., 1973). Como en el método de agitación, los resultados serán

imprecisos a bajos niveles de adsorción, debido a que las concentraciones van

cambiando y no es seguro que se alcance el equilibrio.

Otro sistema consiste en trabajar con núcleos intactos de suelo, que son

colocados en embudos de filtración y mediante vacío controlado se induce un flujo

continuo que se hace pasar a través de estos núcleos (Qualls y Haines, 1992).

También se ha trabajado con sistemas en los que se utiliza una celda de agitación,

consistentes en hacer pasar una solución de concentración conocida a través de una

celda que contiene el adsorbente, el cual se mantiene en suspensión mediante un


80

agitador magnético. De nuevo la concentración del efluente es monitorizada y se

pueden realizar diversas series de medidas a partir de una suspensión (Grice et al.,

1973). Este procedimiento requiere equipo especial, se produce desintegración de

agregados y los resultados son de baja precisión si la adsorción es baja, sin embargo

es particularmente útil para adsorbentes de tamaño coloidal que no pueden ser

manejados fácilmente con otros métodos.

El uso de agitadores magnéticos para mezclar el contenido de la celda ha sido

criticado por otros autores argumentando que la agitación que proporciona este

sistema es insuficiente para impedir la deposición del adsorbente sobre el filtro de

membrana dentro de la celda. Por ello, se han desarrollado celdas de reacción

agitadas por flujo continuo, en las que se produce suficiente turbulencia en las

proximidades del filtro como para mantener el adsorbente en suspensión a flujos

relativamente altos durante periodos de varias horas (Miller et al., 1989).


2.1. Materiales

2.1.1. Patrones

Endosulfan-I, endosulfan-II, endosulfan-sulfato y clorpirifos, productos a partir de

los cuales se elaboraron los patrones, fueron obtenidos de Reidel-de Häen (Alemania).

2.1.2. Formulaciones comerciales de plaguicidas

Se utilizaron las formulaciones de Thimul (endosulfan-I + endosulfan-II, 70:30,

35 % p/v, como líquido emulsionable) y Dursban (clorpirifos 48 % p/v, líquido

emulsionable) obtenidas de Rhône Poulenc (España).

2.1.3. Disolventes y reactivos

Se utilizaron acetato de etilo y etanol de Panreac (España) y DMSO de Scharlau

(España). El Na2SO4 anhidro, K2SO4 , NaOH, CaCl2 y KCl fueron obtenidos de la casa


81

comercial Merck (Alemania). Para la medida de la biomasa se utilizaron: hidridantina,

L-leucina y acetato de litio, que fueron obtenidos de Sigma (España), la ninhidrina, el

ácido cítrico y el cloroformo fueron obtenidos de Merck (Alemania).

2.1.4. Suelo

En los ensayos de degradación se utilizó el suelo B, cuyas características fisico-

químicas se recogen en la Tabla 1 del Capitulo I. Los suelos empleados en el ensayo

de adsorción son de parcelas comerciales de la provincia de Badajoz dedicadas al

cultivo del tomate y las características fisico-químicas se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Características de los suelos utilizados en el ensayo de adsorción.

Suelo % Arena % Arcilla % Limo M.0. (%) a pH b

1 53,7 39,8 6,5 1,2 8,2

2 88,3 5,4 6,3 1,3 5,6

3 87,3 1,8 10,9 1,6 5,6

4 85,7 5,1 9,3 1,8 5,7

5 56,1 36,2 7,6 1,9 8,3

6 72,5 15,2 12,4 2,2 6,3

7 56,4 34,6 9,1 2,6 8,2

8 52,9 41,5 5,7 2,7 7,9 a Se midió el carbono total por combustión en un analizador CHN (% M.O. = % C.O. x 1,724). b pH calculado en suspensión suelo:agua (1:2,5).

2.1.5. Columnas de extracción

Para la extracción de los plaguicidas del suelo se utilizaron las columnas de

polipropileno descritas en el apartado 2.1.7. de materiales y métodos del Capítulo I.

2.1.6. Material vegetal

En el ensayo de influencia de la rizosfera en la degradación de los insecticidas se

utilizaron las plantas Amaranthus retroflexus, Chenopodium album y Solanum nigrum y

plantas de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), que se mantuvieron bajo


82

condiciones controladas en una cámara de cultivo (24 ºC y 70 % de humedad relativa)

durante 2 meses hasta el comienzo de los ensayos.

2.2. Aparatos

2.2.1. Equipo de Laboratorio

Para la extracción de los plaguicidas de las muestras de suelo se utilizó el equipo

descrito en el apartado 2.2.1. de materiales y métodos del Capítulo I.

2.2.2. Sistema de análisis cromatográfico A

La determinación cromatográfica de los residuos de los plaguicidas estudiados

se llevó a cabo utilizando el sistema cromatográfico A que está descrito en el apartado

2.2.2. de materiales y métodos del Capítulo I. El programa de temperatura utilizado fue

el siguiente:

La temperatura de la columna se mantuvo a 150 ºC durante 1 minuto, luego fue

aumentando a una velocidad de 25 ºC/minuto hasta 230 ºC y se mantuvo 0,5 minutos,

luego fue aumentando a una velocidad de 12 ºC/min hasta 280 ºC donde se mantuvo 3

minutos. La temperatura del inyector fue de 270 ºC y la del detector de 300 ºC.

2.2.3. Cámara climática y estufas de incubación

La cámara climática (precisión de regulación de temperatura de ± 0,5 ºC) donde

se cultivaron las plantas utilizadas en los ensayos fue de IBERCEX A.S.L., S.A.

(España). Los suelos utilizados en los ensayos de degradación se incubaron en una

estufa de la casa comercial Heraeus (Alemania) modelo BK-600 (rango de

temperatura 3-40 ºC, homogeneidad de la temperatura ± 1º C, estabilidad de la

temperatura ± 0,5 ºC ) y en otra de la casa comercial Raypa (España) modelo IR-325

(rango de temperatura 0-45 ºC, homogeneidad de la temperatura ± 1ºC, estabilidad de

la temperatura ± 0,1 ºC).


83

2.3. Métodos

2.3.1. Ensayos de degradación en suelo

2.3.1.1. Ensayo de degradación a distintas humedades y temperaturas

Los ensayos de degradación de los insecticidas clorpirifos y endosulfan se

realizaron tratando 1,4 kg de suelo B con las correspondientes disoluciones acuosas

de los compuestos a estudiar, Thimul para endosulfan y Dursban para clorpirifos. El

tratamiento se realizó distribuyendo el suelo uniformemente en una bandeja de

plástico (40 x 25 cm) y añadiendo las formulaciones con una pipeta, de manera

homogénea, para obtener una concentración final de 1 µg/g de clorpirifos y

endosulfan. El suelo tratado se tamizó 2 veces y se transfirió a una bolsa de plástico

con cierre hermético, que se mantuvo durante 24 h en una cámara a 4 ºC para permitir

la homogenización del sistema. Se tomaron 4 muestras de 20 g de suelo y se

mantuvieron 24 h en una estufa a 100 ºC para determinar la humedad que contenía el

suelo después del tratamiento. Posteriormente se realizaron los correspondientes

ajustes de humedad y se tomaron 24 muestras individuales de 300 g que se

introdujeron en frascos de vidrio tapados y se distribuyeron de acuerdo con el diseño

experimental que se presenta en la Figura 2 de manera que se obtuvieran 4 replicados

de cada tratamiento ensayado.

Tratamientos a diferente temperatura. El estudio de la influencia de la

temperatura en la degradación de los compuestos investigados se realizó mediante los

tratamientos en los que el suelo tenía el mismo contenido de humedad (T1-T4). La

humedad seleccionada fue del 8%, que corresponde al 60 % de la capacidad de

campo del suelo a –33 Kpa, y los ensayos se realizaron a 5, 15, 25 y 35 ºC.

Tratamientos a diferente contenido de humedad. El estudio de la influencia de la

humedad en la degradación se realizó mediante los tratamientos en los que los suelos

se encontraban a la misma temperatura (T3, T5 y T6). Se seleccionó la temperatura de

25 ºC y los ensayos se realizaron ajustando los suelos al 4, 8 y 13 % de humedad, que


84

corresponden al 30 %, 60 % y aproximadamente el 100 % de la capacidad de campo,

respectivamente.

Todos los frascos de vidrio correspondientes a las repeticiones de cada

tratamiento se colocaron en bandejas, que contenían agua en su base para disminuir

la pérdida de humedad del suelo, y dentro de las estufas a las diferentes temperaturas

estudiadas. El seguimiento de la concentración de los insecticidas a lo largo del tiempo

se efectuó mediante el análisis de las correspondientes muestras (20 g de cada

frasco) que se tomaron a tiempo cero (24 h después de la aplicación) y

aproximadamente cada 20 días durante los 4 meses que duró el ensayo.

Paralelamente se realizó un control semanal de la humedad de los suelos.

2.3.1.2. Degradación en la rizosfera

Para evaluar la influencia de la rizosfera en la degradación del clorpirifos y

endosulfan, se utilizaron diferentes malas hierbas encontradas frecuentemente en el

cultivo del tomate (Amaranthus retroflexus, Chenopodium album y Solanum nigrum) y

H = 8 % T = 5 ºC

1, 4kg suelo

H = 8 % T = 15 ºC

1, 4kg suelo

H = 8 % T = 25 ºC

1, 4kg suelo

H = 13 % T = 25 ºC

1, 4kg suelo

H = 8 % T = 35 ºC

1, 4kg suelo

H = 4 % T = 25 ºC

1, 4kg suelo

T1

T2

T3 T5 T6

T4

Figura 2. Diseño experimental para los ensayos de degradación a distintas humedades y temperaturas. Se representan los seis tratamientos (T) ensayados.


85

plantas de tomate (Lycopersicon esculentum Mill). Se utilizaron macetas de plástico

individuales con suelo B para cultivar 4 plantas de cada especie por separado (suelos

muestra) y otras 4 para contener al suelo B sin plantas (suelos testigo). El cultivo se

realizó en las condiciones descritas en el apartado 2.1.6. de materiales y métodos de

este capítulo. Después de dos meses, se sacaron las macetas de la cámara y las

plantas fueron extraídas cuidadosamente del suelo. Todos los suelos, que quedaron

en las macetas, se tamizaron (2 mm) y se distribuyeron uniformemente en diferentes

bandejas (20) donde fueron tratados con las suspensiones acuosas de Thimul y

Dursban para obtener una concentración final de endosulfan y clorpirifos en suelo de 1

µg/g. Se tomaron 4 muestras de 20 g de cada suelo y se mantuvieron 24 h en una

estufa a 100 ºC para determinar la humedad que contenía el suelo después del

tratamiento. Después de un periodo de homogenización de 24 h a 4 ºC, se ajustaron

las humedades de todos los suelos al 8 % y se tomaron 20 muestras individuales de

300 g (una de cada bandeja) de manera que se obtuvieran 4 replicados de cada

sistema suelo-planta ensayado. Las muestras se introdujeron en frascos de vidrio

tapados y se llevaron a la cámara donde se mantuvieron a 25 ºC durante 3 meses. El

seguimiento de las concentraciones de los insecticidas a lo largo del experimento se

realizó de la misma manera que para el ensayo de degradación a diferentes

temperaturas y humedades.

2.3.1.3. Medida de la biomasa del suelo

Se realizaron dos medidas de la biomasa de cada uno de los suelos, la primera

justo al empezar el ensayo de degradación y la segunda al cabo de tres meses, es

decir, a tiempo cero y al final de dicho ensayo. Para la medida de la biomasa se utilizó

el método de fumigación-extracción. El procedimiento seguido consta de tres fases:

fumigación, extracción y determinación espectrofotométrica.

Fumigación

La fumigación se realizó siguiendo el procedimiento propuesto por Jenkinson y

Powlson (1976). Se pesaron 7,5 g de cada suelo y se introdujeron en los recipientes


86

de vidrio correspondientemente etiquetados. Se introdujo un papel de filtro mojado en

la base del desecador sobre el que se colocó un vaso de precipitados que contenía

cloroformo libre de etanol. Se colocó la rejilla del desecador y sobre está los

recipientes que contenían las muestras. Se cerró el desecador y se hizo vacío hasta

que el cloroformo empezó a burbujear y se dejó en este estado durante 2 min. Se

desconectó la bomba de vacío, se cerró la llave del desecador y se trasladó el sistema

a una estufa que estaba a 25 ºC, manteniéndose en su interior durante 22 h. Tras el

periodo de fumigación se realizó la apertura del desecador, se retiró el recipiente de

cloroformo y se limpió cuidadosamente la pared interna del desecador. Se introdujeron

nuevamente las muestras en el desecador y se conectó la bomba de vacío durante 1

min, posteriormente se igualaron presiones nuevamente, y se repitió esta secuencia 9

veces para asegurar la total eliminación del cloroformo del sistema. Se transfirieron las

muestras a unos tubos de plástico y se realizó el proceso de extracción.

Extracción

La extracción del carbono se realizó mediante una disolución 0,5 M de K2SO4, se

añadieron 30 ml de la disolución de K2SO4 a los 7,5 g de suelo y se agitaron los tubos

durante 30 min en un agitador de vaivén. Posteriormente se filtraron los extractos con

filtros Whatman nº 42 y se recogieron en tubos de plástico con tapón que fueron

congelados hasta el momento del análisis.

Determinación espectrofotométrica

La determinación espectrofotométrica está basada en la reacción que se produce

entre la ninhidrina y los grupos nitrogenados que están presentes en el extracto de

suelo en K2SO4. La formación de un complejo coloreado permite la determinación

colorimétrica de éste nitrógeno, que posteriormente se relaciona con la biomasa

microbiana (Jorgensen y Brooks, 1990). Se añadieron 750 µl de muestra en los

correspondientes tubos de ensayo, posteriormente se adicionaron 1,75 ml de ácido

cítrico y 1,25 ml del reactivo de ninhidrina. Después de una agitación en el Vortex, los

tubos se sumergieron en un baño de agua a 100 ºC durante 25 min, periodo después


87

del cual se sacaron del baño y se dejaron enfriar a temperatura ambiente.

Posteriormente se añadieron 4,5 ml de EtOH al 50 % y tras una nueva agitación en el

Vortex, se analizó el nitrógeno contenido en las muestras midiendo las

correspondientes absorbancias a λ =570 cm. En la Figura 3, se muestra el esquema

del método seguido.

2.3.2. Ensayos de volatilización en planta

En el estudio de la volatilización del endosulfan desde superficies foliares se

aplicó el método desarrollado para el análisis de residuos de plaguicidas en muestras

de aire, basado en la retención de estos compuestos en columnas de Florisil (apartado

2.3.3.2. de materiales y métodos del Capitulo I). Asimismo, se realizó un ensayo

preliminar en el que también se determinó la concentración de endosulfan en hoja

después del periodo de volatilización con objeto de realizar un balance de masas y

Muestras fumigación

SUELOS

Extracción (K2SO4 0,5 M)

Fumigación (CHCl3)

Determinación Biomasa (N-Ninhidrina)

Biomasa muestras control

Biomasa muestras fumigadas

BIOMASA NETA

Figura 3. Esquema del método de fumigación-extracción para la determinación de la biomasa de los suelos estudiados.

Extracción (K2SO4 0,5 M) Determinación Biomasa

(N-Ninhidrina)

Muestras control


88

comprobar la efectividad del método, para lo que se utilizó la metodología desarrollada

para la determinación de plaguicidas en muestras vegetales (apartado 2.3.4. de

materiales y métodos del Capitulo I).

El ensayo de volatilización se realizó introduciendo una hoja de la planta de

tomate por una de las bocas del matraz de fondo redondo. La planta de tomate fue

previamente regada hasta observar la percolación del agua. A continuación se fortificó

la hoja, dentro del matraz, con una formulación comercial de endosulfan para alcanzar

una concentración de 12 µg de insecticida /hoja.

En la otra boca del matraz se acoplaron dos columnas ensambladas en serie y

en la parte superior de la última se conectó una bomba portátil, como se muestra en la

Figura 4-B, a un flujo constante de 0,5 L/min. Se llevaron a cabo dos ensayos en una

estufa a una temperatura constante de 30 ºC (Figura 4-A) durante 48 h, realizándose

diferentes muestreos en periodos de tiempo comprendidos entre 1 y 48 h. Después del

último muestreo, se realizó un lavado del matraz de fondo redondo con acetato de etilo

y se determinó la cantidad de endosulfan que había en la segunda columna.

Figura 4. Montaje utilizado para el estudio de la volatilización del endosulfan desde superficies foliares en condiciones controladas de temperatura (A) y detalle del sistema de doble columna utilizado (B).

A B


89

Asimismo, se determinó la cantidad de endosulfan que había permanecido en la

hoja utilizando el método descrito en el Capítulo I para el análisis de plaguicidas en

material vegetal.

2.3.3. Ensayos de adsorción

Método de agitación

Se prepararon distintas disoluciones de Thimul y de Dursban en CaCl2 0,01 M,

obteniéndose unos valores de concentraciones finales de 0,1, 0,2, 0,5 y 1,0 µg/ml. El

experimento fue llevado a cabo en tubos de centrífuga de vidrio tapados

adecuadamente, y en los que se añadió 1 g de suelo y 10 ml de las disoluciones de las

formulaciones de los insecticidas anteriormente mencionadas.

Los tubos fueron llevados a un agitador mecánico durante 24 h, a temperatura

ambiente (25 ºC). Estudios preliminares de cinética demostraron que el equilibrio de

adsorción es alcanzado dentro del intervalo de 24 h. Al finalizar este periodo, las

muestras fueron centrifugadas a 4000 r.p.m. y 20 ºC durante 10 minutos y 5 ml de fase

líquida fueron retirados cuidadosamente y transferidos a tubos de ensayo de vidrio

para la determinación de la concentración del endosulfan y clorpirifos en el equilibrio,

que llamaremos concentración en el equilibrio (C). Se realizó la extracción liquido-

liquido de los insecticidas tal y como está descrito en el apartado 2.3.2.1. de materiales

y métodos del Capítulo I.


3.1. Ensayos de degradación en suelo

3.1.1. Influencia de la humedad y la temperatura

3.1.1.1. Variación de la concentración con el tiempo


90

En la Figura 5, se muestra la evolución de la concentración de clorpirifos a lo

largo del experimento en las distintas condiciones ensayadas. Se puede apreciar que,

en general, las concentraciones de clorpirifos van decayendo con el tiempo de un

forma exponencial, observándose una primera etapa de rápida disminución y una

segunda etapa en la que la disminución es más lenta.

En las condiciones de temperatura más baja (5 ºC y 15 ºC), no es tan notable la

primera etapa de disminución rápida, especialmente en el caso de 5 ºC. En estas

condiciones la degradación del insecticida evoluciona más despacio.

En la Figura 6, se presenta la evolución de la concentración de endosulfan-I en

las condiciones ensayadas. La transición entre las dos fases está menos marcada en

los tratamientos con temperatura de 5 ºC y 35 ºC.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 40 80 120 160 200Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

T= 5ºC, H=8% T=15ºC, H=8% T=25ºC, H=8%

T=35ºC, H=8% T=25ºC, H=4% T=25ºC, H=13%

Figura 6. Variación con el tiempo de la concentración de endosulfan-I en las condiciones ensayadas de humedad y temperatura.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 40 80 120 160 200Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

T=5ºC, H=8% T=15ºC, H=8% T=25ºC, H=8%

T=35ºC, H=8% T=25ºC, H=4% T=25ºC, H=13%

Figura 5. Variación con el tiempo de la concentración de clorpirifos en las condiciones ensayadas de humedad y temperatura.


91

Se aprecia nuevamente una primera etapa de disminución rápida de la

concentración del insecticida, seguida de una segunda de disminución más lenta. En

la Figura 7, se recoge la evolución de la concentración de endosulfan-II en las

condiciones ensayadas. En este caso no se aprecia una disminución exponencial de

las concentraciones, siendo en todo momento una disminución lenta. La degradación

del compuesto en las condiciones de 5 ºC y 15 ºC es más lenta.

En la Figura 8, se puede seguir la evolución de la concentración de endosulfan-

sulfato a lo largo del ensayo.

Figura 7. Variación con el tiempo de la concentración de endosulfan-II en las condiciones ensayadas de humedad y temperatura.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 40 80 120 160 200Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

T=5ºC, H=8% T=15ºC, H=8% T=25ºC, H=8%

T=35ºC, H=8% T=25ºC, H=4% T=25ºC, H=13%

Figura 8. Variación con el tiempo de la concentración de endosulfan-sulfato en las condiciones ensayadas de humedad y temperatura.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 40 80 120 160 200Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

T=5ºC, H=8% T=15ºC, H=8% T=25ºC, H=8%

T=35ºC, H=8% T=25ºC, H=4% T=25ºC, H=13%


92

En general, se aprecia que no aparece este metabolito hasta el segundo

muestreo (20 días), luego se observa una fase de formación, seguida de una fase de

desaparición.

Se aprecia en todas las gráficas que los muestreos se prolongaron hasta los 185

días en los tratamientos a temperaturas de 5 ºC y 15 ºC, donde la degradación de

todos los compuestos fue, en general, más lenta. En las demás condiciones, donde la

degradación progresó más rápidamente, se muestreó hasta los 122 días.

3.1.1.2. Ajuste a cinética de primer orden y cálculo de vidas medias

En primer lugar se estudió si la degradación del clorpirifos y de los dos isómeros

del endosulfan (endosulfan-I y endosulfan-II) se ajustaba a una cinética de primer

orden, descrita por la ecuación:

donde Co es la concentración inicial de insecticida, C es la concentración alcanzada a

tiempo t y K es la constante de degradación. Las constantes de degradación y los

coeficientes de determinación (r2), en cada caso, fueron calculados por análisis de

regresión lineal del Ln C frente al tiempo de incubación, utilizando la ecuación [1] en su

forma logarítmica:

Las vidas medias (t ½) de los compuestos estudiados se calcularon mediante la

ecuación:

En la Tabla 2, se presentan los resultados obtenidos para el clorpirifos. Se pone

de manifiesto un buen ajuste a la ecuación de cinética de primer orden en todos los

C = Co e –K t [1]

Ln C = Ln Co – K t [2]

t ½ = Ln 2/K [3]


93

tratamientos estudiados. Las vidas medias estuvieron comprendidas entre 85 y 25

días.

Tabla 2. Constantes de degradación (K), vidas medias (t 1/2) y coeficientes de determinación (r2) obtenidos para el clorpirifos a.

Clorpirifos Tratamiento T (ºC) H (%) b

K ± SD (d-1) t 1/2 (d) r2 T1 5 8 0,0081 ± 0,0004 85 0,985 T2 15 8 0,0138 ± 0,0009 50 0,970 T3 25 8 0,0246 ± 0,0018 28 0,972 T4 35 8 0,0282 ± 0,0018 25 0,981 T5 25 4 0,0215 ± 0,0015 32 0,976 T6 25 13 0,0272 ± 0,0027 26 0,951

a Los valores se obtuvieron por regresión lineal del Ln C frente al tiempo de incubación considerando ocho muestreos de cada replicado (cuatro replicados). b Humedad del suelo.

En las Tablas 3 y 4 se presentan los resultados obtenidos para el endosulfan-I y

endosulfan-II, respectivamente.

Los resultados obtenidos para endosulfan-I y endosulfan-II también se ajustan a

una cinética de primer orden. Las vidas medias obtenidas para el endosulfan-I

estuvieron comprendidas entre 40 y 19 días y para el endosulfan-II entre 513 y 89

días. Los valores de vidas medias obtenidas para el clorpirifos, el endosulfan-I y el

endosulfan-II son del orden de las citadas por otros autores (Racke, 1993 y Shalini-

Singh et al., 1999).

Tabla 3. Constantes de degradación (K), vidas medias (t 1/2) y coeficientes de determinación (r2) obtenidos para el endosulfan-I a.

Endosulfan-I Tratamiento T (ºC) H (%) b

K ± SD (d-1) t 1/2 (d) r2 T1 5 8 0,0174 ± 0,0008 40 0,984 T2 15 8 0,0215 ± 0,0024 32 0,932 T3 25 8 0,0342 ± 0,0026 20 0,983 T4 35 8 0,0258 ± 0,0018 27 0,974 T5 25 4 0,0268 ± 0,0034 26 0,900 T6 25 13 0,0362 ± 0,0034 19 0,974



94

Se observó un incremento de la degradación del clorpirifos y del endosulfan-II al

aumentar la temperatura, pero para el endosulfan-I, una cierta disminución de la

degradación se manifestó cuando la temperatura aumentó de 25 ºC a 35 ºC.

Tabla 4. Constantes de degradación (K), vidas medias (t 1/2) y coeficientes de determinación (r2) obtenidos para el endosulfan-II a.

Endosulfan-II Tratamiento T (ºC) H (%) b

K ± SD (d-1) t 1/2 (d) r2

T1 5 8 0,0013 ± 0,0003 513 0,768 T2 15 8 0,0027 ± 0,0004 255 0,813 T3 25 8 0,0057 ± 0,0004 121 0,925 T4 35 8 0,0077 ± 0,0007 89 0,967 T5 25 4 0,0070 ± 0,0011 98 0,909 T6 25 13 0,0070 ± 0,0010 98 0,895


La disminución de la degradación de un plaguicida al aumentar la temperatura es

un fenómeno poco observado y este hecho pudiera ser explicado en base a las

diferencias en la tasa de interconversión de los isómeros del endosulfan a esas

temperaturas. De hecho, cuando ambos isómeros se consideraron juntos, se obtuvo

una correlación positiva de la degradación con la temperatura, como se aprecia en la

Tabla 5, en la que se presentan las vidas medias obtenidas para la suma de los

isómeros del endosulfan. Cuando ambos isómeros se consideraron conjuntamente los

valores de las vidas medias estuvieron comprendidos entre 46 y 103 días.

Tabla 5. Constantes de degradación (K), vidas medias (t 1/2) y coeficientes de determinación (r2) obtenidos para la suma de isómeros del endosulfan a.

Endosulfan-I + Endosulfan-II Tratamiento T (ºC) H (%) b

K ± SD (d-1) t 1/2 (d) r2 T1 5 8 0,00670 ± 0,00076 103 0,917 T2 15 8 0,00710 ± 0,00151 98 0,760 T3 25 8 0,01228 ± 0,00248 56 0,831 T4 35 8 0,01503 ± 0,00121 46 0,969 T5 25 4 0,01325 ± 0,00292 52 0,805 T6 25 13 0,01409 ± 0,00328 49 0,787



95

3.1.1.3. Influencia de la temperatura en la degradación

Para estudiar el efecto de la temperatura en la degradación se utilizó la ecuación

de Arrhenius:

donde K es la constante de degradación del insecticida, Ea es la energía de activación,

R la constante universal de los gases y T la temperatura. Teniendo en cuenta que la

degradación de los insecticidas estudiados sigue una cinética de primer orden, se

puede utilizar la siguiente expresión de la ecuación [4]:

De esta manera, realizando un análisis de regresión lineal del logaritmo

neperiano de la vida media frente al inverso de la temperatura, se obtiene la energía

de activación, que es una medida de la dependencia de la degradación con la

temperatura. La ecuación de Arrhenius ha sido utilizada por otros autores para el

estudio de la dependencia de la constante de degradación con la temperatura para

diferentes plaguicidas (Zimdahl et al., 1970, Usoroh y Hance, 1974, Obrador et al.,

1993 y Martínez et al., 1996).

En la Tabla 6, se presentan las energías de activación obtenidas, el coeficiente

de determinación y las vidas medias de los insecticidas estudiados correspondientes a

los tratamientos en los que la humedad del suelo fue constante (8 %) y la temperatura

variable.

Se observa que la mayor energía de activación corresponde al endosulfan-II y la

menor al endosulfan-I. Asimismo, no se apreció una correlación con la temperatura

para este isómero. Sin embargo, cuando ambos isómeros se consideraron juntos, se

obtuvo un valor de Ea de 21,1 Kjmol-1 y un coeficiente de determinación r2 de 0,909.

Este hecho indica una correlación de la degradación con la temperatura para el

endosulfan considerado como la suma de los dos isómeros.

K = Ao e –Ea/RT [4]

Ln t ½ = Ea/RT + Cte [5]


96

Tabla 6. Efecto de la temperatura en la degradación. Vidas medias (t 1/2 )y Ea para los insecticidas estudiados en el intervalo de temperaturas ensayado *.

t 1/2 (días) T (ºC)

Clorpirifos Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan (I + II) 5 85 40 513 103 15 50 32 255 98 25 28 20 121 56 35 25 27 89 46

Ea ± SD (Kjmol-1) 30,8 ± 4,5 11,9 ± 7,3 42,8 ± 4,3 21,1 ± 4,7

r2 0,960 0,572 0,980 0,909

* La humedad se ajustó al 8 % en todos los casos.

3.1.1.4. Influencia de la humedad en la degradación

Para el estudio del efecto de la humedad en la degradación de los plaguicidas

investigados se utilizó una ecuación empírica que relaciona la degradación y el

contenido de humedad del suelo (Walker, 1974):

donde H es el contenido de humedad del suelo y A y B son constantes que indican la

dependencia de la degradación con la humedad. Esta ecuación ha sido aplicada por

otros autores a diferentes compuestos (Hurle y Walker, 1980, Singh et al., 1990-b y

Obrador et al., 1993). Utilizando la forma logarítmica de la ecuación [6] se obtiene la

siguiente expresión:

Realizando un análisis de regresión lineal del logaritmo neperiano de la vida

media frente al logaritmo neperiano del contenido de humedad del suelo se obtienen

las constantes A y B.

En la Tabla 7 se recogen los valores obtenidos de estas constantes junto con las

vidas medias correspondientes a los tratamientos en los que la temperatura fue

constante (25 ºC) y la humedad del suelo varió. Se observa que el clorpirifos y el

t ½ = A H-B [6]

Ln t ½ = Ln A – B Ln H [7]


97

endosulfan-I se ajustan bien a la ecuación [7], pero no se observa ajuste para el

endosulfan-II. Este hecho podría ser debido a la mayor simetría de la molécula del

endosulfan-II, que se traduce en una mayor estabilidad y por lo tanto determinadas

rutas de degradación se ven dificultadas (Stewart y Cairns, 1974 y Shalini-Singh et al.,

1999). Esto podría explicar que las rutas que se ven favorecidas por la humedad del

suelo en la degradación del endosulfan-I no progresaran en el endosulfan-II debido a

su mayor estabilidad estructural.

Tabla 7. Efecto de la humedad en la degradación. Vidas medias (t 1/2 ) y constantes A y B para los insecticidas estudiados en el intervalo de humedades ensayado *.

t 1/2 (días) H (%)

Clorpirifos Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan (I +II) 4 32 26 98 52 8 28 20 121 56 13 25 19 98 49

Ln A ± SD 3,7479 ± 0,0096 3,5948 ± 0,1317 4,6208 ± 0,4130 4,0449 ± 0,2243 A 42,4 36,4 101,6 57,1

B ± SD -0,1976 ± 0,0046 -0,2612 ± 0,0637 -0,0182 ± 0,1997 -0,0413 ± 0,1085 r2 0,999 0,944 0,008 0,126

* La temperatura fue de 25 ºC en todos los casos.

El endosulfan-I mostró el valor negativo más alto para la constante B, por lo que

la degradación de este compuesto en el suelo estudiado fue la más sensible al

contenido de humedad de dicho suelo. Este hecho también podría explicar que la vida

media del endosulfan-I sea más pequeña que la del endosulfan-II. Cuando ambos

isómeros se consideraron conjuntamente no se obtuvo correlación entre la

degradación y la humedad del suelo.

3.1.2. Influencia de la rizosfera

3.1.2.1. Vidas medias en los suelos estudiados

Se estudió la degradación de los insecticidas clorpirifos, endosulfan-I y

endosulfan-II en suelos procedentes de la rizosfera de varias malas hierbas

encontradas frecuentemente en el cultivo del tomate, en suelos procedentes de la


98

rizosfera de plantas de tomate y en suelos testigo. Se calcularon las vidas medias de

estos compuestos en los suelos mencionados.

En las Tablas 8, 9 y 10 se recogen los resultados obtenidos para el clorpirifos,

endosulfan-I y endosulfan-II, respectivamente. Las vidas medias para el clorpirifos en

los distintos suelos estudiados variaron entre 20 y 22 días, para el endosulfan-I

variaron entre 16 y 17 días y para el endosulfan-II entre 81 y 91 días. Se realizó un

análisis de varianza y no se encontraron diferencias significativas (α = 0,05) en la

degradación de cada compuesto en los diferentes suelos estudiados.

El ensayo de degradación se realizó a una temperatura de 25 ºC y a una

humedad de los suelos de 8 %. Las vidas medias, para los tres insecticidas

estudiados, obtenidas en estas condiciones fueron algo más pequeñas que las

correspondientes obtenidas a 25 ºC y 8 % de humedad del suelo en el ensayo de

degradación a distintas humedades y temperaturas (Tablas 2-4). En ambos ensayos

se utilizaron los mismos suelos, pero en el ensayo del efecto de la rizosfera las plantas

estuvieron interaccionando durante dos meses con los suelos que las contenían. Estas

interacciones pudieron modificar las condiciones del suelo, lo que podría explicar las

diferencias encontradas en las vidas medias.

Tabla 8. Vidas medias del clorpirifos en los suelos estudiados *.

Clorpirifos

Especie K ± SD (d-1) t 1/2 (d) r2

Solanum nigrum 0,0341 ± 0,0032 20 0,974 Chenopodium album 0,0327 ± 0,0028 21 0,978

Amaranthus retroflexus 0,0339 ± 0,0034 20 0,970 Tomate 0,0327 ± 0,0032 21 0,973 Testigo 0,0315 ± 0,0033 22 0,968

* Los valores se obtuvieron por regresión lineal del Ln C frente al tiempo de incubación considerando cuatro muestreos de cada replicado (cuatro replicados).


99

Tabla 9. Vidas medias del endosulfan-I en los suelos estudiados *.

Endosulfan-I





Tabla 10. Vidas medias del endosulfan-II en los suelos estudiados *.

Endosulfan-II





3.1.2.2. Biomasa de los suelos estudiados

La biomasa microbiana edáfica puede definirse como la parte viva de la materia

orgánica del suelo, excluyendo las raíces de las plantas y los animales de tamaños

superiores a 5x103 µm3 (Jenkinson y Ladd, 1981). Dicha biomasa incluye diferentes

grupos sistemáticos de microorganismos, tales como bacterias, algas, levaduras,

hongos, protozoos, etc.

El método utilizado está basado en que la fumigación de los suelos con

cloroformo provoca la muerte de dichos microorganismos, produciéndose la lisis

celular que libera una fracción representativa de la biomasa microbiana. La posterior

reacción de los grupos α-amino con la ninhidrina para formar un complejo de color

púrpura hace que los aminoácidos, péptidos, proteínas, grupos amonio y otros


100

compuestos con grupos α-amino libres puedan ser cuantificados. De esta manera, el

nitrógeno susceptible de reaccionar con la ninhidrina (N-ninhirina) es la suma de α-

amino-N, aminas primarias y nitrógeno amoniacal (NH4+-N).

La biomasa en los diferentes suelos estudiados se estimó de la siguiente

manera:

donde ESF= extractos de los suelos fumigados con cloroformo y ESNF= extractos de

los suelos no fumigados. De esta manera se calculó la biomasa microbiana de los

suelos ensayados, tanto al principio como al final del experimento de degradación,

para evaluar el posible efecto que pudieran tener las diferentes combinaciones suelo-

planta en la producción de biomasa.

En la Figura 9 se presentan los resultados obtenidos en esta medida. Como se

aprecia en la gráfica, la cantidad de biomasa medida al principio del experimento

(columnas en amarillo) es menor que la correspondiente cantidad encontrada al final

(columnas en naranja).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Bio

mas

a m

icro

bian

a ( µµ µµ

g N

/ g s

oil)

S.ni

grum

A.re

trofle

xus

Ch.a

lbum

Tom

ato

Suel

o te

stig

o

Inicial Final

Figura 9. Biomasa microbiana medida por el método de fumigación-extracción en los suelos muestra (Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Solanum nigrum y tomate) y en el suelo testigo.

Biomasa (N-ninhidrina) = N-ninhidrina (ESF) - N-ninhidrina (ESNF)


101

Se realizó un análisis de varianza, al principio y al final del ensayo, y no se

encontraron diferencias significativas (α =0,05) en la producción de biomasa en los

diferentes suelos ensayados. Este hecho podría explicar el comportamiento tan similar

observado en cuanto a la degradación de los plaguicidas estudiados en estos suelos.

3.2. Ensayos de volatilización en planta

El ensayo de volatilización se llevó a cabo utilizando el montaje descrito en el

apartado de metodología de este Capítulo. Se seleccionó el sistema de retención de

los compuestos volatilizados mediante columnas de Florisil debido a la posibilidad de

analizar independientemente los dos isómeros del endosulfan así como su principal

metabolito. Asimismo, este método permite realizar la extracción de hasta 12 muestras

a la vez, en lugar de una en el caso de haber seleccionado el método de HS-SPME.

Las hojas de tomate se fortificaron con una formulación comercial de endosulfan a una

concentración de 12 µg/hoja.

Se realizó un ensayo de volatilización preliminar a temperatura ambiente, en el

que se muestreó después de 1 h y a las 18 h (Tabla 11).

Tabla 11. Resultados del ensayo preliminar de volatilización del endosulfan.

Cantidad recuperada (%) a TOTAL (%) b Análisis (horas transcurridas) Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato End-I + End-II

Columna A (1h) 1,8 0,8 nd 1,5

Columna A (18h) 13,1 3,6 nd 10,2

Columna B (18h) nd nd nd nd

Lavado del matraz 1 2,3 nd 1,4

Extracción de hoja 62,1 90 nd 70,4

Parcial isómeros 78 96,6 nd 83,5 a Porcentaje relativo recuperado de cada isómero considerando su proporción [I/II (7:3)]. b Porcentaje recuperado total con respecto a la cantidad aplicada (12 µg/hoja), nd= no detectado.

En cada uno de estos muestreos se retiró la columna correspondiente (columna

A), para la extracción y determinación de endosulfan, y se reemplazó por otra nueva.

Asimismo, con objeto de establecer un balance de masas, se determinó la cantidad de


102

endosulfan en la hoja después de las 18 h y se realizó un lavado del matraz en el que

estuvo la hoja. También se analizó la segunda columna (columna B), acoplada en

serie, con objeto de comprobar que la cantidad total volatilizada de endosulfan fue

retenida en la primera columna.

En estas condiciones se obtuvo una tasa de volatilización cercana al 1% de la

cantidad aplicada por hora durante el ensayo, aunque el la primera hora la tasa fue

algo mayor. No se detectó ningún residuo de endosulfan en la columna B, indicando

que toda la cantidad volatilizada del insecticida se retuvo en la columna A. El balance

de masas de este ensayo mostró que más del 80 % de la cantidad inicial de insecticida

aplicada se recuperó y que la cantidad de endosulfan (I + II) que permaneció en la

hoja fue del 70 %. Asimismo, los resultados indican que el endosulfan-I es el isómero

que más se volatiliza, alcanzando un 85 % de la cantidad total volatilizada, hecho que

ha sido publicado anteriormente por otros autores y que puede ser debido diferentes

motivos. En primer lugar, la presión de vapor del endosulfan-I es aproximadamente el

doble que la del endosulfan-II, traduciéndose en una mayor volatilización del primer

isómero frente al segundo (Hinckley et al., 1990 y Singh, P.P. et al., 1991). Otros

autores sugieren que la volatilización del endosulfan-II, molécula simétrica, provocaría

una asimetría en su molécula, debido al cambio de fase, y se podría transformar en

endosulfan-I, molécula asimétrica, aumentando, por lo tanto, la concentración del

isómero I en el aire (Schmidt, et al., 1997). Por lo tanto, la proporción de endosulfan-II

que permanece en las hojas va aumentando con el tiempo y este isómero se

constituye como el compuesto predominante en las superficies foliares poco tiempo

después del tratamiento con endosulfan.

No se detectaron residuos de endosulfan-sulfato, hecho que confirma que la

cantidad desaparecida, en el intervalo de tiempo muestreado, se debe al proceso de

volatilización y no a una posible degradación del endosulfan.

Debido a que se observó una tasa de desaparición superior en las primeras

horas después de la aplicación, en el ensayo de volatilización en condiciones de

temperatura controlada se realizaron muestreos en los siguientes intervalos de tiempo:

1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 24 h y 48 h. Asimismo, después de 24 h se analizó el contenido de

endosulfan en la segunda columna y se sustituyó por otra nueva que fue analizada al


103

final del ensayo (48 h). Por último se realizó un lavado del matraz con acetato de etilo.

Los resultados de ensayo se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Ensayo de volatilización de endosulfan a 30 ºC a.

Cantidad recuperada (%) b TOTAL (%) c Análisis (horas transcurridas)

Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato End-I + End-II

Columna-A (1h) 2,9 0,4 nd 2,1

Columna-A (2h) 2,9 0,5 nd 2,2

Columna-A (3h) 4,8 0,6 nd 3,5

Columna-A (4h) 4,7 0,7 nd 3,5

Columna-A (24h) 31,0 16,1 nd 26,5

Columna-A (48h) 6,2 9,9 nd 7,3

Columna-B (24h) 0,4 0,5 nd 0,4

Columna-B (48h) 0,4 nd nd 0,2

Lavado matraz 0,3 10,2 nd 3,3

Parcial isómeros 53,6 38,9 nd 49,1

a Los resultados son la media de dos ensayos. nd = no detectado.

b Porcentaje relativo recuperado de cada isómero considerando su proporción [I/II (7:3)]. c Porcentaje recuperado total con respecto a la cantidad aplicada (12 µg/hoja).

En las condiciones del ensayo se obtuvo una tasa de volatilización de endosulfan

cercana al 3 % de la cantidad aplicada por hora durante las 4 primeras horas. Esta

tasa de volatilización se redujo aproximadamente a la mitad en las 20 h siguientes

hasta alcanzar valores cercanos al 0,5 % / h al final del ensayo. Se detectó una

pequeña cantidad de endosulfan en la columna B al ser en este caso la temperatura

del ensayo más elevada. Los resultados mostraron que el isómero I del endosulfan

representa 74 % de la cantidad total de endosulfan volatilizada, mientras que el

isómero II representa el 23 %, fenómeno observado también en el ensayo a

temperatura ambiente. En este ensayo, se obtuvieron tasas de volatilización mayores

que el correspondiente a temperatura ambiente y se encontró que en 48 h de volatilizó

cerca del 50 % del endosulfan aplicado a la hoja.

En la Figura 10 se muestra la volatilización del endosulfan frente al tiempo. Se

obtuvo un buen ajuste a la curva logarítmica propuesta, obteniéndose un coeficiente


104

de determinación r2= 0,973. Se aprecia que en las primeras horas del ensayo es

cuando se produce la mayor volatilización, disminuyendo paulatinamente según

transcurre el tiempo.

3.3. Ensayos de adsorción

3.3.1. Isotermas de adsorción. Determinación de Kd y Kf

En la Figura 11, se representan las isotermas de adsorción obtenidas para el

clorpirifos, en los suelos estudiados.

En general, se observaron dos tendencias. Por una parte, en los suelos 2, 3, 6 y 8

(Figura 11, A) las formas de las isotermas de adsorción se asemejaron a las de las

isotermas de adsorción de tipo S propuestas por Giles, que implican una mayor

adsorción del compuesto cuando la concentración en la fase líquida aumenta. Por otra

parte las isotermas de adsorción de los insecticidas en los suelos 1, 4, 5 y 7 (Figura

11, B) se asemejaron más a una isoterma de tipo L o C. Las isotermas de tipo L

indican que a medida que se van saturando los puntos activos del adsorbente, la

adsorción de nuevas moléculas tiene lugar con mayor dificultad. Las isotermas tipo C

indican una partición constante del soluto entre el adsorbente y la disolución y son

características de la adsorción de compuestos orgánicos hidrofóbicos por la materia

orgánica del suelo.

Figura 10. Volatilización del endosulfan en el ensayo de laboratorio a 30 ºC y durante 48 h.

y = 12,169Ln(x) - 2,6585R2 = 0,9734

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (horas)

% V

olat

iliza

ción


105

Frecuentemente ocurre que las isotermas de adsorción son estrictamente

curvas L, pero están muy cerca de curvas C, por lo que pueden ser estudiadas

mediante descripciones aproximadas (Calvet, 1989). En la Figura 12, se presentan las

isotermas de adsorción correspondientes al endosulfan en los suelos estudiados. Se

observó un comportamiento similar y en los suelos 1, 2, 3, y 6 (Figura 12, A) las

formas de las isotermas de adsorción fueron más parecidas al tipo S, mientras que en

los suelos 4, 5, 7 y 8 se asemejaron al tipo L o C (Figura 12, B).

0,01,0

2,0

3,0

4,0

5,06,0

7,0

8,0

9,0

0,00 0,05 0,10 0,15

C ( µµµµ g/ ml)

Suelo 1 Suelo 2 Suelo 3 Suelo 6

El orden de adsorción del clorpirifos en los suelos estudiados fue el siguiente:

S6 > S8 > S3 > S5 > S7> S1 >S2 >>S4, mientras que el orden de adsorción del

endosulfan fue : S6 > S3 > S5 > S8 > S2 > S4 > S1 > S7. Se aprecia que los dos

Figura 12. Isotermas de adsorción del endosulfan en los suelos estudiados

A

Figura 11. Isotermas de adsorción del clorpirifos en los suelos estudiados

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0,00 0,05 0,10 0,15

Suelo 1 Suelo 4 Suelo 5 suelo 7

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0,00 0,05 0,10 0,15

Suelo 2 Suelo 3 suelo 6 suelo 8x/

m ( µµ µµ

g/g)

C (µµµµg/ml)

B

C (µµµµg/ml)

A

x/m

( µµ µµg/

g)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0,00 0,05 0,10 0,15

C ( µµµµ g/ ml)

Suelo 4 Suelo 5 Suelo 7 Suelo 8

B

x/m

( µµ µµg/

g)

x/m

( µµ µµg/

g)


106

compuestos se adsorbieron más en el suelo 6. No obstante, el uso de isotermas para

la descripción de la adsorción debe ir acompañado de estudios termodinámicos así

como de detalles del mecanismo de adsorción para la obtención de resultados

detallados de este fenómeno.

Ajuste a la isoterma de adsorción lineal. Determinación de Kd

La forma más simple de isoterma es la isoterma de adsorción lineal en la que

ambos parámetros se relacionan por una función lineal:

siendo Kd el coeficiente de adsorción, también llamado coeficiente de distribución, que

es una medida del grado de retención del soluto por el suelo. La isoterma de adsorción

lineal ha sido usada frecuentemente para describir la adsorción de plaguicidas en el

suelo, ya que debido al rango de concentración en el que se encuentran en esta

matriz, existe un buen ajuste de los datos a esta ecuación.

Los resultados obtenidos para el clorpirifos y para el endosulfan se ajustaron a

una isoterma de adsorción lineal. En la Tabla 13 se muestran los parámetros del ajuste

así como los coeficientes de adsorción obtenidos para el clorpirifos.

Tabla 13 . Resultados del ajuste a la isoterma de adsorción lineal. Valores de Kd para el clorpirifos en los suelos estudiados.

Suelo Ecuación r2 Kd (ml/g)

1 y = 87,34x - 0,0396 0,990 87

2 y = 83,11x - 0,4632 0,946 83

3 y = 132,78x - 0,5777 0,946 133

4 y = 40,65x + 0,8651 0,933 41

5 y = 105,31x + 0,1230 0,995 105

6 y = 170,53x - 0,3574 0,993 171

7 y = 98,91x - 0,0271 0,994 99

8 y = 135,91x - 0,5865 0,989 136

x/m = Kd C


107

Se observó un buen ajuste de los datos a este tipo de isoterma. Las Kd

obtenidas, estuvieron comprendidas entre los valores de 41 y 171 ml/g. En la tabla 14,

se presentan los resultados del ajuste y los valores de Kd obtenidos para el

endosulfan. En el caso del endosulfan, también se obtuvo un buen ajuste a la isoterma

ensayada y los valores de Kd fueron más altos que para el clorpirifos, estando

comprendidos entre 86 y 255 ml/g.

Tabla 14 . Resultados del ajuste a la isoterma de adsorción lineal. Valores de Kd para el endosulfan* en los suelos estudiados.

Suelo Ecuación r2 Kd (ml/g)

1 y = 98,56x - 0,5495 0,991 99

2 y = 148,38x - 2,1313 0,986 148

3 y = 238,96x - 1,7988 0,986 239

4 y = 113,68x - 0,5388 0,989 114

5 y = 186,47x - 0,4396 0,999 186

6 y = 254,63x - 1,3219 0,999 255

7 y = 85,71x - 0,0027 0,997 86

8 y = 153,83x - 1,3668 0,999 154

* Para todos los cálculos se consideró la suma de los dos isómeros.

Ajuste a la isoterma de adsorción de Freundlich. Determinación de Kf

De forma general la adsorción no es un proceso lineal, y de las isotermas de

adsorción no lineales propuestas, la más usada es la isoterma de adsorción de

Freundlich, la cual es una relación empírica, que viene representada por la siguiente

expresión:

donde Kf y 1/n son constantes. La isoterma de adsorción lineal es un caso particular

de esta expresión en el que el exponente es igual a la unidad.

Los resultados obtenidos del ensayo de adsorción se ajustaron a la forma lineal

de la ecuación de Freundlich, expresada como Ln x/m = Ln Kf +1/n Ln C, donde 1/n es

x/m = Kf C1/n


108

una constante (pendiente de la recta). En la Tabla 15, se presentan los resultados del

ajuste así como los coeficientes de adsorción de Freundlich obtenidos para el

clorpirifos en los suelos estudiados. Los valores de Kf estuvieron comprendidos entre

44 y 179.

Tabla 15 . Resultados del ajuste a la isoterma de adsorción de Freundlich. Valores de Kf para el clorpirifos en los suelos estudiados.

Suelo Ecuación r2 Kf n

1 y = 0,8905x + 4,0979 0,970 60 1,12

2 y = 1,169x + 4,7594 0,938 117 0,86

3 y = 1,086x + 4,9870 0,981 146 0,92

4 y = 0,8994x + 3,7952 0,935 44 1,11

5 y = 0,9773x + 4,6213 0,995 102 1,02

6 y = 1,0474x + 5,1891 0,986 179 0,95

7 y = 1,1239x + 4,9884 0,987 147 0,89

8 y = 1,1356x + 5,1846 0,994 179 0,88

En la Tabla 16, se recogen los resultados del ajuste a la isoterma de adsorción

de Freundlich para el endosulfan. Los valores obtenidos de Kf variaron desde 111

hasta 1812.

Tabla 16 . Resultados del ajuste a la isoterma de adsorción de Freundlich. Valores de Kf para el endosulfan* en los suelos estudiados.

Suelo Ecuación r2 Kf n

1 y = 1,1709x + 4,9464 0,996 141 0,85

2 y = 1,7773x + 6,9262 0,975 1019 0,56

3 y = 1,6748x + 7,5024 0,979 1812 0,60

4 y = 1,33x + 5,6223 0,977 277 0,75

5 y = 1,1915x + 5,8039 0,998 332 0,84

6 y = 1,5049x + 7,1205 0,990 1237 0,66

7 y = 1,0839x + 4,7051 0,993 111 0,92

8 y = 1,5928x + 6,6389 0,972 764 0,63

* Para todos los cálculos se consideró la suma de los dos isómeros.


109

Se observó una variación entre los valores calculados de Kd y Kf para ambos

insecticidas estudiados, siendo mayores los valores de Kf, especialmente en el caso

del endosulfan. Esta diferencia de valores puede ser explicada en base a que la

ecuación x/m = Kd C no considera la no linealidad del proceso de adsorción. En el

caso del clorpirifos, los valores de n obtenidos en el ajuste a la isoterma de Freunlich

se aproximan más a la unidad que en el caso del endosulfan, por lo que los valores de

ambas constantes son más próximos, especialmente en los suelos 1, 4 y 5. En el caso

del endosulfan, cuando los valores de n se aproximan a la unidad, también se observa

que las constantes Kd y Kf tienen valores más próximos, fenómeno más apreciable en

los suelos 1 y 7.

3.3.2. Determinación del coeficiente Koc

La materia orgánica juega un importante papel en la adsorción de solutos. Se ha

descrito el coeficiente de adsorción referido al contenido de carbono orgánico del suelo

(Koc), que viene definido por la expresión:

y el referido al contenido de materia orgánica del suelo (Kom), expresado como:

donde C.O. y M.O. son los contenidos de carbono orgánico y materia orgánica,

respectivamente (Hamaker y Thompson, 1972)

Teóricamente, estos coeficientes implican que la materia orgánica se comporta

prácticamente de la misma manera independientemente del suelo (Calvet, 1989), por

lo que el valor de Koc de cada compuesto sería prácticamente el mismo para todos los

suelos, resultando así un parámetro útil para comparar la adsorción de diferentes

compuestos. No obstante, las características de la materia orgánica varían de un suelo

a otro, lo que hace que el valor de la Koc varíe (Khan, 1972, Rutherford et al.,1992,

Weber, 1995 y Torrents et al.,1997).

Numerosos trabajos han puesto de manifiesto la correlación existente entre la

adsorción y el contenido de carbono orgánico o de materia orgánica (Payá-Pérez et

Kom = Kd / M.O.

Koc = Kd / C.O.


110

al., 1992 y Pendersen et el., 1995). Para el caso de los compuestos no iónicos e

hidrofóbicos, como es el caso del clorpirifos y en endosulfan, se ha propuesto que la

adsorción en el suelo tiene lugar principalmente en la materia orgánica (Felsot y

Dahm, 1979, y Parkpian et al., 1998). En estos trabajos, los suelos estudiados

presentaros un amplio intervalo en el contenido de materia orgánica, variando desde el

1 al 31 %. El mecanismo de adsorción podría ser, en gran escala, fuerzas de Van der

Waals o uniones hidrofóbicas. El conocimiento del coeficiente Koc es, por lo tanto, útil

para realizar una estimación de la adsorción de estos insecticidas en el suelo.

El la Tabla 17, se presentan los valores obtenidos de los coeficientes Koc para el

clorpirifos y el endosulfan. Se obtuvieron unos valores de Koc para el clorpirifos

comprendidos entre 3872 y 14398, mientras que para el endosulfan variaron entre

5662 y 25911. Estos valores son similares a los encontrados por otros autores

(Wauchope, 1992).

Tabla 17. Coeficientes Koc para el endosulfan y el clorpirifos en los suelos estudiados.

Koc Suelo %C.O.*

Clorpirifos Endosulfan

1 0,72 12139 13698

2 0,74 11194 19985

3 0,92 14398 25911

4 1,05 3872 10829

5 1,11 9456 16743

6 1,25 13611 20323

7 1,51 6534 5662

8 1,54 8842 10008

* Porcentaje de carbono orgánico del suelo.

No se encontró correlación entre la adsorción de los compuestos estudiados y la

materia orgánica, probablemente debido a que el intervalo de materia orgánica de los

suelos ensayados fue muy pequeño (1,2-2,6%) y no se pudo apreciar el efecto. Otros

autores han puesto de manifiesto que cuando el contenido de materia orgánica de un

suelo es bajo, menor de 2,3 %, la correlación entre ésta y la adsorción no es tan

evidente (Calvet et al., 1980). Debido a que el contenido de materia orgánica fue


111

bastante bajo en todos los suelos estudiados, la adsorción podría atribuirse también a

otros factores como el contenido de determinados tipos de arcilla presentes en el

medio. No obstante, sería necesario determinar el tipo de arcilla presente en el suelo,

ya que no todas las arcillas poseen las mismas propiedades de adsorción de

moléculas orgánicas. El fenómeno de adsorción de los plaguicidas por las arcillas en

suelos con bajo contenido en materia orgánica ha sido previamente citado por otros

autores, como es el caso de la adsorción del insecticida diazinon en suelos con un

contenido de materia orgánica < 2% (Arienzo et al., 1994). Este hecho podría explicar

la aparición, en algunos suelos, de isotermas tipo S, que son características de la

adsorción de moléculas orgánicas en las superficies de las arcillas (Calvet, 1989).

4. CONCLUSIONES

Ensayos de degradación

Los resultados obtenidos en estos ensayos, ponen de manifiesto el buen ajuste

de la degradación del clorpirifos, el endosulfan-I y el endosulfan-II, a una cinética de

primer orden. Las vidas medias de los insecticidas calculadas en las condiciones

estudiadas (5-35 ºC y 4-13 % humedad del suelo) variaron entre 25-85 días para el

clorpirifos, entre 19-40 días para el endosulfan-I y entre 89-513 días para el

endosulfan-II, siendo, por lo tanto, este último el compuesto más persistente en las

condiciones ensayadas. Cuando se consideraron el endosulfan-I y el endosulfan-II

conjuntamente se obtuvieron unas vidas medias que variaron entre 46 y 103 días.

Se encontró una clara correlación de la degradación con la temperatura para el

clorpirifos y para el endosulfan-II. Sin embargo, la degradación del endosulfan-I

disminuyó ligeramente en el intervalo de temperatura más alto ensayado. No obstante,

cuando ambos isómeros de endosulfan se consideraron conjuntamente, se obtuvo una

buena correlación con la temperatura, hecho que pone de manifiesto que la baja

correlación entre degradación y temperatura para el endosulfan-I en el intervalo más

alto de temperatura estudiado pudiera deberse a las diferencias en la interconversión

de los isómeros del endosulfan a esas temperaturas.


112

Se encontró una correlación positiva de la degradación del clorpirifos y del

endosulfan-I con la humedad del suelo y no se encontró correlación en el caso del

endosulfan-II. Este hecho podría atribuirse a la mayor estabilidad de este isómero

frente al endosulfan-I. Tampoco se encontró correlación entre estas dos variables

cuando se consideraron los dos isómeros conjuntamente.

La presencia de suelo de la rizosfera no afectó a la degradación de los

insecticidas estudiados, no encontrándose diferencias significativas en las tasas de

degradación. Asimismo, no se encontraron diferencias significativas en la producción

de biomasa en los distintos suelos ensayados.

Ensayos de volatilización

Se obtuvo una tasa de volatilización de endosulfan cercana al 1 % de la cantidad

aplicada, por hora, en el ensayo de volatilización realizado a temperatura ambiente,

mientras que una tasa en torno al 3 % de la cantidad aplicada, por hora, fue medida

durante las primeras horas, en el ensayo a 30 ºC, observándose una disminución de la

volatilización del endosulfan con el tiempo hasta alcanzar valores cercanos al 0,5 %

por hora al final del ensayo (48 h).

Los resultados mostraron que el endosulfan-I contribuye con más de un 70 % al

total volatilizado, lo que indica que este compuesto se volatiliza más y por lo tanto es el

isómero predominante en el aire, mientras que el endsoulfan-II se establece como el

isómero predominante en las hojas poco tiempo después del tratamiento.

La ausencia de endosulfan-sulfato, principal metabolito de la degradación del

endosulfan, confirmó que la desaparición del insecticida, en el tiempo estudiado, se

debió al proceso de volatilización. Asimismo, se estimó que cerca del 50 % de la

cantidad de endosulfan aplicada a la hoja se volatilizó en 48 h.


113

Ensayos de Adsorción

Se han obtenido las isotermas de adsorción del endosulfan y del clorpirifos en

distintos suelos procedentes de parcelas comerciales dedicadas al cultivo del tomate

en la región de Badajoz. Se han encontrado isotermas de tipo S, L y C. Asimismo, se

han determinado los coeficientes de adsorción lineal (Kd) y de adsorción de Freundlich

(Kf) observándose un buen ajuste de los datos a ambas isotermas.

No se ha obtenido correlación entre la adsorción de los insecticidas estudiados y

el contenido de materia orgánica de los suelos. Este hecho puede ser debido al bajo

porcentaje de materia orgánica presente en todos los suelos estudiados, así como al

pequeño intervalo de materia orgánica existente (1,2-2,6 %). La aparición de isotermas

de adsorción tipo S, en algunos suelos, junto con el bajo contenido de materia

orgánica, sugieren que la retención del clorpirifos y del endosulfan en los suelos

estudiados puede deberse a un proceso mixto en el que están implicados tanto los

minerales de la arcilla como la materia orgánica presente.

Se han determinado los coeficientes Koc para los insecticidas estudiados

observándose, en general, una variabilidad moderada, posiblemente debido a la

distinta naturaleza y composición de la materia orgánica en los distintos suelos.

Los distintos coeficientes de adsorción determinados indican que la adsorción de

ambos compuestos en los suelos de las parcelas investigadas es elevada, siendo más

alta la adsorción del endosulfan que la del clorpirifos. Este hecho limitará

apreciablemente la presencia de ambos plaguicidas en la disolución del suelo y su

transporte a otras matrices medioambientales.

III. PERSISTENCIA Y DISTRIBUCIÓN EN CONDICIONES DE CAMPO


114

CAPITULO III. PERSISTENCIA Y DISTRIBUCIÓN EN CONDICIONES DE CAMPO

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Persistencia y distribución de un plaguicida en el medio ambiente

Los plaguicidas pueden contaminar distintas matrices medioambientales, cuando

se encuentran en ellas en cantidades suficientes, por lo que es de gran importancia

conocer los procesos por los que estos fitofármacos llegan a los distintos medios.

Desde el momento en que un plaguicida es aplicado hasta que alcanza su objetivo se

están produciendo pérdidas como consecuencia de distintos fenómenos.

Fundamentalmente dos factores son los causantes de estas pérdidas. En primer lugar,

el proceso de aplicación, en el que la tasa más elevada de pérdida se produce

normalmente en cortos periodos de tiempo después de la aplicación, 5 minutos,

aunque puede prolongarse hasta 1 hora. Las distintas cantidades de producto aplicado

por unidad de área, el método de aplicación y otras variables influyen en la cantidad de

producto perdido. En segundo lugar, el proceso de volatilización. Las pérdidas debidas

a este fenómeno, durante el proceso de aplicación, están gobernadas, principalmente,

por la presión de vapor del plaguicida, el método de aplicación (aplicación foliar o

edáfica), la temperatura, la humedad relativa y la velocidad del viento. Por otra parte,

una vez que el plaguicida alcanza el objetivo también es susceptible de volatilizarse.

Como consecuencia de la aplicación foliar, se produce directamente un depósito

en la planta, e indirectamente otro depósito en el suelo, que son eliminados con mayor

o menor rapidez, en función de factores tales como la tasa de crecimiento del vegetal,

las condiciones ambientales (temperatura, viento, lluvia), las propiedades fisico-

químicas del plaguicida (presión de vapor y solubilidad en agua) y la degradación del

mismo que puede ocurrir en el interior de la planta, en caso de plaguicidas con poder

penetrante, en la superficie de la planta y en el suelo. En estos dos últimos casos,

juega un papel fundamental la radiación solar (fotodegradación) (Mc Call el al.,1983,

Scheunert, 1992-b, Beitz et al., 1994, y Morell y Candela, 1998). En la Figura 1 se

presentan los principales procesos que rigen la dinámica de los plaguicidas en el


115

medio ambiente y que por lo tanto son directamente responsables de su aparición en

las distintas matrices ambientales (agua, suelo, aire y plantas).

Cuando un fitofármaco llega al suelo, tiene lugar su distribución en las tres fases

del mismo, es decir, parte del plaguicida se adsorbe a los coloides del suelo, parte

queda en la solución del suelo y parte queda en la fase gaseosa de este medio (en los

poros). La cantidad de plaguicida que queda en cada una de las tres fases dependerá

de su coeficiente de adsorción (Kd) y de su coeficiente de reparto en la fase gaseosa,

que está determinado por la ley de Henry (KH) (Jury et al., 1987-b).

Cuando el plaguicida está en la disolución del suelo es cuando sufre más

procesos de transformación y transporte y además puede ser absorbido por las

plantas (factor más importante en el caso de los herbicidas).

Figura 1. Procesos implicados en el comportamiento de plaguicidas en el medio ambiente.

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116

Por lo tanto serán de gran importancia aquellos factores que regulen la cantidad

de fitofármaco en la disolución del suelo, y en este sentido se puede decir que el

fenómeno de mayor importancia es la adsorción coloidal.

En un plaguicida disuelto en la disolución del suelo, las moléculas del fitosanitario

tenderán a moverse hacia capas mas profundas, bien sea mediante arrastre por las

aguas de riego o lluvia, o bien por difusión, debido a gradientes de concentración.

Ambos procesos podrían hacer que el plaguicida se incorporase a las aguas

subterráneas con la consiguiente contaminación del acuífero. Este desplazamiento del

fitofármaco a capas inferiores del terreno provocaría además, en el caso de los

herbicidas, que estuvieran fuera del alcance de las raíces de las malas hierbas. A su

vez, el agua de lluvia, o de riego cuando se aplica en exceso, puede provocar el

arrastre del plaguicida en las aguas de escorrentía, que contaminará las aguas

superficiales. Las moléculas fuertemente adsorbidas tendrán limitada su movilidad y,

por lo tanto, poca posibilidad de contaminar los acuíferos por percolación profunda,

aunque, en el caso de fenómenos erosivos, sí que serán arrastradas al estar

completamente unidas a las partículas del suelo (Wauchope, et al, 1992).

Por lo tanto, el término de persistencia de un plaguicida es un término que

engloba todos los procesos por los que se puede producir una disminución de la

concentración de un plaguicida en la matriz o matrices en las que se encuentre. En el

medio ambiente todos los procesos se producen al mismo tiempo, por lo que el estudio

individual de cada proceso se hace más complejo.

El término más frecuentemente utilizado para caracterizar la persistencia de un

plaguicida en la matriz donde se encuentra es el denominado tiempo de vida media,

que se designa por t1/2 y es el tiempo necesario para la disipación de la mitad de la

cantidad de plaguicida inicialmente presente en la matriz.

1.2. Determinación de vidas medias en condiciones de campo

La determinación de las vidas medias de los plaguicidas aplicados a los

diferentes cultivos aporta información esencial tanto desde el punto de vista de su

eficacia como desde el punto de vista de la contaminación de las distintas matrices

medioambientales en las que se encuentran.


117

El cálculo de las vidas medias de los plaguicidas en condiciones de campo está

sujeto a la influencia variable de diferentes factores. En primer lugar es importante

determinar, con la mayor exactitud posible, la cantidad de plaguicida depositada, en la

matriz donde se va a realizar la medida, después de la aplicación. En el caso del suelo

se ha descrito una gran variabilidad en la distribución de los plaguicidas después de la

aplicación, habiéndose encontrado coeficientes de variación de hasta el 66 % (Hance

et al., 1976, Walker, 1978 y Noegrohati y Hammers, 1992). Por otra parte, la

desaparición de los plaguicidas de las superficies foliares inmediatamente después de

la aplicación, debido a la volatilización de los compuestos, puede ser muy rápida

(Willis et al., 1985) por lo que es necesario realizar los muestreos tan rápido como sea

posible para conseguir una medida exacta de la cantidad real de compuesto

interceptada por las plantas.

Otros factores que afectan a la determinación de las vidas medias en el suelo

son la concentración y tasa de aplicación de los plaguicidas, el tipo de suelo, la

adsorción de estos compuestos en el suelo, el pH del suelo, las enmiendas que se

realicen en este medio, la temperatura y humedad, la distribución de los plaguicidas

dentro del suelo y el tipo de formulación aplicada. Por su parte, los factores que

afectan a la determinación de vidas medias en las superficies foliares son la

distribución de los fitofármacos aplicados en esta matriz, el tipo de planta y factores

climáticos tales como la humedad relativa, la lluvia, el viento, la temperatura y la

radiación solar (Willis y Mc Dowell, 1987).

La metodología comúnmente utilizada para el cálculo de vidas medias en

condiciones de campo se basa en la determinación de la cantidad inicial de plaguicida

depositada en la matriz a estudiar después de la aplicación y en la realización de

muestreos a diferentes intervalos de tiempo, a lo largo de los cuales se observa la

desaparición de los compuestos objeto de estudio. Se han descrito cinéticas de

desaparición de diferentes ordenes, siendo la de primer orden frecuentemente

utilizada para la determinación de las vidas medias de los plaguicidas (Hurle y Walker,

1980).


118


2.1. Materiales

2.1.1. Patrones, disolventes y reactivos

Los productos, a partir de los cuales se prepararon los patrones cromatográficos

de clorpirifos, endosulfan-I, endosulfan-II y endosulfan-sulfato, los disolventes y los

reactivos utilizados, fueron los mismos que los descritos en el apartado de materiales y

métodos del Capítulo I.

2.1.2. Suelos

Parcelas de seguimiento

Las principales características fisico-químicas de los suelos de las parcelas de

seguimiento se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Características de los suelos de las parcelas de seguimiento.

Parcela % Arena % Arcilla % Limo % M.O.a pH b

A 73,9 10,1 16,0 1,2 7,9

B 83,4 4,4 12,2 0,8 6,5 a Se midió el carbono total por combustión en un analizador CHN (% M.O. = % C.O. x 1,724). b pH calculado en suspensión suelo:agua (1:2,5).

Parcelas del muestreo amplio

Las principales características fisico-químicas de los suelos de las parcelas

utilizadas en el muestreo amplio se recogen en la Tabla 2.


119

Tabla 2. Características de los suelos del muestreo amplio.

Parcela % Arena % Arcilla % Limo %M.O.a pH b

1 69,1 18,8 12,1 1,3 7,7

2 68,8 11,8 19,4 0,8 6,5

3 55,7 18,1 26,2 1,1 6,8

4 72,8 11,7 15,5 0,6 6,4

5 56,2 22,7 21,2 0,9 7,4

6 41,0 36,7 22,3 1,3 7,0

7 55,2 25,7 19,1 1,3 6,9

8 56,6 34,2 9,2 1,6 6,5

9 71,9 21,2 6,9 0,8 5,7

10 77,7 12,8 9,5 0,7 5,8

11 63,8 26,9 9,3 1,7 6,5

12 83,6 9,0 7,4 0,4 5,0

13 43,8 47,8 8,4 1,4 7,4

14 44,6 43,8 11,6 2,3 8,2

15 59,0 31,3 9,7 1,1 8,2

16 65,0 27,2 7,9 1,2 7,3

17 59,7 31,3 8,9 1,7 8,3

18 71,9 19,2 9,0 1,5 5,5 a Se midió el carbono total por combustión en un analizador CHN (% M.O. = % C.O. x 1,724). b pH calculado en suspensión suelo:agua (1:2,5).

Localización de las parcelas

Todas las parcelas seleccionadas para el estudio pertenecen a la provincia de

Badajoz y son utilizadas para el cultivo del tomate. En la Figura 2, se muestra su

localización sobre un mapa de la zona. Los cuadrados indican la situación de las dos

parcelas donde se realizó el seguimiento de los niveles de endosulfan y clorpirifos, y

los círculos sitúan las 18 parcelas donde se realizó el muestreo amplio.


120

2.2. Aparatos

El material y equipos utilizados para la extracción y determinación de los

plaguicidas en suelo y en el material vegetal están también descritos en el apartado de

materiales y métodos del Capítulo I.

2.3. Métodos

2.3.1. Ensayos de campo

Para el estudio de los niveles de clorpirifos y endosulfan, en el suelo y hojas, a lo

largo del ciclo de cultivo se seleccionaron dos parcelas comerciales (A y B), dedicadas

al cultivo del tomate, en la provincia de Badajoz. Asimismo, para el estudio de los

niveles residuales de estos compuestos al final del ciclo de cultivo, se realizó un

Figura 2. Localización de las parcelas de seguimiento (Cuadrados) y de las parcelas donde se realizó el muestreo amplio (círculos). La situación de los campos es aproximada.


121

muestreo amplio en el que 18 parcelas dedicadas al cultivo del tomate fueron

estudiadas. Todas las parcelas fueron tratadas con Tiagrex-forte, formulación

comercial de endosulfan de aplicación foliar, y con Fostan-48%, formulación de

clorpirifos de aplicación edáfica. Se aplicaron unas dosis que dieron lugar a una

concentración inicial de aproximadamente 0,9 kg/ha de ambos insecticidas. Las

principales características fisico-químicas de los suelos de todas las parcelas

estudiadas se presentan en las Tablas 1 y 2.

Muestreo de suelo

Las parcelas fueron periódicamente muestreadas desde el comienzo de la

campaña agrícola del año 2000, en el mes de Mayo, hasta las cosecha del tomate,

durante los meses de Septiembre y Octubre. El muestreo se realizó siguiendo la

diagonal de la parcela y sin muestrear los bordes. Se recogieron 2 submuestras (10

cm de profundidad) en cada punto de muestreo, una a cada lado de la línea de

plantas, y se homogeneizaron en una bolsa constituyendo la muestra definitiva.

Muestreos de hojas

Se tomaron 10 puntos de muestreo y dos foliolos de hojas de tomate en cada

uno de ellos. Las hojas se recogieron a distintas alturas de la planta para estudiar la

variación de los niveles después de la aplicación. Igualmente se dejaron los bordes de

las parcelas sin muestrear y se siguió la diagonal de la parcela durante la toma de

muestras. Las parcelas fueron periodicamente muestreadas durante las campañas

agrícolas del año 2000 y 2001.

2.3.2. Extracción y determinación de los insecticidas

Para la extracción de los insecticidas del suelo y del material vegetal se utilizaron

los métodos descritos en los apartados 2.3.1.2. y 2.3.4.2. de materiales y métodos del

Capítulo I, respectivamente. Asimismo, la determinación de estos compuestos en


122

ambas matrices se llevó a cabo utilizando los sistemas cromatográficos descritos en

los apartados 2.3.1.3. y 2.3.4.3. de materiales y métodos del mismo Capítulo.


3.1. Estudio de los insecticidas en el suelo

3.1.1. Niveles en el suelo durante el ciclo de cultivo

Según los datos aportados por las cooperativas de la región, se realizó una sola

aplicación (edáfica) de clorpirifos en ambas parcelas, antes de proceder al transplante

del tomate, y tres aplicaciones de endosulfan, una vez realizado el transplante, hasta

el momento de la recolección. Se consideró como el inicio del ciclo de cultivo la fecha

en la que se realizó el primer tratamiento de insecticida, por lo que todos los tiempos

presentados en las gráficas están referidos a este momento.

Los resultados del estudio de los niveles de clorpirifos en el suelo en las dos

parcelas de seguimiento a lo largo del ciclo de cultivo en la campaña agrícola del año

2000 se muestran en la Figura 3. Según se aprecia, existe una diferencia entre las

concentraciones iniciales de clorpirifos en los campos A y B. Este hecho es debido a

que la aplicación de insecticida se realizó en fechas distintas en ambas parcelas, con 5

días de diferencia, y el muestreo de las dos parcelas se realizó en el mismo día. Por

consiguiente, el muestreo en la parcela A se realizó 6 días después de la

correspondiente aplicación mientras que el muestreo de la parcela B se realizó 1 día

después de la aplicación. La cantidad de clorpirifos encontrada en la parcela B en esas

condiciones fue de 0,15 µg/g frente a una concentración de 0,03 µg/g encontrada en la

parcela A. Asimismo, se estimó la concentración de clorpirifos en la parcela A que se

hubiera encontrado un día después de la aplicación y se obtuvo un valor de 0,14 µg/g.

El fenómeno observado pone de manifiesto la rápida disipación del insecticida durante

los primeros días después de la aplicación.


123

En la Figura 4, se presenta la evolución de la concentración de endosulfan-I

durante el ciclo de cultivo. Según los datos aportados, se realizaron tres aplicaciones

de endosulfan durante la campaña agrícola. En este caso, tampoco coincidieron las

fechas de las aplicaciones en los dos campos estudiados. Los dos primeros puntos en

la gráfica, que cubren un intervalo de aproximadamente 20 días después del inicio del

ciclo de cultivo, corresponden a los muestreos realizados antes de la aplicación de

endosulfan, por lo que no se detectaron residuos de este compuesto. Desde este

momento y hasta los 70-75 días, se observa una fase en la que la concentración del

insecticida aumenta hasta alcanzar los valores de 0,07 µg/g en la parcela A y de 0,03

µg/g en la parcela B. Esta diferencia observada en los valores de concentración,

correspondientes al último muestreo, puede ser explicada en base a que el muestreo

efectuado en el campo A se realizó a las 24 h, aproximadamente, de la aplicación,

mientras que la aplicación en el campo B se efectuó cuatro días antes del muestreo,

poniéndose de manifiesto nuevamente el fenómeno de desaparición del compuesto

descrito anteriormente para el clorpirifos. En esta fase están reflejadas las tres

aplicaciones que se realizaron del insecticida. Finalmente se observa una disminución

de la concentración del insecticida, que se prolonga hasta después de la cosecha. Los

valores observados en esta etapa oscilaron desde los 0,02 µg/g encontrados en la

parcela A hasta los 0,01 µg/g medidos en la parcela B.

Figura 3. Niveles de clorpirifos encontrados a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g) A B


124

En la Figura 5, se representan la variación de la concentración de endosulfan-II a

lo largo del ciclo de cultivo. Como se aprecia en la gráfica, la evolución es similar a la

del endosulfan-I. En este caso, se detectaron residuos de este isómero en la parcela

A, con valores de concentración del orden del límite de detección (LD) del método

analítico empleado (0,01 µg/g), durante los primeros 20 días del ciclo. Estos valores se

deben a concentraciones residuales de la campaña anterior, ya que el isómero II del

endosulfan es el más persistente. En la parcela B no se apreciaron niveles de

endosulfan-II por encima del LD hasta, aproximadamente, 20 días después del

comienzo del ciclo de cultivo.

Figura 4. Niveles de endosulfan-I encontrados en el suelo a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0 20 40 60 80 100 120Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

A B

Figura 5. Niveles de endosulfan-II encontrados en el suelo a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0 20 40 60 80 100 120Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g) A B


125

Las concentraciones de endosulfan-II más altas encontradas variaron entre 0,15

µg/g en la parcela A y 0,04 µg/g en la parcela B. Nuevamente se encontraron valores

más altos del isómero estudiado en la parcela A. En la fase final, los valores de

concentración descendieron hasta los 0,06 µg/g encontrados en la parcela A y los 0,02

µg/g encontrados en la parcela B.

En la Figura 6, se muestra la variación de la concentración del endosulfan-sulfato

con el tiempo. Este compuesto es el principal producto de degradación del endosulfan

(Martens, 1977, Antonious y Byers, 1997 y Leung et al., 1998). Se aprecia que en las

dos parcelas existen niveles residuales de la campaña anterior, que aparecen en los

20 primeros días del ciclo de cultivo. Las concentraciones de endosulfan-sulfato a lo

largo del ciclo variaron menos que en el caso de los demás insecticidas estudiados,

encontrándose valores comprendidos entre 0,03 y 0,04 µg/g en la parcela A, y

concentraciones del orden de 0,01 µg/g en la parcela B.

En la Figura 7, se muestra la evolución de los niveles de endosulfan-I,

endosulfan-II, endosulfan-sulfato y del total (considerado como la suma de los tres

compuestos anteriores) en las parcelas estudiadas. En las gráficas se aprecian

menores niveles de los compuestos estudiados, a lo largo de la campaña agrícola, en

la parcela B. Este hecho podría deberse a las diferencias en las fechas de aplicación

con respecto a los muestreos, como ya se ha indicado, a las diferentes prácticas

agrícolas aplicadas en cada parcela, así como a otros factores tales como el tipo de

Figura 6. Niveles de endosulfan-sulfato encontrados en el suelo a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0 20 40 60 80 100 120Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g) A B


126

riego (por goteo en la parcela A y por gravedad en la B) y la distinta localización de

ambos campos dentro de la provincia de Badajoz.

3.1.2. Determinación de las vidas medias

En la Tabla 3 se presentan las constantes de degradación y las vidas medias en

condiciones de campo del clorpirifos en las dos parcelas estudiadas.

Tabla 3. Vidas medias del clorpirifos en condiciones de campo.

Clorpirifos Parcela

K ± SD (días-1) t 1/2 (días) r2

A 0,0406 ± 0,0106 17 0,831

B 0,0498 ± 0,0146 14 0,854

Las constantes de degradación y los coeficientes de determinación, en cada

caso, fueron calculados por análisis de regresión lineal del Ln C frente al tiempo,

utilizando la ecuación [2] descrita en el apartado 3.1.1. de resultados y discusión del

Capítulo II y las vidas medias fueron calculadas por medio de la ecuación [3] descrita

en el mismo aparatado.

Se realizaron 5 muestreos de cada parcela a lo largo del ciclo de cultivo y en cada

uno de ellos se recogieron 10 muestras. La concentración utilizada en cada muestreo

para el cálculo de los parámetros anteriormente descritos, es la media del análisis de

Figura 7. Evolución de la concentración del endosulfan-I, endosulfan-II ,endosulfan-sulfato y de la total (suma de los tres compuestos) en los suelos de las parcelas A y B.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

6 22 51 75 121

Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

End-I End-II End-sulfato Total

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

1 16 45 71 115Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

End-I End-II End-sulfato Total

A B


127

esas 10 muestras en cada parcela. Los valores de vidas medias calculados para el

clorpirifos, en las condiciones descritas anteriormente, variaron entre 14 y 17 días.

Estos valores están de acuerdo con los citados por otros autores (Racke et al., 1992

Racke, 1993, Racke el at., 1996).

En la Tabla 4 se recogen las vidas medias obtenidas para los dos isómeros del

endosulfan y para la suma de éstos. Los muestreos se realizaron como se ha descrito

anteriormente para el clorpirifos, pero debido a que se realizaron 3 aplicaciones del

insecticida durante el ciclo de cultivo, las vidas medias se calcularon utilizando

únicamente los muestreos que tuvieron lugar después de la última aplicación, donde

se pudo apreciar una disminución paulatina de la concentración de los isómeros con

respecto al tiempo.

Tabla 4. Vidas medias del endosulfan en el suelo en condiciones de campo.

t 1/2 (días) Parcela

Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-I+II

A 22 32 28

B 22 73 40

Los valores de vidas medias obtenidos para el endosulfan-I, fueron de 22 días en

ambas parcelas, mientras que para el endosulfan-II fueron de 32 y 73 días. Por otra

parte, se calcularon las vidas medias de la suma de isómeros y los valores fueron de

28 y 40 días. Estas vidas medias constituyen una aproximación, debido a la

complejidad del cálculo en las condiciones descritas. No obstante, los valores aquí

presentados están en el rango de valores de campo citados por otros autores para

estos compuestos (Wauchope et al., 1992, Kathpal et al., 1997). Las investigaciones

de algunos autores sugieren que la disipación del endosulfan desde el suelo y desde

algunos frutos, ocurre en dos fases reguladas por cinéticas de primer orden,

produciéndose una mayor perdida de producto en la primera y una disipación más

lenta en la segunda fase (Kathpal et al. 1997 y Antonious et al., 1998).

Se observa que el endosulfan-II es el isómero más persistente en el suelo. Este

hecho ha sido encontrado por otros investigadores y ha sido atribuido a diferentes


128

causas, como a la simetría de la molécula del endosulfan-II, que se traduce en una

mayor estabilidad y por lo tanto el proceso de degradación se ve dificultado (Stewart y

Cairns, 1974 y Shalini-Singh et al., 1999). También se ha atribuido a una mayor

adsorción en el suelo del endosulfan-II frente al endosulfan-I, fenómeno que dificultaría

las posibles reacciones de degradación de la molécula (Beyers et al., 1965). La

estructura y simetría de los isómeros del endosulfan han sido revisadas en

condiciones de laboratorio confirmando que la molécula de endosulfan-I es asimétrica

mientras que la molécula de endosulfan-II es simétrica y por lo tanto más estable

frente a procesos que impliquen un cambio en su estructura (Schmidt et al., 1997).

Asimismo, se ha descrito un fenómeno de interconversión entre los dos isómeros del

endosulfan y entre éstos y el endosulfan-sulfato en el suelo en condiciones de campo

(Mukherjee y Gopal, 1994) y en cultivos de microorganismos, obtenidos del suelo, en

laboratorio (Milles y Moy, 1979).

La diferencia de vida media observada para el endosulfan-II entre las dos

parcelas estudiadas, pudiera ser debido a una diferencia en la tasa de interconversión

entre los isómeros del endosulfan, así como a las diferentes prácticas agrícolas

aplicadas en cada parcela.

La temperatura atmosférica ha sido citada como un factor determinante que

influye en la degradación de muchos plaguicidas en el suelo y controla la

concentración en el aire de los plaguicidas en una determina región (Hermanson y

Hites, 1989, Manchester-Neesvig y Andersen, 1989 y Burgoyne y Hites, 1993). En la

Figura 8 se recogen los datos, de temperatura media y precipitación total mensual

entre Mayo y Septiembre, de diferentes estaciones meteorológicas situadas en el área

donde se encontraban las parcelas de estudio. Los valores de temperatura media

mensual oscilaron entre 19 y 27 ºC aunque se registraron valores máximos por encima

de los 40 ºC entre los meses de Junio y Agosto en las tres estaciones y en casi todos

los años del intervalo estudiado. Asimismo, la precipitación fue bastante baja en los

meses estudiados, registrándose los valores más pequeños en los meses de Julio y

Agosto.

De las condiciones de humedad y temperatura ensayadas en los experimentos

de laboratorio, las más semejantes a las condiciones de campo corresponden a los


129

Tratamientos 3, 4 y 5, en los que se ensayaron unas temperaturas de 25 y 35 ºC, y

humedades del suelo del 4 y el 8 % (Figura 1 del Capítulo II).

En la Tabla 5 se presentan una comparación de las vidas medias obtenidas en

condiciones de campo y las obtenidas en los ensayos de laboratorio.

Tabla 5. Vidas medias en condiciones de campo y en laboratorio.

t1/2 (días) Compuesto

Laboratorio * Campo

Clorpirifos 25-28 14-17 Endosulfan-I 20-27 22 Endosulfan-II 89-121 32-73 Endosulfan-I + -II 46-56 28-40

* Vidas medias calculadas a 25 y 35 ºC y 4 y 8% de humedad del suelo.

Las vidas medias obtenidas para el clorpirifos, el endosulfan-I y el endosulfan-II y

para la suma de isómeros en condiciones de campo, fueron menores que las

obtenidas en los correspondientes ensayos de laboratorio. Este hecho puede ser

explicado por la influencia de diferentes procesos que tienen lugar en condiciones

reales pero no se producen en las condiciones controladas de los ensayos de

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

Mayo Junio Julio Agosto Septiembre

Pre

cipi

taci

ón (m

m)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

Tem

pera

tura

(ºC

)

Precipitación Temperatura

Figura 8. Valores de temperatura media y precipitación total mensual durante los meses del ciclo de cultivo. Los valores son las media de los registros recogidos por tres estaciones meteorológicas situadas en la zona donde se realizó el estudio y durante el periodo 1990-2000.


130

laboratorio. Tales procesos como la volatilización, la fotodegradación y el transporte,

junto con las diferentes condiciones climatológicas de la zona (viento, ciclos de

temperatura, lluvias, etc.) pueden aumentar la desaparición del suelo de los residuos

de los insecticidas estudiados. Por otra parte, los ensayos de degradación en

laboratorio se realizaron con suelos distintos a los de las parcelas de Badajoz,

presentando características fisico-químicas diferentes, por lo que diferencias en

procesos como la adsorción coloidal de los insecticidas en los suelos estudiados

pudieron influir también en la diferencia encontrada en las vidas medias. No obstante,

teniendo en cuenta las diferencias indicadas, los valores obtenidos en el laboratorio

son indicativos de la vida media esperada para un determinado compuesto y permiten

a su vez el estudio de la influencia de los factores que la afectan.

3.1.3. Niveles residuales en la provincia de Badajoz después del ciclo de cultivo

En la Tabla 6 se presentan los niveles residuales encontrados, de los insecticidas

estudiados, dos meses después de la cosecha del tomate.

Se puede apreciar que no se encontraron niveles detectables de clorpirifos en

ninguna de las parcelas muestreadas. Por otra parte, aparecieron residuos de

endosulfan-I en 5 de las parcelas estudiadas. Las concentraciones medidas de este

isómero estuvieron comprendidas entre 0,03 y 0,01 µg/g. El endosulfan-II fue

detectado en 17 de las 18 parcelas analizadas mostrando unos niveles comprendidos

entre 0,18 y 0,01 µg/g y el endosulfan-sulfato apareció en todas las parcelas a unos

niveles entre 0,14 y 0,01 µg/g.


131

Tabla 6. Niveles residuales de los insecticidas después del ciclo de cultivo (µg/g) *.

Parcelas Clorpirifos Endosulfan-I Endosulfan-II Endosulfan-sulfato 1 nd nd 0,028 ± 0,009 0,019 ± 0,009 2 nd nd 0,024 ± 0,006 0,018 ± 0,003 3 nd nd 0,014 ± 0,005 0,020 ± 0,011 4 nd nd nd 0,010 ± 0,006 5 nd nd 0,028 ± 0,018 0,056 ± 0,003 6 nd nd 0,032 ± 0,023 0,033 ± 0,016 7 nd 0,016 ± 0,002 0,130 ± 0,042 0,124 ± 0,027 8 nd nd 0,022 ± 0,006 0,015 ± 0,005 9 nd 0,032 ± 0,020 0,140 ± 0,109 0,052 ± 0,029

10 nd nd 0,037 ± 0,009 0,042 ± 0,017 11 nd 0,018 ± 0,013 0,138 ± 0,094 0,113 ± 0,080 12 nd nd 0,056 ± 0,023 0,044 ± 0,027 13 nd 0,017 ± 0,007 0,178 ± 0,064 0,135 ± 0,053 14 nd nd 0,073 ± 0,046 0,065 ± 0,027 15 nd nd 0,053 ± 0,042 0,085 ± 0,038 16 nd 0,011 ± 0,005 0,119 ± 0,054 0,129 ± 0,059 17 nd nd 0,019 ± 0,017 0,029 ± 0,025 18 nd nd 0,050 ± 0,016 0,080 ± 0,041

* Los resultados son la media de 5 muestras tomadas en cada parcela ± la desviación estándar. nd = por debajo del límite de detección (0,01 µg/g).

3.2. Estudio de los insecticidas en las hojas

3.2.1. Niveles durante el ciclo de cultivo

El estudio de los niveles de endosulfan en hoja durante el ciclo de cultivo se

realizó en la campaña agrícola del año 2001. Según los datos proporcionados por las

cooperativas de la comarca, se realizó una sola aplicación de endosulfan como

Tiagrex-forte durante la campaña, en fechas distintas en las parcelas A y B.

En la Figura 9, se muestra la variación de la concentración de endosulfan-I en las

hojas de las dos parcelas estudiadas. Los muestreos en ambas parcelas se realizaron

en días distintos, el primer muestreo en la parcela A se realizó 1 día después de la

aplicación, mientras que en la parcela B tuvo lugar a los 2 días aproximadamente.


132

Las concentraciones de endosulfan-I encontradas en las hojas, en estas

condiciones, fueron de 19,92 µg/g en la parcela A y de 17,49 µg/g en la parcela B.

Según se aprecia en la Figura 9, se produce una disminución de las concentraciones

del insecticida, al avanzar en ciclo de cultivo, en ambas parcelas hasta alcanzar los

valores de 0,31 y 0,28 µg/g en los campos A y B, respectivamente.

En la Figura 10, se presentan las concentraciones de endosulfan-II encontradas

en las hojas. De igual manera se observa la disminución de las concentraciones

encontradas de este insecticida a lo largo del tiempo. Los valores de concentración

medidos fueron, en general, más altos en la parcela B donde estuvieron comprendidos

entre 18,78 µg/g y 0,86 µg/g. En la parcela A, las concentraciones de endosulfan-II en

hoja variaron desde 12,56 µg/g hasta 1,74 µg/g.

Figura 9. Niveles de endosulfan-I encontrados en las hojas a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 5 10 15 20 25

Tiempo tras la aplicación (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

A B

Figura 10. Niveles de endosulfan-II encontrados en las hojas a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 5 10 15 20 25

Tiempo tras la aplicación (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

A B


133

En la Figura 11, se presentan las concentraciones de endosulfan-sulfato

encontradas en las hojas. Se aprecia que los niveles encontrados en las dos parcelas

estudiadas son similares. Las concentraciones de endosulfan-sulfato en las hojas

variaron entre 2,75 µg/g y 1,00 µg/g en el campo A y entre 3,18 µg/g y 0,61 µg/g en el

campo B.

En la Figura 12 se representan las concentraciones en las hojas de endosulfan-I,

endosulfan-II, endosulfan-sulfato y endosulfan total (suma de los tres anteriores) en las

parcelas A y B, respectivamente.

Figura 12. Evolución del endosulfan-I, endosulfan-II , endosulfan-sulfato y del total (suma de los tres compuestos) en las hojas de las parcelas A y B.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

1 8 23

Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

End-I End-II End-sulf Total

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

2 18 24

Tiempo (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g)

End-I End-II End-sulf Total

A B

Figura 11. Niveles de endosulfan-sulfato encontrados en las hojas a lo largo del ciclo de cultivo del tomate en las parcelas A y B.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 5 10 15 20 25Tiempo tras la aplicación (días)

Co

nce

ntr

ació

n (

µµ µµg

/g) A B


134

Se observa que la concentración relativa de los isómeros va cambiando con el

tiempo. En parcela A, donde el muestreo se realizó un día después de la aplicación,

predomina el endosulfan-I, frente al endosulfan-II, y en el siguiente muestreo, a los 8

días, predomina el endosulfan-II. En la parcela B, el primer muestreo tuvo lugar a los 2

días y se aprecia que el isómero predominante en estas condiciones es el endosulfan-

II. En el último muestreo, 23-24 días después de la aplicación, se aprecia que los

compuestos predominantes, en ambas parcelas, son el endosulfan-II y el endosulfan-

sulfato, aunque ya en concentraciones muy bajas. No obstante, la tasa de conversión

entre los isómeros y entre cada uno de los isómeros y el endosulfan-sulfato, así como

las condiciones concretas de cada parcela, han de tenerse en cuenta a la hora de

estimar la predominancia de cada uno de los compuestos a lo largo del ciclo de cultivo.

Por otra parte, teniendo en cuenta que el endosulfan-sulfato es el principal

metabolito de la degradación del endosulfan, es razonable suponer que existe otra vía

de desaparición de endosulfan en el medio ambiente distinta a la degradación, ya que

los isómeros I y II del endosulfan desaparecen a tasas muy superiores de las que

aparece el endosulfan-sulfato. Considerando la suma de los dos isómeros, se encontró

que en el segundo muestreo había desaparecido entre un 66 y un 84 % de la cantidad

medida en el primer muestreo, es decir entre 21,3 y 30,5 µg/g de endosulfan (I + II)

mientras que la cantidad de endosulfan-sulfato encontrada en el segundo muestreo

estuvo comprendida entre 2,4 y 2,7 µg/g. Asimismo, los resultados de los ensayos de

volatilización en condiciones controladas en laboratorio pusieron de manifiesto que en

48 h se volatilizó aproximadamente el 50 % del endosulfan aplicado a la hoja, por lo

que la volatilización se constituye como el proceso mayoritario por el que se produce la

desaparición del endosulfan de las superficies foliares después de su aplicación.

3.2.2. Determinación de las vidas medias

En la Tabla 7 se recogen las vidas medias en las hojas de los insecticidas

estudiados. Las vidas medias obtenidas son bastante similares en ambos campos,

variando entre 4 y 8 días en la parcela A y entre 4 y 5 días en la parcela B. El

endosulfan-II es nuevamente el isómero más persistente. Los resultados obtenidos


135

son similares a los citados por otros autores (McNeil y Hikichi, 1976, Magalhaes et al.,

1989, Mukherjee et al., 1992, Gopal y Mukherjee, 1993 y Tanwar y Handa, 1998). No

obstante, otros investigadores han encontrado vidas medias en las hojas de otros

cultivos más bajas para los isómeros del endosulfan cuando las plantas fueron

tratadas independientemente con cada uno de los isómeros y en un clima sub-tropical

(Singh P.P. et al., 1991) o cuando se aplicaron dosis más pequeñas (0,5 kg/ha) y la

temperatura ambiental fue elevada (Sukul y Handa, 1984), habiéndose citado valores

para el endosulfan-I comprendidos entre 1 y 2 días y para el endosulfan-II de 3 días. El

fenómeno de ínterconversión y de oxidación de cada uno de los isómeros al

endosulfan-sulfato ha sido igualmente descrito en hojas, habiéndose observado que

tanto el endosulfan-I como el endosulfan-II se transforman en endosulfan-sulfato,

siendo la conversión del endosulfan-I al sulfato la que se da más fácilmente. La

interconversión entre los isómeros se da en menor escala (Chopra y Mahfouz, 1977 y

Singh, P.P. et al., 1991).

Tabla 7. Vidas medias de los compuestos estudiados en hoja.

Parcela A

Compuestos K ± SD (días-1) t 1/2 (días) r2

Endosulfan-I 0,1849 ± 0,0237 4 0,984

Endosulfan-II 0,0915 ± 0,0082 8 0,992

End-I + End-II 0,1236 ± 0,0095 6 0,994

Parcela B

Isómeros K ± SD (días-1) t 1/2 (días) r2

Endosulfan-I 0,1782 ± 0,0360 4 0,961

Endosulfan-II 0,1313 ± 0,0329 5 0,941

End-I + End-II 0,1484 ± 0,0327 5 0,954

Estas vidas medias son algo mayores que las obtenidas en el ensayo de

volatilización en condiciones de laboratorio (3 días) (Capítulo II). Este hecho puede ser

debido a que a pesar de la actuación de los procesos que tienen lugar sólo en

condiciones de campo, las diferencias de temperatura entre los periodos nocturno y

diurno, que fueron de más de 10 ºC, influyeron en estos resultados. Asimismo, la


136

fotodegradación no tiene lugar durante la noche. En la Tabla 7 se aprecia que las

vidas medias menores corresponden al endosulfan-I, hecho que está de acuerdo con

los resultados obtenidos en los ensayos de volatilización realizados en condiciones de

laboratorio, donde se pone de manifiesto que de la cantidad total volatilizada, más del

70 % corresponde al endosulfan-I por lo que este isómero persiste menos en las hojas

que el endosulfan-II y pasa a ser el isómero predominantemente volatilizado. Este

hecho, además, ha sido citado anteriormente por otros autores (Burgoyne y Hites,

1993 y Bidleman et al., 1992). Por lo tanto, se confirma que el mecanismo principal de

desaparición del endosulfan de las superficies foliares es la volatilización.

3.3. Distribución del endosulfan

En la estimación de la distribución del endosulfan después de su aplicación al

cultivo del tomate, se hicieron varias consideraciones basadas en los datos

proporcionados por las cooperativas y en conteos realizados en campo. Se consideró

que el número de plantas por hectárea era de 3x104 y que el número de foliolos por

planta madura era de 400, por lo que el número de foliolos por hectárea utilizado en el

cálculo fue 12x106. A partir de estos datos y de las concentraciones de endosulfan

determinadas en el suelo y en las hojas tras su aplicación se estimó la distribución del

insecticida.

Los resultados de la estimación de la distribución del insecticida endosulfan

después de su aplicación al cultivo del tomate se recogen en la Figura 13. Las

concentraciones de endosulfan encontradas en el suelo y en las hojas después de la

aplicación del insecticida pusieron de manifiesto que en la parcela A el 42% de la

cantidad aplicada se depositó en la parte aérea de la planta y el 22% en el suelo. Los

resultados de la parcela B fueron similares, encontrándose el 51% de la cantidad

aplicada en las hojas y el 13% en suelo. Análisis adicionales de endosulfan en hoja en

la parcela A, un día después de la aplicación, durante la siguiente campaña revelaron

que el 45% de la cantidad aplicada se depositó en las hojas, confirmándose así los

resultados anteriores.

Los resultados obtenidos están de acuerdo con los citados por otros autores

referentes a la intercepción por las plantas diana de los plaguicidas aplicados, en los


137

que se recogen valores de intercepción comprendidos entre el 45 y el 62 % de la

cantidad aplicada. No obstante, estos autores mantienen que la cantidad de plaguicida

interceptado por la planta después de la aplicación presenta una gran variabilidad que

depende de las condiciones meteorológicas, del tamaño de las gotas en la aplicación y

del tipo de aplicación, entre otros factores (Willis y McDowell, 1987).

Los resultados obtenidos en ambos campos indicaron que aproximadamente el

64% de la cantidad total aplicada de endosulfan se depositó en las hojas y en el suelo,

por lo tanto, alrededor del 35% de la dosis aplicada se perdió durante el proceso de

aplicación.

Figura 13. Distribución del endosulfan en el cultivo del tomate. Los números entre paréntesis son el porcentaje respecto al total aplicado.

0.9 kg endosulfan/ha

42-51% del aplicado

13-22% del aplicado

Parcela Total aplicado

(kg End/ha)kg End/ha

(Planta )kg End/ha

(Suelo )

A 0,9 0,4 (42%) 0,2 (22%)

B 0,9 0,5 (51%) 0,1 (13%)


138

Estos resultados, junto con los valores obtenidos en el apartado anterior ponen

de manifiesto que las emisiones de endosulfan a la atmósfera, tanto durante la

aplicación del insecticida como en la volatilización posterior, pueden ser importantes,

lo que constituye un hecho a tener en cuenta debido a sus implicaciones de posible

contaminación del medio ambiente y de los cultivos del entorno.

3.4. Predicción de la distribución y persistencia del endosulfan (hoja de cálculo)

Se ha desarrollado una hoja de cálculo que permite hacer una predicción de la

distribución y persistencia ambiental del endosulfan en el cultivo del tomate en las

parcelas de la región de Badajoz. Las estimaciones de esta hoja de cálculo están

basadas en los resultados, expuestos a lo largo de este trabajo, obtenidos en los

diferentes ensayos realizados con el endosulfan, tanto en el campo como en el

laboratorio. La hoja de cálculo se presenta de una forma sencilla, como se puede ver

en la Figura 14.

Figura 14. Hoja de calculo desarrollada para la estimación de la distribución y la persistencia del endosulfan en el cultivo del tomate en la región de Badajoz.

t 1/2 (días) kg/ha

t 1/2 (días) kg/ha

Deposición en el suelo Persistencia en suelo

kg /ha de endosulfan

Cantidad de endosulfan aplicada (kg/ha)

Intercepción por las hojas Persistencia en hojas


Pérdida durante la aplicaciónCantidad emitida a la atmosfera


kg de endosulfan por parcela

PREDICCIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN Y PERSISTENCIA DEL ENDOSULFAN EN EL CULTIVO DEL TOMATE

Cantidad Formulación aplicada (kg/ha)

ha de la parcela T media diaria (ºC)

Riqueza de la formulación (% endosulfan)


139

En las casillas amarillas se introducen las variables que se han tenido en cuenta

(cantidad y riqueza de la formulación aplicada de endosulfan, número de hectáreas

que tiene la parcela de estudio y la temperatura media diaria) y en las casillas azules

se generan los valores correspondientes a la distribución del endosulfan después de la

aplicación (cantidad perdida durante el proceso de aplicación, cantidad interceptada

por las hojas y cantidad depositada en el suelo), los correspondientes a la persistencia

(persistencia en hojas y persistencia en suelo) y la cantidad de endosulfan emitida a la

atmósfera desde esa parcela. Asimismo, en las dos casillas rosas se generan las vidas

medias del endosulfan en el suelo y en las hojas en función de la temperatura media

diaria.

A continuación se explican los fundamentos supuestos para la obtención de los

diferentes resultados proporcionados por la hoja de calculo:

Distribución del endosulfan

Las estimaciones de la distribución del endosulfan en los distintos

compartimentos ambientales están basadas en los resultados presentados en la

Figura 13.

Vidas medias

El cálculo de las vidas medias en el suelo está basado en la dependencia de la

degradación del endosulfan con la temperatura, ya que ha sido demostrado que es el

factor que más influye en este proceso en las condiciones estudiadas. Se ha utilizado

la ecuación [5] (apartado de resultados del Capitulo II), que relaciona el tiempo de vida

media con la temperatura, para el cálculo de la vida media del endosulfan en el suelo

en condiciones de campo. Teniendo en cuenta que esta ecuación ha sido obtenida en

condiciones de laboratorio y que las vidas medias obtenidas en condiciones de campo

para el endosulfan en la región de Badajoz fueron menores que las obtenidas en

condiciones de laboratorio (Tabla 5 de resultados de este Capítulo) debido a la

actuación de diferentes procesos, como ha sido explicado anteriormente, se estimó

que se produjo una disminución del 25 % en la vida media del endosulfan en


140

condiciones de campo con respecto a la calculada en el laboratorio y se aplicó este

factor en la hoja de calculo.

La estimación de las vidas medias en las hojas se realizó en base a los ensayos

de volatilización en condiciones de laboratorio y a los valores de vidas medias

obtenidos en condiciones de campo. En primer lugar, se utilizó la ecuación obtenida en

el ensayo de volatilización a 30 ºC (Figura 10, del apartado de resultados del Capítulo

II), para estimar las vidas media en esas condiciones. En segundo lugar, se

compararon esas vidas medias con las obtenidas en condiciones de campo. En este

caso, las vidas medias de campo fueron algo mayores que las calculadas en

condiciones de laboratorio, probablemente debido a que en condiciones de campo,

existen ciclos de temperatura, pudiendo existir una diferencia de hasta 10 ºC entre el

día y la noche, ralentizandose por lo tanto la degradación. Además, otros procesos

como la fotodegradación, de gran importancia en la desaparición de plaguicidas de las

superficies foliares, no tiene lugar durante los periodos nocturnos. De esta manera se

estimó que el aumento de un grado de temperatura (temperatura media diaria)

implicaría una disminución de la vida media de 0,4 días.

A continuación se muestra un ejemplo de aplicación de la hoja de cálculo. En

este ejemplo se introdujeron los datos correspondientes a una de las parcelas donde

se realizó el seguimiento del ciclo de cultivo (parcela B).

• Superficie de la parcela: 4,25 Ha

• Formulación aplicada: Tiagrex forte

• Cantidad: 30 kg /Ha

• Riqueza: 3 %

• Temperatura media diaria: 23 ºC

Introduciendo estos datos en la hoja de cálculo se obtuvieron los siguientes

resultados (Figura 15).


141

Según estos resultados, de los 0,9 kg de endosulfan aplicados por ha, 0,42 kg/ha

son interceptados por las hojas del cultivo de tomate, 0,16 kg/ha son depositados en el

suelo y 0,32 kg/ha se pierden en el proceso de aplicación. La cantidad interceptada

por las hojas se reduce a la mitad en 6 días mientras que la depositada en el suelo

tarda 53 días. Asimismo, una cantidad de 2,3 kg de endosulfan es emitida a la

atmósfera desde la parcela como consecuencia de la aplicación realizada.

En la Tabla 8 se presenta una comparación entre los resultados predichos por la

hoja de cálculo y los medidos realmente en condiciones de campo. Como se aprecia

los resultados predichos y los realmente medidos son similares.

Figura 15. Ejemplo de aplicación de la hoja de cálculo para la predicción de la distribución y la persistencia del endosulfan en el cultivo del tomate en una de las parcelas estudiadas en la provincia de Badajoz.

Ea (J mol-1) R (JK-1 mol-1) T (ºK) Cte RxTxCte RT t 1/2 (días)

21092 8,31441 296,15 -4,3954 -10822,8485 2462,312522 64,75

t 1/2 (días) kg/ha

t 1/2 (días) kg/ha

0,16 53 0,08

Deposición en el suelo Persistencia en suelo


0,90 0,42 6 0,21

Cantidad de endosulfan aplicada (kg/ha)

Intercepción por las hojas Persistencia en hojas


Cantidad emitida a la atmosfera kg /ha de endosulfan

3 0,32 Kg de endosulfan por parcela

2,3

30 4,25 23

Riqueza de la formulación (% endosulfan)

Pérdida durante la aplicación

PREDICCIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN Y PERSISTENCIA DEL ENDOSULFAN EN EL CULTIVO DEL TOMATE

Ecuación de Arrhenius

Cantidad Formulación aplicada (kg/ha)

ha de la parcela T media diaria (ºC)


142

Tabla 8. Distribución y persistencia del endosulfan según hoja de cálculo y medida real.

Resultados Predichos (hoja de cálculo) Medidos en campo

Intercepción por plantas 0,42 kg/ha 0,46 kg/ha

Deposición en suelo 0,16 kg/ha 0,12 kg/ha

Vida media en hoja 6 días 5 días

Vida media en suelo 53 días 40 días

4. CONCLUSIONES

Las vidas medias en el suelo obtenidas para el clorpirifos en condiciones de

campo variaron entre 14 y 17 días mientras que las obtenidas para el endosulfan lo

hicieron entre 28 y 40 días. Las vidas medias calculadas en estas condiciones fueron

menores que las obtenidas en los ensayos de laboratorio. Este hecho puede ser

explicado por la influencia de procesos como la volatilización, la fotodegradación y el

transporte, que junto con las diferentes condiciones climatológicas de la zona (viento,

ciclos de temperatura, lluvias, etc.) pueden aumentar la desaparición del suelo de los

residuos de los insecticidas estudiados. Estos procesos no fueron contemplados en los

ensayos efectuados en condiciones de laboratorio.

El tratamiento del cultivo del tomate con el insecticida endosulfan a una dosis

normal recomendada, en torno a 1 kg/ha, produjo en las condiciones estudiadas, un

depósito en las hojas que varió entre el 40 y el 50 % de la cantidad aplicada y un

depósito en el suelo varió entre un 10 y un 20 % de la cantidad inicialmente aplicada.

Por lo tanto, un porcentaje medio del 64 % de la cantidad aplicada se encuentra en las

hojas y en el suelo del cultivo después del tratamiento, mientras que aproximadamente

el 35 % de la dosis utilizada se pierde durante el proceso de aplicación.

Las vidas medias obtenidas para el endosulfan (suma de isómeros) fueron

apreciablemente menores en las hojas (5-6 días), que en el suelo (28-40 días),

poniendo de manifiesto que la cantidad depositada desaparece más rápido en las

hojas que en el suelo.


143

El isómero más persistente, tanto en la hoja como en el suelo, fue el

endosulfan-II, probablemente debido al hecho de que su mayor estabilidad molecular

dificulta los procesos de degradación en el caso del suelo y debido a que la mayor

volatilización del endosulfan-I desde las superficies foliares hace que se constituya

como isómero predominante en hoja. Asimismo, la elevada tasa de desaparición de

endosulfan-I y endosulfan-II comparada con la baja tasa de formación de endosulfan-

sulfato, el principal metabolito de la degradación de estos compuestos, junto con la

alta tasa de volatilización obtenida en los ensayos de laboratorio (Capitulo II) indican

que la vía mayoritaria de disipación del endosulfan de las superficies foliares es la

volatilización. Por otra parte, la diferencia encontrada entre las vidas medias de

endosulfan-I y endosulfan-II, en hoja, se corresponde con la diferencia encontrada en

la tasa de volatilización, en condiciones de laboratorio, para ambos isómeros. De esta

manera, las emisiones de endosulfan a la atmósfera, tanto durante la aplicación del

insecticida como en la volatilización posterior, pueden ser importantes, lo que

constituye un hecho a tener en cuenta debido a sus implicaciones de posible

contaminación del medio ambiente y de los cultivos del entorno.

Dos meses después de la cosecha no se encontraron residuos de clorpirifos en

el suelo en ninguna de las parcelas estudiadas, mientras que endosulfan-I se detectó

en 5 de las 18 parcelas muestreadas. Asimismo, se encontraron residuos de

endosulfan-II en 17 de las 18 parcelas muestreadas y endosulfan-sulfato en todas

ellas. Los niveles encontrados fueron bajos, estando comprendidos entre 0,03 y 0,01

µg/g para el endosulfan-I, entre 0,18 y 0,01 µg/g para el endosulfan-II y entre 0,14 y

0,01 µg/g para el endosulfan-sulfato.

La hoja de cálculo desarrollada permite obtener una estimación de la

distribución y persistencia del endosulfan en las parcelas de la región de Badajoz,

conociendo datos sencillos como la temperatura media diaria, la cantidad de

insecticida aplicado por hectárea y la superficie total tratada.

CONCLUSIONES GENERALES

Conclusiones generales

144

CONCLUSIONES GENERALES

Los métodos analíticos desarrollados para la determinación de los residuos de

los insecticidas estudiados en el suelo, agua (disolución del suelo), aire y material

vegetal, han permitido la cuantificación de estos compuestos de una forma sencilla,

rápida y fiable. Estos métodos requieren cantidades pequeñas de disolventes

orgánicos, reduciendo, por lo tanto, el riesgo para la salud humana y el medio

ambiente. La metodología desarrollada se ha utilizado satisfactoriamente en el estudio

de los procesos de degradación y de adsorción de los insecticidas clorpirifos y

endosulfan en el suelo, así como en estudio de la volatilización del endosulfan desde

superficies foliares.

La degradación del clorpirifos y del endosulfan en el suelo puede ser descrita por

una cinética de primer orden. La temperatura ambiente y la humedad del suelo son los

factores que más influyen en el caso de la degradación del clorpirifos mientras que, en

general, la humedad del suelo no es un factor importante en la degradación del

endosulfan, siendo la temperatura ambiental el factor que más afecta a la degradación

del insecticida en el suelo. Asimismo, no se produce un incremento de la degradación

de los compuestos estudiados en la zona de la rizosfera de las malas hierbas

frecuentemente encontradas en el cultivo del tomate ni en la rizosfera de las propias

plantas del tomate en los suelos ensayados.

Las vidas medias calculadas en condiciones de campo en la región estudiada,

donde la temperatura mensual media durante los meses del ciclo de cultivo varió entre

19 y 27 ºC, presentan valores entre 14 y 17 días para el clorpirifos y entre 28 y 40 días

para el endosulfan. Por otra parte, las vidas medias obtenidas para estos insecticidas

en el suelo en condiciones de laboratorio, considerando los tratamientos en los que se

ensayaron las condiciones de humedad y temperatura más similares a las existentes

en el campo (temperaturas de 25 y 35 ºC y humedades del suelo del 4 y 8%), son

mayores que las calculadas en condiciones de campo, obteniéndose vidas medias

entre 25 y 32 días para el clorpirifos y entre 46 y 56 días para el endosulfan. Este

hecho pone de manifiesto que existen otros procesos, además de la degradación, que


145

tienen lugar en condiciones de campo, que afectan a la desaparición de los

compuestos estudiados. Los procesos de volatilización, fotodegradación y transporte,

junto con las condiciones climatológicas de la zona (precipitación, viento, ciclos de

temperatura, etc) aumentan la disipación de estos insecticidas.

El estudio de los isómeros del endosulfan, tanto en condiciones de laboratorio

como de campo, indica que el endosulfan-II es el isómero más persistente en el suelo,

probablemente debido a su simetría molecular y por lo tanto a su mayor estabilidad,

mientras que el endosulfan-I se disipa antes del suelo. Asimismo, el clorpirifos es el

insecticida que más rápido se degrada tanto en los ensayos de laboratorio como en el

campo. De esta manera, dos meses después de la cosecha, no se encuentran

residuos de clorpirifos en el suelo mientras que se detectan residuos de endosulfan,

fundamentalmente, de endosulfan-II y endosulfan-sulfato a niveles en torno a 0,01

µg/g.

Los coeficientes de adsorción determinados para el clorpirifos y el endosulfan

indican que la adsorción de ambos compuestos en los suelos de las parcelas

investigadas es elevada, siendo más alta la adsorción del endosulfan. Este hecho

podría influir en que la degradación del endosulfan se viera más dificultada al estar

más retenido en los coloides del suelo que el clorpirifos. Por otra parte, la adsorción

elevada de ambos compuestos limita apreciablemente su presencia en la disolución

del suelo y su transporte a otros compartimentos ambientales desde esta matriz.

Los ensayos de volatilización en condiciones de laboratorio ponen de manifiesto

que aproximadamente el 50 % de la cantidad de endosulfan aplicada a la hoja se

volatiliza en 48 h. Asimismo, el endosulfan-I contribuye con más de un 70 % al total

volatilizado, lo que indica que este compuesto es el isómero predominante en el aire,

mientras que el endosulfan-II se establece como el isómero predominante en las hojas

poco tiempo después de la aplicación. El endosulfan presenta vidas medias en las

hojas, en condiciones de campo, entre 5 y 6 días, confirmando la rápida desaparición

del compuesto observada en los ensayos de laboratorio. La alta tasa de volatilización


146

del endosulfan indica la existencia de una emisión a la atmósfera de este compuesto

en las zonas donde se aplica.

El tratamiento edáfico con clorpirifos en los campos estudiados de la región de

Badajoz, con el método de aplicación empleado y a las dosis recomendadas (1 kg/ha)

no deja residuos detectables (LD = 0,01 µg/g) para el siguiente ciclo de cultivo, siendo

su principal vía de desaparición la degradación en el suelo (t½ = 14-17 días). Asimismo,

debido a su elevada adsorción en el suelo y a su baja solubilidad en el agua es

retenido en los coloides de dicha matriz. Este efecto de inmovilización por parte de los

coloides del suelo minimiza su transporte a otros compartimentos ambientales.

La aplicación foliar de endosulfan en las parcelas estudiadas produce un

depósito minoritario en el suelo (entre un 10 y un 20 % de la cantidad inicialmente

aplicada) cuya principal ruta de desaparición es la degradación en esta matriz (t½ = 28-

40 días). De igual manera, debido a su elevada adsorción en el suelo y a su baja

solubilidad en el agua, es inmovilizado por los coloides de este medio minimizando su

transporte a otros compartimentos ambientales. Este depósito puede ocasionar la

aparición de residuos de endosulfan-II y endosulfan-sulfato en la misma parcela al

comienzo del siguiente ciclo de cultivo. Por otra parte, se genera un depósito

mayoritario en las hojas de las plantas de tomate (entre el 40 y el 50 % de la cantidad

aplicada) que pasa rápidamente a la atmósfera, como consecuencia de su elevada

volatilización (t½ = 5-6 días), siendo este fenómeno la principal ruta de desaparición del

endosulfan de las superficies foliares. Por lo tanto, un porcentaje medio del 64 % de la

cantidad aplicada se encuentra en las hojas y en el suelo del cultivo después del

tratamiento, mientras que aproximadamente el 35 % de la dosis utilizada se pierde

durante el proceso de aplicación.

La cantidad de endosulfan volatilizada junto con la cantidad perdida en el

proceso de aplicación, generan una importante emisión de este insecticida a la

atmósfera, siendo un dato a considerar desde el punto de vista de la exposición al ser

humano y a otros organismos no diana y desde el punto de vista de la contaminación


147

medioambiental, ya que la cantidad de endosulfan emitida al aire es susceptible de ser

transportada a otros compartimentos ambientales.

Por último, la hoja de cálculo desarrollada para la predicción de la distribución

ambiental y la persistencia del endosulfan en el cultivo del tomate en las parcelas de la

provincia de Badajoz, basada en los resultados que han sido anteriormente expuestos,

pretende ser una herramienta de ayuda para los técnicos y agricultores. Mediante esta

hoja se puede realizar, de una forma sencilla, una estimación aproximada de las

cantidades de endosulfan disponibles en los distintos compartimentos ambientales en

función de la dosis aplicada y de otros parámetros sencillos. Asimismo, se puede

realizar una estimación de las vidas medias que presentará este insecticida en dichos

compartimentos ambientales.

DIFUSIÓN DE RESULTADOS

Difusión de resultados

148

Los resultados obtenidos en el presente trabajo se han difundido e través de su

publicación en revistas internacionales así como a través de su presentación en

diferentes congresos nacionales e internacionales:

Publicaciones

Tadeo, J.L., Castro, J. and Sánchez-Brunete, C. Multiresidue determination in

soil of pesticides used in tomato crops by sonication assisted extraction in small

columns and gas chromatography. International Journal of Environmental Analytical

Chemistry, 84, 29-37 (2004).

Castro, J., Sánchez-Brunete, C., Rodríguez J.A. y J.L. Tadeo. Persistence of

chlorpyrifos and endosulfan in soil. Fresenius Environmental Bulletin, 11, 578-582

(2002).

Castro, J., Pérez, R.A., Miguel, E., Sánchez-Brunete, C. y J.L. Tadeo. Analysis

of endosulfan isomers and endosulfan sulfate in air and tomato leaves by gas

chromatography with electron-capture detection and gas chromatography-mass

spectrometry. Journal of Chromatography A, 947, 119-127 (2002).

Castro, J., Pérez, R.A., Sánchez-Brunete, C. y J.L. Tadeo. Analysis of

pesticides volatilised from plants and soil by headspace solid-phase microextraction

and gas chromatography. Chromatographia, 53,361-365 (2001).

Castro, J., Sánchez-Brunete, C. y J.L. Tadeo. Multiresidue analysis of

insecticides in soil by gas chromatography with electron-capture detection and

confirmation by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography

A, 918, 371-380 (2000).


149

Presentaciones en congresos:

2nd European Conference on Pesticides and Related Organic

Micropollutants in the Environment. Corfú, 2002. Se presentaron los trabajos:

“Persistence and distribution of endosulfan applied to tomato crops”. Proceedings, 339-

342 y “Multiresidue determination in soil of tomato pesticides by SAESC extraction and

gas chromatography”. Proceedings, 57-60.

11th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on

Life in the Mediterranean Region. Limassol, 2001. Se presentó el trabajo:

“Persistence of chlorpyrifos and endosulfan in soil.” Abstracts book, C11.

VIII Congreso de La Sociedad Española de Malherbología. León, 2001. Se

presentó el trabajo: “Persistencia en el suelo del herbicida pendimetalina utilizado en el

cultivo del tomate.” Libro de Actas, 323-326.

11th Annual Meeting of SETAC Europe. Madrid, 2001. Se presentó el trabajo

titulado: “Rapid multiresidue methods for the determination of pesticides in soil and air.”

Abstracts book, 175.

XXX Scientific Meeting of the Group of Chromatography and related

techniques and I Meeting of the Spanish Society of Chromatography and Related

Techniques. Valencia, 2001. Se presentó el trabajo titulado: “Analysis of endosulfan

isomers and endosulfan sulfate in air and tomato leaves by GC-ECD and GC-MS.”

Abstracts book, 159.

23rd International Symposium on Chromatography. Londres, 2000. Se

presentó el trabajo: “Analysis of pesticides volatilised from plants and soil by

headspace solid-phase microextraction and GC-MS.” Abstracts book, 123.


150

XXIX Scientific Meeting of the Group of Chromatography and related

techniques. Madrid, 2000. Se presentó el trabajo titulado: “Multiresidue analysis of

insecticides in soil by GC-ECD and confirmation by GC-MS.” Abstracts book, 156.

�

BIBLIOGRAFÍA �

�

�

�

Bibliografía

151

BIBLIOGRAFÍA

AEPLA (Asociación Empresarial para la Protección de las Plantas). Memoria del año

2000.

Agüera, A., Contreras, M. y Fernández-Alba, A.R. (1993). Gas chromatographic

analysis of organophosphorus pesticides of horticultural concern. J. Chromatogr. A.

655, 293-300.

Aguilar, C., Peñalver, S., Pocurull, E., Borull, F. y Marcé, R.M. (1998). Solid-phase

microextraction and gas chromatography with mass spectrometric detection for the

determination of pesticides in aqueous samples. J. Chromatogr. A. 795,105-115.

Aguilera-del Real, A., Valverde-García, A., Fernandez-Alba, A.R. y Camacho-

Ferre, F. (1997). Behaviour of endosulfan residues in peppers, cucumbers and cherry

tomatoes grown in greenhouse: Evaluation by decline curves. Pestic. Sci. 51, 194-200.

Aigner, E.J., Leone, A.D. y Falconer, R.L. (1998). Concentration and enantiomeric

ratios of organochlorine pesticides in soils from the U.S. corn belt. Environ. Sci.

Technol. 32, 1162-1168.

Albanis, T.A. y Hela, D.G. (1995). Multi-residue pesticide analysis in environment

water samples using solid-phase extraction discs and gas chromatography with flame

thermometric and mass-selective detection. J. Chromatogr. A. 707, 283-292.

Albanis, T.A., Hela, D.G., Sakellarides, T.M. y Konstantinou, I.K. (1998). Monitoring

of pesticide residues and their metabolites in surface and underground waters of

Imathia (N. Greece) by means of solid-phase extraction disks and gas

chromatography. J. Chromatogr. A. 823, 59-71.

Anson Moye, A. (1981). Analysis of pesticide residues. John Wiley and Sons.

Bibliografía

152

Antonious, G.F. y Byers, M. E. (1997). Fate and movement of endosulfan under field

conditions. Environ. Toxicol. Chem. 16, 644-649.

Antonious, G.F., Byers, M.E. y Snyder, J.C. (1998). Residues and fate of endosulfan

on field-grown pepper and tomato. Pestic. Sci. 54, 61-67.

Arienzo, M., Crisanto, T., Sánchez-Martín, M.J., Sánchez-Camazano, M. (1994).

Effect of soil characteristics on Adsorption and mobility of (14C) diazinon. J. Agric. Food

Chem. 42, 1803-1808.

Avidov, E., Aharonson, N., Katan, J., Rubin, B. y Yarden, O. (1985). Persistence of

terbutryn and atrazine in soil as affected by soil disinfestation and fungicides. Weed

Science. 33, 457-461.

Babi�, S., Petrovi�, M. y Kaštelan-Macan, M. (1998). Ultrasonic solvent extraction of

pesticides from soil. J. Chromatogr. A. 823, 3-9.

Baker, S.A. (1998). Matrix solid-phase dispersion. LC-GC International. November,

719-724.

Barberá, C. (1989). Pesticidas Agrícolas. Cuarta edición revisada y ampliada. Ed.

Omega, S.A.

Bartelt, R. (1997). Calibration of a commercial solid-phase microextraction device for

measuring headspace concentrations of organic volatiles. Anal. Chem. 69, 364-372.

Beitz, H., Schmidt, H. y Herzel, F. (1994). Occurrence, Toxicological and

Ecotoxicological Significance of Pesticides in Groundwater and Surface Water. En:

Ebing, W. Chemistry of Plant Protection. Vol.9. Ed. Springer-Verlag.

Bentson, K.P. (1990). Fate of xenobiotics in foliar pesticide deposits. Residue Rev. Nº

114, 125-161.

Bibliografía

153

Berset, J.D. y Holzer, R. (1999). Quantitative determination of polycyclic aromatic

hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in sewage

sludges using supercritical fluid extraction and mass spectrometric detection.

J.Chromatogr. A. 852, 545-558.

Bertoncini-Delaunay, N, Pichon, V. y Hennion, M-C. (2001). Inmunoextraction: A

highly selective method for sample preparation. LC-GC Europe, March. 162-172.

Beyers, R.A., Woodham, D.W. y Bowman, M.C. (1965). Residues on Coastal

Bermuda grass, trash and soil treated with endosulfan. J. Econ. Entomol. 58, 160-161.

Bidleman, T.F., Cotham, W.E., Addison, R.F., Zinck, M.E. (1992). Organic

contaminats in the northwest atlantic atmosphere at Sable Island, Nova Scotia, 1988-

89. Chemosphere. 24, 1389-1412.

Blair, A.M., Martin, T.D., Walker, A. y Welch, S.J. (1990). Measurement and

prediction of isoproturon movement and persistence in three soils. Crop Protection. 9,

289-294.

Blumhorst, M.R. y Weber, J.B. (1992). Cyanazine dissipation as influenced by soil

properties. J. Agric. Fodd Chem. 40, 894-897.

Braithwaite, A. y Smith, F.J. (1999). Chromatographic Methods. Kluwer Academic

publishers.

Briggs, G.G. (1981). Theoretical and Experimental Relationships between Soils

Adsorption, Octanol-Water Partition Coefficients, Water Solubilities, Bioconcentration

Factors, and the Parachor. J. Agric. Food Chem. 29, 1050-1059.

Burchill, S., Cardew, M.H., Hayes, M.H.B. y Smedley, R.J. (1973). Continuous flow

methods for studying adsorption of herbicides by soil dispersions and soil columns.

Proc. Eur. Weed Res. Counc. Symp. Herbicides—Soil, Versailles, 70.

Bibliografía

154

Burgoyne, W.T. y Hites, R.A. (1993). Effects of temperature and wind direction on the

atmospheric concentrations of α-endosulfan. Environ. Sci. Technol. 27, 910-914.

Cai, C.P., Liang, M. y Wen, R.R. (1995). Rapid multiresidue screening method for

organophosphate pesticides in vegetables. Chromatographia. 40, 417-420.

Calvet, R. (1989). Adsorption of Organic Chemicals in Soils. Environmental Health

Perspectives. 83, 145-177.

Calvet, R., Tercé, M y Arvieu, J.C. (1980). Bibliographic review. Adsorption of

pesticides by soils and their constituents.III. General characteristics of the pesticides

adsorption. J. C. Ann. Agron. 31, 125-162.

Capri, E., Ghebbioni, C. y Trevisan, M. (1995). Metamitron and chloridazon

dissipation in silty clay loam soil. J. Agric. Food Chem. 43, 247-253.

Capriel, P., Haisch, A. y Khan, S.U. (1986). Supercritical methanol: An efficacious

technique for the extraction of bound pesticide residues from soil and plant samples. J.

Agric. Food Chem. 34, 70-73.

Cheah, U-B., Kirkwood, R.C. y Lum K-Y. (1998). Degradation of four commonly used

pesticides in malasyan agricultural soils. J. Agric. Fodd Chem. 46, 1217-1223.

Chopra, N.M. y Mahfouz, A.M. (1977). Metabolism of endosulfan I, endosulfan II, and

endosulfan sulfate in tobacco leaf. J. Agric. Food Chem. 25, 32-36.

Clément, M., Arzel, S., Le Bot, B., Seux R. y Millet, M. (2000). Adsorption/thermal

desorption-GC/MS for the analysis of pesticides in the atmosphere. Chemosphere. 40,

49-56.

Colina, C., Báez, M.E., Peña, A., Romero, E., Dios, G. y Sánchez-Rasero, F. (1994).

Simultaneous determination of various pesticides in water by solid-phase

Bibliografía

155

extraction/HPLC with photodiode array detection. The Science of the Total

Environment. 153, 1-6.

Colina, C., Heras, A.P., Cancela, G.D. y Rasero, F.S. (1993). Determination of

organophosphorous and nitrogen containing pesticides in water samples by solid

phase extraction with gas chromatography and nitrogen-phosphorous detection. J.

Chromatogr. A. 655, 127-132.

Davis, A.C. y Kuhr, R.J. (1976). Dissipation of chlorpyrifos from muck soil and onions.

Journal of Economic Entomology. 69, 665-666.

Davis, R. y Frearson, M. (1987). Mass Spectrometry. John Wiley and Sons.

Di, H.J. Aylmore, L.A.G. y Kookana, R.S. (1998). Degradation rates of eight

pesticides in surface and subsurface soils under laboratory and field conditions. Soil

Science. 163, 404-411.

Dörfler, U., Schneider, P. y Scheunert, I. (1991). Volatilization rates of pesticide from

soil and plant surfaces under controlled conditions. Toxicological and Environmental

Chemistry. Vols 31-32, 87-95.

Edwards, C.A. (1974). Factors that affect the persistence of pesticides in plants and

soils. Pesticide Chemistry 3. IUPAC. 39. Ed. Butterworths. Londres.

Eisert, R. y Levsen, K. (1995). Determination of organophosphorous, triazine and 2,6-

dinitroaniline pesticides in aqueous samples via soild-phase microextraction (SPME)

and gas chromatography with nitrogen-phosphorous detection. Fresenius J. Anal.

Chem. 351, 555-562.

Eisert, R. y Levsen, K. (1996). Solid-phase microextraction coupled to gas

chromatography: a new method for the analysis of organics in water. J. Chromatogr. A.

733, 143-157.

Bibliografía

156

Ensing, K., Berggren, C. y Majors, R.E. (2002). Selective sorbents for solid-phase

extraction based on molecularly imprinted polymers. LC-GC Europe, January, 16-25.

Erstfeld, K.M: y Chen, C-Y. (1998). Comparison of supercritical fluid and soxhlet

extraction methods for the determination of chlorothalonil from cranberry bog soils. J.

Agric. Food Chem. 46, 499-503.

Ezzell, J.L., Richter, B.E., Felix, W.D., Black, S.R. y Meikle, J.E. (1995). A

comparison of accelerated solvent extraction with conventional solvent extraction for

organophosphorous pesticides and herbicides. LC-GC International. May, 390-397.

Fank, R., Clegg, B.S., y Patni, N.K. (1991). Dissipation of cyanazine and metolachlor

on clay loam soil, Ontario, Canada, 1987-1990. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 21,

253-262.

Farmer, W.J., Igue, K., Spencer, W.F. y Martin, J.P. (1972). Volatility of

organochlorine insecticides from soil: I. Effect of concentration, temperature, air flow

rate, and vapour pressure. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 36, 443-447.

Felsot, A. y Dahm, P.A. (1979). Sorption of organophosphorus and carbamate

insecticides by soil. J. Agric. Food Chem. 27(3), 557-563.

Fernández, M.J., García, C., García-Villanova, R.J. y Gómez, J.A. (1996).

Evaluation of liquid-soilid extraction with a new sorbent and liquid-liquid extraction for

multiresidue pesticides. Determination in raw and finished drinking waters. J. Agric.

Food Chem. 44, 1790-1795.

Fernández-Alba, A.R., Valverde, A., Agüera, A. y Contreras, M. (1994). Gas

chromatographic determination of organochlorine and pyrethroid pesticides of

horticultural concern. J.Chromatogr. A. 686, 263-274.

Bibliografía

157

Fifield, F.W. y Haines, P.J. (1998). Environmental Analytical Chemistry. Blackie

Academic & Professional.

Font, G., Mañes, J., Moltó, J.C. y Picó, Y. (1993). Solid-phase extraction in multi-

residue pesticide analysis of water. J. Chromatogr. A. 642, 135-161.

Frank, R., Clegg, B.S. y Patni, N.K. (1991). Dissipation of cyanazine and metolachlor

on clay loam soil, Ontario, Cananda, 1987-1990. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 21,

253-262.

Fruhstorfer, P., Schneider, R.J., Weil, L.. y Niessner, R. (1993). Factors influencing

the adsorption of atrazine on montmorillonitic and kaolinitic clays. The Science of the

Total Environment. 138, 317-328.

García, C., Tiedra, P., Ruano, A., Gómez, J.A. y García-Villanova, R.J. (1992).

Evaluation of the liquid-liquid extraction technique and application to the determination

of volatile halo-organic compounds in chlorinated water. J. Chromatogr. A. 605, 251.

García, N.S., Barba, A., Cámara, M.A. y Navarro S. (1992). Persistencia de los

plaguicidas en suelos agrícolas. Procesos y factores condicionantes. Universidad de

Murcia.

García-Valcárcel, A.I., Sánchez-Brunete, C., Martínez, L., Tadeo, J.L. (1996).

Determination of dinitroaniline herbicides in environmental samples by gas

chromatography. J. Chromatogr. A. 719, 113-119.

Gelsomio, A., Petrovi�ová, B., Tiburtini, S., Magnani, E y Felici, M. (1997).

Multiresidue análisis of pesticides in fruits and vegetables by gel permeation

chromatography followed by gas chromatography with electron-capture and mass

spectrometric detection. J.Chromatogr. A. 782, 105-122.

Bibliografía

158

Gilchrist, G.F.R., Gamble, D.S., Kodama, H. y Khan S.U. (1993). Atrazine

Interactions with Clay Minerals: Kinetics and Equilibria of Sorption. J. Agric. Food

Chem. 45, 1748-1755.

Giles, C.H., MacEwan, T.H., Nakhwa, S.N. y Smith, D. (1960). Studies in adsorption.

Part XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the

diagnosis of adsorption mechanisms and in measurement of specific surface areas of

solids. J. Chem. Soc. 3, 3973-3993.

Glass, B.L. (1972). Relation between the degradation of DDT and the iron redox

system in soils. J. Agric. Food Chem. 20, 324-327.

González, F.J.E., Cano, M.L.C., Vidal J.L.M. y Galera, M.M. (1997). Analyses of

chlorthalonil and dichlofluanid in greenhouse air. J. AOAC Int. 80, 1091-1097.

Gopal M. y Mukherjee, I. (1993). Determination of residues of endosulfan and

endosulfan-sulfate on eggplant, mustard and chickpea. Pestic. Sci. 37, 67-72.

Green, M.B. (1984). Los plaguicidas: ¿Beneficiosos o perjudiciales?. Ed Academia

León.

Green, R.E. y Corey, J.C. (1971). Pesticide Adsorption Measurement by Flow

Equilibration and Subsequent Displacement. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., Vol 35,

561-565.

Green, R.E., Davidson, J.M. y Biggar, J.W. (1980). An assessment of methods for

determining adsorption-desorption of organic chemicals. En: Banin, A. y Kafkafi, U.

Agrochemicals in soils. New York Pergamon.

Grice, R.E., Hayes, M.H.B., Lundie, P.R. y Cardew, M.H. (1973). Continuous flow

method for studying adsorption of organic chemicals by a humic acid preparation.

Chem. Ind. (London), p. 233.

Bibliografía

159

Grover, R. (1975). A method for determining the volatility of herbicides. Weed Sci. 23,

529-532.

Gudéhn A. y Kolmodin-Hedman, B. (1987). Sampling and determination of

fenitrothion, dimethoate, mevinphos, linuron, metoxuron and trifluralin from air. J.

Chromatogr. A. 387, 420-427.

Hamaker, W.J. (1972). Diffusion and volatilization. En: Organic Chemicals in the Soil

Environment. Vol.2. Goring, I.A.C. y Hamaker, W.J. Ed. Dekker. New York.

Hamaker, W.J. y Thompson, M.J. (1972). Adsorption. En: Organic Chemicals in the

Soil Environment. Vol.1. Goring, I.A.C. y Hamaker, W.J. Ed. Dekker. New York.

Hance, R.J. (1971). Complex formation as an adsorption mechanisms for linuron and

atrazine. Weed Res. 11, 106-110.

Hance, R.J. (1988). Adsorption and Bioavailability. En: Grover, R. Environmental

Chemistry of Herbicides. Vol.1, pp 1-19. CRC Press, Inc. Boca Ratón, FL.

Hance, R.J. y Haynes, R.A. (1981). The kinetics of linuron and metribuzin

decomposition in soil using different laboratory systems. Weed Research. 21, 87-92.

Hance, R.J., Smith, P., Byast, T.H. y Cotterill, E.G. (1976). Variability in the

persistence and movement in soils of abnormally high rates of simazine and linuron;

some wider implications. Proc. 1976. Br. Crop Prot. Conf.-Weeds, pp. 643-648.

Hawthorne, S.B. (1990). Analytical-scale supercritical fluid extraction. Anal. Chem. 62,

633-642.

Hayes, M.H.B., Pick, M.E. and Toms, B.A. (1975). Interactions between clay minerals

and bipyridilium herbicides. Residue Rev. Nº 57, 1.

Bibliografía

160

Hermanson, M.H. y Hites, R.A. (1989). Long-term measurements of atmospheric

polychlorinated biphenyls in the vicinity of superfund dumps. Environ. Sci. Technol. 23,

1253-1258.

Heuer, B., Birk, Y. y Yaron, B. (1976). Effect of Phosphatases on the persistence of

organophosphorus insecticides in soil and water. J Agric. Food Chem. Vol.24 (3), 611-

614).

Hinckley, D.A., Bidleman, T.F., Foreman, W.T., Tuschall, J.R. (1990). Determination

of vapor pressures for nonpolar organic compounds from gas chromatographic

retention data. J. Chem. Eng. Data. 35, 232-237.

Hinsmann, P., Arce, L., Ríos, A. y Valcárcel, M. (2000). Determination of pesticides

in waters by automatic on-line solid-phase extraction-capillary electrophoresis. J.

Chromatogr. A. 866, 137-146.

Hsu, R-C., Biggs, I. y Saini, N.K. (1991). Solid-phase extraction cleanup of

halogenated organic pesticides. J. Agric. Food Chem. 39, 1658-1666.

Hurle, K. y Walker, A. (1980). Chapter 4: Persistence and its prediction. En: Hance,

R.J. Interactions between herbicides and the soil. Academic Press.

Jenkinson D.S y Ladd, J.N. (1981). Microbial biomass in soil: measurement and

turnover. En: E.A. Paul y J.N. Ladd. Soil Biochemistry Vol. 5. 415-471. Dekker.

Jenkinson D.S. y Powlson D.S. (1976). The effects of biocidal treatments on

metabolism in soil V. A method for measuring soil biomass. Soil Biol. Biochem. 8, 209-

213.

Joergensen, R.J. y Brookes, P.C. (1990). Ninhydrin-reactive nitrogen measurements

of microbial biomass in 0,5M K2SO4 soil extracts. Soil Biol. Biochem. 22, 1023-1027.

Bibliografía

161

Johnsen, R.E. y Starr, R.I. (1972). Ultrarapid extraction of insecticides from soil using

a new ultrasonic technique. J. Agric. Food Chem. 20, 48-51.

Johnson, J.A. y Farmer, W.J. (1993). Batch versus column method for determining

distribution of organics between soil and water phases. Soil Science. 155, 92-99.

Jurado-Expósito, M. y Walker, A. (1998). Degradation of isoproturon, propyzamide

and alachlor in soil with constant and variable incubation conditions. Weed Research.

38, 309-318.

Jury, W.A., Focht, D.D. y Farmer, W.J. (1987-a). Evaluation of Pesticide Groundwater

Pollution Potential from Standard Indices of Soil-Chemical Adsorption and

Biodegradation. J. Environ. Qual. Vol.16 (4), 422-428.

Jury, W.A., Winer, A.M, Spencer, W.F. y Focht, D.D. (1987-b). Transport and

transformation of organic chemicals in the soil-air-water ecosystem. Reviews of

Environmental Contamination and Toxicology. 99, 118.

Kadenczki L.; Arpad Z.; Gardi I.; Ambrus A.; Gyorfi L.; Reese G. y Ebing, W.

(1992). Column extraction of residues of several pesticides from fruits and vegetables:

a simple multiresidue analysis method. J. AOAC Int. 75, 53-61.

Katayama, A. y Matsumura, F. (1993). Degradation of organochlorine pesticides,

particularly endosulfan, by Trichoderma harzianum. Environmental Toxicology and

Chemistry. 12, 1059-1065.

Kathpal, T.S., Singh, A., Dhankhar, J.S. y Singh, G. (1997). Fate of endosulfan in

cotton soil under sub-tropical conditions of northern India. Pestic. Sci. 50, 21-27.

Kawata, K., Mukai H. y Yasuhara, A. (1995). Monitoring of pesticides in air by gas

chromatography-mass spectrometry and the use of quartz-fibre wool and activated

carbon for sampling J. Chromatogr. A. 710, 243-250.

Bibliografía

162

Kenneth, W.E., Elizabeth, J.E., James, E.L. y López-Avila, V. (1992). Liquid

chromatographic determination of pesticides in finished drinking waters: collaborative

study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 75, 858.

Khan, S.U. (1972). Adsorption of pesticide by humic substances. A review.

Environmental Letters, 3 (1), 1-12.

Khan, S.U. (1995). Supercritical fluid extraction of bound pesticide residues from soil

and food commodities. J. Agric. Food Chem. 43, 1718-1723.

Kirkwood, R.C. (1999). Recent developments in our understanding of the plant cuticle

as a barrier to the foliar uptake of pesticides. Pestic. Sci. 55, 69-77.

Kullman, S.W. y Matsumura, F. (1996). Metabolic Pathways utilized by

phanerochaete chrysosporium for degradation of the cyclodiene pesticide endosulfan.

Applied and Environmental Microbiology. 62, 593-600.

Kuo, H-W. y Lee, H-M. (1999). Volatility of propoxur from different surface materials

commonly found in homes. Chemosphere. 38, 2695-2705.

Lambropoulou, D.A. y Albanis, T.A. (2001). Optimization of headspace solid-phase

microextraction conditions for the determination of organophosphorous insecticides in

natural waters. J. Chromatogr. A. 922, 243-255.

Lechón Y., Sánchez-Brunete C., Tadeo J.L. (1997). Influence of the laboratory

incubation method on chlortoluron and terbutryn degradation in soil. J. Agric. Food

Chem. 45, 951-954.

Lechón Y.; García-Valcárcel A.I.; Matienzo T.; Sánchez-Brunete; Tadeo J.L.

(1997). Comparison of analytical procedures for determination of soil sorption

coefficients of some triazine herbicides. Communications in Soil Science and Plant

Analysis. 19 & 20, 1835-1844.

Bibliografía

163

Lee, N., Beasley, H.L., Kimber, S.W.L., Silburn, M., Woods, N., Skerritt, J.H. y

Kennedy, I.R. (1997). Application of immunoassays to studies of the environmental

fate of endosulfan. J. Agric. Food Chem. 45, 4147-4155.

Lehotay, S.J. y Eller, K.I. (1995). Development of a method of analysis for 46

pesticides in fruits and vegetables by supercritical fluid extraction and gas

chromatography/ion trap mass spectrometry. J. AOAC Int. 78, 821-830.

Leung A.M., McDonough, D.M. y West, C.D. (1998). Determination of endosulfan in

soil/sediments samples from point mugu, Oxnard, ca using capillary gas

chromatography/mass selective detection (GC/MSD). Environmental Monitoring and

Assessment. 50, 85-94.

Liao, W., Joe, T. y Cusick, W.G. (1991). Multiresidue screening method for fresh fruits

and vegetables with gas chromatography/mass spectrometric detection. J. Assoc. Off.

Anal. Chem. 74, 554-565.

Ling, Y-C. y Huang, I-P. (1995). Multi-residue matrix solid-phase dispersion method

for the determination of six synthetic pyrethroids in vegetables followed by gas

chromatography with electron capture detection. J. Chromatogr. A. 695, 75-82.

Littlewood, A.B. (1970). Gas Chromatography. Principles, Techniques, and

Applications. Academic Press.

Lopez-Avila, V. y Benedicto, J. (1998). Stability of organochlorine and

organophosphorous pesticides when extracted from soils matrixes with microwave

energy. J. AOAC International 81, 1224-1232.

Lopez-Avila, V., Young, R., Benedicto, J., Ho, P. y Kim, R. (1995). Extraction of

organic pollutants from solid samples using microwave energy. Anal. Chem. 67, 2096-

2102.

Bibliografía

164

Magalhaes, M.J.A, Ferreira, J.R., Frutuoso, L. y Taínha, A.A. (1989). Study of the

disappearance of endosulfan, parathion, trichlorfon and pirimicarb from broccoli and

Portuguese cabbage. Pestic. Sci. 27, 23-31.

Magdic, S. y Pawliszyn, J.B. (1996). Analysis of organochlorine pesticides using

solid-phase microextraction. J. Chromatogr. A. 723, 111-122.

Magdic, S., Boyd-Boland, A., Jinno, K. y Pawliszyn, J.B. (1996). Analysis of

organophosphorous insecticides from environmental samples using solid-phase

microextraction. J. Chromatogr. A. 736, 219-228.

Majors, R.E. (1996). The changing role of extraction in preparation of solid samples.

LC-GC International. October, 638-648.

Mallick, K., Bharati, K., Banerji, A., Shakil, N.A. y Sethunatahn, N. (1999). Bacterial

degradation of chlorpyrifos in pure cultures and in soil. Bull. Environ. Contam. Toxicol.

62, 48-54.

Manchester-Neesvig, J.B. y Andersen, A.W. (1989). Seasonal variation in the

atmospheric concentration of polychlorinated biphenyl congeners. Environ. Sci.

Technol. 23, 1138-1148.

Marco, M-P., Gee, S.J., Cheng, H.M., Liang, Z.Y. y Hammock, B.D. (1993).

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for carbaryl. J. Agric. Food

Chem. 41, 423-430.

Martens, R. (1976). Degradation of [8,9-14C] endosulfan by soil microorganisms.

Applied and Environmental Microbiology. 31, 853-858.

Martens, R.F. (1977). Degradation of endosulfan-8,9-carbon-14 in soil under different

conditions. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 17, 438-446.

Bibliografía

165

Martijn A., Bakker, H. y Schreuder, R.H. (1993). Soil persistence of DDT, dieldrin,

and lindane over long period. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 51, 178-184.

Martínez Vidal, J.L., Espada, M.C.P., Frenich, A.G. y Arrebola, F.J. (2000).

Pesticide trace analysis using solid-phase extraction and gas chromatography with

electron-capture and tandem mass spectrometric detection in water samples. J.

Chromatogr. A. 867, 235-245.

Martínez Vidal, J.L., González, F.J.E., Glass, C.R., Galera, M.M. y Cano, M.L.C.

(1997). Análisis of lindane, α- and β-endosulfan and endosulfan-sulfate in greenhouse

air by gas chromatography. J. Chromatogr. A. 765, 99-108.

Martínez, L., Lechón, Y., Sánchez-Brunete, C. y Tadeo, J.L. (1996). Persistence of

metolachlor, atrazine and deethylatrazine in soil and its simulation by deterministic

models. Toxicological and Environmetal Chemistry. 54, 219-232.

Martínez, L., Sánchez-Brunete C. y Tadeo, J.L. (1994). Determination of herbicide

volatilization from soil by different trapping phases. Quím. Anal. 13, 206-208.

Mc Call, P.J., Laskowski, D.A., Swann, R.L. y Dishburger, H.J. (1983). Estimation of

environmental partitioning of organic chemicals in model ecosystems. Residue

Reviews. 85, 231-244.

McNeil, J.D. y Hikichi, M. (1976). Degradation of endosulfan and ethion on pears and

grape foliage. J. Agric. Food Chem. 3, 608-611.

Metcalf, R.L. (1971). Chemestry and Biology of Pesticides. En: White-Stevens, R.

Pesticides in the Environment. Vol. I, Part I. (In Two Parts). Marcel Dekker, Inc., New

York.

Bibliografía

166

Miglioranza, K.S.B., Aizpún de Moreno, J.E., Moreno, V.J., Osterrieth, M.L. y

Escalante, A.H. (1999). Fate of organochlorine pesticides in soil and terrestrial biota of

“Los Padres” pond watershed, Argentina. Environmental Pollution 105, 91-99.

Miles, J.R.W. y Moy, P. (1979). Degradation of endosulfan and its metabolites by a

mixed culture of soil microorganisms. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 23, 13-19.

Miliadis, G.E. (1998). Analysis of pesticide residues in water samples by gas capillary

chromatography. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 61, 255-260.

Miller, D.M., Miller, W.P. y Summer, M.E. (1989). A Continuous-Flow Stirred Reaction

Cell For Studying Adsorption In Suspensions. Soil Sci. Soc. Am. J. 53, 1407-1411.

Mingelgrin, U, Saltzman, S y Yaron, B. (1977). A possible model for the surface-

inducted hydrolysis of organophosphorus pesticides on kaolinite clays. Soil Sci. Soc.

Am. J. Vol. 41, 519-523

Miyahara, M., Okada, Y., Takeda, H., Aoki, G., Kobayashi, A. y Saito, Y. (1994).

Multiresidue procedure for the determination of pesticides in food using capillary gas

chromatography, flame photometric, and mass spectrometric techniques. J. Agric.

Food Chem. 42, 2795-2802.

Mogadati, P., Louis, J.B., y Rosen, J.D. (1999). Multiresidue determination of

pesticides in high-organic-content soils by solid-phase extraction and gas

chromatography/mass spectrometry. J. AOAC International 82, 705-715.

Molinari, G.P., Cavanna, S. y Ferroni, B. (1998). Multiresidue method for

determination of organophosphorous pesticides in vegetables. Food Additives and

Contaminants. 15, 510-517.

Bibliografía

167

Morell, I. y Candela, L. (1998). Comportamiento de los plaguicidas en suelos y aguas.

En: Plaguicidas. Aspectos ambientales analíticos y toxicológicos. pp 9-23. Ed. I. Morell

y L. Candela.

Morelli-Cardoso, M.W., Cardozo, R.T.M., Mello, J.L, Abrantes, S. y Menezes,

K.M.P. (1999). Extraction and clean-up meted for the determination of twenty

organochlorine pesticide residues in tomatoes by GLC-ECD. J. High Resol.

Chromatogr. 22, 619-622.

Motohashi, N., Nagashima, H., Párkányi, C., Subrahmanyam, B. y Zhang, G-W.

(1996). Official multiresidue methods of pesticide analysis in vegetables fruits and soil.

J. Chromatogr. A. 754, 333-346.

Mudd, P.J., Hance, R.J. y Wright, S.J.L. (1983). The persistence and metabolism of

isoproturon in soil. Weed Research. 23, 239-246.

Mukherjee, I. Y Gopal, M. (1994). Interconversión of stereoisomers of endosulfan on

Chickpea crop under field conditions. Pestic. Sci. 40, 103-106.

Mukherjee, I., Gopal, M. y Yaduraju, N.T. (1992). HCH, endosulfan and fluvalinate

residue behaviour in pigeonpea (Cajanus cajan L. Mill sp.). Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 48, 163-170.

Nash, R.G. (1983). Determining environmental fate of pesticides with

microagroecosystems. Residue Rev. 85, 199-215

Nearpass, D.C., Edwards, W.M. y Taylor, A.W. (1978). Triazine persistence in soil in

eastern Ohio. Agronomy Journal. 70, 937-940.

Noegrohati, S. y Hammers, W.E. (1992). Bimodal distribution of organochlorine

insecticide levels in soil due to emulsion spraying. Toxicological and Environmental

Chemistry. 34, 207-218.

Bibliografía

168

Obrador, A., Lechón, Y. y Tadeo J.L. (1993). Simulation of atrazine persistence in

Spanish soils. Pestic. Sci. 37, 301-303.

Okumura, T. Y Nishikawa, Y. (1995). Determination of organophosphorous pesticides

in environmental samples by capillary gas chromatography-mass spectrometry. J.

Chromatogr. A. 709, 319-331.

Papadopoulou-Mourkidou, E., Patsias, J. y Kotopoulou, A. (1997). Determination

of pesticides in soils by gas chromatography-ion trap mass spectrometry. J. AOAC

International 80, 447-454.

Parkpian, P., Anurakpongsatorn, P., Pakkong, P. y Patrick, Jr. W.H. (1998).

Adsorption, desorption and degradation of α-endosulfan in tropical soils of Thailand. J.

Environ. Sci. Health. 33, 211-233.

Parrilla, P., Martinez-Vidal, J.L. y Fernández-Alba, A.R. (1993). Optimization of the

separation isolation and recovery of selected pesticides in water samples by soild-

phase extraction and HPLC photodiode array detection. J. Liquid. Chromatogr. 16,

4019-4029.

Pawliszyn, J. (1997). Solid Phase Microextraction-Theory and Practice, Wiley-VCH,

New York.

Payá-Pérez, A.B., Cortés, A., Sala, M.N. y Larsen, B. (1992). Organic matter

fractions controlling the sorption of atrazine in sandy soils. Chemosphere. 25, 887-898.

Pearce, K.L., Trenerry, V.C. y Were, S. (1997). Supercritical fluid extraction of

pesticides residues from strawberries. J. Agric. Food Chem. 45, 153-157.

Pedersen, H.J, Kudsk, P. y Helweg, A. (1995). Adsorption and ED50 Values of Five

Soil-Applied Herbicides. Pestic. Sci. 44, 131-136.

Bibliografía

169

Potter, T.L., Carpenter, T., Putman, R., Reddy, K. y Clark, J.M. (1991). Rapid

method for analysis of atrazine and acetanilide herbicides in groundwater by micro

liquid/liquid extraction. J. Agric. Food Chem. 39, 2148.

Pramauro, E. (1990). Los Pesticidas y el Medio Ambiente. Servei Publicaciones.

Universidad de Valencia.

Primo Yúfera, E. y Carrasco Dorrién, J.M. (1990). Química Agrícola II. Plaguicidas y

Fitorreguladores. Ed. Alhambra.

Qualls, R. y Haines, B.L. (1992). Measuring Adsorption Isotherms Using Continuous,

Unsaturated Flow trough Intact Soil Cores. Soil Sci. Soc. Am. J. 56, 456-460.

Racke, K.D. (1993). Environmental fate of Chlorpyrifos. Rev. Environ. Contam. Toxicol.

131.

Racke, K.D., Lubinski, R.N., Fontaine, D.D., Miller, J.R., McCall, P.J. y Oliver, G.R.

(1992). Comparative fate of chlorpyrifos insecticide in urban and agricultural

environments. Capítulo 8 en: Racke, K.D. y Leslie A, R. Fate and significance of

pesticides in urban environments. ACS, Washington, D.C. ACS Symp Series.

Racke, K.D., Steele, K.P., Yoder, R.N., Dick, W.A. y Avidov, E. (1996). Factors

affecting the hydrolytic degradation of chlorpyrifos in soil. J. Agric. Food Chem. 44,

1582-1592.

Rao, D.M.R. y Murty, A.S. (1980). Persistence of endosulfan in soils. J. Agric. Fodd

Chem. 28, 1099-1101.

Rhodes, C.R. (1980). Soil studies with 14C-labeled hexazinone. J. Agric. Fodd

Chem. 28, 311-315.

Bibliografía

170

Richter, B.E., Ezzell, J.L., Felix, D., Roberts, K.A. y Later, D.W. (1995). An

accelerated solvent extraction system for the rapid preparation of environmental

organic compounds in soil. Am. Lab. 27, 24-28.

Richter, B.E., Jones, B.A., Ezzell, J.L., Porter, N.L., Avdalovic, N. y Pohl, C. (1996).

Accelerated solvent extraction: a technique for sample preparation. Anal. Chem. 68,

1033-1039.

Rodriguez del Rincon, A. (1999). Manejo del cultivo extensivo para industria. En:

Nuez, F. y Rodríguez del Rincón, A. (1999). El Cultivo del tomate. Ediciones Mumndi-

Prensa.

Rüdel, H. (1997). Volatilisation of pesticides from soil and plant surfaces.

Chemosphere. 35, 143-152.

Rüdel, H., Schmidt, S. Kördel W. y Klein, W. (1993). Degradation of pesticides in

soil: comparison laboratory experiments in a biometer system and outdoor lysimeter

experiments. The Science of the Total Environment. 132, 181-200.

Russell, J.W. (1975). Analysis of air pollutants using sampling tubes and gas

chromatography. Environ. Sci. Technol. 9, 1175-1178.

Rutherford, D.W., Chiou, C.T. y Kile, D.E. (1992). Influence of soil organic matter

composition on the partition of organic compounds. Environ. Sci. Technol. 26, 336-340.

Sahid, I.B. y Teoh, S.S. (1994). Persistence of terbuthylazine in soils. Bull. Environ.

Contam. Toxicol. 52, 226-230.

Sánchez-Brunete, C., Pérez, R.A., Miguel, E. y Tadeo, J.L. (1998). Multiresidue

herbicide analysis in soil samples by means of extraction in small columns and gas

chromatography with nitrogen-phosphorus and mass spectrometric detection.

J.Chromatogr. A. 823, 17-24.

Bibliografía

171

Sanders, P.F., McChesney, M.M. y Seiber, J.N. (1985). Measuring pesticide

volatilisation from small surface areas in the field. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 35,

569-575.

Sannino, A., Mambriani, P., Bandini, M. y Bolzoni, L. (1996). Multiresidue method

for determination of organochlorine insecticides and polychlorinated biphenyl

congeners in fatty processed foods. Residues and Trace Elements. 79, 1434-1446.

Santos, F.J., Jáuregui, O., Pinto, F.J. y Galceran, M.T. (1998). Experimental design

approach for the optimization of supercritical fluid extraction of chlorophenols from

polluted soils. J. Chromatogr. A. 823, 249-258.

Scheunert, I. (1992-a). Physical and Physico-Chemical Processes Governing the

Residue Behaviour of Pesticides in Terrestrial Ecosystems. En: Ebing, W. Chemistry of

Plant Protection. Vol.8. Ed. Springer-Verlag.

Scheunert, I. (1992-b). Transformation and degradation of pesticides in soil. En:

Ebing, W. Chemistry of Plant Protection. Vol.8. Ed. Springer-Verlag.

Scheunert, I., Mansour, M., Dörfler, U. y Schroll, R. (1993). Fate of pendimethalin,

carbofuran and diazinon under abiotic and biotic conditions. The Science of the Total

Environment. 132, 361-369.

Schmidt, F.W., Hapeman, C.J., Fettinger, C.J., Rice, P.C. y Bilboulian, S. (1997).

Structure and asymmetry in the isometric conversion of β- to α- endosulfan. J. Agric.

Food Chem. 4, 1023-1026.

Senders, P.F. y Seiber, J.N. (1983). A chamber for measuring volatilisation of

pesticides from model soil and water disposal systems. Chemosphere. 12, 999-1012.

Bibliografía

172

Shalini-Singh, Dureja, P., Kumar, S. y Jain, M.C. (1999). Persistence of α and β

isomers of endosulphan and endosulphan sulfate in diverse soils of India as influenced

by flooding. J. Environ. Sci. Health. B34, 965-974.

Sherma, J. (1999-a). Recent advances in thin-layer chromatography of pesticides. J.

AOAC International. 82, 48-53.

Sherma, J. (1999-b). Pesticide residue analysis: 1997-1998. J. AOAC International 82,

561-574.

Sicbaldi, F., Sarra, A. y Copeta, G.L. (1997). Diatomaceous earth-assisted extraction

for the multiresidue determination of pesticides. J.Chromatogr. A. 765, 23-30.

Silverstein, R.M., Bassler, G.C. y Morril, T.C. (1991). Spectrometric identification of

organic compounds. Jhon Wiley and Sons, Inc.

Singh, G., Spencer, W.F, Cliath, M.M. y Genunchten, M.Th. (1990-a). Sorption

Behavior of s-Triazine and Thiocarbamate Herbicides on Soils. J. Environ. Qual. 19,

520-525.

Singh, G., Spencer, W.F., Cliath, M.M. y Genunchten, M. Th. (1990-b). Dissipation

of s-triazines and thiocarbamates from soil as related to soil moisture content.

Environmental Pollution. 66, 253-262.

Singh, N.C., Dasgupta, T.P., Roberts, E.V. y Mansingh, A. (1991). Dynamic of

pesticides in tropical conditions. 1. Kinetics studies of volatilisation, hydrolysis and

photolysis of dieldrin and α- y β-endosulfan. J. Agric. Food Chem. 39, 575-579.

Singh, P.P., Battu, R.S., Singh, B. y Karla, R. L. (1991). Fate and interconversion of

endosulfan-I, II and sulfate on Gram crop (Cicer arietium Linn.) in subtropical

Environment. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 47, 711-716.

Bibliografía

173

Snyder, J.L., Grob, R.L., McNally, M.E. y Oostdyk, T.S. (1992). Comparison of

supercritical fluid extraction with classical sonication and soxhlet extractions for

selected pesticides. Anal. Chem. 64, 1940-1946.

Snyder, J.L., Grob, R.L., McNally, M.E. y Oostdyk, T.S. (1994). Supercritical fluid

extraction of selected pesticides from fortified soils and determination by gas

chromatography with electron capture detection. J.Environ. Sci. Health. A29, 1801-

1816.

Soma, Y. y Soma, M. (1989). Chemical reactions of organic compounds on clay

surfaces. Environmental Health Perspectives. Vol.83, 205-214.

Spear, R. (1991). Recognized and Possible Exposure to Pesticides. En: Hayes, W.J

(Jr). y Laws, E.R. (Jr). Handbook of Pesticide Toxicology. Vol. 1. Academic Press, Inc.

Spencer W.F. y Cliath, M.M. (1973). Pesticide volatilization as related to water loss

from soil. J. Environ. Quality. 2, 284-289.

Spencer, W.F., Farmer, W.J. y Cliath, M.M. (1973). Pesticide volatilization. Residue

Reviews. 49, 1-47.

Stewart, D.K.R., y Cairns, K.G. (1974). Endosulfan persistence in soil and uptake by

potato tubers. J. Agric. Food Chem. 6, 984-986.

Sukul, P. y Handa, S.K. (1984). Persistence and metabolism of endosulfan on

chickpea. Indian J. agric. Sci. 54, 925-930.

Suri, K.S. y Joia, B.S. (1996). Persistence of chlorpyriphos in soil and its terminal

residues in wheat. Pesticide Research Journal. 8, 186-190.

Bibliografía

174

Swami, K., Marjit, A., Narang, S. y Narang, R.S. (1997). Determination of chlordane

and chlorpyrifos in ambient air at low nanogram-per-cubic meter levels by supercritical

fluid extraction. J. AOAC Int. 80, 74-77.

Tabernero, M.T., Álvarez-Benedí, J., Atienza, J. y Herguedas, A. (2000). Influence

of temperature of volatilization of triallate and terbutryn from two soils. Pest. Manag.

Sci. 56, 175-180.

Tanwar, R.S. y Handa, S.K. (1998). Persistence, translocation and metabolism of

endosulfan residue on pigeonpea (Cajanus cajan L. Mill sp.). Pesticide Research

Journal. 10, 73-79.

Taylor, A.W. (1978). Post-application volatilization of pesticides under field conditions.

Journal of the Air Pollution Control Association. 28, 922-927.

Taylor, A.W., Glotfelty, D.E. (1988). Evaporation from soils and crops. En: Grover, R.

Environmental chemistry of herbicides. CRC Press. inc.

Tekel, J. y Hatrík, S. (1996). Pesticide residue analyses in plant material by

chromatographic methods: clean-up procedures and selective detectors. J.

Chromatogr. A. 754, 397-410.

Thomas, T.C., Jackson J.W. y Nishioka, Y.A. (1980). Chlordane sampling efficiency

with Chromosorb 102 and ethylene glycol. Am. Ind. Hyg. Assoc. 41, 599-601.

Topp, E., Smith, W.N., Reynolds, D. W. y Khan, S.U. (1994). Atrazine and

metolachlor dissipation in soils incubated in undisturbed cores, repacked cores, and

flasks. J. Environ. Qual. 23, 693-700.

Torrents, A., Jayasundera, S. y Schmidt, W.J. (1997). Influence of the Polarity of

Organic Matter on the Sorption of Acetamide Pesticides. J. Agric. Food Chem. 45,

3320-3325.

Bibliografía

175

Usoroh, N.J. y Hance, R.J. (1974). The effect of temperature and water content on the

rate of decomposition of the herbicide linuron in soil. Weed Research. 14, 19-21.

Valverde-García, A., Fernadez-Alba, A.R., Contreras, M. y Agüera, A. (1996).

Supercritical fluid extraction of pesticides from vegetables using anhydrous magnesium

sulfate for sample preparation. J. Agric. Food Chem. 44, 1780-1784.

Volante M., Pontello M., Valoti L., Cattaneo M., Bianchi M., Colzani L. (2000).

Application of Solid Phase Micro-Extraction (SPME) to the analysis of pesticide

residues in vegetables. Pest. Manag. Sci. 56, 618-636.

Walker, A. (1974). A simulation model for prediction of herbicide persistence. J.

Environ. Quality. 3, 396-401.

Walker, A. (1978). Simulation of persistence of eight soil-applied herbicides. Weed

Research. 18, 305-313.

Walker, A. (1987). Evaluation of a simulation model for prediction of herbicide

movement and persistence in soil. Weed Research. 27, 143-152.

Wauchope, R.D:, Buttler, T.M., Hornsby, A.G., Augustijn-Beckers, P.W.M. y Burt,

J.P. (1992). The SCS/ARS/CES Pesticides database for environmental decision-

making. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology 123.

Weber, J.B. (1970-a). Adsroption of s-Triazines by Montmorillonite As a Function of pH

and Molecular Structure. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 34, 401-404.

Weber, J.B. (1970-b). Mechanisms of adsorption of s-triazines by clay colloids and

factor affecting plant availability. Residue Rev. 32, 93.

Bibliografía

176

Weber, J.B. (1995). Physicochemical and mobility studies with pesticides. En: Leng,

M.L, Leovey, E.M.K y Zubkoff, P.L. Agrochemical Environmental Fate. State of the art.

CRC. Lewis Publishers.

Willis, G.H. y McDowell, L.L. (1987). Pesticide persistence on foliage. Reviews of

Environmental Contamination and Toxicology. 100, 24-73.

Willis, G.H., McDowell, L.L., Southwick, L.M., Smith, S. (1985). Toxaphene, methyl

parathion, and fenvalerate disappearance from cotton foliage in the Mid South. J.

Environ Qual. 14, 446-450.

Yaron, B. (1978). Some aspects of surface interaction of clays with

organophosphorous pesticides. Soil Science. 125, 210-216.

Zapf, A., Heyer, R. y Stan, H-J. (1995). Rapid micro liquid-liquid extraction method for

trace analysis of organic contaminants in drinking water. J. Chromatogr. A. 694, 453-

461.

Zimdahl, R.L., Freed, V.H., Montgomery, M.L. y Furtick, W.R. (1970). The

degradation of triazine and uracil herbicides in soil. Weed Res. 10, 18-26.

determinaciÓn, persistencia y distribuciÓn de …jcastrojimenez.net/web_documents/phd thesis...

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