développement d'un simulateur vasculaire original et d'un modèle lésionnel pour...
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Travaux presentes a la Peripheral Vascular SurgicalSociety - Hiver 2007
Developpement d’un simulateur vasculaireoriginal et d’un modele lesionnel pourevaluer la reponse des cellules musculaireslisses apres angioplastie a ballonnet
K. Bethany Acampora,1 Eugene M. Langan III, 2 Richard S. Miller,3
Martine LaBerge,1 Clemson et Greenville, Caroline du Sud, Etats-Unis
Apres angioplastie a ballonnet, la denudation des cellules endotheliales expose les cellulesmusculaires lisses vasculaires (CML) aux forces de cisaillement normalement invisibles duflux sanguin. Les etudes in vivo etudient la reponse aux lesions d’angioplastie, mais peud’etudes ont ete realisees avec des systemes in vitro. Afin d’etudier la reponse des CML invitro, un simulateur de cisaillement et de forces de tension a ete developpe pour fournir desniveaux cliniquement significatifs de forces de contrainte et de cisaillement en plus de lasimulation de forces semblables a celles liees a l’angioplastie a ballonnet. Dans cette etudeaigue (8 hr), des CML aortiques de rat proliferaient de maniere significative apres les forcesde tension accrues liees aux lesions d’angioplastie et l’exposition au cisaillement parcomparaison aux niveaux moindres d’exposition a une tension semblable au niveauphysiologique normal, avec une augmentation moyenne de 75% du nombre de cellules dugroupe lesionnel compare au groupe dynamique normal. Les CML exposees aux lesionsd’angioplastie a ballonnet et aux forces mecaniques de cisaillement et de tension simultaneesavaient une diminution de l’expression du marqueur phenotypique contractile a-actinemusculaire lisse. Ces resultats demontrent l’efficacite du modele developpe pour l’angioplastiein vitro et de l’environnement mecanique simule pour les cellules. Ceci fournit un modele invitro pour isoler les effets des forces mecaniques simultanees et pourrait egalement constituerune etape preliminaire vers une utilisation dans la recherche pharmaceutique pour lareduction ou la prevention de la proliferation des CML due aux forces mecaniques modifieespar les procedures endovasculaires.
DOI of original article: 10.1016/j.avsg.2007.07.013.1Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC,
Etats-Unis.2Department of Vascular Surgery, Greenville Hospital System,
Greenville, SC, Etats-Unis.3Department of Mechanical Engineering, Clemson University,
Clemson, SC, Etats-Unis.
Correspondance : Martine LaBerge, Department of Bioengineering,Clemson University, 401 Rhodes Hall, Clemson, SC 29634, USA,E-mail: [email protected]
Ann Vasc Surg 2008; 21: 734-741DOI: 10.1016/j.acvfr.2008.02.002� Annals of Vascular Surgery Inc.Edite par ELSEVIER MASSON SAS
INTRODUCTION
Apres angioplastie a ballonnet, la denudation de la
couche de cellules endotheliales entraıne
l’exposition des cellules musculaires lisses (CML) a
des forces de cisaillement inhabituelles du flux de
sang. La reponse des CML a ces forces mecaniques
inclut l’apoptose, la differentiation, la migration,
l’hypertrophie, et la proliferation. Les lesions
induites par l’angioplastie a ballonnet peuvent etre
la cause du changement des CML d’un phenotype
contractile a un phenotype synthetique.1 On pense
373
374 Acampora et coll. Annales de chirurgie vasculaire
que la proliferation du muscle lisse (ML) est une
reponse aigue a des lesions et peut se produire
jusqu’au 7eme jour apres une angioplastie a
ballonnet, la plupart des cellules entrant en cycle
de croissance dans les 2 ou 3 jours suivant les
lesions.2 Apres la reponse aigue, le nombre de CML
dans d’intima reste relativement constant jusqu’a
un an apres la procedure endovasculaire. En raison
de la stabilite de la population de CML au cours du
temps, on pense que des augmentations ulterieures
de l’hyperplasia intimale sont dues a la production
de la matrice extracellulaire et du tissu conjonctif
et a l’hypertrophie cellulaire.3 L’epaississement
intimal maximum chez l’homme se produit
habituellement dans les 2 ou 3 mois suivant le
traumatisme.4
Les CML non pathologiques siegent
principalement dans la media des vaisseaux
sanguins et sont d’un phenotype contractile. Apres
l’angioplastie a ballonnet, Les CML de la media
peuvent changer d’un phenotype contractile a un
phenotype synthetique.1 Ces cellules synthetiques
migrent vers l’intima, proliferent et excretent des
composants de la matrice extracellulaire tels que
l’elastine, le collagene, et les proteoglycans.5 La
production de matrice extracellulaire des CML
synthetiques est quatre a cinq fois celle des CML
contractiles. On estime que 50% des CML qui
migrent de la media apres angioplastie a ballonnet
se divisent trois fois.2 Ces cellules representent
huit neuviemes de la population de CML intimales
resultantes.2 Le neuvieme restant de la population
intimale resultante de CML comprend les autres
50% des CML actives par l’angioplastie a ballonnet
qui ont simplement migre vers l’intima sans
multiplication.2 Les CML synthetiques sont
caracterises par un plus grand nombre d’organelles
synthetiques telles que le reticulum
endoplasmique rugueux, une proliferation plus
intense, une diminution de l’a-actine, la perte de
la capacite de contraction, et un volume cellulaire
accru.6 En revanche, les CML contractiles sont
generalement fusiformes, non proliferantes,
capables de se contracter et de contenir
relativement plus d’a-actine que les CML
synthetiques.6 En resume, on pense que le degre
d’activation des CML apres angioplastie affecte les
caracteristiques de migration et de proliferation des
CML et contribue directement au degre
d’epaississement et a l’hyperplasie de l’intima.
Les caracteristiques de l’angioplastie
transluminale percutanee (ATP) ou angioplastie a
ballonnet dependent du stade des lesions
vasculaires, du choix du chirurgien, du diametre
du ballon, de la longueur des lesions, et d’autres
facteurs. L’importance du traumatisme en termes
de pression transmurale exercee sur la paroi
arterielle et sur les cellules dans la paroi vasculaire
peut affecter la reponse cellulaire aux lesions. Des
travaux precedents dans la litterature ont montre
que des lesions importantes sans atteinte de la
media entraınent une replication des CML de la
media sans proliferation intimale.7 Les lesions de
l’angioplastie a ballonnet peuvent causer plusieurs
perturbations dans l’artere dont l’agregation des
plaquettes, la denudation endotheliale, la
production de facteur de croissance a partir des
CML lesees et mortes, l’attraction des leucocytes et
des macrophages due a la reponse inflammatoire,
et une elongation mecanique durable des CML,
qui peuvent tous contribuer a la proliferation des
CML.8
A ce jour, beaucoup d’etudes ont ete concues
pour etudier la reponse in vivo des CML aux
lesions apres angioplastie a ballonnet. En raison de
la difficulte a maintenir simultanement des forces
de cisaillement et des forces de tension pour
evaluer leur effet sur les CML in vitro, peu
d’etudes ont ete realisees a l’aide d’un modele in
vitro. Nous rapportons la premiere utilisation d’un
modele in vitro de reponse des CML aux lesions
mecaniques avec un simulateur de forces de
cisaillement et de forces de tension developpe pour
produire des niveaux medicalement significatifs de
forces de contrainte et de cisaillement
d’applicabilite statistique.
Avec ce modele, les forces mecaniques peuvent
etre isolees des signaux biochimiques et de leur
influence sur la reponse des CML aux lesions.
L’utilisation de ce modele de simulateur permet
l’acquisition de donnees qui peuvent intervenir en
tant qu’etape preliminaire a la manipulation
pharmacologique des CML et la recherche de la
reduction, et par la suite de la prevention, de
l’hypertrophie et de la proliferation des CML apres
les procedures endovasculaires.
MATERIELS ET METHODES
Conception du simulateur
Ce systeme de simulateur se compose de six canaux
independants, permettant l’evaluation de six
populations independantes de cellules avec une
applicabilite statistique accrue et des techniques
d’analyse multiples. Le systeme est compose de
deux appareils, chacun avec trois canaux, comme
montre sur la Figure 1a. Les parametres de
conception ont ete consideres pour simuler des
conditions physiologiques avec des compromis
Vol. 21, No. 6, 2008 Reponse des CML apres angioplastie a ballonnet 375
Fig. 1. Presentation d’un canal individuel du simulateur
mecanique vasculaire. a Configuration du systeme. b Un
des simulateurs mecaniques vasculaires pendant
l’experimentation. c Vue superieure d’un canal
individuel avec la longueur d’entree et la culture
cellulaire sur silicone. d Vue laterale du point d’entree
montrant la section de coupe du canal.
minimes, avec un ecoulement laminaire, un
ecoulement developpe aux cellules, et des forces
de cisaillement appliquees. Les cellules sont
cultivees sur une membrane flexible de silicone,
qui oscille a 60 cycles/min (1 Hz) pendant le test
mecanique.
Une geometrie de plaque parallele a ete choisie
pour cette application, pour exposer un echantillon
plat de cellules a des forces de cisaillement et de
tension simultanees. La Figure 1 donne une
illustration du simulateur mecanique. La longueur
d’entree du canal permettant d’assurer un
ecoulement completement developpe au niveau
des cellules a ete determinee par le nombre de
Reynolds de 151 resultant d’un ecoulement
volumetrique d’entree (Qin) de 350 mL/mn. Le
nombre de Reynolds (Re) etait determine a partir
de l’equation appliquee a un canal rectangulaire :9
Re ¼rQin
mb
ou b est la largeur du canal (cm), r la densite du
fluide (kg/cm3), et m la viscosite du fluide ([dynes *
sec]/cm2). Le nombre de Reynolds etait egalement
employe pour etablir un flux canalise laminaire.
Ceci etait considere comme un flux d’entree
fortement laminaire puisque le nombre de
Reynolds etait tres inferieur a 2000 pour ce canal
rectangulaire.9 Cette equation suppose que le
fluide se comporte comme un fluide Newtonien
incompressible.
Le parametre minimum de longueur d’entree
pour un profil de vitesse totalement developpe, Le
(cm), etait estime comme suit :10
Le ¼ 0:05Re
La longueur d’entree minimale necessaire
calculee de 7,55 cm etait presque double a 13,95
cm pour assurer un profil de vitesse pleinement
developpe au niveau des cellules, suivant les
indications de la Figure 1d.
Un profil equibiaxial de contrainte etait applique le
long de la membrane de silicone sous vide selon la
technologie mise en oeuvre par Flexcell International
(Hillsborough, OR, Etats-Unis). Le logiciel Flexcell
3000 a ete employe pour controler la contrainte et
pour regler la pression de vide. D’autres ont montre11 que pres des 20% externes des membranes de
silicone situes au-dessus du point statique dans le
systeme Flexcell ne suivent pas des profils de
contraintes radiales et circulaires constants. Puisque
le systeme utilise dans cette etude faisait appel a une
geometrie similaire de colonne statique, les cellules
etaient confinees au centre de la membrane pour
favoriser une contrainte radiale et circulaire
constante au niveau des cellules cultivees pendant le
test mecanique en employant un anneau de Teflon
d’une section interieure de 2,75 cm2 et d’une
hauteur d’environ 1,75 cm centre sur la surface de
silicone au-dessus de la colonne centrale de lexan au
cours de la periode de culture des cellules. Cet
anneau de Teflon etait retire avant le test mecanique
376 Acampora et coll. Annales de chirurgie vasculaire
et agissait seulement pour retenir les cellules pendant
leur culture.
Culture de cellules
Des cellules musculaires lisses aortiques de rat
(CMLAR, 11-14 passages) obtenues de VEC
Technologies (Rensselaer, NY, Etats-Unis) etaient
maintenues dans du milieu modifie de Dulbecco
Eagle (MDME) (10-013-CV ; Mediatech, Herndon,
VA, Etats-Unis) complete avec 10% de serum
fœtal de veau inactive a la chaleur (FBS, F- 4135;
Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Etats-Unis) et 1%
d’antibiotique-antimycotique (A5955, Sigma-
Aldrich, St Louis, MO, Etats-Unis). Les cellules
etaient trypsinisees avec de la trypsine a 0,25%
avec 0,2 mg/mL d’acide ethylene-diamine-
tetracetique (EDTA, E6511 ; Sigma, St Louis, MO,
Etats-Unis).
Ensemencement des cellules pour le test
mecanique
Les membranes de silicone (5,25 cm de diametre) de
chaque test etaient decoupees sur des feuilles de
silicone de grade biomedical (lot SM04106803 ;
Specialty Manufacturing, Saginaw, MI, Etats-unis)
de 0,015 pouce d’epaisseur et 40 durometres.
Celles-ci etaient ultrasoniquees dans de l’eau
demineralisee et assemblees avec les plaques du
systeme experimental. Les plaques assemblees
etaient sterilisees a la vapeur (3870M ; Tuttnauer
Brinkmann, Jerusalem, Israel) a 121�C pendant 30
min puis placees dans l’appareil de simulation sur
environ 0,2 cc de lubrifiant silicone (51360 ;
Loctite, Rocky Hill, CT, Etats-Unis). Le lubrifiant
etait distribue a l’aide d’un tampon de silicone
sterile en exercant une contrainte mecanique de
5% avec le systeme de contrainte FlexerCell
(FlexCell International). Le systeme assemble etait
alors sterilise aux ultraviolets (UV) pendant 3 hr.
Apres sterilisation, les anneaux de Teflon steriles
etaient installes sur la surface de silicone. La zone
centrale du silicone entoure par les anneaux de
Teflon etait enduite de collagene de type I
(Vitrogen 100, 3 mg/mL ; Cohesion Tech, Palo Alta,
CA, Etats-Unis) dilue avec de l’eau sterile a 50,0 mg/
mL et seche pendant 72 hr dans une hotte sterile a
flux laminaire selon le protocole de Cohesion Tech
pour la formation d’un film mince de collagene.
Avant l’ensemencement des cellules, les
membranes etaient rincees avec 1,0 mL de solution
de tampon phosphate de Dulbecco (STPD, 21-031
cm ; Mediatech). Les cellules etaient comptees avec
un hemocytometre et du bleu trypan, ensemencees
a une densite de 7,5 � 104/mL et incubees pendant
48 hr leur permettre de s’etendre et d’adherer.
Un millilitre additionnel de milieu etait ajoute
apres 24 hr.
Groupes des tests de simulation
Deux groupes experimentaux simulant des
conditions in vivo ont ete etudies dans cette etude
en plus d’un groupe controle, dans lequel les
cellules n’etaient pas exposees au cisaillement ou
aux forces de tension. Le groupe du modele
lesionnel (ML) correspondait a des cellules
exposees a des contraintes elevees produites
pendant l’angioplastie a ballonnet entraınant
simultanement des forces de cisaillement et de
tension. Ces cellules etaient les CML directement
exposees au flux sanguin lors de la denudation de
la monocouche endotheliale. Le groupe de tension
cyclique (TC) simulait une situation physiologique
ou les cellules sont cycliquement soumises a une
tension de 0% a 4% sans etre directement
exposees au flux. Des controles statiques non
exposes (U) ont ete employes comme controles
d’adherence et de comportement phenotypique.
Les controles d’adherence (A), qui etaient
determines et comptes avant le test, ont aide a
determiner les problemes d’adherence dus a
l’exposition aux forces mecaniques.
Tests mecaniques
Avant les tests mecaniques, la confluence etait
evaluee par microscopie des controles statiques
non exposes. Le milieu contenant 10% de SFV
etait enleve, et les CMLAR etaient maintenues
dans un milieu stable constitue de MDME sans
adjonction de SFV pour la duree du test
mecanique. Le milieu sans adjonction de SFV est
utilise dans les tests dynamiques pour etudier les
effets des changements de la proliferation. Pendant
les tests mecaniques, les deux groupes
experimentaux dynamiques etaient soumis la
premiere fois a un regime de preconditionnement
par une contrainte cyclique de 0-4% pendant 2
heures avec des frequences graduellement
croissantes de 0,1 (30 min), 0,5 (30 min), et 1,0 (60
min) Hz. Apres ce regime de preconditionnement,
le groupe TC (n ¼ 6) a ete soumis a une contrainte
cyclique de 0-4% pendant 8 hr et le groupe ML
(n ¼ 6) etait soumis a deux etirements circulaires
statiques de 12% maintenus pendant 75 sec
chacun avec un intervalle de 30 sec entre les
etirements comme cela est habituellement le cas au
cours des angioplasties a ballonnet. Apres le
deploiement simule du ballon, un flux de
cisaillement etait repris a 350 mL/min et une
Vol. 21, No. 6, 2008 Reponse des CML apres angioplastie a ballonnet 377
contrainte cyclique etait appliquee a 0-4% pendant
8 hr. Un debit de 350 mL/min fournissait des forces
de cisaillement parietales faibles (0,25 dynes/cm2)
pour favoriser la proliferation des cellules. Les
echantillons statiques U, qui n’etaient pas soumis a
l’exposition de forces dynamiques servirent de
controles (n ¼ 6) et les controles A (n ¼ 6), qui
etaient determines avant les tests dynamiques, ont
servi a determiner le nombre de cellules perdues
du fait de problemes d’adherence cellulaire.
Evaluation de la reponse cellulaire
Chaque groupe experimental comportait six
echantillons. La proliferation des cellules a ete
evaluee a l’aide d’une methode quantitative
(n ¼ 3) et d’un test qualitatif (n ¼ 3). L’approche
quantitative impliquait la coloration des noyaux
cellulaires avec du 40.6 diamidino-2-phenylindole
(DAPI, D-1306 ; Molecular Probes, Eugene, OR,
Etats-Unis). Pour cette methode, les cellules etaient
rincees avec une STPD apres le test mecanique,
fixees avec de l’ethanol a 100% pendant 30 min, et
rincees a nouveau avec une STPD. Les echantillons
etaient recouverts avec 0,5 ml d’une solution de
DAPI pendant 10 min et rinces avec une STPD. Les
echantillons etaient examines en microscopie a
fluorescence (Diaphot 300 ; Nikon, Melville, NY,
Etats-Unis) en 10 endroits distribues sur tout
l’echantillon. Le logiciel d’analyse ImagePro Plus
(version 5.1 ; Media Cybernetics, Silver Spring,
MD) a ete employe pour mesurer le nombre de
cellules presentes.
L’analyse qualitative a utilise le Cell Titer 96
AQueous ONE Solution Cell Proliferation Assay
(sel interne (4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 5
(3-carboxymethoxyphenyl) - 2 (4-sulfophenyl) -
2H-tetrazolium [MTS], G-3580 ; Promega,
Madison, WI, Etats-Unis), dans lequel 1,25 mL
etaient ajoutes a chaque puis et incube pendant 3
hr. Le surnageant etait collecte individuellement,
distribue dans des alveoles, et vortexe doucement
pour favoriser une repartition harmonieuse des
echantillons. Quatre echantillons de 125 mL
provenant de chaque surnageant etaient places
dans une plaque de spectrophotometrie Cell Titer
96 AQueous ONE Solution Cell Proliferation Assay a
96 puits. La densite optique etait determinee a 490
nm (modele DU� 640B ; Beckman Instruments,
Fullerton, CA, Etats-Unis).
Marqueur phenotypique
La a-actine du ML a ete evaluee comme marqueur
phenotypique cellulaire6 dans des extraits de
cellules a l’aide de techniques Western blot
standard. L’expression de la glyceraldehyde-
3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) a ete
egalement evaluee et employee comme
normalisation et controle de la charge proteique. Les
cellules etaient retirees de la membrane de silicone
et lysees a l’aide d’un tampon d’extraction se
composant de 0,5% de Triton X-100 (T-9284,
Sigma-Aldrich), de sodium dodecyl sulfate a 1%
(SDS, L-4522, Sigma-Aldrich), de Tris20 mM (161-
0716, Bio Rad, Hercules, CA, Etats-Unis), et de 10
mL/mL de cocktail inhibiteur des proteases (P8340,
Sigma-Aldrich). Le kit d’analyse proteique de BCA
(23225 ; Pierce, Rockford, IL, Etats-Unis) ont ete
alors employes pour determiner la teneur en
proteines totales de chaque echantillon. Ces
echantillons etaient dilues a 1 mg/mL a l’aide d’un
tampon temoin compose de b-mercaptoethanol, de
Tris-HCL 0,5 M, de SDS a 10%, de 0.5% de bleu de
bromophenol, de glycerol, et d’eau distillee. Chaque
echantillon etait normalise a 10 mg/mL. Avant
l’electrophorese sur gel, les echantillons etaient
portes a ebullition pendant 5 min pour lineariser les
proteines. Un gel de polyacrylamide a 10% (161-
0158, Bio Rad) etait employe dans l’electrophorese
avec une solution de cellules de 17,5 mL chargee en
ligne. L’analyse Western blot etait executee a l’aide
d’un transfert sur membrane de difluoride (PVDF)
de polyvinylidene (162-0184, Bio Rad). Le kit
WesternBreeze� chromogenic Western Blot
Immunodetection (WB7103 ; Invitrogen, Carlsbad,
CA, Etats-Unis) etait employe pour doser l’a-actine
et l’expression de GAPDH. Le WesternBreeze
Chromogenic Immunodetection Protocol etait suivi
avec des anticorps monoclonaux primaires de souris
specifiques de l’a-actine ML (ab18460-1 ; Abcam,
Cambridge, MA, Etats-Unis) a la dilution de 1:1000
et avec d’anticorps primaire monoclonal anti-
GAPDH de souris (6C5) (CB1001 ; Calbiochem, San
Diego, CA, Etats-Unis) a la dilution de 1:1500. La
densitometrie etait executee sur les Western blots
developpes pour evaluer les differences d’expression
de l’a-actine ML entre les groupes U (n ¼ 3), CT
(n ¼ 3), et ML (n ¼ 6). La densite optique integree
(DOI) des bandes etait determinee a l’aide d’un
densitometre d’imagerie (GS-700, Bio Rad) couple
au logiciel d’analyse Quantity One (version 4.1.1,
170-9600 ; Bio Rad). Les rapports de l’a-actine ML a
GAPDH ont ete evalues pour normaliser les
donnees, et ces valeurs ont ete employees dans
l’analyse statistique.
Analyse statistique
Une analyse statistique de la variance appariee avec
l’analyse de Tukey a ete executee a l’aide de
378 Acampora et coll. Annales de chirurgie vasculaire
SigmaStat (Systat Software, San Jose, CA, Etats-
Unis) pour examiner les donnees sur la
proliferation des cellules et l’a-actine ML, avec p <0,05 indiquant une difference significative.
RESULTATS
Proliferation
Les etudes aigues (8 hr) utilisant CMLAR ont
montre une proliferation de cellules apres lesions
d’angioplastie et exposition au cisaillement
(groupe ML) par comparaison a l’exposition de
tension cyclique « physiologique » (groupe CT).
L’analyse DAPI a montre une augmentation de
75% du nombre de cellules du groupe ML compare
au groupe CT ( p ¼0,001). Les moyennes du
nombre de cellules du decompte de cellules DAPI
etait de 3,45 � 104 (deviation standard ± 1,7 � 103
[DS]) cellules/mL pour le groupe CT, 6,07 x 104
(DS ± 5,0 � 103) cellules/mL pour le groupe ML,
10,0 � 104 (DS ± 15,8 � 103) cellules/mL pour les
moyennes combinees du groupe statique U, et
8,2 � 104 (DS ± 16,1 � 103) cellules/mL pour le
groupe A, suivant les indications de la Figure 2a.
Suivant les indications de la figure 2b, les resultats
MTS allaient dans le sens des resultats de DAPI,
avec des niveaux d’absorbance resultante moyenne
a 490 nanometre de 0,062 (DS ± 0,028) pour CT,
de 0,153 (DS ± 0,04) pour ML, et 0,345 (DS ±
0,034) pour les groupes U.
Western Blot
L’analyse Western blot a ete executee pour detecter
les niveaux du marqueur phenotypique de l’a-
actine contractile du ML. Des niveaux diminues de
l’expression de l’a-actine ML indiqueraient un
phenotype plus synthetique des CML. Les
echantillons statiques non charges (U1-U6)
exprimaient une a-actine ML IOD normalisee du
ML de 1,038 (DS ± 0,103). La simulation de
fonction normale dans le groupe CT (CT1-CT3)
a demontre une augmentation de 12% de l’ a eactine ML, avec des niveaux d’IOD de 1,162 (DS ±
0,098) ; cependant, ces resultats n’etaient pas
significativement differents. Des differences
significatives etaient observees avec le modele de
lesions d’angioplastie a ballonnet (ML1-IM3), avec
une expression normalisee diminuee de l’a-actine
ML a un niveau IOD de 0,841 (DS ± 0,046) ( p ¼0,006) et une diminution de 19% de l’expression
de l’a-actine ML en comparant les echantillons IM
aux echantillons statiques U.
DISCUSSION
Les effets des differentes forces mecaniques sur le
comportement des CML dans une situation in
vitro ont ete bien documentes par d’autres.
Cependant, le modele presente a ete developpe
avec la possibilite de representer plus exactement
les forces mecaniques simultanees dues a la
reponse lesionnelle additionnelle liee au
deploiement du ballon d’angioplastie surajoutee a
la reaction des CML aux forces de cisaillement
parietales faibles qui stimulent la proliferation des
CML.
Un but du modele lesionnel etait de simuler les
forces accrues de deploiement du ballon sur les
cellules par rapport aux niveaux normaux dus a
l’expansion du vaisseau sanguin liee au flux
sanguin. Pendant l’angioplastie a ballonnet, des
forces de deploiement elevees de 5-10
atmospheres peuvent affecter negativement les
CML voisines. Souvent, la procedure
d’angioplastie a ballonnet est decrite comme la
compression de la plaque arterielle dans le
vaisseau sanguin pour reconstituer un diametre
luminal nominal. Cependant, la rigidite plus
importante de la plaque dans les parois vasculaires
comparee a celle des tissus environnants entraıne
un plus grand transfert des forces de deploiement
aux tissus environnants et aux CML.8 Une
exposition des CML a une force dynamique de
tension physiologique de 0-4% pour des arteres
moins elastiques a 1 Hz ressemblait aux forces de
tension normales auxquelles les CML sont
soumises in vivo.
Le passage des CML d’un phenotype contractile
a un phenotype plus synthetique a un role
significatif dans l’hyperplasie intimale apres les
procedures endovasculaires. In vivo, les CML
normales siegent principalement dans la media
du vaisseau sanguin et sont d’un phenotype
contractile. Apres angioplastie a ballonnet, les
CML mediales peuvent changer d’un phenotype
contractile a un phenotype synthetique.1 Ces
changements cellulaires entraıne la perte de la
capacite cellulaire a se contracter, la secretion
accrue de proteines, et une reaction accrue aux
facteurs de croissance autocrines et paracrines.12-
14 Les CML contractiles contiennent relativement
plus d’a-actine de ML que les CML synthetiques,
raison pour laquelle ce marqueur a ete choisi
dans cette etude.6 Mecaniquement, la rigidite des
CML contractiles est plus elevee que celle des
CML synthetiques, ce qui est considere comme
la consequence d’une plus grande quantite
d’actine dans la cellule.15
Vol. 21, No. 6, 2008 Reponse des CML apres angioplastie a ballonnet 379
Fig. 2. Comparaison de la proliferation des cellules entre
les groupes tests de tension cyclique (TC), de lesion (ML),
U non charge, et d’adherence (A) (pour DAPI
seulement). a La quantification des cellules par DAPI
montrait une difference significative, ML et U etant
differents de tous les autres groupes (*p ¼ 0,001).
b Comparaison MTS de la proliferation des cellules,
confirmant une difference significative entre les
groupes experimentaux (*p < 0,001).
Les lignees cellulaires in vitro sont
generalement caracterisees comme de phenotype
synthetique. Une fois en culture statique, les
CML vasculaires contractiles tendent a changer
leur phenotype en un etat synthetique. Des
niveaux plus eleves des forces de tension
appliquees (>10%) ont ete montres pour ayant
comme consequence une proliferation accrue des
CML16,17 en plus de l’expression diminuee de
marqueurs tels que le l’a-actine ML.17 En
examinant les resultats de cette etude, les CML
statiques non chargees, normales en culture in
vitro, ont servi de ligne de base pour l’expression
de l’a-actine ML. Meme a un intervalle court de
8 hr apres les lesions, un bas niveau des forces
de tension semblable a celui des forces in vivo
avait comme consequence un plus haut niveau
d’expression de l’a-actine ML, comme indique
sur la Figure 3. Bien que non significatif, ceci
suggere que l’application d’un bas niveau de
forces de tension pourrait stimuler la
differentiation vers un phenotype plus contractile
au cours du temps. Une evaluation d’intervalles
de temps accrus serait necessaire pour explorer
cette hypothese. La diminution significative de
l’expression de l’a-actine ML representee sur la
Figure 3 apres un temps precoce d’exposition au
cisaillement et aux forces de tension apres
angioplastie a ballonnet in vitro de 8 hr donne
une vue pertinente du changement precoce de
phenotype du aux forces mecaniques appliquees.
Les resultats de proliferation indiques sur la
Figure 2 soutenaient le concept d’un changement
phenotypique precoce. Comparant les groupes
dynamiques CT et IM, les resultats de DAPI
montraient une augmentation sensiblement
differente de 75% du nombre de cellules presentes
dans le groupe IM compare au groupe CT simulant
la fonction arterielle normale, indiquant que les
lesions et l’exposition simultanee au cisaillement
et aux forces de tension avaient comme
consequence la plus grande proliferation du
modele lesionnel. Comme l’adherence des cellules
est une preoccupation des experiences
dynamiques dans les deux groupes CT et IM, une
comparaison directe de la proliferation des deux
groupes avec le groupe statique est non pertinente.
Ceci etait conforte par les donnees du groupe A
indiquant une perte significative de cellules due a
l’exposition dynamique. Pour cette raison, le
groupe statique U n’a pas ete inclus dans cette
comparaison.
L’application de la force de cisaillement aux CML
peut avoir divers effets sur la reponse des cellules.
Les variations du flux peuvent appeler differentes
reponses de meme que l’importance du taux de
cisaillement. Les etudes de cisaillement
demontrent l’inhibition de la proliferation in vitro
des CML avec des niveaux eleves de forces de
cisaillement.18 Generalement des niveaux de
forces de cisaillement superieurs a 10 dynes/cm2
sont consideres eleves et atheroprotecteurs.19 En
revanche, des forces de cisaillement basses (<10
dynes/cm2) favorisent une reponse atherogene et
une proliferation accrue de CML.19 Les
changements de la geometrie arterielle peuvent
avoir comme consequence des separations de flux,
une stagnation, et une recirculation. Ces
380 Acampora et coll. Annales de chirurgie vasculaire
perturbations du profil de vitesse peuvent avoir
comme consequence des zones de faibles forces de
cisaillement parietales, favorisant la proliferation
des CML.
L’application d’une force de tension aux cellules
est habituellement circulaire, uniaxiale, ou
biaxiale. La direction est habituellement ajustee
sur l’application. Les cellules vasculaires sont
cycliquement deformees par la dilatation et la
relaxation du vaisseau sanguin, habituellement
represente par un test circulaire ou uniaxial. La
reponse cyclique des cellules vasculaires a la
contrainte est importante pour les fonctions
cellulaires normales et anormales. Elle peut
affecter la proliferation des cellules, la migration,
l’apoptose, la morphologie, et l’alignement.20
La differentiation des cellules est un point
important du developpement et des tests in vitro.
Une fois transferees dans une culture statique, les
CML vasculaires contractiles tendent a evoluer
vers un phenotype synthetique. La tension
cyclique augmente l’expression de certains
Fig. 3. Resultats Western blot pour l’a-actine ML pour
les groupes de tension cyclique (TC), lesionnel (ML), et
U non charge. a Image densitometrique de l’a-actine
ML employee pour evaluer la densite optique integree
pour comparer l’expression. b Image densitometrique
de GAPDH agissant en tant que controle de la charge
proteique. c Normalisation de l’expression de l’a-actine
ML avec le controle de charge GAPDH, montrant une
difference significative de l’expression de l’a-actine ML
dans le modele lesionnel (*p ¼ 0,006).
marqueurs de l’etat differencie des CML. Dans une
etude par Birukov et collaborateurs,16 outre la
stimulation de h-caldesmon, une proliferation
accrue a ete observee, indiquant un comportement
synthetique contradictoire, mais le niveau de
contrainte des cellules etait plus eleve que les
contraintes physiologiques (15%), ce qui pouvait
affecter le comportement de proliferation des
cellules. Butcher et collaborateurs17 ont montre
une variation de phenotype dans une structure
tridimensionnelle de collagene de CMLAR soumise
a des forces de tension correspondant a une
contrainte de 10% a 1 Hz pendant 48 hr a l’aide
d’une platine multiaxiale de contrainte. Les
resultats du groupe teste montraient une
augmentation de la viabilite des cellules,
une diminution de l’elongation morphologique,
une diminution de l’expression de l’a-actine et de
la calponine, et une expression accrue de la
vimentine par comparaison avec le controle
statique. Ces resultats suggerent une evolution
d’un phenotype contractile vers un phenotype
plus synthetique.
Il y a differents systemes in vitro disponibles
pour etudier les effets des forces mecaniques
appliquees. Par exemple, les forces de
cisaillement sont generalement provoquees par
un fluide a l’aide d’une chambre de flux
parallele plate basee sur des differences de
pression ou par un cone sur un dispositif plat
rotationnel. Les tests de tension in vitro utilisent
des dispositifs qui appliquent des forces de
tension unidirectionnelles, bidirectionnelles, et
radiales/circulaires. L’avantage du systeme de
cette etude est l’effet combinatoire de
l’application de forces par l’utilisation simultanee
de l’application d’une tension radiale/circulaire et
d’un cisaillement parallele a plat.
Bien que le systeme developpe soit un modele in
vitro ameliore, il y a des limitations de cette etude
qui seront prises en compte dans d’autres etudes.
Comme precedemment indique, l’application de
forces mecaniques peut causer une serie de
reponses telles que l’apoptose, la migration,
l’hypertrophie, la differentiation, et la
proliferation. D’autres analyses cellulaires
etudieront les reponses possibles d’apoptose, de
proliferation, et d’hypertrophie des cellules. En
plus, comme discute precedemment, il y a d’autres
marqueurs phenotypiques qui indiquent le
comportement synthetique ou contractile.
L’evaluation d’autres marqueurs que l’a-actine ML
aidera a une meilleure caracterisation des effets sur
la differentiation des forces mecaniques appliquees
sur les CML vasculaires.
Vol. 21, No. 6, 2008 Reponse des CML apres angioplastie a ballonnet 381
CONCLUSION
Cette etude presente un modele in vitro pour simuler
in vitro une angioplastie a ballonnet suivie de forces
tensiles et de cisaillement appliquees sur les CML.
Les resultats de cette etude montrent l’efficacite du
modele developpe pour l’angioplastie in vitro et
l’environnement mecanique simule des cellules.
En outre, la reponse significative a court terme
suggere l’evaluation ulterieure de forces accrues et
d’intervalles de temps plus longs par rapport a une
reponse accrue des SMC.
La signification clinique de ce modele in vitro de
proliferation cellulaire est la capacite d’imiter des
forces mecaniques cliniquement pertinentes et
d’appliquer un regime applique plus complexe
pour simuler l’intervention clinique combinee a
une exposition normale. En etant optimiste, ce
modele pourrait etre mis en oeuvre pour dans les
recherches pharmaceutiques initiales pour evaluer
les agents antiproliferatifs potentiels pour les CML
afin d’essayer d’empecher l’hyperplasie et la
restenose apres intervention endovasculaire.
Les auteurs remercient Cassie Gregory, Rebecca
Cribb,et le Dr. Agneta Simionescu pour l’aide
apportee a ce travail et le Greenville Hospital
System pour le financement de ce travail.
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