deviannistia suyonoputri spektrofotometri

8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri

1/20


2/20

2

2.1 PENGERTIAN

Spektrofotometri merupakan salah satu jenis teknik dari spektroskopi yang

mempelajari tentang absorpsi dan emisi radiasi dari suatu senyawa. Radiasi tersebut

didasarkan atas gelombang elektromagnetik dengan kecepatan m/detik (Sudarmadji,

1996; Holme & Peck, 1998). Gelombang elektromagnetik tersebut dapat diketahui panjang

gelombangnya dari spektrum sinar yang dibiaskan. Spektrum-spektrum tersebut dibagi

menjadi dua yakni cahaya tampak dan cahaya tak tampak. Dengan adanya spektrum inilah,

maka dapat digunakan untuk menganalisa suatu senyawa atau mikrobia dalam dalam

sejumlah penelitian. Alat yang betindak untuk spektrofotometri disebut spektrofotometer

(Christian, 1994).

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukurabsorbansi dengan

cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau

kuarsa yang disebutkuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan

dilewatkan. Nilai absorbansi daricahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan

konsentrasi larutan di dalamkuvet.

2.2 JENISJENIS SPEKTROFOTOMETRI

Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan.

Diantaranya adalah sebagai berikut:

1. Spektrofotometer Vis (Visible)

2. Spektrofotometer UV (Ultra Violet)

3. Spektrofotometer UV-Vis

4. Spektrofotometer IR (Infra Red)
http://id.wikipedia.org/wiki/Absorbansihttp://id.wikipedia.org/wiki/Kuarsahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Cahayahttp://id.wikipedia.org/wiki/Konsentrasihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://www.codecogs.com/eqnedit.php?latex=3/times%2010^{8}http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Konsentrasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Cahayahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Kuarsahttp://id.wikipedia.org/wiki/Absorbansi


3/20

3

1. Spektrofotometer Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya

tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap

oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga

semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama

ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu

Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan

simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C)

dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilkii warna. Hal ini

menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk

sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan

reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus

betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk

senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.

Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein).Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat

berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.

Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan

peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat

dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru

menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar

konsentrasi protein terlarut dalam sample.

2. Spektrofotometer UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometer visible, pada spektrofotometer UV berdasarkan

interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.

Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy

hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan

daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogenhanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa


4/20

4

Yunani, deuteros, yang berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.

Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap

sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan

penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa

preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau

centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut

sempurna.

Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein

terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu

dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample

dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada

panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample

(Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar. Spektrofotometri UV

memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian

preparasi sample.

Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi darisenyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini

berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

3. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan Visible.

Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya

visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar

sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk

sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.

Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk

sample tak berwarna.

4. Spektrofotometer IR (Infra Red)


5/20

5

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometer ini berdasar pada

penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah

dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan

pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada spektro IR meskipun

bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif.

Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa,

terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan

adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap

panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal

standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni.

Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva

yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada

penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry

(NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan

baku yang bersifat rutin dan cepat.

2.3 BAGIAN ATAU KOMPONEN SPEKTROFOTOMETER

Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :

a. Sumber Cahaya

Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang

stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,

ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut

terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah

panjang gelombang (l ) adalah 3502200 nanometer (nm).

b.

Monokromator


6/20

6

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis

menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda

(terdispersi).

c.

Cuvet

Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau

cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic

dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di

daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat

dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk

pengukuran di daerah sinar tampak (visible).

d.

Detektor

Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai

panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya

akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.

Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan

konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akanmengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya

sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam

persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.

2.4 PRINSIP KERJA SPEKTROFOTOMETER

Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur jumlah relatif cahaya dari panjang

gelombang yang berbeda yang diabsorbsi dan ditransmisikan oleh suatu senyawa. Gambar 1

menjelaskan mekanisme kerja spektrofotometer yang mana cahaya putih dibiaskan oleh

prisma menjadi sejumlah cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Cahaya tersebut

akan melewati sampel dan kemudian melewati tabung/kuvet yang mengubah energi cahaya

menjadi energi listrik yang digunakan untuk mengukur densitas sampel tersebut (Campbell et

al., 2011).


7/20

7

Gambar 1. Prinsip kerja spektrofotometer (Campbell et al., 2011).

Teknik spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisi baik secara kuantitatif maupun

secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan adanya pola spektrum yang

mengenali suatu senyawa dan secara kuantitatif berdasarkan hukum Lambert-Beer. Hukum

Lambert-Beer mengatakan bahwa intensitas suatu cahaya yang diserap berbanding lurus

dengan konsentrasi senyawa. Semakin besar suatu konsentrasi, maka semakin besar nilai

absorbasinya. Dengan adanya Hukum ini, maka dapat dirumuskan nilai absorbansi dengan

persamaan:

A = b c

A = Absorban

= koefisien ekstingsi molar

b = tebal larutan (kuvet)

c = konsentrasi larutan

Tipe-tipe SpektrofotometerPada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer,

yaitu

1. Single-beam instrument

Single-beam instrument

dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukurabsorbansi pada panjang gelombangtunggal.

Single-beam instrument

mempunyai beberapakeuntungan yaitu sederhana, harganya

murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakankeuntungan yang nyata. Beberapa

instrumen menghasilkansingle-beam instrument

untuk pengukuran sinar ultra violet dan
http://2.bp.blogspot.com/-8vSdKK8p2wg/UDDFS5ZoKbI/AAAAAAAABPc/iNSEPYzvuvM/s1600/spektrofotometer.jpg


8/20

8

sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190sampai 210 nm dan paling tinggi

adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).

2. Dou ble-beam i nst ru m ent

Double-beam

dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.Double-beaminstrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan

cerminyang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan

blangko dansinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang

keluarmenjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh

alat pembaca (Skoog, DA, 1996).

2.5 KALIBRASI ALAT SPEKTROFOTOMETER

Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelumdigunakan untuk analisis. Secara umum sbb:

1.

Nyalakan alat spektrofotometer

2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)

3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi.

4.

->keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur

saat kuvet dalam keadaan terisi larutan.

5.

Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer

6. lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam

bentuk teks)

Contoh tabel pengamatan absorbansi sebagai fungsi gelombang

Hal-hal yang harus diperhatikan :
http://4.bp.blogspot.com/_F2K3be_pU9E/TTfZu7o_SCI/AAAAAAAAADI/zg2Ucycc3h0/s1600/Picture0004.jpg


9/20


10/20

10

Prosedur Kerja

1. Pembuatan Kurva Standar
http://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/screenshot_4.png


11/20

11

2. Penentuan Kadar Vitamin C

3. Data dan perhitungan
http://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/perhitungan.pnghttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/kadar.pnghttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/perhitungan.pnghttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/kadar.png


12/20

12

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisiskualitatif dari suatu sampel yang

ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan

kepolaran. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa

menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi

juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun

cuplikannya.

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik

seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.

KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang

diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi

senyawa murni skala kecil.Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang

dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan

pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT

adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat

dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai

jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh

pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0

A. Fungsi Kromatografi Lapis Tipis
http://www.facebook.com/pages/w/107511932611897http://id.wikipedia.org/wiki/Kualitatifhttp://id.wikipedia.org/wiki/Sampelhttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/ppm.pnghttp://id.wikipedia.org/wiki/Sampelhttp://id.wikipedia.org/wiki/Kualitatifhttp://www.facebook.com/pages/w/107511932611897


13/20

13

Digunakan untuk tujuan analitik

Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau

pemadaman fluoresensi, radiasi UV

Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending) atau menurun (descending) ataudengan cara elusi 2 dimensi

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan

merupakan noda yang tidak bergerak

Identitas komponen dijabarkan dalam harga Rf (retardation factor) yang dalam

penentuan kualitatif dibandingkan dengan standar

Untuk tujuan kuantitatif digunakan KLT preparatif (dikerok lalu senyawa diisolasi

dalam pelarutnya)B. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Prinsip

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel

denganpelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakanfase diam dari bentukplat

silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau

campuran larutan yang digunakan dinamakaneluen.Semakin dekat kepolaran antara sampel

dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.

Visualisasi

Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi.Tahapan ini

sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat

karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji.Salah satu yang dipakai

adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin.Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)

adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila

pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu.

Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.

Nilai Rf

Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu

perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama

walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini

digunakan sebagai nilaiperbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat

retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktorretensi.

Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :
http://www.facebook.com/pages/w/105649302803388http://id.wikipedia.org/wiki/Fasehttp://id.wikipedia.org/wiki/Plathttp://id.wikipedia.org/wiki/Silikahttp://id.wikipedia.org/wiki/Eluenhttp://www.facebook.com/pages/w/109344559092075http://id.wikipedia.org/wiki/Keterampilanhttp://id.wikipedia.org/wiki/Metodehttp://id.wikipedia.org/wiki/Tepathttp://id.wikipedia.org/wiki/Ujihttp://www.facebook.com/pages/w/112411485441121http://id.wikipedia.org/wiki/Ninhidrinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Gugushttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Relatif&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Perbandingan&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Retensi&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Retensi&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Perbandingan&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Relatif&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Gugushttp://id.wikipedia.org/wiki/Ninhidrinhttp://www.facebook.com/pages/w/112411485441121http://id.wikipedia.org/wiki/Ujihttp://id.wikipedia.org/wiki/Tepathttp://id.wikipedia.org/wiki/Metodehttp://id.wikipedia.org/wiki/Keterampilanhttp://www.facebook.com/pages/w/109344559092075http://id.wikipedia.org/wiki/Eluenhttp://id.wikipedia.org/wiki/Silikahttp://id.wikipedia.org/wiki/Plathttp://id.wikipedia.org/wiki/Fasehttp://www.facebook.com/pages/w/105649302803388


14/20

14

Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa

tersebut padaplat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di

bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang

polar dan berinteraksi dengan adsorbentpolar dari plat kromatografi lapis tipis.

Nilai Rf dapat dijadikanbukti dalam mengidentifikasikansenyawa.Bila identifikasi nilai Rf

memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memilikikarakteristik yang

sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan

merupakan senyawa yang berbeda.

a. Fase diam-jel silika

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh

atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom

silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H

selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan

hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van

der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-

aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang

kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.

b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-

senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan

cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung

pada:

Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul

senyawa dengan pelarut.

Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada baga imana besar

atraksi antara senyawa dengan jel silika.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat

dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang

lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya.

Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.

Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam
http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Plat&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Polar&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Bukti&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Karakteristik&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Karakteristik&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Bukti&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Polar&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Plat&action=edit&redlink=1


15/20

15

pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa

dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini

akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari

permukaan silika.

Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan

yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali

pada larutan dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu

terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses

penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat

senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik

ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu

dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.

C. Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina

yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau

alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga

mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak

merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam

pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan

isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning

a. Kromatogram

Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang

merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.


16/20

16

Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis:

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes

pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis

di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan

tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas

kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan

bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas

kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia

biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh

dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari

campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai

perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini

akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk

kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

b. Perhitungan nilai Rf

Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari

lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini

berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna

masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas

kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.

Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut


17/20

17

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,

sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah

menjadi:

nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf

untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi

pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah.

c. mengidentifikasi senyawa-senyawa

Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya. Caranya :

Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil

yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan

yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang

sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam

amino yang telah diketahui ditandai 1-5.

Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas

dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang

terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.

Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan

bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui

posisi dan warnanya.

D. Kromatografi Lapis Tipis pada Substansi Tak Berwarna

a. Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang

ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar

ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-

bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkansinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi

bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.


18/20


19/20

19

Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa,

sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke

fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis

yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin

penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral.

Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan

penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur

kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat,

mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah

antara 11-12 % b/b.

Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik

dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak.

Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.

2. Fase Gerak pada KLT

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-

coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah

dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut

ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.

Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan

teknikyang sensitive

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara

0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase

gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf

Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non

polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai

fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu.

Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing - masing akan mening-katkan elusi

solut-solut yang bersifat basa dan asam.

3. Aplikasi (Penotolan) sampel


20/20

20

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika

menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana

dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan

menurunkan resolusi.

deviannistia suyonoputri spektrofotometri

Documents