determinaciÓn de metabolitos de clorhidrato de...
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MEXICO, D.F. DICIEMBRE 2010
T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS P R E S E N T A
Q.B.P. ANA GABRIELA CERDA GÓMEZ
DIRECTOR Dr. RICARDO ALEJANDRE AGUILAR
DETERMINACIÓN DE METABOLITOS DE
CLORHIDRATO DE COCAÍNA EN
MUESTRAS DE ENTOMOFAUNA
OBTENIDAS EN RATAS
PREVIAMENTE TRATADAS
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGIAS
El presente trabajo fue realizado en las instalaciones del Laboratorio de Química del
Servicio Médico Forense del Distrito Federal dependencia perteneciente al Tribunal
Superior de Justicia del Distrito Federal bajo la asesoría del Q.F.B. Adrian Waldo
Capetillo, del M. en C. Ernesto Bernal Morales, del Q.F.B. Alejandro Romero Ayón, del
pBiol. Arturo Gabriel Cortes Cruz y en el Laboratorio de Entomología del Departamento de
Parasitología en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas bajo la dirección del Dr.
Ricardo Alejandre Aguilar. Este proyecto fue financiado por la Secretaría de Investigación
y Posgrado (SIP) del IPN mediante el proyecto con clave SIP 20100954 y por el programa
de becas CONACYT nacionales del periodo Agosto de 2008 a Julio 2010
i
ÍNDICE GENERAL
Pág.
Índice general i
Índice de figuras iii
Índice de tablas iv
Resumen v
Abstract vi
1. Introducción 1
1.1 Cocaína 4
2. Antecedentes 10
3. Justificación 14
4. Hipótesis 15
5. Objetivo General 16
6. Objetivos Particulares 16
7. Material y métodos
7.1 Análisis presuntivo para la determinación de clorhidrato
de cocaína
7.2 Análisis confirmativo para la determinación de
clorhidrato de cocaína
7.3 Identificación taxonómica de larvas de dípteros
17
18
18
19
8. Resultados
8.1 Análisis presuntivo para la determinación de metabolitos
de clorhidrato de cocaína
8.2 Análisis confirmativo para la determinación de
20
20
ii
metabolitos de clorhidrato de cocaína
8.3 Identificación taxonómica
8.4 Relación entre especies colonizadoras y temperatura
20
27
30
9. Discusión 32
10. Conclusiones 36
11. Bibliografía 37
iii
ÍNDICE DE FIGURAS Pág.
Figura 1. Adulto de Chrysomya albiceps, díptero representativo del
periodo sarcofágico.
2
Figura 2. Adulto de Dermestes maculatus representante del periodo
dermesteriano.
3
Figura 3. Nicrophorus orbicollis representante del periodo silfiano 3
Figura 4.
Larva de Eutrombicula belkini, representante del cuarto
periodo
5
Figura 5.
Eritroxylon coca lam 5
Figura 6. Representación de la distribución de los cadáveres en donde
se muestran los diferentes lotes.
17
Figura 7. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el
tiempo de corrimiento del compuesto benzoilecgonina-TMS
21
Figura 8. Espectro de benzoilecgonina-TMS 22
Figura 9. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el
tiempo de corrimiento del compuesto ecgonina metil éster
23
Figura 10. Espectro de ecgonina metil ester 24
Figura 11. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el
tiempo de corrimiento del compuesto cadaverina tri-TMS
25
Figura 12.
Espectro de cadaverina tri-TMS 26
Figura 13. Larva de díptero con estructuras anatómicas de utilización
para identificación taxonómica
27
Figura 14
Esquematización de las especies de dípteros identificados
taxonómicamente, con las estructuras en estadio larvario y
ejemplar de adulto, y la presencia de los dípteros en las
épocas estacionales
29
Figura 15.
Ejemplares de coleópteros y díptero colonizadores de
cadáveres.
30
Lote 1 Lote 2 Lote 3
Lote 4
iv
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1.
Aportaciones más importantes sobre el uso y
descubrimiento de la cocaína.
6
Tabla 2. Farmacocinética de cocaína de acuerdo a la ruta de
administración
8
Tabla 3. Trabajos de entomología forense realizados del año
1916 a 2000
11
Tabla 4. Asignación de la dosis administrada a cada uno de los
ejemplares.
17
Tabla 5. Tabla comparativa entre la temperatura media por
estación y el periodo de duración del periodo larvario.
20
Tabla 6. Periodo con obtención de resultados positivos dentro
del intervalo total de descomposición.
20
Tabla 7. Especies de ejemplares del orden Diptera y Coleoptera
identificadas taxonómicamente
27
Tabla 8. Aparición de artrópodos durante el periodo de
exposición del cadáver.
31
v
RESUMEN
Actualmente existen ramas que han aportado información extra para poder completar la
investigación forense, entre las cuales se encuentra la antropología, la odontología, la
patología, la genética, la química, la toxicología y la que concierne a este trabajo: la
entomología. La Entomología es la ciencia que estudia a los artrópodos en general; como
auxiliar en el área forense aporta información de relevancia sobre todo cuando el cuerpo no
es descubierto inmediatamente después de la muerte, la entomotoxicología se encarga de la
determinación cualitativa y/o cuantitativa de sustancias toxicas en artrópodos que colonizan
restos humanos.
El presente trabajo tiene como propósitos determinar los metabolitos del clorhidrato de
cocaína en los artrópodos presentes en cadáveres de ratas previamente tratados, proponer la
técnica adecuada para la determinación de cocaína en entomofauna cadavérica e identificar
las especies de artrópodos que colonizan los cadáveres de ratas previamente tratados con el
clorhidrato de cocaína en la zona urbana del Distrito Federal.Se administró una solución de
clorhidrato de cocaína a ratas Wistar macho de 336.6 + 34.6 g de peso corporal, en
diferentes dosis para que al ser sacrificadas se permitiera la colonización de los artrópodos
y de esta manera fue posible determinar los metabolitos producidos por la
biotransformación del xenobiótico administrado lo cual demostró que es una herramienta
importante la utilización de los artrópodos en un análisis toxicológico preciso. La
exposición de los cadáveres de ratas fue de 27 días, en las cuatro épocas estacionales:
verano, primavera, otoño e invierno. Se obtuvieron muestras de los artrópodos
colonizadores para realizar la determinación de los metabolitos de clorhidrato de cocaína
por medio de la técnica EMIT y por Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas, así como para la identificación taxonómica. Se identificaron los siguientes
compuestos: la benzoilecgonina en su forma derivatizada (Benzoilecgonina-TMS),
ecgonina metil éster y también fue identificado otro compuesto presente en los cuerpos en
descomposición: cadaverina en su forma derivatizada (cadaverina tri-TMS), mediante el
desarrollo de la técnica propuesta para el tratamiento de muestras entomológicas. Los
artrópodos identificados en los cadáveres en las cuatro estaciones del año fueron los
siguientes: Lucillia sp, Chrysomia sp, Calliphora sp, Sarcophaga sp, Hydrotea capensis,
Saprinus sp, Dermestes maculatus y Necrobia rufipes.
vi
ABSTRACT
Currently there are branches that have provided extra information to complete the forensic
investigation, among which is the anthropology, dentistry, pathology, genetics, chemistry,
toxicology and regards this job: entomology. Entomology is the science of studying
arthropods in general, as an aid in the forensic field provides important information
especially when the body is not discovered immediately after death; entomotoxicology is
responsible for the qualitative and/or quantitative toxic substances in arthropods that
colonize human remains.
The present study is to determine the metabolites of cocaine hydrochloride in arthropods
present in the bodies of rats previously treated propose the appropriate technique for the
determination of cocaine in entomofauna cadaverous and identify species of arthropods that
colonize the bodies of rats pretreated with cocaine hydrochloride in the urban area of
Mexico City. It was given a solution of cocaine hydrochloride to male Wistar rats 336.6 +
34.6 g body weight at different doses for that being sacrificed to be allowed the
colonization of arthropods and thus were able to determine the metabolites produced by the
biotransformation of xenobiotic administered which showed that it is an important tool
arthropods using a precise toxicological analysis. The exposure of dead rats was 27 days in
the four seasonal periods: summer, spring, autumn and winter. Samples were collected
arthropods settlers to make the determination of metabolites of cocaine hydrochloride using
the technique EMIT and gas chromatography coupled with mass spectrometry, as well as
for taxonomic identification. We identified the following compounds: benzoylecgonine in
derivatized form (Benzoylecgonine-TMS), ecgonine methyl ester and was also identified
another compound in the decomposing bodies: cadaverine in derivatized form (cadaverine
tri-TMS), through the development of the proposed technique for the treatment of
entomological samples. Arthropods identified in the bodies in the four seasons were:
Lucillia sp, Chrysomia sp, Calliphora sp, Sarcophaga sp, Hydrotea capensis, Saprinus sp,
Dermestes maculatus and Necrobia rufipes.
1
1. INTRODUCCIÓN
La palabra entomología proviene de los vocablos griegos: tomos que significa “parte
cortada” y logos que significa “ciencia, estudio o tratado” de ahí que sea la ciencia que
estudia a los seres segmentados (Torrez et al., 2006).
Actualmente, la entomología estudia a los artrópodos en general; entendemos por
artrópodos al conjunto de animales con apéndices segmentarías, provista de musculatura
intrínseca, rodeada de una cutícula constituida básicamente por quitina y esclerotina y que
está parcialmente esclerotizada. Poseen musculatura somática organizada en haces y piezas
endoesqueléticas, de origen tendinoso y secundariamente cuticular; su órgano dorsal es
contráctil y está metamerizado; la cavidad general del cuerpo es hemocelica siendo su
liquido el liquido circulatorio, su desarrollo embrionario originariamente holoblástico,
desigual y espiral, ha pasado a un tipo no espiral e incluso meroblástico superficial (Nieto y
Mier., 1985).
Las ciencias forenses están relacionadas con la criminalística, que es un conjunto de
técnicas y procedimientos de carácter técnico-científicas, de suma importancia en la época
actual en que nos encontramos en pleno desarrollo científico de la investigación judicial. La
medicina forense es el punto de unión de las ciencias jurídicas y las biológicas, cuyos
conocimientos deberán ser comunes a médicos, abogados y agentes investigadores de la
policía científica. De esta manera el médico forense, evitando toda precipitación, divide las
dificultades de la observación y el análisis del hecho delictuoso en estudio, en tanta partes
como sea posible, para poder resolverlos mejor, dirigiendo ordenadamente el pensamiento,
de los más sencillo a lo más complejo, haciendo enumeraciones completas de datos y
revisiones exhaustivamente, ayudando a resolver los problemas más importantes,
convirtiéndose en un valioso auxiliar de la administración de justicia (Fernández, 1981).
Para lograr llegar a una respuesta sobre el acto delictivo, el médico forense debe considerar
las herramientas que tiene a su alcance y que serán de gran utilidad; algunas de las
disciplinas forenses auxiliares son: traumatología, asfixiología, tanatología, sexología,
2
obstetricia, psiquiatría, legislación mexicana, odontología, toxicología, y por último pero no
menos importante, la entomología (Fernández, 1981).
La muerte de un ser vivo lleva consigo una serie de cambios y transformaciones físico-
químicas (Torrez et al. 2006), atrayendo una variedad de insectos y otros invertebrados
(Kenneth, 1973), que hacen de este cuerpo sin vida un ecosistema dinámico y único (Torrez
et al., 2006) que va reduciendo éste a lo que conocemos como "restos áridos". Los
artrópodos están usualmente entre los primeros y más importantes invertebrados que
colonizan un cadáver y siguen una secuencia de sucesión predecible en carcasas animales
(Iannacone, 2003).
La entomología es usualmente aplicada como ayuda en el establecimiento del tiempo de
muerte, como un factor importante en algún crimen (Kenneth, 1973). Tras la intervención
de Megnin en numerosos casos de la práctica judicial, valorando la intervención de los
insectos en el proceso de destrucción de la materia orgánica, dicho autor recopiló sus
experiencias, publicando en 1894 su conocida obra La faune des cadavres, con la que sentó
las bases científicas de la entomología cadavérica (Romero-Polanco et al., 2006).
Megnin divide en cuatro periodos la colonización del cuerpo desde el momento en que
exhala el último suspiro, hasta la desaparición completa de las partes blandas, los cuales
son llamados de la siguiente forma:
a) Primer periodo o sarcofágico, dura tres meses (Figura 1)
Fuente. Grassberger, et al., 2003.
Figura 1. Adulto de Chrysomya albiceps, díptero representativo del periodo sarcofágico.
3
b) Segundo periodo o dermesteriano tiene una duración de 3 a 4 meses (Figura 2)
Fuente. Leccese, 2004
Figura 2. Adulto de Dermestes maculatus representante del periodo dermesteriano.
c) Tercer periodo o silfiano, dura de 4 a 8 meses (Figura 3).
Fuente. http://picasaweb.google.com/lh/photo/vPipfA-CMV1nEq7e4w4LiA
Figura 3. Nicrophorus orbicollis representante del periodo silfiano
d) Cuarto periodo o acarino tiene una duración aproximada de de 6 a 12 meses (Figura
4)
Fuente. Bennett yWebb, 1985
Figura 4. Larva de Eutrombicula belkini, representante del cuarto periodo
Estos cuatro periodos se suceden con regularidad, pero una vez pasado el primer periodo
los que siguen pueden presentarse conjuntamente, así se ve con frecuencia que mientras una
4
parte del cadáver está ocupado por escuadras de trabajadores del segundo periodo, en otra
parte ya existen algunos del tercero, y todavía no han desaparecido éstas por completo,
cuando alguna parte del cuerpo, entra en vías de momificación, gracias al trabajo de ciertos
ácaros (Marín-Retiff, 1996).
Puede afirmarse que en los últimos años ha comenzado un verdadero resurgir de la
entomología cadavérica, con la aparición de un amplísimo grupo de trabajos sumamente
interesantes para conseguir un mayor conocimiento de la misma, no limitándose sus
aplicaciones al establecimiento del intervalo postmortem (Romero-Polanco et al., 2006).
Mediante la identificación de los insectos presentes y sus estadios de vida, es posible
estimar cuanto tiempo el cuerpo ha estado muerto y donde ocurrió la muerte del cadáver
(Iannacone, 2003). Diversos autores señalan la conveniencia de repetir aquellas
observaciones en las diferentes localidades, habiéndose denunciado la ausencia de extensas
investigaciones sistemáticas que permitieran establecer particularidades para las diferentes
regiones geográficas (Romero-Polanco et al., 2006).
La toxicología médico legal ha tenido la labor de aportar pruebas en caso de crimen por
envenenamiento, o bien esclarecer la etiología de las intoxicaciones, si éstas son de origen
suicida, si es accidental debida a una causa fortuita, o bien en caso de homicidio, cuando la
es intencional y con propósitos criminales (Fernández, 1981).
La entomotoxicología es el área especializada de la entomología y de las ciencias forenses
que se encarga de la determinación cualitativa y/o cuantitativa de sustancias toxicas en
artrópodos en restos humanos (Gagliano-Candela y Aventaggiato, 2001).
1.1 Cocaína
La cocaína es un alcaloide extraído de las hojas del arbusto Erythroxylon coca (Figura 5),
que crece mayormente en Sudamérica (Lange y Hills, 2001) en regiones cálidas y húmedas
entre 600-1500 m sobre el nivel del mar. Perteneciente a la familia de las eritroxiláceas, con
hojas alternas, aovadas y enteras, flores blanquecinas y fruto en baya pequeña y roja, crece
5
hasta una altura media de un metro y contiene hasta 14–17 alcaloides distintos de los que el
más conocido y estudiado es la cocaína. Existen entre setenta y cinco y doscientas
cincuenta especies de eritroxiláceas, aunque las más extendidas son la Eritroxylon coca lam
y la Erytroxylon novogratense, destinadas en la región andina al cultivo para consumo
tradicional y su transformación en cocaína. (Pascual et al., 2001).
Fuente. Herbario ENCB, IPN
Figura 5. Eritroxylon coca lam
En Sudamérica y Centroamérica el habito de masticar hoja de coca se remonta a tiempos
muy antiguos, pero fue hasta que los primeros exploradores llevaron a Europa noticias
sobre la planta y sus propiedades (Arif, 1988) (Tabla 1).
6
Tabla 1. Aportaciones más importantes sobre el uso y descubrimiento de la cocaína.
Acontecimiento
1530. Pizarro Encontró que la corte del imperio Inca,
usaba la coca como un privilegio. Se
producían panes de coca
1551 y 1567 La Iglesia intentó suprimir su consumo al
considerar que iba unido a rituales
profanos, condenándola por estar unida a
la idolatría y a la hechicería
LA COCA DURANTE EL SIGLO XIX.
1830. J.J. von Tschudi Escribió el libro llamado Travels in Perú,
en el que plasmó como los porteadores del
Perú podían pasar cinco días sin tomar
alimento alguno y durmiendo muy poco
gracias al consumo de coca.
1850. Paolo Mantegazza Destaca el efecto exaltante y recomienda
para las enfermedades nerviosas.
1876, La revista Lancet en un artículo de
Dowdeswell que describe los primeros
efectos negativos tales como cambios en
el pulso y en la temperatura.
A finales del siglo XIX Alrededor de diez millones de indios de
América del Sur seguían con su costumbre
de mascar coca.
Fuente: Pascual et al., 2001
El uso de la coca data desde el año 5000 a.de. C. y se ha observado en restos funerarios del
2500 a. de C. En objetos precolombinos de 1000 a. de C. y en estatuillas encontradas en las
costas de Ecuador y Perú datadas en el s. III a. de C. (Pascual et al., 2001). Uno de los usos
más extendidos fue entre los braceros al norte de los Andes para no notar el cansancio, en
7
las grandes caminatas, mascaban hojas de coca, para calmar el hambre y la sed. Las
distancias se contaban por “cocadas”, es decir, por descansos durante los cuales se volvía a
mascar las consabidas hojas de coca cuyo efecto no solía rebasar los tres cuartos de hora, la
cocada era tanto una unidad de tiempo como de espacio (Pascual et al., 2001).
En 1859, Albert Niemann, aisló el alcaloide principal de la coca: la cocaína. Entre 1863 y
1865, un químico austriaco, Wilhem Lossen, descubrió que la fórmula química de la
cocaína es C17 H21 N O4 (Pascual et al., 2001).
Durante 1880 la cocaína se consideraba toda una panacea, e incluso se podría prescindir de
los asilos para alcohólicos, y conseguir su cura radical en 10 días. Angelo Mariani, químico
de Córcega, embotelló y vendió el “Vin Mariani”, e incluso el Papa León XIII prestó su
efigie para la etiqueta y concedió la medalla de oro a su inventor. (Pascual et al., 2001)
Los principales modos de administración son: masticación (hojas), inhalación (clorhidrato
de cocaína), inyección (clorhidrato de cocaína), fumar (pasta de coca) (Arif, 1988). El
clorhidrato de cocaína se descompone cuando se calienta. Ésta puede ser tomada oral,
intravenosa o intranasalmente. La base libre es manufacturada procesando la cocaína con
amonio o bicarbonato de sodio para remover el clorhidrato. Esta forma es termoestable y se
funde a 98oC, lo que permite que sea fumada. A esto se le conoce como “crack” porque es
el sonido que se produce cuando es calentada (Lange y Hills, 2001).
El clorhidrato de cocaína se absorbe bien a través de todas las membranas mucosas, los
consumidores crónicos alcanzan una alta concentración sanguínea principalmente por
administración intranasal, sublingual, intravaginal o rectal. En comparación con la
inyección intravenosa de cocaína, la administración por mucosas resulta ser de acción más
lenta, un efecto pico más tardado, y una larga duración de acción (Tabla 2).
8
Tabla 2. Farmacocinetica de cocaína de acuerdo a la ruta de administración
Fuente. Pascual et al., 2001.
La cocaína es metabolizada por el plasma y colinesterasas hepáticas a metabolitos solubles
en agua (principalmente benzoilecgonina y ecgonina metilester) que son excretados en
orina. La vida media sérica de la cocaína es de 45 a 90 minutos; solo el 1% de la droga
puede ser recuperada en la orina después de ser ingerida. Así la cocaína se puede detectar
en la sangre o en la orina en tan solo 4 horas después de su uso. Sin embargo, sus
metabolitos son detectables en la sangre o en la orina de 24 a 36 horas después de la
ingestión proporcionando así un indicador útil de reciente consumo de drogas (Pascual et
al, 2001).
Cuando se administra de manera sistémica, sus efectos están mediados a través de
alteraciones en la transmisión sináptica. La cocaína bloquea la recaptación pre sináptica de
noradrenalina y dopamina, produciendo un exceso de estos neurotransmisores en el sitio de
receptor postsinaptico. (Lange y Hills, 2001).
El aumento de dopamina en las estructuras límbicas y prefrontales se vincula con los
efectos placenteros de refuerzo, y un exceso de la misma produciría rabia, agresividad,
alucinaciones y delirios. El aumento de noradrenalina se relaciona con el estado simpático
de alerta, taquiarritmias e hipertensión arterial y el de serotonina con las variaciones del
ánimo, temperatura, apetito y sueño. La inhibición prolongada de la recaptura de dopamina
se vincula con un estado de virtual depleción del neurotransmisor acompañado de una
Vía de
administración
Inicio de acción Pico máximo Duración de
acción
Inhalación
(fumada)
3-5 s 1-3 min 5-15 min
Intravenosa 10-60 s 3-5 min 20-60 min
Intranasal u otra
mucosa
1-5 min 15-20 min 60-90 min
9
supersensibilidad de receptores que se asocia a los síntomas el hambre o anhelo de droga
(Toro y Rudelir, 2004).
Los riesgos del consumo de cocaína además de su potencial de adicción, son arritmias
cardiacas (aparato cardiovascular), isquemia del miocardio, miocarditis, disección aortica,
vasoconstricción cerebral y convulsiones (Sistema Nervioso Central). La cocaína produce
un incremento dependiente de la dosis en la frecuencia cardiaca y la presión arterial,
aunado a un aumento de la excitación, rendimiento mejorado en las tareas de vigilancia y
alerta, y sensación de confianza en sí mismo. El daño que produce tanto en Sistema
Nerviosos Central como en Sistema Nervioso Periferico se debe al bloqueo de la captación
de catecolaminas. También son frecuentes los trastornos psiquiátricos, como ansiedad,
depresión y psicosis. Se ha informado que la cocaína genera un orgasmo prolongado e
intenso si se administra antes del coito, y su utilización se relaciona con una actividad
sexual compulsiva y promiscua. Sin embargo, a largo plazo, su consumo suele culminar en
disminución del impulso sexual. El consumo en mujeres embarazadas pueden tener trabajo
de parto prematuro y desprendimiento prematuro de placenta. (Goodman y Gilman, 2006)
10
2. ANTECEDENTES
Desde el primer registro del uso de la entomología en un caso criminal hace 13 siglos en
China, los trabajos en entomología forense han sido esporádicos (Kenneth, 1992). El primer
caso de entomología forense fue documentado en The Washing Away of Wrongs en el que
se describe el caso de un asesinato de un campesino de una aldea china, que fue encontrado
asesinado a machetazos por una hoz de mano, lo que sugirió que otro trabajador campesino
había cometido el asesinato. El magistrado realizó la investigación llamando a todos los
campesinos locales para que cada uno llevara sus hoces de mano a la plaza del pueblo y una
vez reunidos colocaron sus hoces en el suelo, cuando aparecieron moscas verde metálico
brillante que comenzaron a centrarse en una de las hoces de mano en específico. El
conocimiento del juez de la aldea sobre la conducta de un grupo de insectos específicos con
respecto a su atracción al tejido humano muerto fue la clave para resolver este acto violento
y la justicia se sirvió en la antigua China.
A finales de 1800 fue usada esporádicamente en Europa la aplicación de entomología
forense para la determinación del tiempo de muerte, y en mayor grado en los Estados
Unidos. La mayoría de los textos publicados sobre medicina forense e investigación de la
muerte han proporcionado poca información práctica sobre el uso e importancia de la
entomología, parte de la investigación y estudios de casos relacionados sobre éste tema han
sido publicados principalmente en revistas entomológicas (Rodríguez III, 1988).
La descomposición de los cuerpos humanos es diferente según el clima (fresco o cálido) y
la zona, ya sea urbana o rural (Barreto et al., 2002). La descomposición comienza por la
acción de los microorganismos como hongos y bacterias, después una serie de artrópodos
continúa con la descomposición, predominando los insectos sarcosaprófagos. Payne
menciona que existe una notable diferencia en el proceso de descomposición relacionada
básicamente en el tiempo de desintegración que depende de la presencia o ausencia de
insectos (Carvalho et al., 2000).
La identificación de insectos asociados con cadáveres humanos es relativamente escasa en
la literatura de la región neotropical (Tabla 3).
11
Tabla 3. Trabajos de entomología forense realizados del año 1916 a 2000
Autor Trabajo
1916. Dunn. Reporto a Hermetia illuscens en Panamá
1941. Pessôa and Lane. Presenta registros de Scarabaeidae
necrophilus en Brasil
1979. Jirón.
1983. Jirón et al.
1988. Jirón y Solano.
Muestran información sobre
Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae y
Stratiomyidae en Costa Rica
1984. Baumgartner y Greenberg.
Presencia de un total de 70 insectos
adultos son colectados de 12 cuerpos
humanos, también 2 hembras del género
Sarcophagidae, así como Chrysomya
megacephala y Chrysomya rufifacies,
especies que arriban en el Sur y Centro de
América, de África y Australia
respectivamente
1985. Dear. Identifica ejemplares de la familia
Calliphoridae
1985. Baumgartner y Greenberg.
Encontraron que hay una alta
competencia entre especies de
Cochliomyia y Chrysomya por los
cadáveres humanos en algunas áreas en
Cali Colombia
1988. Greenberg. Ambas especies fueron reconocidas por en
el Norte de América
1999. Olaya
Estudios en carcasas de perros
2000. Carvalho et al
Identifica artrópodos asociados con la
carroña de los cerdos y cuerpos humanos
en Campinas, Estado de São Paulo, Brasil.
Fuente: Barreto et al., 2002
12
Recientemente, algunos estudios experimentales de entomología forense tienden a ser
realizados en diferentes regiones de Colombia entre los que podemos mencionar los
realizados por Idrobo y Martínez 2000, Restrepo et al. 2000, Wolff y Uribe 2000. En Cali,
Olaya en 1999 determinó la sucesión de artrópodos y la velocidad de descomposición en
perros, pero aparentemente no la identificación específica de insectos hallados en cuerpos
humanos. Entre 1990 y 1991 se descubrieron insectos sobre 16 cadáveres humanos son
colectados en el Instituto de Medicina legal de Cali (Barreto, et al., 2002).
Uno de los países latinoamericanos que ha utilizado esta herramienta de forma ordinaria y
ha presentado avances importantes en la fauna cadavérica de la región es Brazil, los
primeros reportes publicados corresponden entre 1908 y 1940 directamente influenciados
por las ideas de Megnin, desde 1991 aparecieron reportes que describen los insectos
asociados con carroña (Moura et al., 1997).
Si bien ha podido comprobarse la coincidencia de familias y géneros de insectos de los que
suelen acudir a los cadáveres en muy diferentes y distantes puntos geográficos, es necesaria
la realización de investigaciones sistemáticas que permitan establecer las peculiaridades de
la fauna cadavérica en cada región geográfica. Algunos estudios de este tipo se han
realizado en diversas zonas del planeta, en la provincia de Cádiz en el sur de España en
cadáveres de perros realizado en tres épocas estacionales y en diferentes zonas: zona de
marismas, zona de campiña y zona de serranía (Romero-Polanco et al., 2006)
Estudios previos han demostrado que la mayoría de las sustancias involucradas en muertes
relacionadas con drogas son detectables por medio de análisis de gusanos que se alimentan
del cuerpo (Campobasso et al. 2004).
La entomotoxicología es una herramienta que tiene dos problemas a resolver:
a) La identificación y cuantificación de xenobióticos en artrópodos que se
alimentan de carroña, y su relevancia en la evaluación toxicológica de las causas
y circunstancias de muerte. De acuerdo a la literatura las drogas detectadas en
13
larvas incluyen barbitúricos, benzodiacepinas, antidepresivos, opiáceos,
derivados de anfetaminas, cocaína y/o benzoilecgonina, trazodona,
acetaminofén, salicilatos y malation.
b) El estudio de cambios inducidos por droga en el crecimiento de artrópodos con
respecto a la estimación del intervalo post-mortem por métodos entomológicos
(Tracqui et al., 2004).
En los cuerpos en descomposición, las larvas de moscas pueden ser usadas como sustrato
para análisis toxicológico y proveer información cuando se sospecha de envenenamiento.
Las larvas de la clase Diptera son frecuentemente usadas en cuerpos descompuestos
después de un tiempo largo cuando las muestras tradicionales de tejidos para análisis
toxicológico como sangre, orina u órganos sólidos han desaparecido (Campobasso et al.,
2004). El análisis toxicológico usado para materiales de insectos son generalmente los
mismos usados para tejidos humanos y fluidos biológicos e incluyen radioinmunoensayo
(RIA), cromatografía de gases (GC), cromatografía de gases/espectrometría de masas
(GC/MS) y cromatografía de líquidos de alta resolución/espectrometría de masas (HPLC-
MS) (Campobasso et al., 2004).
La historia de la entomotoxicología es relativamente corta. El primer reporte fue de Sohal y
Lamb en 1970, demostró la acumulación de diferentes metales, incluyendo cobre, fierro,
zinc y calcio, en tejido de moscas adultos.
En 1982 Nourteva describe la recuperación de mercurio en varias especies de califóridos.
Posteriormente Gunatilake y Goff detectan el plaguicida malation. En 1980 el primer
artículo sobre fenobarbital fue publicado por Beyer et al. En casos entomológicos otros
autores también analizan las muestras para drogas y narcóticos, en particular triazolam,
oxazepam, fenobarbital, alimemazina, clomipramina, bromazepam, levomeprazina y
clomipramina, morfina, cocaína, amitriptilina y nortriptilina, propoxifeno y acetaminofén,
opiáceos, temazepam, trazodona y trimipramina, salicilatos, paracetamol, aminohipurato
(Gagliano-Candela y Aventaggiato., 2001).
14
3. JUSTIFICACIÓN
La aplicación de los conocimientos de la entomología forense en la toxicología podría
convertirse en determinante en los casos de difícil diagnóstico de la posible causa de
muerte, cuando esta pudiera estar relacionada con el consumo de drogas y que por el estado
avanzado de descomposición del cadáver no se cuente con los tejidos idóneos para realizar
dichas pruebas toxicológicas. Por tal motivo, el utilizar las larvas y/o adultos de artrópodos
que se alimentan de los cadáveres es una alternativa en el análisis toxicológico forense.
Al administrarse clorhidrato de cocaína; a ratas y luego sacrificarlos, estos cadáveres
atraerán diversas especies de artrópodos que se alimentarán de los mismos e incorporarán la
droga y sus metabolitos que fueron previamente administrados, por lo que se espera
encontrar la sustancia en el cuerpo de dichos artrópodos.
Considerando lo anterior de igual forma al analizar la entomofauna presente en cadáver en
estado avanzado de descomposición se espera encontrar la droga y sus metabolitos cuando
se sospeche de su consumo.
15
4. HIPÓTESIS
Los metabolitos de clorhidrato de cocaína pueden aislarse de los artrópodos que colonizan
el cadáver, si en sus tejidos se encuentra este compuesto.
16
5. OBJETIVO GENERAL
Determinar los metabolitos de clorhidrato de cocaína en muestras de entomofauna
cadavérica obtenidas de cadáveres de ratas previamente tratadas, así como la
identificación de los artrópodos que colonizan el cadáver en diferentes épocas del
año en una zona de la Delegación Cuauhtémoc del Distrito Federal.
6. OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar los metabolitos del clorhidrato de cocaína en los artrópodos presentes
en cadáveres de ratas previamente tratados.
2. Proponer la técnica adecuada para la determinación de metabolitos de clorhidrato
de cocaína en entomofauna cadavérica.
3. Identificar las especies de artrópodos que colonizan los cadáveres de ratas
previamente tratados con el clorhidrato de cocaína en la zona urbana del Distrito
Federal.
17
7. MATERIAL Y MÉTODOS
Con base a los resultados del estudio preliminar hecho en la época de otoño-invierno 2008-
2009, en una zona del Distrito Federal en las coordenadas 19°25’21.569” y 99°08’58.00”.
Se determinaron las dosis para los experimentos posteriores tomando como dato la dosis
mínima letal de cocaína 1.2 g (Moffat et al., 1986) (Tabla 4), así como el volumen de
distribución a fin de comprobar que la dosis administrada se distribuyera de forma
homogénea en todo el organismo. El número de animales de experimentación por lote fue
de 5 individuos con un total de 20 y el tiempo entre la administración y el sacrificio por
dislocación cervical fue de 1 hora, así como el tiempo total de exposición fue durante 27
días.
Tabla 4. Asignación de la dosis administrada a cada uno de los ejemplares.
Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 4
0 g/Kg 0.3 g/Kg 0.75 g/Kg 1.2 g/Kg
Cada una de las diferentes cantidades fue disuelta en 0.3 mL de solución salina 0.85 % e
inyectada vía intraperitoneal en el individuo correspondiente y fueron sacrificados una hora
después de la administración y expuestos a temperatura ambiente.
Los ejemplares son expuestos en un área total de 4 m2, que está totalmente descubierta para
estar expuesta a lluvia, polvo, luz, etc., la distribución de los cuerpo se realizó de forma
lineal para cada uno de los diferentes (Figura 6)
Figura 6. Representación de la distribución de los cadáveres en donde se muestran los
diferentes lotes. El lote No. 1 es el grupo testigo, en el lote 2, se administró 0.3 g/Kg de
solución de clorhidrato de cocaína, en el lote 3, se administró 0.75 g/Kg de solución de
clorhidrato de cocaína, en el lote 4, se administró 1.2 g/Kg de clorhidrato de cocaína.
Lote 1 Lote 2 Lote 3
Lote 4
18
7.1 Análisis presuntivo para la determinación de metabolitos de clorhidrato de cocaína
Se realizó una curva con los controles de concentración conocida (150 ng/mL, 300 ng/mL,
500 ng/mL, 1000 ng/mL) de cocaína de la marca Dade Behring utilizado para el equipo
Viva Twin. Para este análisis se colectaron 3 g de larvas de dípteros en cada uno de los
ejemplares, durante el tiempo de monitoreo del experimento en cada una de las estaciones.
El procedimiento para la extracción de la droga de la matriz biológica, es la siguiente: 1 g
de muestra se le agregaron 2 mL de metanol, se trituró con homogeneizador de tejidos, se
agitó en vortex por 5 minutos (Perrigo y Joynt, 1989) y se centrifugaron 5 minutos (3000
r.p.m.) y el sobrenadante es separado y analizado por la técnica EMIT (Asselin et al.,
1988). Las muestras de resultado positivo para la técnica EMIT (Enzyme-Multiplied
Immunoassay Technique) se procesan para el análisis confirmativo.
7.2 Análisis confirmativo para la determinación de metabolitos clorhidrato de cocaína
Los aparatos digestivos resultantes de 1 g de muestra de larvas de dípteros con 3 mL de
agua bidestilda son triturados con un homogeneizador de tejidos, esta mezcla fue colectada
en un embudo de separación en donde se agregarón 6 mL de hexano, se agitó
vigorosamente por 1 minuto y se desechó la fase orgánica. Ésto se realizó en una segunda
ocasión, a la fase inorgánica se le agregarón 6 mL de una mezcla de cloroformo:
isopropanol: amoniaco (78:20:2) y se llevó a cabo la extracción, recuperando la fase
orgánica, este procedimiento se realizó dos veces más, la fase recuperada en las tres
extracciones se evaporó bajo corriente de nitrógeno, y se añadió 100 µL de BSTFA +
TMCS (N,O-bis(trimethylsilil) trifluoroacetamide y trimethylchlorosilane) y fue sometido
a 70°C durante 15 minutos; después de este procedimiento se inyectan 2 µl en el
cromatógrafo Agilent 6890N con un detector de masas Agilent 5973N en modo splitles.
Las condiciones de operación fueron las siguientes: la temperatura del inyector es de 250°C
en modo splitless, la temperatura inicial del horno es 100°C por 3 minutos, para después
aumentar 25°C/min hasta llegar a 300°C y mantenerse 15minutos, la presión fue de 21.74
psi, flujo total de 32.7 mL/min, el gas acarreador fue helio, Columna HP-5MS 5 % fenil
metil siloxano, la operación del detector de masas se realizó en forma scan con un intervalo
de detección de masa menor de 82.0 m/z y de masa mayor de 370 m/z. Para detectar la
benzoilecgonina-TMS los iones buscados son 82, 240,361 m/z, para ecgonina metil ester
82, 96, 271 m/z, para cadaverina tri-TMS son 174, 73 y 303 m/z.
Solo algunas drogas pueden ser determinadas en escarabajos o en sus exuvias, y esto se
logra utilizando métodos para extracción de la sustancia en cabello. (Gagliano y
Aventaggiato, 2001) por lo tanto las muestras de escarabajos, se trituraron con 10 mL de
HCl 10% y se incubó a 80ºC por 24 h, pasado este tiempo fue filtrado y recuperada la fase
del HCl y se realizó la extracción con una mezcla de cloroformo: isopropanol: amoniaco
(78:20:2) que fue agregada en proporción 2:1 respecto al volumen obtenido del filtrado, la
19
extracción con la mezcla se realiza 2 ocasiones más, al reunir las 3 porciones resultantes de
las extracciones son evaporadas bajo flujo de nitrógeno y se añade 100µL de BSTFA y es
sometido a 70°C durante 15 minutos para ser inyectado en el CG-EM mediante el mismo
método utilizado para larvas de dípteros.
7.3 Identificación taxonómica de larvas de dípteros
Se tomarón 10 ejemplares más y se sacrificarón sumergiéndolos en agua caliente, para
después transportarse en etanol al 70% (Lord y Burger, 1983). A dichos ejemplares se les
realizó el procedimiento de fijación, el cual consiste en:
1. Realizar un corte de forma sagital en la larva
2. Retirar el contenido del espécimen ayudándose de una solución de KOH al 10% a
90ºC durante 15 minutos.
3. Lavar con agua corriente
4. Lavar con agua destilada
5. Sumergir en agua acidulada (acido acético) 10 minutos
6. Deshidratar en alcohol al 70 % por 15 minutos
7. Deshidratar en alcohol al 80 % por 15 minutos
8. Deshidratar en alcohol al 90 % por 15 minutos
9. Deshidratar en alcohol al 96 % 15 minutos
10. Sumergir en xilol 30 minutos, y fijar en resina.(Alejandre-Aguilar y Martin-
Frias, 1996)
20
8. RESULTADOS
8.1 Análisis presuntivo para la determinación de clorhidrato de cocaína
El número total de muestras utilizadas para esta fase estuvieron determinadas por la
cantidad de tomas durante la duración del periodo larvario, especifico para cada una de las
épocas estacionales (Tabla 5).
Tabla 5. Tabla comparativa entre la temperatura media por estación y el periodo de
duración del periodo larvario
Estación Temperatura
°C
Duración
periodo larvario
Inicio toma de
muestra
Fin de toma de
muestra
Verano 18.5 11 Día 2 Día 11
Otoño 15.6 26 Día 10 Día 26
Invierno 14.5 26 Día 14 Día 26
Primavera 20.6 14 Día 7 Día 14
Así mismo el número de días en que se obtuvieron resultados positivos durante el periodo
de descomposición para todas las dosis administradas (Tabla 6)
Tabla 6. Periodo con obtención de resultados positivos dentro del intervalo total de
descomposición
Estación Intervalo de días de descomposición
Verano Del día 2 al día 9
Otoño Del día 10 al día 24
Invierno Del día 14 al día 26
Primavera Del día 7 al día 14
8.2 Análisis confirmativo para la determinación de clorhidrato de cocaína
Después de haber inyectado las muestras en el cromatografo de gases acoplado a
Espectrometria de Masas se obtuvieron tanto los cromatogramas como los espectros de
masas. En los cromatogramas mostrados para cada uno de los compuestos identificados se
puede observar que en la parte superior denominada como “a” se muestra el corrimiento
total de la muestra en donde cada uno de los picos cromatográficos representa un
compuesto específico el cual fue eluido en un tiempo (minutos) definido según el método
utilizado, así como la abundancia en la que se presenta; y en la parte inferior denominada
como “b” se logra observar la imagen amplificada en donde se especifican el pico que
representa el metabolito de importancia (Figuras 7,9,11)
21
Para las imágenes en las que se muestra los espectro de masas resultantes, en la parte
superior denominada como “a” se encuentra el espectro correspondiente a nuestra muestra
problema, enmarcando con un círculo rojo los iones principales que permiten la
identificación del compuesto, así mismo, también se muestra la estructura química, formula
condensada y nombre; y en la parte inferior de la imagen llamada “b” se encuentra el
espectro del compuesto proveniente de la biblioteca NIST 05 con el cual se corrobora la
identidad del compuesto detectado (Figuras 8,10,12)
Fig.7 Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del
compuesto benzoilecgonina-TMS. a) Corrimiento total de la muestra R9-1. b)
Acercamiento del pico cromatrográfico de la benzoilecgonina-TMS, en el minuto 7.55
22
Figura 8 .Espectro de benzoilecgonina-TMS. a) Espectro de masas de la muestra R9-1
indicando los iones principales. b) Espectro de masas de la biblioteca NIST 05 para el
compuesto benzoilecgonina-TMS
23
Fig.9. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento del
compuesto ecgonina metil éster. a) Corrimiento total de la muestra R9.b) Acercamiento del
pico cromatrográfico de la ecgonina metil éster, en el minuto 6.976
24
Figura 10.Espectro de ecgonina metil éster. a) Espectro de masas de la muestra R9
indicando los iones principales encontrados. b) Espectro de masas de la biblioteca NIST 05
para el compuesto ecgonina metil éster
25
Fig.11. Cromatrograma de larvas de dípteros, donde se muestra el tiempo de corrimiento
del compuesto cadaverina tri-TMS. a) Corrimiento total de la muestra R9.b) Acercamiento
del pico cromatrográfico de la cadaverina tri-TMS, en el minuto 3.720
26
Figura 12.Espectro de cadaverina tri-TMS. a) Espectro de masas de la muestra R9
indicando los iones principales encontrados. b) Espectro de masas de la biblioteca NIST 05
para el compuesto cadaverina tri-TMS.
27
8.3 Identificación taxonómica
Se observó la colonización de diferentes especies de artrópodos sobre los cadáveres de las
ratas los cuales fueron identificados, entre los que se encontraron ejemplares de los ordenes
Diptera y Coleoptera (Tabla 7)
Tabla 7. Especies de ejemplares del orden Diptera y Coleoptera identificadas
taxonómicamente
Orden: Diptera Orden: Coleoptera
Lucillia sp. Dermestes maculatus
Chrysomia sp Necrobia rufipes
Calliphora sp Saprinus sp
Sarcophaga sp.
Hydrotaea capensis
Las partes importantes para la identificación taxonómica de las larvas de dípteros son:
estigmas respiratorios posteriores, estigmas respiratorios anteriores, aparato cefalofaringeo
y la presencia de espinas o procesos carnosos (Figura 13).
Figura 13. Larva de díptero con estructuras anatómicas de utilización para identificación
taxonómica.
28
En base a las estructuras antes mostradas se identificaron diferentes especies de dípteros en
estadio larvario, así mismo se muestra el estadio adulto correspondiente a cada uno y las
estaciones en las que estuvieron presentes colonizando los cadáveres de ratas.. Hay que
observar que tanto el tamaño como las estructuras externas en las larvas son diferentes, de
esta forma es fácilmente apreciar una diferencia muy marcada en la larva del genero
Chrysomya que muestra procesos carnosos a diferencia de las demás que solo presentan
espinas distribuidas a todo lo largo del cuerpo. Los estigmas respiratorios posteriores
pueden presentar el peritrema abierto o incompleto como en el caso de Sarcophaga sp., o
presentar este peritrema mas grueso como en el caso de Chrysomya, o peritrema completo
como en el caso de Calliphora sp. y Lucillia sp., en el caso de los adultos es bastante
observable la diferencia de colores entre ellas, Lucillia sp. muestra un color verde metálico
con una coloración roja marcada en los ojos, los ejemplares del género Chrysomya sp.
También son llamadas moscas azules por su coloración azul metálico o en el caso de
Sarcophaga sp. La disposición de las bandas blancas y negras en el torax y la presencia de
un abdomen ajedrezado, sólo por mencionar algunas características (Figura 14)
29
Especie Larva Estigmas
respiratorios
posteriores
10x
Espinas
10x
Estigmas
respiratorios
anteriores
10x
Aparato
cefalofaringeo
10x
Adulto Aparición en
estación
Lucillia sp.
Predominando
en primavera
y verano
Chrysomya
sp.
Otoño
Invierno
Menor en
Verano y
primavera
Calliphora
sp.
Predominando
en invierno,
menor en
verano,
primavera y
otoño
Sarcophaga
sp.
Verano
Primavera
Menor en
Otoño e
Invierno
Figura 14. Esquematización de las especies de dípteros identificados taxonómicamente, con las estructuras en estadio larvario y
ejemplar de adulto, y la presencia de los dípteros en las épocas estacionales.
30
También se identificaron otras especies de artrópodos en estadio adulto colonizando los
cadáveres de ratas, entre los cuales encontramos ejemplares del género Saprinus,
Dermestes y Necrobia rufipes, los cuales son representantes del Orden Coleoptera, los
cuales se presentaron colonizando los cadáveres de ratas en las estaciones de primavera y
verano; otra especie de dípteros que se presentaron fueron ejemplares de Hydrotea capensis
que están relacionados con parasitismo hacia otros dípteros pero no están relacionados
específicamente con la sucesión cadavérica, sin embargo, pueden influir de forma indirecta
en el tiempo de descomposición de un cuerpo (Figura 15)
Saprinus sp
Necrobia rufipes
Dermestes sp
Hydrotea capensis
(díptero)
Figura 15. Ejemplares de coleópteros y díptero colonizadores de cadáveres.
8.4 Relación entre especies colonizadoras y temperatura
Al ocurrir la sucesión cadavérica el factor más crítico fue la temperatura, (Lord y Burger,
1983) de la cual va a depender el tiempo de aparición y variabilidad en el número de
especies. Por esta razón consideramos importante el hecho de monitorear la temperatura
ambiental para poder comparar entre una y otra estación, y la probable repercusión en la
diversidad de fauna cadavérica. Los datos de temperatura fueron obtenidos de la página
oficial del Servicio Meteorológico Nacional.
La diversidad de artrópodos en cada una de las épocas estacionales en cuanto a su tiempo
de aparición dentro del periodo total de descomposición, es diferente e incluso podemos
encontrar a ejemplares de distintas familias conviviendo en armonía en la ardua labor de
alimentarse de los diferentes tejidos de un cuerpo, en nuestro experimento logramos
observar la presencia de varios grupos de artrópodos y su colonización respecto al tiempo.
El tipo de artrópodos presentes en todas las estaciones fueron los dípteros, los ejemplares
31
del Orden Coleoptera sólo se presentaron en primavera y verano, ya que en estas estaciones
del año se presenta la temperatura adecuada para su desarrollo, aunque la función de éstos
dentro de la sucesión cadavérica no es descomponer los tejidos blandos, se encuentran
desde el principio de la exposición ya queen los primeros días depositan los huevos para
que cuando los dípteros hayan realizado su función las larvas de los coleópteros se
dediquen a descomponer la piel y anexos, los himenópteros sólo se presentaron en verano e
invierno por la misma razón de la temperatura mayor en comparación con los ácaros que se
presentaron en una sola estación y por un periodo muy corto (Tabla 9)
Cabe mencionar que cada uno de los grupos de artrópodos realiza una función específica
sobre la descomposición de los tejidos de los cuerpos pero pueden estar conviviendo en un
mismo momento, es decir, no es necesario que termine el periodo sarcofagico para que
comience el periodo dermesteriano y así sucesivamente.
Tabla 8. Aparición de artrópodos durante el periodo de exposición del cadáver.
Dípteros Coleópteros Himenópteros Ácaros
Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Verano
Otoño
Invierno
Primavera
32
9. DISCUSIÓN
El uso más amplio que se les ha dado a los insectos en el área legal es la estimación del
tiempo post-mortem, porque diferentes artrópodos son atraídos por los distintos estados de
descomposición de un cadáver, lo que produce una sucesión de ellos (Benecke, 1998), pero
debido a las variaciones apreciadas entre la fauna cadavérica se hace necesario conocer la
influencia que puede tener el medio geográfico y las condiciones climáticas en dicha
sucesión, por lo que surge la necesidad de realizar estudios experimentales de la fauna
tanatológica a nivel local, debido a que no existe registro alguno en el Distrito Federal, y
con ello se podría mejorar la aplicación práctica de estos conocimientos.
Ya que las condiciones climatológicas son suficientes para modificar la evolución
espontánea de la putrefacción cadavérica en uno u otro medio, así como para influir en la
mayor o menor riqueza entomológica de la zona e incluso sobre la duración del ciclo
biológico de las diferentes especies (Romero-Polanco et al. 2006). Lo que se logró observar
desde el estudio preliminar en donde se presentó exclusivamente la colonización por
especies de dípteros. En los 4 experimentos posteriores correspondientes a las 4 estaciones
del año mostraron una marcada diferencia en cuanto al número de familias representantes
de 2 órdenes diferentes: Diptera y Coleoptera; pudiendo observar que en todas las
estaciones se presentaron ejemplares de las familias Sarcophagidae y Calliphoridae, pero su
tiempo de permanencia fue mayor durante la época de primavera y verano predominando
los ejemplares de la amilia Sarcophagidae; los adultos representantes del orden Coleoptera
permanecieron menor tiempo y aparecieron de forma intermitente, es decir al principio de
la descomposición fueron atraídos los adultos y depositaron sus huevos, pero como
avanzaba el estado de descomposición fue haciéndose notable la ausencia gradual de
adultos y el aumento de larvas de coleópteros, ya que comenzaba el periodo de desecación
para alimentarse de la piel y anexos, no es de extrañar que se hayan encontrado estos
artrópodos ya que son los que comúnmente se han colectado alrededor de una escena del
crimen a lo largo del mundo. Esto coincide con lo observado por Introna y colaboradores en
Italia (1998); en Cali, Colombia por Barreto y colaboradores (2002), en Brazil por Carvalho
y colaboradores (2000), en Tennessee por Rodriguez y Bass (1983), en las islas Hawaianas
por Lee y Flynn (1991), en Tailandia por Sukontason y colaboradores (2001), entre muchos
más, destacando un reporte de éstas y otras familias en una zona de Aguascalientes
realizado por Martínez et al en 2009, sin duda una investigación que sirve para aportar una
gran información en el área de entomología forense en nuestro país y específicamente en la
zona mencionada, el trabajo antes mencionado también fue realizado en diferentes épocas
estacionales (primavera, otoño y verano). Además, el hallazgo de estos tipos de artrópodos
de acuerdo con el tiempo de exposición concuerda con lo encontrado por Lord y Burger en
1983, los cuales mencionan que los grupos de artrópodos más importantes durante los
primeros dos meses de descomposición de un cuerpo son los pertenecientes al orden
Diptera y Coleoptera. Sucediendo lo contrario en las estaciones frías en las que se presenta
una exclusiva colonización de ejemplares de dípteros, lo que es un factor importante en el
desarrollo de moscas (Ames & Turner 2003) esto es debido a que durante las temperaturas
bajas del otoño e invierno el numero y tipos de insectos carroñeros es menor por lo tanto la
degradación de los cadáveres es más lenta (Rodriguez y Bass 1983). Cabe mencionar que
los artrópodos presentes en la descomposición que ocurrió en las ratas expuestas son
33
sarcosaprófagos y depredadores con diferentes especies participantes dependiendo de la
región y la estación (Greenberg, 1991) ya que existe una diversidad específica para cada
región dependiendo de la altitud, humedad, tipo de suelo (ej.: arcilloso), entre otras, esto es
importante saberlo ya que en México no existe un diagrama de distribución de cada una de
las especies que pudiesen encontrarse en un área determinada, para poder determinar si un
cuerpo fue trasladado de una zona a otra o el deceso ocurrió en el lugar en donde fue
localizado, por lo que este estudio trata de mostrar una de las pequeñas muestras de
información que puede aportar la investigación entomológica que puede ser crucial para la
solución de casos legales.
Así mismo, cabe mencionar que el periodo de descomposición en la época de verano se
pudo haber modificado por la presencia de otro tipo de artrópodos parasitoides como
Hydrotea capensis los cuales depositan sus huevos sobre las pupas de las moscas para que
al emerger las larvas se alimente del contenido de dichas pupas, lo que por consecuencia
hace que la cantidad de adultos sea menor, esta especie son un ejemplo de control biológico
que puede ser a menudo entre especies estrechamente relacionadas con las especies que
comúnmente se encuentran en los cadáveres, además los parasitoides no son estrictamente
selectivos de una sola especie por lo tanto es de suponer que pueden infestar a las moscas
utilizadas como indicadores post-mortem, alterándose su desarrollo o matándolas, lo cual
trae como consecuencia la alteración de las investigaciones entomológicas (Turchetto y
Vanin, 2004).
Es muy importante para el toxicólogo forense seleccionar las muestras apropiadas para la
determinación e interpretación de niveles de drogas postmortem, porque la concentración
de drogas básicas en muestras biológicas tiende a incrementar tiempo después de la muerte
(Moriya y Hashimoto, 1996),lo que es tomado en cuenta para utilizar los especímenes
entomológicos como muestra de elección en un cadáver en descomposición sin embargo se
debe de tomar en cuenta diversos aspectos, el primero de ellos es que la sustancia tóxicas
pueden modificar el ciclo de vida de los artrópodos, por lo que la determinación
cuantitativa provee de un parámetro adicional para la evolución del intervalo postmortem
(Gagliano y Aventaggiato 2001) para de esta manera proporcionar información de
importancia en la ciencias forenses (Lord y Burger 1983) y otra consideración importante
es la notable disminución en concentración de drogas en estadios de no alimentación (pupa)
lo que es mejor trabajar con muestras de estados activos de alimentación (estadios
larvarios) ya que existen reportes de ausencia de algunas drogas en pupas que bien puede
ser atribuible a la eliminación de drogas durante el estado de larvas, o a que la
concentración está por debajo de los límites de detección de los métodos usados (Gagliano
y Aventaggiato 2001), lo que fue claramente observado el experimento preliminar en el que
en el estadio de pupas no fue posible detectar la sustancia a analizar. De esta forma se
decidió utilizar solo larvas de dípteros al ser encontrados a menudo en cuerpos en
descomposición, después de largos periodos en donde las muestras de tejido
tradicionalmente utilizados para análisis toxicológico como sangre, orina u órganos sólidos
tienden a desaparecer, para así comprobar los que algunos estudios previos han
demostrado: que la mayoría de las sustancias involucradas en la muerte son detectables a
través de análisis de larvas que se alimentaron de la droga o sus metabólitos (Campobasso
et al 2004) Se ha demostrado que existe una correlación entre la concentración de drogas o
toxinas en larvas y tejidos del cadáver, particularmente con cocaína y opiáceos aunque
34
también se ha demostrado que la concentración encontrada en larvas es significativamente
baja (Campobasso et al. 2004) lo que también nos hace pensar que tal vez debido a esta
razón como va avanzando la sucesión de fauna cadavérica va disminuyendo la cantidad
detectable de benzoilecgonina por el método EMIT.
Los resultados de análisis toxicológico de las muestras recolectadas dieron positivo para los
lotes a los que se les administró diferentes dosis de solución de clorhidrato de cocaína
aunque el intervalo en el que siguieron obteniéndose estos resultados fue diferente por
estación, ya que en las estaciones cálidas disminuyó al haber presentado la descomposición
en menor tiempo, pero también es importante mencionar que otra causa pudo ser la
degradación postmortem de algunas drogas y venenos es un proceso que es poco entendido
y que bien puede ocurrir como resultado de procesos metabólicos o derivar de la
descomposición química de moléculas lábiles (Robertson y Drummer, 1995).
El uso potencial de insectos como una muestra alternativa de detección de drogas y toxinas
ha sido documentada anteriormente, así también pueden surgir algunas limitaciones. Esto
incluye la posible bioacumulación de drogas a través del desarrollo larvario y la potencial
correlación entre la concentración de droga en larvas y los tejidos usados como una fuente
de alimento (Campobasso et al 2004) que hay que tomar en consideración para la correcta
interpretación de los resultados analíticos.
El procedimiento para la prueba confirmatoria de las muestras de larvas y pupas tanto de
dípteros como de coleópteros que fueron de los especímenes que más ejemplares se
recolectaron se realizó de formas diferentes debido a la naturaleza de las estructuras que
forman el exoesqueleto (Gagliano-Candela y Aventaggiato 2001) por lo que el
procedimiento para extraer la benzoilecgonina de la matriz biológica correspondiente tuvo
que ser especifico para una correcta detección.
El propósito general del estudio sobre la importancia de la presencia de cocaína en
investigaciones post-mortem es de importancia para la posible explicación de muertes que
aparentemente son inexplicables. Por lo que es de suma importancia saber seleccionar los
métodos que van a ser utilizados de manera rutinaria que puedan detectar la cocaína o su
metabolito, la benzoilecgonina, e incluso ambos. Basándonos en estos conocimientos
elegimos una técnica para la prueba presuntiva, la cual es una técnica inmunológica
llamada EMIT porque tiene la ventaja de ser rápida, directa de la muestra y detecta el
metabolito de cocaína: benzoilecgonina. (Finkle y McClosey, 1978). En nuestro caso las
muestras no podían ser analizadas directamente por lo que se hizo un tratamiento previo, el
cual fue realizado de acuerdo a la optimización de extractos metanolicos para sangre
realizada en 1989 por Perrigo y Joynt, esto debido a que las técnicas analíticas para
muestras entomológicas son iguales o con ligeras variaciones que las utilizadas para otro
tejidos comúnmente usados.
Para el análisis confirmativo es importante mencionar que el procedimiento de
derivatización nos permitió detectar la benzoilecgonina por cromatografía de gases, lo cual
no hubiese sido posible sin dicho procedimiento, debido a la naturaleza polar del
compuesto (Jain et al, 1977). También se logró detectar el segundo metabolito principal
derivado de la biotransformación del clorhidrato de cocaína que es la ecgonina metil éster,
35
lo que nos permite asegurar que al momento de la muerte del individuo el compuesto
inyectado ya había sido biotransformado por enzimas carboxilesterasas presentes en tejidos
como corazón, estómago, riñón, colon y más abundantes en hígado (Laizure et al, 2003) y
que al alimentarse las larvas de dípteros de éstos tejidos blandos del cadáver se pudo aislar
el compuesto del cuerpo de estos estadios juveniles. También se tiene que considerar que
después de la muerte varios mecanismos pueden dar lugar a un incremento artificial de
concentraciones en sangre de droga. En primer lugar, una droga puede ser liberada post
mortem de tejidos finos con altas concentraciones de la droga y redistribuir por medio de la
difusión y de la convección de la sangre y de otros líquidos en el cuerpo, ya que ha sido
verificado experimentalmente que los pulmones son una fuente del liberación post mortem
de la droga a la sangre. En segundo lugar, la difusión de la droga sin absorber. En tercer
lugar, el reflujo post mortem del material rico en droga del estómago en vías aéreas siguió
por el lanzamiento a la sangre puede dar lugar a concentraciones falsamente elevadas de la
droga en sangre del corazón y otros tejidos centrales (Hilberg et al 1999).
Otro compuesto que se logró detectar en forma derivatizada fue la cadaverina tri-TMS que
no es un compuesto resultado de la biotransformación del clorhidrato de cocaína, pero es un
compuesto presente en cuerpos en descomposición o también conocido como compuesto de
putrefacción que es un producto de degradación microbiológica que nos sirve como
indicador para demostrar que la muestra proviene de un cadáver.
36
10. CONCLUSIONES
Se propuso la técnica adecuada para la detección específica por Cromatografia de
Gases con Detector de Masas de metabolitos de clorhidrato de cocaína en fases
larvarias de entomofauna cadavérica.
Se determinó semicuantitativamente la benzoilecgonina en estadios larvarios de
dípteros presentes en cadáveres de ratas previamente tratados con clorhidrato de
cocaína.
Se identificaron los siguientes metabolitos: benzoilecgonina-TMS y ecgonina metil
éster.
Se identificaron los siguientes géneros de artrópodos que colonizaron los cadáveres
de ratas en la colonia Doctores del D. Federal: Lucillia sp, Chrysomia sp,
Calliphora sp, Sarcophaga sp, Hydrotea capensis, Saprinus, Dermestes maculatus y
Necrobia rufipes.
Hay una diferencia marcada en diversidad de entomofauna en las estaciones cálidas
(verano y primavera) en comparación a las estaciones frías (otoño e invierno)
37
11. BIBLIOGRAFÍA
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