deusielly da silva avelar - monografias.ufrn.br · primeiramente a deus, por me proteger e me...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
Atividade antioxidante e isolamento de flavonóides glicosilados
de Waltheria ferruginea
Deusielly da Silva Avelar
Natal/RN
2016
Deusielly da Silva Avelar
Atividade antioxidante e isolamento de flavonóides glicosilados
de Waltheria ferruginea
Natal-RN
2016
Monografia apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial
para obtenção do título de Bacharel em
Química.
Orientadora: Profª. Drª. Renata
Mendonça Araújo
Co-orientador: Prof. Ms. Rusceli Diego de
Araújo
Deusielly da Silva Avelar
Atividade antioxidante e isolamento de flavonóides glicosilados
de Waltheria ferruginea.
Monografia submetida ao Instituto de Química, da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como
requisito parcial à obtenção do titulo de Bacharel em
Química.
Orientadora: Profª Drª Renata Mendonça de Araujo
Natal/RN
2016
Dedico este trabalho a
Deus por ter me guiado em
todos os caminhos difíceis. Aos
meus pais que me sempre me
incentivaram e me deram forças.
Ao meu noivo por estar sempre
ao meu lado em todos os
momentos.
Tudo posso naquele que me fortalece.
Deusielly da Silva Avelar
Atividade antioxidante e isolamento de flavonóides glicosilados
de Waltheria ferruginea
Aprovado em:____/____/_______
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________ Profa. Dra. Renata Mendonça Araújo
Orientadora
_____________________________________
Prof. Ms. Rusceli Diego de Araujo Co-Orientador
_____________________________________ Prof. Dr. Fabiano do Espírito Santo Gomes
Trabalho de conclusão de curso para
obtenção do título de graduação em
Química Bacharelado, apresentado à
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte – UFRN.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por me proteger e me iluminar dia após dia,
estando sempre ao meu lado me guardando de qualquer mal.
Aos meus pais João e Cândida sempre me deram força, apoio e total
incentivo no desenvolvimento do mesmo bem como no meu progresso
acadêmico. Amo vocês.
A minha irmã Lilian que apesar da distância sempre foi minha fonte de
força, coragem e dedicação aos estudos, e a minha irmã Deusiany por ter nela
um exemplo a ser seguido.
Ao meu noivo Mykevison pelas renúncias feitas, por todo
companheirismo, confiança, força, carinho e compreensão, estando ao meu
lado em todos os momentos. Te amo.
A minha orientadora, Profª. Renata pelos ensinamentos, dedicação,
orientação, incentivos e amizade, sempre me aconselhando, mostrando
caminhos e portas abertas para o futuro.
Ao meu amigo Kleiton, pelas explicações e ajuda dada quando cheguei
ao laboratório.
Ao meu co-orientador, amigo de todas as horas, Rusceli, por toda
amizade, presteza, esclarecimentos (os quais não foram poucos) e toda ajuda
que me forneceu no laboratório e durante o desenvolvimento do presente
trabalho. Muito obrigado!
As minhas amigas, melhor presente que a faculdade me trouxe Anne,
Jéssica, Sheeza, Taiannie e Raphaella que caminharam junto comigo para
mais essa vitória, por todas lagrimas derramadas e por sempre estarem ao
meu lado, muito obrigado. Adoro muito vocês.
A todos os colegas de laboratório, que de uma forma ou de outra
colaboraram, Erivaldo, Edson, Anne, Taiannie, Nara, Marcela, Rusceli, Gizelly,
Janielly, Jessica, Sheeza, Muito Obrigado.
A meu chefe Bruno pela oportunidade e pela família Aquanalous que me
recebeu super bem. Principalmente as minhas aqualoucas, Cristiane e Yzabelli
que fazem meu dia de trabalho mais feliz. MUITO OBRIGADA!
A todos os meus amigos e familiares que sempre acreditaram e me
deram incentivos para continuar essa caminhada.
Por fim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma
para a finalização deste trabalho. Obrigado!
RESUMO
Este trabalho relata o estudo fitoquímico das folhas de Waltheria
ferruginea e o teste de atividade antioxidante, pelo método do DPPH da fração
hidroalcoólica. Esta espécie, comumente encontrada no Nordeste do Brasil,
revelou-se como fonte de flavonoides glicosilados. O tratamento cromatográfico
do extrato etanólico das folhas, permitiu o isolamento e purificação de dois
flavonoides: canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo e canferol-3-O-β-
glicopiranosídeo, ambas as moléculas com atividades biológicas comprovadas
na literatura, mas inéditas para a espécie. O extrato etanólico das folhas de W.
ferruginea apresentou resultados satisfatórios em testes de atividade
antioxidante. A determinação estrutural dos metabólitos secundários isolados
foi realizada através de técnicas espectrométricas: Ressonância Magnética
Nuclear de Hidrogênio-1 e Carbono-13, através de seqüências de pulsos uni e
bidimensionais e comparação com dados de RMN da literatura.
Palavras-chave: Estudo fitoquímico, metabólitos secundários, Waltheria
ferruginea, teste antioxidante.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Classes de substâncias naturais produzidas pelo metabolismo primário e secundário e biorreações...................
16
Figura 2- Fotos de Waltheria ferruginea no seu habitat natural (a) e
ocorrência da espécie por região do Brasil (b).........................
20
Figura 3- Estruturas básicas de um flavonoide........................................ 21
Figura 4- Rota biossintetica geral dos flavonoides................................... 21
Figura 5- Proposta de formação do acido chiquimico.............................. 22
Figura 6- Proposta de formação do acido cinamico (4-cumaril-CoA)....... 23
Figura 7- Proposta de formação da flavonona......................................... 24
Figura 8- Estrutura genérica de uma chalcona........................................ 25
Figura 9- Estrutura genérica de uma flavona........................................... 25
Figura10- Estrutura genérica de um flavonol............................................ 26
Figura11- Estrutura genérica de uma flavona........................................... 26
Figura12- Estrutura genérica de uma antocianinas................................... 27
Figura13- Estrutura genérica de um isoflavonoide.................................... 27
Figura14- (A)DPPH na sua forma oxidada, na cor púrpura, (B)DPPH coloração amarela, na sua forma reduzida...............................
38
Figura15- Espectro de RMN 1H (500MHz MeOH) de WFFE-1................. 47
Figura16- Espectro de RMN 13C (500MHz Piridina) de WFFE-1.............. 48
Figura17- Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H,13C – HMBC de WFFE-1......................................................
49
Figura18- Espectro de RMN bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H –COSY de WFFE-1.....................................................
50
Figura19- Espectro de RMN 1H de WFFE-2 (MeOH, 300 MHz).................. 52
Figura20- Curva da atividade antioxidante versus concentração do extrato hidroalcoolico, a absorbância (1)..................................
41
Figura21- Curva da atividade antioxidante versus concentração do extrato hidroalcoolico, a absorbância (2)..................................
42
Figura22- Curva da atividade antioxidante versus concentração do extrato hidroalcoolico, a absorbância (3).................................
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Dados referentes ao modo de eluição utilizado no
fracionamento cromatográfico de WFFE-
H.............................................................................................
33
Tabela 2- Dados referentes ao fracionamento cromatográfico
WFFH..........................................................................................
34
Tabela 3- Dados referentes ao modo de eluição utilizado no
fracionamento cromatográfico de WFFE-
H.................................................................................................
34
Tabela 4- Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-
H...................................................................................................
35
Tabela 5- Dados referentes ao modo de eluição utilizado no
fracionamento cromatográfico de WFFE-
C............................................................................................
35
Tabela 6- Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-
C...........................................................................................
35
Tabela 7- Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-
A...........................................................................................
38
Tabela 8- Dados das concentrações, absorbâncias e atividades
antioxidante..................................................................................
40
LISTA DE ABREVIATURAS
%AA Porcentagem da atividade antioxidante
CCD Cromatografia de camada delgada
DPPH Composto químico 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
RMN 1H Ressonância Magnetica Nuclear de Hidrogenio
RMN 13C Ressonância Magnetica Nuclear de Carbono-13
HSQC Correlação heteronuclear
HMBC Correlação homonuclear
WFFE Extrato etanolico da folha de Waltheria ferruginea
WFFH Extrato hexanico da folha de Waltheria ferruginea
SUMÁRIO 1. Introdução ................................................................................................ 15
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 18
2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 18
2.2 Objetivos específicos ............................................................................... 18
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................. 19
3.1 Waltheria ferruginea ................................................................................. 19
3.2. Flavonoides ............................................................................................. 20
3.3. Rota Biosintética dos flavonoides ........................................................ 21
3.4. Classes de Flavonoides .......................................................................... 24
3.4.1 Chalconas .............................................................................................. 25
3.4.2 Flavonas ................................................................................................. 25
3.4.3 Flavonois ................................................................................................ 26
3.4.4. Flavanonas ............................................................................................ 26
3.4.5 Antocianinas .......................................................................................... 26
3.4.6 Isoflavonoides ....................................................................................... 27
3.5. Métodos de isolamento dos compostos .............................................. 28
3.5.1. Cromatografia em camada delgada (CCD) ......................................... 28
3.6. Cromatografia em Coluna ....................................................................... 28
4. Parte Experimental ..................................................................................... 29
4.1. Métodos Cromatográficos ...................................................................... 29
4.1.2 Cromatografia de Adsorção ................................................................. 29
4.1.3. Cromatografia de Exclusão ................................................................. 30
4.1.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .. Erro! Indicador não definido.
4.2 Métodos Espectrométricos ..................................................................... 31
4.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
(RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C) ........................................................... 31
4.3 Estudo Fitoquimico de W. ferruginea ..................................................... 33
4.3.1. Partição Liquido-liquido de WFFE ...................................................... 33
4.3.1.1. Fracionamento Cromatográfico da fração WFFH ........................... 33
Tabela 1: Dados referentes ao modo de eluição utilizado no fracionamento
cromatográfico de WFFH. .............................................................................. 33
Tabela 2: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFH. ...... 34
4.3.2 Fracionamento Cromatografico da fração WFFE-H ........................... 34
Tabela 3: Dados referentes ao modo de eluição utilizado no fracionamento
cromatográfico WFFE-H. ............................................................................... 34
Tabela 4: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-H. .. 35
4.3.1.2. Fracionamento Cromatografico da fração WFFE-C ....................... 35
Tabela 5: Dados referentes ao modo de eluição utilizado no fracionamento
cromatográfico WFFE-C. ............................................................................... 35
Tabela 6: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-C. .. 35
4.3.1.3. Fracionamento Cromatografico da fração WFFE-A ....................... 36
Tabela 7: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-A. .. 36
4.4. Estudo para a Atividade Antioxidante (AA%) ....................................... 37
5. Resultados e discussão ............................................................................. 38
5.1. Avaliação da atividade antioxidante pela captura do radical livre ...... 38
5.1.1. Analise das curvas .............................................................................. 39
5.2. Caracterização dos metabolitos secundários da Waltheria ferruginea
......................................................................................................................... 44
5.2.1. Caracterização do flavonoide WFFE-1 .............................................. 44
5.2.2. Caracterização do flavonoide WFFE-2 ............................................... 50
6. CONCLUSÃO................................................................................................57
15
1. INTRODUÇÃO
O uso de plantas como medicamento é, provavelmente, tão antigo
quanto o aparecimento do próprio homem. A preocupação com a cura de
doenças sempre se fez presente ao longo da história da humanidade. No início
da década de 1990, a organização Mundial da Saúde (OMS) divulgou que
65%-80% da população dos países em desenvolvimento dependiam das
plantas medicinais como a única forma de acesso aos cuidados básicos de
saúde (MACIEL; PINTO & VEIGA JÚNIOR, 2005).
Os povos primitivos utilizavam as plantas para os mais variados fins, por
exemplo: nutricionais, medicinais, tóxicos e também utilizavam como corantes
para seus rituais. A biodiversidade do Brasil é considerada uma fonte
promissora de substâncias biologicamente ativas, sendo fundamental sua
preservação, tanto pelo valor intrínseco dessa imensa riqueza biológica, como
pelo seu enorme potencial como fonte de novos fármacos. (BARREIRO &
BOILZANI, 1999).
O desenvolvimento sustentável de um país depende essencialmente de
uma política consistente de educação, ciência e tecnologia e inovação,
sustentada na preservação da natureza, na biodiversidade e na exploração
racional de fontes naturais necessárias para alimentação, avanço social e
econômico. As atividades da fitoquímica podem contribuir significativamente
para a concretização através da investigação da flora e seu quimismo, da
divulgação e geração de novos conhecimentos. A química de produtos
naturais, fitoquímica como é conhecida atualmente, se dedica principalmente à
caracterização estrutural, avaliação das propriedades e investigações
biossintéticas de substancias naturais produzidas pelo metabolismo secundário
de organismos vivos. (BRAZ FILHO, 2009).
As plantas, através do seu metabolismo secundário, sintetizam
substâncias que são úteis para sua defesa e que podem também servir como
moduladores hormonais ou para atrair polinizadores. Muitas destas substâncias
são reconhecidas por outros organismos apresentando alguma propriedade
biológica ou farmacológica, podendo ser benéfica ou tóxica, como mostrado na
figura 1 a seguir.
16
Figura 1: Classes de substâncias naturais produzidas pelo metabolismo primário e secundário e biorreações.
Fonte: BRAZ FILHO, 2009.
Frente a essa grande variedade de diferentes substâncias produzidas
através dos metabolismos primário e secundário dos seres vivos pode destacar
o Brasil, ele possui a maior diversidade genética em espécies de plantas no
mundo, porém, menos de 10% foram avaliadas quanto às suas características
biológicas e, menos de 5% foram submetidas a estudos fitoquímicos
detalhados. Apesar de um recente aumento de pesquisas nesta área, as
plantas ainda constituem uma fonte relativamente subutilizada e,
17
potencialmente, muito valiosa para descoberta de novas substâncias
biologicamente ativas (Luna et al. 2005).
Ao longo dos anos, as pesquisas com plantas medicinais
mostraram-se promissoras em relação à obtenção de novas substâncias com
atividades farmacológicas definidas e com grandes potencialidades de
transformações destas substâncias em medicamentos, seja por isolamento
direto ou por modificações estruturais através da síntese orgânica. No caso
particular do câncer isto é verdade, até 2003, cerca de 60% das drogas em uso
são de origem natural ou derivada de um protótipo natural (Cragg et al., 1997;
2003).
Produtos naturais abundantes e facilmente acessíveis podem servir
como matéria-prima para a preparação de novas moléculas com potencial e
aplicação na área de fármacos ou ainda como inseticidas.
Tendo em vista o grande potencial apresentado pelas plantas e a
riqueza vegetal brasileira com muitas espécies ainda inexploradas, o presente
trabalho é dedicado principalmente à caracterização estrutural, avaliação de
propriedades e investigações biossintéticas de substâncias naturais produzidas
pelo metabolito secundário de organismos vivos.
Os flavonóides são os compostos fenólicos mais importantes e
diversificados entre os produtos naturais, é um pigmento natural encontrado em
vegetais e tem um papel muito importante contra agentes antioxidantes,
acredita-se também q a ingestão de frutas e legumes frescos previne contra
câncer e doenças cardíacas. Dado que essas substâncias não podem ser
sintetizadas pelo nosso organismo, são obtidos através da ingestão de
alimentos que o contenham ou através de suplementos nutritivos, como frutas,
legumes, vinhos, chá preto, chá verde, entre outros (ANGELO, 2007).
A espécie W. Ferruginea não possui estudo relatado na literatura e este
trabalho visa suprir esta lacuna e contribuir para o conhecimento químico desta
espécie. O estudo químico foi realizado através de métodos cromatográficos e
a elucidação estrutural dos metabólitos secundários obtidos foi realizada a
partir da análise de dados espectroscópicos do tipo Ressonância Magnética
Nuclear 1 H e 13C unidimensional.
18
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Realizar a investigação fitoquímica de Waltheria Ferruginea, visando o
isolamento dos flavonoides com potencial biológico.
2.2 Objetivos específicos
- Isolar por métodos cromatográficos os flavonoides da W. ferruginea.
- Utilizar técnicas RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais, para caracterização
dos metabólitos secundários, como também se familiarizar com as informações
que esta técnica disponibiliza.
- Realizar teste antioxidante com o extrato de W. ferruginea pelo método
DPPH.
19
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Waltheria ferruginea
Sterculiaceae é uma vasta família constituída de 68 gêneros e cerca de
1100 espécies espalhadas em todo o mundo, sendo que no Brasil ocorrem 11
gêneros e 115 espécies, dentre estas 60 pertencem ao gênero Waltheria.
Investigações químicas em espécies de Waltheria mostraram que muitas são
ricas em flavonoides, triterpenos, compostos polifenólicos, saponinas,
alcaloides, entre outros (GRESSLER, 2006).
As plantas pertencentes a essa família apresentam-se como grandes
arbustos nas matas montanhosas, vivendo nos mais variados ambientes, de
areia e solo pedregosos. (GRESSLER, 2008)
Waltheria ferruginia é um arbusto, algumas vezes uma arvoreta, de 1 a 4
metros de altura, que apresenta ramos alongados, densos velutinos, folhas de
coloração verde escura, aveludadas e flores amareladas como mostrado na
figura 2 abaixo.
Figura 2: Fotos de Waltheria ferruginea no seu habitat natural (a) e ocorrência da
espécie por região do Brasil (b).
Fonte: (a) autoria própr ia, (b) specieslink em 16/06/2016
20
3.2. Flavonoides
Os flavonóides são os compostos fenólicos mais importantes e
diversificados entre os produtos naturais. Os flavonoides são pigmentos
naturais presentes nos vegetais que desempenham um papel fundamental na
proteção contra agentes oxidantes, como por exemplo, os raios ultravioletas, a
poluição ambiental, substâncias químicas presentes nos alimentos, entre
outros, e atuam também como agentes terapêuticos num elevado número de
patologias tais como arteriosclerose e cancro (SILVA, 2010). Acredita-se
também que as propriedades antioxidantes dos flavonoides presentes em
frutas e hortaliças frescas contribuam para seu efeito preventivo contra o
câncer e as doenças cardíacas (SARKER, NAHAR, 2009). Dado que essas
substâncias não podem ser sintetizadas pelo nosso organismo, sendo
representativos da parte não energética da dieta humana, são obtidas através
da ingestão de alimentos que o contenham ou através de suplementos
nutritivos. Exemplos de fontes de flavonoides são: frutas, verduras, cerveja,
vinho, chá verde, chá preto, soja dentre outras. Com exemplo do que foi
anteriormente citado, a maioria dos flavonoides presentes no vinho provém da
uva, especialmente da pele, e do processo fermentativo (SILVA, 2010).
Os flavonoides são compostos de origem biossintética mista, envolvendo
blocos provenientes da via poliacetato (anel A) e da via do chiquimato (anel B)
como apresentado na figura 3.
Figura 3: Estruturas básicas de um flavonoide.
O
O
2'
5'
6'
2
310
5
6
7
89
A C
B
Fonte: autoria própria.
21
3.3. Rota Biosintética dos flavonoides
Os flavonoides tem sua origem a partir de duas rotas: Chiquimato e
acetato-malonato, conforme apresentado na figura 4, a seguir.
Figura 4: Rota biosintética geral dos flavonoides.
Fonte: autoria própria.
O ácido chiquimico é gerado pelo acoplamento do fosfoenolpiruvato com
D-eritrose-4-fosfato, resultando no ácido 7-fosfato-3-desoxi-D-arabino-
heptulosônico, o qual sofre eliminação de ácido fosfórico e reação aldólica
intramolecular para produzir o ácido 3-dehidroquinico. Este intermediário é
convertido em ácido chiquimico após desidratação e redução com NADPH
(DEWICK, 2002) como ilustrado na figura 5 a seguir.
22
Figura 5: Proposta de formação do ácido chiquímico
Fonte: autoria própria.
O aminoácido L-fenilalanina tem como precursor o acido fenilpiruvico,
formado pela descarboxilação e aromatização do ácido prefênico originado
pelo ácido chorismico. Este pode se transformar respectivamente em ácido
cinâmico e ácido p-cumarico, após eliminação de amônia da cadeia lateral.
Dessa forma, o ácido p-cumárico é mais comumente produzido por hidroxilação
do ácido cinâmico, de acordo com a figura abaixo (DEWICK,2002).
23
Figura 6: Proposta de formação do ácido cinâmico (4-cumaril-CoA).
Fonte: Autoria própria.
A condensação da molécula de p-cumarioil-SCoA com mais três
moléculas de malonil-SCoA produz aumento da cadeia lateral, a qual se
aromatiza após enolização das carbonilas cetônicas. O produto gerado, a
naringenina-chalcona, pode converter-se na forma isomérica conhecida como
flavonona.
24
Figura 7: Proposta de formação da flavonona.
Fonte: Autoria própria.
3.4. Classes de Flavonoides
Os flavonoides podem ser classificados de acordo com suas origens
biossintéticas. Estruturalmente, os flavonoides constituem substâncias
aromáticas com 15 átomos de carbono (C15) no seu esqueleto básico. A
explicação para a existência de uma grande diversidade estrutural dos
flavonóides é explicada pelas modificações que tais compostos podem sofrer,
tais como: hidroxilação, metilação, acilação, glicosilação, entre outras (Koes et
al, 1994).
A partir da chalcona, todos os demais derivados flavonoídicos são
formados. De acordo com o grau de oxidação do anel C, os flavonoides são
divididos em várias subclasses, sendo elas: flavona, flavonol, flavanona, flavan-
3,4-diol, chalcona, antocianina, isoflavona e flavanol (ANDERSEN, 2006;
DEWICK, 2002). Estes compostos têm propriedades químicas semelhantes
aos fenóis simples, ficando relativamente solúveis em água especialmente
25
quando existir açúcar ligado a estrutura do flavonoide, em etanol, metanol e
butanol, por serem compostos relativamente polares (VILA, 2006). O estado
de oxidação do anel heterociclico e a posição do anel B, ambos são
importantes na classificação.
3.4.1 Chalconas
São derivados de três unidades de acetato e uma unidade de ácido
cinâmico, encontradas em plantas como precursores de flavonoides, como é
mostrado abaixo:
Figura 8: Estrutura genérica de uma chalcona.
3X acetato
OH
OH
OH
O ácido cinâmico
Fonte: autoria própria.
3.4.2 Flavonas
Geralmente ocorrem em famílias herbáceas, (ex.: Lamiaceae, Apiaceae,
Asteraceae), cuja estrutura básica está representada na figura abaixo:
Figura 9: Estrutura genérica de uma flavona.
O
OH
OH
O
Fonte: autoria própria.
26
3.4.3 Flavonois
Geralmente ocorrem em angiospermas herbáceas, Flavonois são
flavonas substituídas na posição C-3 por hidroxila. Cujo exemplo é mostrado a
seguir:
Figura 10: Estrutura genérica de um flavonol.
O
OHOOH
OH
Fonte: autoria própria.
3.4.4. Flavanonas
Flavanonas são encontradas quase que exclusivamente em frutas
cítricas.
Figura 11: Estrutura genérica de uma flavanona.
O
OOH
OH
CH3
3.4.5 Antocianinas
Depois da clorofila, é o grupo mais importante e mais difundido de
pigmentos solúveis em água que conferem cor as plantas responsáveis por
todas as cores como rosa, escarlate, vermelha, malva, violeta e azul, nas
pétalas folhas e frutos. Cujo exemplo e mostrado abaixo.
27
Figura 12: exemplo de uma antocianinas.
O+
R
OH
R
R
Fonte: autoria própria.
3.4.6 Isoflavonoides
Em contraste com a maioria de outros flavonoides, isoflavonoides tem
uma distribuição taxonômica um tanto limitada. Apresenta variação estrutural,
onde ocorre a migração arílica do anel B solicitada da posição 2 anterior ou
posição beta para a posição 3 ou posição alfa.
Figura 13: Estrutura genérica de um isoflavonoide.
O
OOH
OH
Fonte: autoria própria.
28
3.5. Métodos de isolamento dos compostos
3.5.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)
A cromatografia em camada delgada (ou fina) consiste na separação
dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma
camada delgada de adsorventes retida sobre uma superfície plana. Técnica
indispensável para análise de substâncias orgânicas. E principalmente para
análise qualitativa.
Dentre as aplicações da CCD estão:
Determinar a pureza de uma amostra ;
Comparação entre duas amostras;
Determinar o solvente apropriado para uma separação por cromatografia de
coluna;
O principio dessa técnica está relacionado com o poder adsorvente da
fase estacionária sólida e na solubilidade da fase móvel, para com a amostra
em estudo. (PAVIA, 2009).
3.6. Cromatografia em Coluna
Essa técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e
purificação de produtos de reações químicas. As fases estacionárias mais
utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir
simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. Fases
estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias
líquidas por partição. (DEGANI, CASS, VIEIRA, 1998).
29
4. Parte Experimental
4.1. Métodos Cromatográficos
A cromatografia é um método físico-químico de separação que se
fundamenta na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a
diferentes interações entre duas fases imiscíveis: fase móvel (gás, líquido ou
um fluido supercrítico) e a fase estacionária fixa (colocada em uma coluna ou
numa superfície sólida). A grande variedade de combinações entre fases
móveis e estacionárias torna a técnica extremamente versátil e de grande
aplicação.
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos,
por comparação de padrões previamente existentes, para a purificação de
compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos
compostos de uma mistura (DEGANI, CASS, VIEIRA, 1998).
A cromatografia é dividida em diferentes categorias com base no
mecanismo de interação entre o soluto e a fase estacionária.
4.1.1 Cromatografia de Adsorção
As cromatografias de adsorção foram realizadas com gel de sílica 60 (Φ
µm 63 - 200) e de sílica 60 para cromatografia flash (Φ µm 40-63), marca
Merck. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as
quantidades das amostras utilizadas. Em ambas foram utilizadas colunas de
vidro.
Para a eluição foram empregados os seguintes solventes: hexano,
diclorometano, clorofórmio, acetato de etila e metanol puros ou misturas entre
dois deles para se obter soluções com polaridades intermediárias a estes.
As cromatoplacas analíticas (gel de sílica 60 (∅ µm 2-25) sobre poliéster
T-6145, marca Sigma Chemical CO), foram reveladas por exposição à luz
ultravioleta de comprimento de onda (254 e 366nm) realizada em aparelho
Spectroline modelo ENF-240 C/F e/ou por aspersão com solução de vanilina
(C8H8O3) e ácido perclórico (HClO4) em etanol (C2H6O), seguido de
30
aquecimento de 100°C por aproximadamente 1 minuto ou ainda por exposição
a vapores de iodo.
4.1.2. Cromatografia de Exclusão
Para os fracionamentos por cromatografia de exclusão foi usado gel de
dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals, utilizando-se metanol
puro.
31
4.2 Métodos Espectrométricos
4.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
(RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C)
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN
1H) e Carbono-13 (RMN 13C), uni e bidimensionais, foram obtidos em
espectrômetros Bruker, modelo Avance DPX-300 e/ou modelo Avance DRX-
500, no Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética
Nuclear da Universidade Federal do Ceará.
O espectrômetro Bruker Avance DRX-300, equipado com sonda de
detecção inversa de 5 mm e magneto de 7,0 T, foi operado nas frequências de
300,13 e 75,47 MHz para hidrogênio e carbono, respectivamente. Nos
experimentos realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500, foram aplicadas
frequências de 500,13 MHz (1H) e 125,75 MHz (13C), sob um campo magnético
de 11,7 T. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: sonda dual de 5
mm com detecção direta (experimentos unidimensionais) e sonda multinuclear
de 5 mm com detecção inversa (experimentos bidimensionais).
As amostras foram dissolvidas em alíquotas de 0,6 mL de solvente
deuterado: clorofórmio (CDCl3), metanol (CD3OD) ou piridina (C5D5N),
comercializados pelas companhias ACROS, Cambridge Isotope Laboratories,
Merck ou Aldrich.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão
(ppm) e referenciados, no caso dos espectros de Hidrogênio, pelos picos
dos hidrogênios pertencentes às moléculas residuais não-deuteradas dos
solventes deuterados utilizados: benzeno (δ 7,16), clorofórmio (δ 7,27), dimetil
sulfóxido (δ 2,50), metanol (δ 3,31), piridina (δ 8,74; 7,58; 7,22) e acetona (δ
2,05). Nos espectros de carbono-13, os deslocamentos químicos foram
referenciados pelos picos centrais dos carbonos-13 dos solventes: benzeno (δ
128,39), clorofórmio (δ 77,23), dimetil sulfóxido (δ 39,50), metanol (δ 49,17),
piridina (δ 150,35; 135,91; 123,87) e acetona (δ 206,68 e 29,92).
As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H
foram indicadas segundo a convenção: s (simpleto), d (dubleto), dd (duplo
dubleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).
32
Nos experimentos unidimensionais de 1H e de 13C foram estabelecidos
os seguintes valores para os parâmetros de aquisição, respectivamente:
larguras espectrais de 24 e 260 ppm, intervalo para relaxação de 1s e largura
de pulso de 90o de 9,60 µs (0 dB) e 10,90 µs (-3 dB) para 1H e 13C,
respectivamente. Para todos os experimentos unidimensionais foram utilizados
65356 pontos para a aquisição e 32768 para o processamento, enquanto para
os experimentos bidimensionais foram utilizados 2048 x 256 pontos para a
matriz de dados de aquisição e 2048 x 1024 pontos para o processamento.
Predição linear para o processamento 2D, utilizando 80 coeficientes, foi usada
quando necessária. O número de transientes variou de 8, para 1H, a 16384,
para 13C, para os experimentos unidimensionais, e 2n (n≥2) para
bidimensionais, dependendo do experimento e quantidade de amostra
disponível.
Os micros programas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H
(zg), 13C-CPD (zgpg), 13C-DEPT 135° (dept135), gs-COSY (cosygp), gs-
NOESY (noesygpph), gs-HSQC (hsqcgpph), gs-HMBC (hmbclpndqf) e gs-
TOCSY (tocsygp). A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization
Transfer), com ângulos de nutação de 135°, CH e CH3 com amplitudes em
oposição aos CH2, e 90°, somente CH, foi utilizada na determinação do padrão
de hidrogenação dos carbonos em RMN 13C, descrito segundo a convenção: C
(carbono não hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico
ou metilidênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não hidrogenados
foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.
Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY,
NOESY e TOCSY) e heteronuclear (HSQC-TOCSY, HSQC e HMBC),
realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500, foram efetuados em sonda
multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se gradiente de
campo, posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados
para os experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n ≥ 2.
33
4.3 Estudos fitoquímico de W. ferruginea
As folhas de um espécime de W. ferruginea coletados na chapada do
Ibiapava - CE. Elas foram secas e trituradas, sendo posteriormente submetidas
à extração exaustiva inicialmente com hexano, em seguida com etanol a
temperatura ambiente. A solução resultante foi filtrada e o solvente destilado
em evaporador rotativo sob pressão reduzida, para obtenção de 9,86 g do
extrato etanólico denominado WFFE e 2,7339 g do extrato hexânico
denominado WFFH.
4.3.1. Partição Liquido-liquido de WFFE
Todo extrato resinoso (9,86 g) de WFFE foi submetido à partição líquido-
líquido, dissolvido em água e metanol, fornecendo as seguintes frações:
hexano (WFFE-H - 1,65 g), clorofórmio (WFFE-C - 0,27 g), acetato de etila
(WFFE-A -1,17g) e hidroalcoólica (WFFE-Aq - 6,12 g).
4.3.1.1. Fracionamento Cromatográfico da fração WFFH
Uma alíquota de WFFH 2,73 g foi submetida a cromatografia em coluna
comum do tipo filtrante, utilizando eluição gradiente com os solventes Hexano,
Clorofórmio, Acetato de etila e Metanol, como mostrado na tabela abaixo:
Tabela 1: Dados referentes ao modo de eluição utilizado no fracionamento cromatográfico de
WFFH.
Eluente V(mL) Frações
Hexano 100% 300 mL WFFH 1-5
Hexano\Clorofórmio 5% 400 mL WFFH 5-25
Hexano\Clorofórmio 1:1 350 mL WFFH 25-38
Acetato\Clorofórmio 1:1 150 mL WFFH 38-50
Acetato 100% 100 mL WFFH 50-65
Acetato\Metanol 1:1 200 mL WFFH 65-82
Metanol 100% 180 mL WFFH 83-116
Fonte: autoria própria.
34
As frações obtidas a partir desse experimento foram analisadas em CCD
e reunidas conforme semelhança.
Tabela 2: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFH.
Fração Massa (g)
WFFH 1-5 0,005
WFFH 6-10 0,028
WFFH 11-17 0,086
WFFH 18-19 0,034
WFFH 20-24 0,041
WFFH 25-27 0,009
WFFH 28-31 0,036
WFFH 32-39 0,057
WFFH 40-47 0,052
WFFH 48-51 0,024
WFFH 52-70 0,031
WFFH 72-76 0,034
WFFH 77-85 0,045
WFFH 86-95 0,183
WFFH 96-107 0,015
WFFH 108-116 0,045
Fonte: autoria própria.
4.3.2 Fracionamento Cromatográfico da fração WFFE-H
WFFE-H 1,5 g foi submetido a cromatografia em coluna, utilizando gel
de sílica do tipo “flash” (22,0 g) a baixa pressão, utilizando eluição gradiente
com os solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, como
mostrado na tabela abaixo.
Tabela 3: Dados referentes ao modo de eluição utilizado no fracionamento cromatográfico
WFFE-H.
Eluente V(mL) Fração
Hexano\Cloroformio 20% 200 mL WFFE-H(1-2)
Cloroformio\acetato 50% 200 mL WFFE-H(3-6)
Acetato 100% 100 mL WFFE-H(7-9)
Metanol 100% 100 mL WFFE-H(10)
Fonte: autoria própria.
35
As frações obtidas foram analisadas em CCD e reunidas conforme
semelhança.
Tabela 4: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-H.
Fração Massa
WFFE-H (1) 0,0110
WFFE-H (2) 0,0107
WFFE-H (3) 0,0112
WFFE-H (4) 0,0123
WFFE-H (5-6) 0,3598
WFFE-H (8) 0,0174
WFFE-H (9) 0,0038
WFFE-H (10) 0,0392
Fonte: autoria própria.
4.3.1.2. Fracionamento Cromatográfico da fração WFFE-C
0,25 g do extrato foi submetida a tratamento cromatográfico em coluna,
utilizando gel de sílica do tipo flash (30,0 g) a baixa pressão, utilizando eluição
gradiente com os solventes Clorofórmio\metanol.
Tabela 5: Dados referentes ao modo de eluição utilizado no fracionamento cromatográfico
WFFE-C.
Eluente V (mL) Fração
Clorofórmio/Metanol 5% 100mL WFFE-C (1-5)
Clorofórmio/Metanol 15% 200mL WFFE-C (6-13)
Clorofórmio/Metanol 25% 250mL WFFE-C (14-17)
Clorofórmio/Metanol 30% 100mL WFFE-C (18-21)
Metanol 100% 50 mL WFFE-C (22-24)
Fonte: autoria própria.
As frações obtidas a partir desse experimento foram analisadas em CCD
e reunidas conforme semelhança.
Tabela 6: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-C.
Fração Massa
WFFE-C (1-2) 0,1106
WFFE-C (3) 0,0081
WFFE-C (4-7) 0,0199
36
WFFE-C (8) 0,0287
WFFE-C (9-10) 0,0247
WFFE-C (11-13) 0,0151
WFFE-C (14-24) 0,1095
Fonte: autoria própria.
4.3.1.3. Fracionamento Cromatografico da fração WFFE-A
Uma alíquota de 1,2 g da fração WFFE-A foi inicialmente dissolvida em 3
mL de matanol e acondicionada em 100 g de sephadex LH-20, em uma coluna
de 5 cm de diâmetro, sendo submetida a cromatrografia por exclusão
molecular. Este procedimento forneceu 60 frações, que foram reunidas, após
comparação por CCD, resultando em 9 frações, como mostrado na tabela
abaixo:
Tabela 7: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico WFFE-A.
Fração Massa (g)
Spx-WFFE-A (1-6) 0,1591
Spx-WFFE-A (7-8) 0,0461
Spx-WFFE-A (9-16) 0,1062
Spx-WFFE-A (17-21) 0,1199
Spx-WFFE-A (22-27) 0,1414
Spx-WFFE-A (28-31) 0,3709
Spx-WFFE-A (32-37) 0,0596
Spx-WFFE-A (38-60) 0,1218
Fonte: autoria própria.
A análise das frações por RMN 1H demonstrou a predominância de
moléculas pertencentes à classe dos flavonoides. As frações Spx-WFFE-A (28-
31 e 32-37) (x-y), denominados de F-1 e F-2, apresentaram-se como uma
mistura composta basicamente de flavonoides glicosilados.
37
4.4. Estudo para a Atividade Antioxidante (AA%)
O procedimento foi baseado segundo Souza (2007), com algumas
modificações. Da fração hidroalcoólica de W. ferruginea preparou-se uma
solução na concentração de 500 µg/mL pela dissolução em metanol (solução
mãe). Através desta solução mãe foram preparadas diluições nas
concentrações de 25, 50, 75, 100, 150 e 250 µg/mL com volumes totais de 2,0
mL cada. De cada uma destas diluições e da solução mãe foram removidas
alíquotas de 0,3 mL, em triplicata, e a cada uma destas foi adicionado 2,7 mL
de DPPH, totalizando 3 mL. O branco foi preparado pela adição de 2,7 mL de
metanol à 0,3mL das amostras. Preparadas as soluções esperou-se 30
minutos para então iniciar as medidas de absorbância, onde foi utilizado
o comprimento de onda λ=517 nm. Os valores médios obtidos foram aplicados
na equação abaixo:
AA% = 100 – {[Absamostra - Absbranco) x 100]/Abscontrole}
Onde:
Absamostra = 0,3 mL da Amostra + 2,7 mL de DPPH
Absbranco = 0,3 mL da amostra + 2,7 mL de MeOH
Abscontrole = DPPH puro (0,04 mg/mL)
38
5. Resultados e discussão
5.1. Avaliação da atividade antioxidante pela captura do radical livre
Esse método consiste em avaliar a capacidade antioxidante via atividade
sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Este possui
coloração púrpura, absorvendo a um comprimento de onda máximo de
aproximadamente 517 nm. Esta técnica é muito utilizada para se determinar a
atividade antioxidante em extratos e substâncias isoladas como compostos
fenólicos tais como: flavonoides, cumarinas, antocianinas, antocianidinas,
dentre outros. Por ação de um antioxidante ou uma espécie radicalar, o DPPH
é reduzido, formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com
consequente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada
pelo decréscimo da absorbância. A partir dos resultados obtidos, determina-se
a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres
e/ou porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional.
Figura 14: (A) DPPH na sua forma oxidada, na cor púrpura. (B) DPPH coloração amarela
na sua forma reduzida.
Fonte: autoria própria
A B B
39
5.1.1. Análise das curvas
Com a finalidade de avaliar a capacidade dos constituintes do extrato
hidroalcoólico de W. ferruginea em capturar radicais livres (DPPH) foi feita
análise da solução deste extrato com DPPH. Os resultados foram expressos
em percentagem de inibição de oxidação, ou seja, a porcentagem de atividade
antioxidante é correspondente à quantidade de DPPH consumida pelo
antioxidante. Quanto maior o consumo de DPPH pela amostra, maior é sua
atividade antioxidante (AA%) (Alves et al., 2007). Sendo assim, quanto maior a
concentração da amostra e menor a absorbância, maior o consumo de DPPH.
A amostra apresentou capacidade de consumo de DPPH, visto que as
absorbâncias após reação de DPPH com as diferentes concentrações das
amostras testadas tiveram um valor significativo, o que pode demonstrar a
atividade antioxidante para o extrato testado. Dentre as sete concentrações
testadas.
Com os valores obtidos foi construído um gráfico de % Ativ. antiox. x
concentração em µg/mL. Para o cálculo do IC50 foi utilizada a equação da reta,
substituindo o valor de y por 50 para obtenção da concentração da amostra
com capacidade de reduzir 50% do DPPH, de acordo com os valores da tabela
abaixo:
40
Tabela 08: dados das concentrações, absorbâncias e atividades antioxidante.
Concen
tração
µg.mL-1
Control
e
Branco ABS 1 ABS 2 ABS 3 AA% 1 AA% 2 AA% 3
25 1,025 0,001 0,879 0,885 0,884 11,804 11,219 11,317
50 1,025 0,002 0,822 0,825 0,823 17,366 17,073 17,268
75 1,025 0,003 0,761 0,766 0,762 23,317 22,829 29,219
100 1,025 0,005 0,713 0,702 0,718 28 29,073 27,512
150 1,025 0,007 0,588 0,606 0,598 40,195 38,439 39,219
250 1,025 0,009 0,478 0,485 0,488 51,804 51,122 50,829
500 1,025 0,022 0,254 0,121 0,118 74,927 87,902 88,195
Fonte: autoria própria.
41
Gráfico 01: Curva da atividade antioxidante versus concentração do extrato
hidroalcoólico, a absorbâncias (1)(µg/mL).
Fonte: autoria própria.
A correlação entre a atividade antioxidante (%) e a concentração do extrato
utilizado para o gráfico 01 (Y = 0,2256x + 6,0878) com R2 = 0,9987 forneceu
um IC50 de 194,64 µg.mL-1, que é a concentração de extrato necessária para
atingir 50% de atividade antioxidante.
42
Gráfico 02: Curva da atividade antioxidante versus concentração do extrato
hidroalcoólico, a absorbâncias (2)(µg/mL).
Fonte: autoria própia.
A correlação entre a atividade antioxidante (%) e a concentração do extrato
utilizado para o gráfico 01 (Y = 0,2193x + 6,1801) com R2 = 0,9965 forneceu
um IC50 de 199,85 µg.mL-1, que é a concentração de extrato necessária para
atingir 50% de atividade antioxidante.
43
Gráfico 03: Curva da atividade antioxidante versus concentração do extrato
hidroalcoólico, a absorbâncias (3)(µg/mL).
Fonte: autoria própia.
A correlação entre a atividade antioxidante (%) e a concentração do extrato
utilizado para o grafico 01 (Y = 0,2204x + 6,0724) com R2 = 0,9981 forneceu
um IC50 de 199,30 µg.mL-1, que é a concentração de extrato necessária para
atingir 50% de atividade antioxidante.
Após todas as análises, foi feita uma média dos valores de IC50 no qual
obtivemos o seguinte valor para todas as %AA e seu desvio padrão como
descrito abaixo.
IC50 = 197,93±2,86
Com base no IC50 obtido a avaliação da %AA do extrato de Waltheria
apresentou um bom grau de captura do radical livre DPPH, isso é justificado
pela presença de flavonoides e outros compostos aromáticos presentes no
extrato.
44
5.2. Caracterização dos metabólitos secundários da Waltheria ferruginea
O extrato etanólico da W. ferruginea foi submetido à partição líquido-
líquido, seguido por cromatografia de exclusão em Sephadex do tipo LH-20,
rendendo frações com grandes quantidades de flavonoides e substâncias
puras, as quais serão apresentadas a seguir.
5.2.1. Caracterização do flavonoide WFFE-1
A fração WFFE-1 apresentou-se como um sólido amarelado. Após
análise por RMN pode-se concluir que esta fração era composta de uma
substância de natureza flavonoidica, caracterizado posteriormente como
flavonoide glicosilado, denominado camferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-
glicopiranosídeo.
O sistema ABC característico de um núcleo flavonônico foi evidenciado
pelos sinais de hidrogênio ligados a carbono sp2, integrando um total de doze
hidrogênios, dos quais dez são característicos de compostos aromáticos e
outros em δ 6,1 ppm (d, J=15,9) e δ 7,4 ppm (d, J=15,9) correspondem a
hidrogênios ligados a dupla ligação com estereoquímica trans. O espectro de
RMN 1H apresentou também um dupleto integrado para um hidrogênio em δ
5,2 (J=7,25 Hz), que juntamente com dois duplos dupletos em δ 4,16
(J=6,5/11,75Hz) e δ 4,28 (J=11,8 Hz) e o padrão de sobreposição de picos
entre δ 3,4 e δ 3,5 sugerem a presença de uma unidade de açúcar na
molécula, sendo atribuídos ao hidrogênio do carbono anomérico e aos
metilênicos.
Dois dupletos em δ 7,98 (J= 9,0 Hz) e δ 6,79 (J= 9,0 Hz) integrados para
dois hidrogênios, característico de acoplamento orto, demonstraram a presença
de um sistema AA’BB’ no composto. Esses dados juntamente com um terceiro
par de dupletos acoplando entre si em δ 6,05 (J=16 Hz) e δ 7,38 (J=16 Hz),
sugeriram uma unidade de ácido p-cumárico com configuração trans (E).
A análise detalhada do espectro bidimensional de correlação
heteronuclear a uma ligação HSQC associada à multiplicidade e os
deslocamentos químicos, permitiu correlacionar os sinais dos hidrogênios aos
45
seus respectivos carbonos. Em δ 4,1 e 4,4 ppm notam-se dois átomos de
hidrogênios correlacionados com um único átomo de carbono em δ 62,95, o
que propõe um ambiente eletromagnético diferente, constatando um par de
hidrogênios diastereotópicos.
O acoplamento em meta dos hidrogênios em δ 6,1 (H6) e δ 6,25 (H-8)
protegidos pelas hidroxilas permite concluir que este é um anel A de flavonoide
5,7 oxigenado.
O espectro RMN 13C exibiu vinte e seis linhas espectrais, onde quatro
sinais com mais intensidade associados a carbonos aromáticos equivalentes
(δ114,63; δ115,38; δ129,77; δ130,82) juntamente com mais dez sinais para
carbonos sp2 aromáticos, foram condizentes com a presença de três sistemas
aromáticos contendo quatro posições oxigenadas (δ 164,68; 161,79; 160,09;
159,74). Em δ 102,62 foi identificado o carbono anomérico e entre δ 62,95 e δ
74,60 os demais carbonos pertencentes à unidade de glicose, confirmando a
presença desta e determinando um glucosil.
Estes dados discutidos até o momento associados à ausência de sinal
entre δ 6,0 e 7,0 ppm, correspondente ao hidrogênio H3 do anel C de
flavonoides sugere que a F1 trate-se de um flavonol, formado por um padrão
de substituição do tipo do camferol.
O COSY mostra que acoplamentos entre H6, H8 e H7’’’, H8’’’ estão
visíveis. Observam-se ainda os acoplamentos diferentes e entre si dos átomos
de hidrogênios diastereotópicos e do H1’’ com átomos da unidade glicosídica.
No espectro de HMBC pode-se observar o acoplamento dos hidrogênios
6’’ com o carbono 9’’’ (δ 167,42), o que comprova a ligação entre a unidade de
acido cumárico e unidade glicosídica. O acoplamento observado entre o H-1’’
(δ 5,1) e C3 (δ 133,82) também determina a posição da ligação da unidade
osídica.
Os dados do RMN 1H e 13C obtidos para WFFE-1 e comparação com
dados da literatura permitiu caracterizar este composto como o camferol-3-O-
β- (6''-cumaroil)-glicopiranosídeo, que apresenta propriedades anti-
inflamatórias e inibidora da enzima TcGAPDH, presente no Trypanosona cruzi.
(JÚNIOR, 2010) (GOULART, 2012).
46
Figura 15: Espetro de RMN 1H (500MHz, MeOD) de WFFE-1.
Fonte: autoria própria.
47
Figura 16: Espectro de RMN 13C (125MHz, piridina) de WFFE-1.
Fonte: autoria própria.
48
Fonte: autoria própria.
Figura 17: Espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear 1H,
13C–HMBC de WFFE-1.
49
Figura 18: Espectro de RMN bidimensional de correlação homonuclear 1H,
1H – COSY de WFFE-1.
Fonte: autoria própria.
50
5.2.2. Caracterização do flavonoide WFFE-2
O espectro de RMN 1H do composto F2 se mostrou bastante similar a
F1, se diferenciando deste pela ausência da unidade do ácido cumárico. O
espectro de RMN 1H também exibiu um padrão típico de compostos da classe
dos flavonoides, com quatro sinais em deslocamento químico acima de δ 6.0,
integrando um total de seis hidrogênios de natureza aromática. Observa-se a
presença de dois dupletos sobrepostos, acoplando em orto, em 8,0 ppm (J=
8,8; H2’ e H6’) e 6,9 ppm (J= 8,8; H3’ e H5’), referentes ao anel B e dois
dupletos acoplados em meta (J= 1,4, H6 e H8). A presença de um dupleto
integrando um hidrogênio em δ 5,2 com J = 7,25 Hz, juntamente com o
conjunto de sinais entre δ 3,1 e δ 3,7 ppm, confirmam a presença da uma
unidade de açúcar na molécula.
Com os dados de RMN 1H e comparação da literatura, pode-se concluir
que o composto isolado de W. ferruginea se trata do canferol-3-O-β-
glicopiranosídeo, como mostra o espectro abaixo:
51
Figura 19 : Espectro de RMN 1H de WFFE-2 (MeOH, 300 MHz).
Fonte: autoria própria.
52
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho mostrou-se eficaz no propósito de otimizar o método
de isolamento para obtenção de flavonóides de W. ferruginea, já que este se
fez apenas por cromatografia do tipo flash, seguido por cromatografia de
exclusão em Sephadex LH-20, descrito anteriormente apenas por
cromatografia líquida de alta eficiência.
O estudo fitoquímico permitiu o isolamento e caracterização estrutural de
quantidade razoável de canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo, canferol-
3-O-β-glicopiranosídeo, o que possibilita a realização de ensaios citotóxicos
mais completos com a substância e com vários derivados que podem ser
preparados.
A RMN 1H e 13C mostrou ser uma técnica espectrométrica extremamente
importante e útil na elucidação dos compostos analisados. Apenas com o uso
desta técnica e comparação feita com a literatura chegaram-se às estruturas
dos metabólitos secundários apresentados.
Os dados de atividade antioxidante foram satisfatórios e compatíveis
com a literatura, que tem correlacionado esta atividade com a presença de
compostos fenólicos e flavonoides nas espécies bioativas.
53
REFERENCIAS
ANDERSEN, O. M.; MARKHAM, K. R. Flavonoids - Chemistry, Biochemistry
and Applications. CRC Taylor & Francis: Boca Raton, 2006.
Disponível em:
http://blogs.cimav.edu.mx/daniel.glossman/data/files/Libros/Flavonoids%20-
%20Chemistry,%20Biochemistry%20and%20Applications.pdf: Acesso Maio de
2015.
ANGELO, M.P.; JORGE, N.; Compostos fenólicos em alimentos - uma
breve revisão. Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.) vol.66 no.1, São Paulo, 2007.
Disponível em:
http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0073-
98552007000100001&lng=pt Acesso em: Março de 2016.
BARREIRO, E.J.; BOLZANI, V.S.; Biodiversidade: fonte potencial para a
descoberta de fármacos. Quimica Nova, vol 32, Nº 3, p. 679-688, 2009.
CRAGG, G.M; NEWMAN D.J. SNADER, K.M. Natural products in drug dicovery
and developmente. J. Nat. prod. V. 60, p.52-60, 1997.
Disponivel em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/np9604893: Acesso em: 9 de Agosto de
2015.
CRAGG, G.M; NEWMAN D.J. SNADER, K.M. Natural products as source of
new drugs over the period of 1981-2002. Journal of Natural products. 66: 1022
– 1037, 2003.
Disponivel em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/np030096l: Acesso em: 9 de Agosto de
2015.
DEGANI, A.L.G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P.C.; Cromatografia um breve ensaio.
Química nova na escola, Nº 7, maio, 1998.
DEWICK, P.M. Medicinal Natural Products: A biosynthetic Approach. 2nd ed. New York: Jonh Wiley e Sons, p.202 , 2002.
Disponivel em:
54
https://www.dmt-nexus.me/doc/Medicinal%20Natural%20Products%20-%20A%20Biosynthetic%20Approach.pdf: Acesso em: 25 de Março de 2015.
DORNAS, W.C. ; OLIVEIRA, T.T.; RODRIGUES-DAS-DORES, R.G. ; SANTOS, A.F. ; NAGEM, T.J; Flavonóides:potencial terapêutico no estresse oxidativo, Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 28, n.3, p. 241- 249, 2007.
Disponível em:
http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/Cien_Farm/article/viewFile/235/230: Acesso em: Dezembro de 2015.
FILHO, R.B.: Contribuição da fitoquimica para o desenvolvimento de um pais emergente. Química Nova, vol 33, Nº 1, p. 229 – 239, 2009.
Disponível em:
http://quimicanova.sbq.org.br/imagebank/pdf/Vol33No1_229_39-AG09398.pdf: Acesso em: Novembro de 2014.
GRESSLER, V. Estudo Fitoquímico e da Atividade Antimicrobiana de Waltheria douradinha Saint Hilaire. 2006. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Santa Maria – UFSM, 2006.
Disponível em:
http://cascavel.cpd.ufsm.br/tede/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=181: Acesso em: Janeiro de 2014.
GRESSLER, V.; STUKER, C. Z.; DIAS, G. O. C, et al, Quinolone alkaloids
from Waltheria douradinha. Phytochemistry v.69, n.4, p.994–999, 2008
Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942207006371 Acesso
em: Maio de 2015.
GOULART, R. R. Otimização do flavonoides tilirosídeo como inibidor da
enzima gliceraldeído-3-fosfato desigrogenase de Trypanosama Cruzi.
Dissertação de Mestrado - USP, 2012.
Disponível em:
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-25072012-090452/pt-
br.php Acesso em: Setembro de 2015.
55
JUNIOR, V.F.V.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M. Plantas medicinais: cura
segura? Química Nova, vol 28, Nº 3, p. 519 – 528, 2005.
Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422005000300026&lng=en&nrm=iso&tlng=pt: Acesso em: Agosto 2015.
KOES, R. E.; QUATTROCCHIO, F.; MOL, J. N. M. The flavonoide biosyn the ticpathway in plants: function and evolution . Bioessays, v.16 (12), p.123-
132, 1994.
Disponível em:
http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio17/17_f.pdf: Acesso em Junho de 2014.
NEGRI, M.L.S.; POSSAMAI, J.C.; NOKASHIMA,T.; Atividade antioxidante das folhas de espinheira-santa - Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss., secas em diferentes temperaturas, Revista Brasileira de Farmacognosia, Abr./Jun. 2009.
Disponível em:
http://www.scielo.br/pdf/rbfar/v19n2b/a07v192b.pdf: Acesso em: Fevereiro de 2016.
OLIVEIRA, T.T, SILVA, R.R., DORNAS, W., NAGEM, J.T., Flavonoides e
arteroclerose, vol. 42(1): 49-54, 2010.
Disponível em:
http://200.239.128.16/bitstream/123456789/760/1/ARTIGO_FlavonoidesAterosc
lerose.pdf: Acesso em: Novembro de 2015.
PAVIA, D.L. LAMPMAM, G.M.; KRIZ, G.S.; VYVYAN, J.R.; Introdução a espectroscopia. Tradução por Pedro Barros. São Paulo: Cengage Learning, 2010. Cap. 3, p. 101 – 136.
QUEIROZ. G.S.; FLAVONOIDES DE Bunchosia armeniaca E DERIVADOS DE 2-ARILIDENO-1-ALFA-TETRALONA: OBTENÇÃO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS, 2012. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade
Federal de Santa Catarina – UFSC, 2012. Disponível em: https://repositorio.ufsc.br/bitstream/handle/123456789/96149/302116.pdf: Acesso em: Julho de 2014.
56
RUFINO, M.S.M., ALVES, E.R., BRITO, S.E., MORAIS, M.S., SAMPAIO, G.C.,
PÉREZ-JIMÉNEZ, J., SAURA-CALIXTO, D.F., Metodologia cientifica:
Determinação da atividade antioxidante total em frutas pela captura do
radical livre DPPH – EMBRAPA. Julho, 2007 Fortaleza, CE
Disponível em:
http://www.cnpat.embrapa.br/cnpat/down/index.php?pub/Cot_127.pdf Acesso
em: Abril de 2016.
SANTOS JÚNIOR, H. M.; TIRELLI, A.A.; CARVALHO, H. W. P.; OLIVEIRA, D.
F.; PRADO, N. R. T; CAMPOS,V. P. Purificação do flavonóide trans-
tilirosídeo do extrato metanólico das folhas de Gochnatia barrosii Cabrera
(asteraceae) e avaliação da sua atividade nematicida. Ciênc. agrotec. v.34,
n.5, 2010.
Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1413-
70542010000500021 Acesso em: Setembro de 2015.
SARKER, S.D.; NAHAR,L.; Química para estudantes de farmacia: química geral, orgânica e de produtos naturais. Tradução por Claudia Lucia Caetano
de Araujo. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. Cap 6, p. 302 – 309.
SOUSA, C. M. M., SILVA, H. R., VIEIRA-JUNIOR, G. M., AYRES, M. C. C.,
COSTA, C. L. S., ARAUJO, D. S., CAVALCANTE, L. C. D., BARROS, E. D. S.,
ARAUJO, P. B. M., BRANDAO, M. S., CHAVES, M. H. fenóis totais e
atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova. V 30, N
2, 351-355, 2007.
Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422007000200021&lng=pt Acesso em: Março 2016.
VILA F. C. Identificação dos flavonoides com atividade antioxidante da
cana-deaçúcar. (Saccharumofficinarum L.), 2006. Disserteção (Mestrado
em Química) – Universidade de São Paulo,SP, 2006
Disponível em:
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75132/tde-11042007-110413/pt-
br.php: Acesso em: Setembro de 2015.